Cristal·lització de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa 42A2 i estudi filogenètic de les subfamílies de les lipoxigenases Albert Garreta i Gambús ADVERTIMENT. La consulta d’aquesta tesi queda condicionada a l’acceptació de les següents condicions d'ús: La difusió d’aquesta tesi per mitjà del servei TDX (www.tdx.cat) ha estat autoritzada pels titulars dels drets de propietat intel·lectual únicament per a usos privats emmarcats en activitats d’investigació i docència. No s’autoritza la seva reproducció amb finalitats de lucre ni la seva difusió i posada a disposició des d’un lloc aliè al servei TDX. No s’autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant al resum de presentació de la tesi com als seus continguts. En la utilització o cita de parts de la tesi és obligat indicar el nom de la persona autora. ADVERTENCIA. La consulta de esta tesis queda condicionada a la aceptación de las siguientes condiciones de uso: La difusión de esta tesis por medio del servicio TDR (www.tdx.cat) ha sido autorizada por los titulares de los derechos de propiedad intelectual únicamente para usos privados enmarcados en actividades de investigación y docencia. No se autoriza su reproducción con finalidades de lucro ni su difusión y puesta a disposición desde un sitio ajeno al servicio TDR. No se autoriza la presentación de su contenido en una ventana o marco ajeno a TDR (framing). Esta reserva de derechos afecta tanto al resumen de presentación de la tesis como a sus contenidos. En la utilización o cita de partes de la tesis es obligado indicar el nombre de la persona autora. WARNING. On having consulted this thesis you’re accepting the following use conditions: Spreading this thesis by the TDX (www.tdx.cat) service has been authorized by the titular of the intellectual property rights only for private uses placed in investigation and teaching activities. Reproduction with lucrative aims is not authorized neither its spreading and availability from a site foreign to the TDX service. Introducing its content in a window or frame foreign to the TDX service is not authorized (framing). This rights affect to the presentation summary of the thesis as well as to its contents. In the using or citation of parts of the thesis it’s obliged to indicate the name of the author. Facultat de Farmàcia Departament de Microbiologia i Parasitologia Sanitàries Cristal·lització de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa 42A2 i estudi filogenètic de les subfamílies de les lipoxigenases Albert Garreta i Gambús 2010 Facultat de Farmàcia Departament de Microbiologia i Parasitologia Sannitàries Programa: Microbiologia Ambiental i Biotecnologia (Facultat de Biologia) Bienni: 2004-2006 Cristal·lització de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa 42A2 i estudi filogenètic de les subfamílies de les lipoxigenases Memòria presentada per Albert Garreta i Gambús per optar al títol de doctor per la Universitat de Barcelona. Dirigida per: Dra. Àngels Manresa i Presas Professora titular Dpt. de Micobiologia i Parasitologia Sanitàries Facultat de Farmàcia (UB) Dra. Montserrat Busquets Abio Professora titular Dpt. de Bioquímica i Biologia Molecular Facultat de Biologia (UB) Albert Garreta i Gambús 2010 Aquesta tesi ha estat finançada per la Universitat de Barcelona a través d’una beca BRD concedida al doctorand i pel Ministerio de Educación y Ciencia a través del projecte “Biocatalizadores para la producción de emulsionantes poliméricos: optimización del sistema y desarrollo de nuevos productos, CTQ 2007-60749/ PPQ”. Ítaca Quan surts per fer el viatge cap a Ítaca, has de pregar que el camí sigui llarg, ple d’aventures, ple de coneixença. Els Lestrígons i els Ciclops, l’aïrat Posidó, no te n’esfereeixis: són coses que en el teu camí no trobaràs, no, mai, si el pensament se’t manté alt, si una emoció escollida et toca l’esperit i el cos alhora. Els Lestrígons i els Ciclops, el feroç Posidó, mai no serà que els topis si no els portes amb tu dins la teva ànima, si no és la teva ànima que els dreça davant teu. Has de pregar que el camí sigui llarg. Que siguin moltes les matinades d’estiu que, amb quina delectança, amb quina joia! entraràs en un port que els teus ulls ignoraven; que et puguis aturar en mercats fenicis i comprar-hi les bones coses que s’hi exhibeixen, corals i nacres, ambres i banussos i delicats perfums de tota mena: tanta abundor com puguis de perfums delicats; que vagis a ciutats d’Egipte, a moltes, per aprendre i aprendre dels que saben. Sempre tingues al cor la idea d’Ítaca. Has d’arribar-hi, és el teu destí. Però no forcis gens la travessia. És preferible que duri molts anys i que ja siguis vell quan fondegis a l’illa, ric de tot el que hauràs guanyat fent el camí, sense esperar que t’hagi de dar riqueses Ítaca. Ítaca t’ha donat el bell viatge. Sense ella no hauries pas sortit cap a fer-lo. Res més no té que et pugui ja donar. I si la trobes pobra, no és que Ítaca t’hagi enganyat. Savi com bé t’has fet, amb tanta experiència, ja hauràs pogut comprendre què volen dir les Ítaques. Konstantinos Kavafis, 1911 Traduït per Carles Riba Agraïments: Ara farà uns sis anys que vaig començar aquest periple que és fer un doctorat i, ni de bon tros, em podia imaginar el que això suposava... Han estat moltes hores, molta feina i també alguna que altre decepció, però ara amb la perspectiva que dóna haver-ho superat, crec que ha valgut la pena. Aquesta tesi no hauria estat possible sense l’ajuda i suport de molta gent, és per això que aprofito aquestes ratlles per agrair-los-ho. En primer lloc agrair a les directores d’aquesta tesi, la Dra. Àngels Manresa i la Dra. Montse Busquets, el seu suport i confiança, però sobretot el fet d’haver-me donat l’oportunitat de no només treballar en aquest laboratori sinó de col—laborar amb d’altres grups d’aquí i de fora. En segon lloc, agrair l’oportunitat de realitzar aquest doctorat al Dr. Miquel Regué, Director del Departament de Microbiologia i Parasitologia Sanitàries, i per extensió agrair-ho a tota la gent del departament. En especial voldria donar les gràcies a la Dra. Marquès, que va dirigir el meu primer treball científic amb cara i ulls (el Màster), a la Dra. Espuny, amb qui sempre he pogut parlar de tota mena de problemes (científics o no), i a la Dra. Fusté sense la qual, l’últim capítol d’aquesta tesi hauria estat impossible. També vull donar les gràcies a la Dra. Berlanga amb qui he compartit despatx i xerrades durant l’última etapa de la tesi, i a la Lucía Muñoz que m’ha guiat a través de la “burrocràcia” que implica fer una tesi. Però és clar que durant sis anys al Departament no només he fet ciència, també hi he fet amics. Amics d’aquells amb qui comparteixes els bons moments però que també t’ajuden a superar els dolents. Éscar, Minyana, Noelí i Mònica moltes gràcies, aquesta tesi també és vostre!!! Una part molt important d’aquesta tesi s’ha realitzat al Parc Científic de Barcelona, al grup del Dr. Ignasi Fita del IBMB (Institut de Biologia Molecular de Barcelona, CSIC). A tota la gent que en forma part, els vull agrair el bon acolliment que em van donar i, especialment al Dr. Carpena, la paciència i dedicació que ha tingut amb mi. No em puc deixar de donar les gràcies a la tècnic d’aquest grup, la Queralt Garcia, a qui tant he atabalat durant aquests anys (allò que vas dir de mi, que era tant alt, m’ha quedat gravat per sempre, jejejeje). També vull donar les gràcies a tota aquella gent de fora de Catalunya que he anat coneixent. A la Rosa Maria (Mèxic), amb qui vaig compartit moments inoblidables al laboratori i a qui crec que, juntament amb RAC1, li vaig ensenyar una mica més de català. Al grup de la Dr. Eliana Lemos (Brasil), amb qui vaig estar mig any que no oblidaré mai (Simone e Maurício, para se um dia você ler estas linhas, muito obrigado por tudo). A la Dra. Betty Gaffney (Florida, USA), de qui he après molt més del que mai hauria imaginat, donar-li les gràcies per haver-me obert les portes del seu laboratori i donar-me l’oportunitat d’entrar en aquest món tant estrany que és l’EPR (Thanks for the patience you had with me and make me understand what, at first, thought it impossible to understand). Vull agrair també als meus amics la paciència que han tingut amb mi. Sé que ha estat molta i els ho agraeixo. Brisa, Ru, Bros, Martes, Aitziber, Dídac, Gis... prometo no atabalar-vos més amb la maleïda lipoxigenasa !!! I per acabar, donar les gràcies a la meva família que, tot i que crec que encara no entenen com es pot gaudir fent el que faig, sempre m’han donat suport. En especial als meus pares, que em serveixen de model per no defallir quan les coses es posen difícils. ÍNDEX 1. INTRODUCCIÓ........................................................................................................ 1 1.1. 1.2. Antecedents ........................................................................................................3 Transformacions microbianes.................................................................................5 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.4. Biotransformacions: definició i característiques.........................................7 Biotransformacions microbianes .............................................................8 Biotransformació de lípids per microorganismes......................................11 Biotransformacions aplicades a la indústria ............................................14 1.3. 1.4. Gènere Pseudomonas..........................................................................................16 Lipoxigenases ....................................................................................................18 1.4.1. 1.4.2. 1.4.3. 1.4.4. Classificació i nomenclatura .................................................................19 Funció biològica .................................................................................20 Mecanisme d’acció ..............................................................................23 Mètodes d’estudi: EPR i Difracció de raig X.............................................25 1.4.4.1. 1.4.4.2. 1.4.5. EPR (Ressonància Paramagnètica Electrònica) .....................25 Difracció de raig X...........................................................31 Estructura .........................................................................................33 1.4.5.1. 1.4.5.2. Lligands del ferro – Centre actiu........................................35 Cavitat ..........................................................................38 1.4.6. 1.4.7. Especificitat posicional i de substrat ......................................................40 Anàlisi filogenètic ...............................................................................46 2. OBJECTIUS ...........................................................................................................49 3. CAPÍTOL 1: Estructura de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa 42A2 ......52 3.1. Material i mètodes ..............................................................................................55 3.1.1. Producció de la lipoxigenasa recombinant de Pseudomonas aeruginosa 42A2 ................................................................................................55 3.1.2. Purificació de la lipoxigenasa recombinant de Pseudomonas aeruginosa 42A2................................................................................................55 3.1.3. 3.1.4. 3.1.5. Detecció de l’activitat lipoxigenasa. Mètode espectrofotomètric .................56 Electroforèsi de proteïnes en gels de poliacrilamida .................................57 Cristal—lització de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa 42A2 .........59 3.1.5.1. 3.1.5.2. 3.1.6. 3.1.7. Mètode de difusió de vapor en gota pendent .......................59 Condicions de cristal—lització .............................................60 Difracció del cristall de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa 42A2...62 EPR: Ressonància Paramagnètica Electrònica .........................................63 3.2. Resultats i discussió............................................................................................65 3.2.1. Purificació de la lipoxigenasa i obtenció de cristalls..................................65 3.2.2. 3.2.3. 3.2.4. 3.2.5. 3.2.6. 3.2.7. Paràmetres del cristall.........................................................................68 Estructura general ..............................................................................71 Esfera de coordinació del ferro. ............................................................75 Cavitats i substrat ..............................................................................78 EPR Ressonància Paramagnètica Electrònica...........................................82 Consideracions globals ........................................................................84 4. CAPÍTOL 2: Prospecció metagenòmica de noves lipoxigenases.............................91 4.1. Material i mètodes ..............................................................................................93 4.1.1. 4.1.2. 4.1.3. 4.1.4. 4.1.5. Recollida de mostres i extracció de DNA de sòls......................................93 Construcció d’una llibreria metagenòmica amb còsmids ...........................93 Gels d’agarosa ..................................................................................94 Disseny d’encebadors específics i degenerats .........................................95 PCR i PCR de seqüenciació............................................. ......................96 4.1.5.1. 4.1.5.2. 4.1.6. 4.1.7. 4.1.8. 4.1.9. PCR...............................................................................96 PCR de seqüenciació........................................................97 Extracció dels clons de DNA cosmídic de les plaques de cultiu de 96 pous ..98 Construcció d’un microarray usant DNA clonat en còsmids .....................100 Disseny i producció de les sondes per a revelar el microarray .................100 Marcatge fluorescent de les sondes. ....................................................101 4.1.10. Hibridació o revelat del microarray ......................................................102 4.1.11. Obtenció d’imatges i anàlisi de dades ..................................................102 4.1.12. SNR (Signal-to-Noise Ratio) ...............................................................104 4.2. Resultats i discussió ..........................................................................................107 4.2.1. 4.2.2. 4.2.3. 4.2.4. 4.2.5. 4.2.6. 4.2.7. 4.2.8. 4.2.9. Encebadors .....................................................................................107 Resultat de les PCR dels pools de clons i plaques escollides per a la generació del microarray..................................................................................108 Producció de sondes i marcatge ..........................................................111 Hibridació ........................................................................................112 Resultats del microarray: valoració estadística ......................................115 Classificació dels resultats..................................................................129 Anàlisis amb SNR (Signal-to-Noise Ratio).............................................131 Seqüenciació dels clons candidats .......................................................133 Consideracions globals ......................................................................134 5. CAPÍTOL 3: Filogènia de les lipoxigenases..........................................................141 5.1. Material i mètodes ............................................................................................143 5.1.1. 5.1.2. Seqüències de lipoxigenases utilitzades en l’anàlisi filogenètic.................143 Programes bioinformàtics ..................................................................144 5.1.2.1. 5.1.2.2. Programes usats per a fer alineaments.............................144 Programes i mètodes per a fer els arbres filogenètics. ........144 5.1.2.3. 5.2. PAML 4.3: Anàlisis filogenètic per màxima versemblança ....145 5.1.2.3.1. CODEML: anàlisi dels models evolutius........................146 Resultats i discussió ..........................................................................................148 5.2.1. 5.2.2. 5.2.3. Anàlisi dels gens de lipoxigenases .......................................................148 Arbres filogenètics ............................................................................150 Evolució de les lipoxigenases bacterianes .............................................154 6. CONCLUSIONS ....................................................................................................165 7. BIBLIOGRAFIA ...................................................................................................169 8. ANNEXES ............................................................................................................181 8.1. 8.2. Annex 1: Composició dels tampons provats per a la cristal·lització de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa...................................................................................183 Annex 2: Taula de valors d’intensitat per a cada spot i altres paràmetres estadístics..217 1. INTRODUCCIÓ 1.1. Antecedents Aquesta tesi s’emmarca en els treballs iniciats per Jaume Vidal-Mas i Víctor Deroncelé en el si del Grup de Biotransformacions de Residus Oleaginosos. L’estudi de l’origen dels productes hidroxilats detectats com a resultat de la biotransformació de residus oleaginosos amb la soca de Pseudomonas aeruginosa 42A2 va portar a pensar en l’existència d’una lipoxigenasa com a responsable d’aquest tipus de transformació. Les lipoxigenases pertanyen a la família de les oxidoreductases que estan àmpliament representades en els microorganismes, en les plantes, i en els animals (Brash RA 1999). Les oxidoreductases catalitzen l'intercanvi d'electrons o d'equivalents redox entre el donant i el receptor molecular en aquelles reaccions que impliquen una transferència d’electrons, l'abstracció d’un hidrogen, l'abstracció d’un protó, la inserció d’un oxigen o d’altres passos clau. Generalment es donen dues “mitges” reaccions, una oxidativa i l’altre reductora, i almenys dos substrats s’activen o es transformen (un reduint-se i l’altre oxidant-se). Així doncs, per acomplir la seva funció biològica, les oxidoreductases utilitzen diversos centres redox actius que estan protegits per la cadena polipeptídica de l’oxidoreductasa i que poden modular la seva selectivitat, potència redox, reactivitat i estabilitat (Munro AW, Taylor P et al. 2000). Els centres redox més comuns inclouen aminoàcids com la tirosina o la cisteïna, ions metàl—lics com el ferro, el coure o el molibdè, o complexos com pot ser un grup hemo o un cluster Fe-S, i coenzims (Feng X. 2005). Les oxidoreductases es poden classificar en funció de la seva seqüència o estructura tridimensional, aquesta és molt informativa per a l'estudi de la relació estructura-funció, de l'evolució de l'enzim, de la genòmica funcional i, en estudis in silico, per a descobriments de nous enzims. Òbviament, per a la seva aplicació, també es poden classificar d'acord a la seva signatura catalítica i/o en funció de la seva coenzim-dependència. En funció de la seva aplicació podem parlar de quatre grans grups d’oxidoreductases: les oxidases, les peroxidases, les oxigenases/hydroxilases i les dehidrogenases/reductases (Feng X. 2005). Tot i que no són moltes, algunes oxidoreductases ja s’estan utilitzant en la indústria alimentària i tèxtil. La seva aplicació tècnico-industrial es troba 3 habitualment en processos de síntesis química, en tractaments ambientals i en la indústria mèdica i alimentària. L’ús d’oxidoreductases com a biocatalitzadors biodegradables permet l’estalvi d’energia fet que encaixa perfectament amb el desenvolupament d’indústries eficients, sostenibles i ambientalment respectuoses (Feng X. 2005). Les pensar en lipoxigenases aquests tipus són un tipus com d’oxidoreductasa a candidat (oxigenases de / la hidroxilases) que es troben presents en el gènere Pseudomonas. Això va fer d’enzim responsable biotransformació dels residus oleaginosos que estava tenint lloc i que fou detectada mitjançant l’observació i descripció d’àcids grassos hidroxilats. En l’article publicat l’any 2004 que porta per títol Isolation and characterization of a lipoxygenase from Pseudomonas 42A2 responsible of the biotransformation of oleic acid into (S)-(E)-10-hydroxy-8-octadecenoic acid (Busquets M 2004) s’aïlla i es descriu un enzim amb activitat lipoxigenasa a partir de la soca de Pseudomonas aeruginosa. L’enzim és monomèric i es localitza en l’espai periplasmàtic i conté 0,55 mols de Fe2+ per cada mol de proteïna. Es descriu la bioquímica de l’enzim obtenint una activitat òptima entre 25 i 30 ºC i mantenint el 44% de l’activitat als 55ºC. Té un pH òptim de 8,5-9 i la presència d’ions de magnesi incrementen l’activitat de l’enzim. El substrat preferencial de l’enzim és l’àcid linoleic, un àcid gras poliinsaturat. En l’article publicat l’any 2005 que porta per títol “Cloning and expression of a lipoxygenase from Pseudomonas aeruginosa 42A2” (Vidal-Mas J 2005) es mostra la clonació i l’optimització de la sobreexpressió lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa obtenint un alt rendiment en la producció de proteïna. L’optimització va requerir l’eliminació del pèptid senyal de la proteïna per evitar la formació de cossos d’inclusió que reduïen notablement la quantitat de proteïna obtinguda en cada producció i dificultava la purificació de la mateixa. Posteriorment això en permetrà la seva cristal—lització i un posterior estudi estructural que constitueix el cos central d’aquesta tesi. Així doncs, partint de la necessitat de revalorar els residus que produeix la societat moderna per tal de reduir-ne el seu impacte ambiental, s’ha trobat un nou enzim capaç que reuneix les característiques necessàries per entrar a 4 formar part de la nova dinàmica industrial per a un desenvolupament sostenible i una producció neta. 1.2. Transformacions microbianes Durant les darreres dècades, el consum de recursos ha augmentat de manera descontrolada i, en conseqüència, també ho ha fet la generació de residus i emissions que van a parar al medi ambient. No és fins la dècada dels noranta que l’home pren consciència de la problemàtica generada i decideix fer-hi front des de dues perspectives: el “desenvolupament sostenible” i la “producció neta”. El desenvolupament sostenible és aquell capaç de satisfer les necessitats actuals sense comprometre els recursos i possibilitats de futures generacions, i per tant es basa en l’ús de recursos naturals renovables (Brundtland GH. 1991). La producció neta és aquella que es basa en l’ús de tecnologies que minimitzen l’impacte ambiental reduint l’emissió de residus (Clift R. 1997). Així doncs, l’aplicació de les tecnologies netes ha suposat i està suposant un canvi en la manera de produir que es tradueix en una actitud diferent de la societat enfront el medi ambient. La clau per entendre aquest canvi recau en la reutilització sistemàtica de residus que permet augmentar la producció de recursos i fer així, l’activitat humana sostenible (Clift R. 1997). Aquestes noves perspectives i possibilitats econòmiques, fan que l’estudi i l’ús d’eines biotecnològiques que permetin millorar les propietats de productes industrials, reduir-ne l’impacte ambiental i incrementar-ne la biodegradabilitat, siguin molt importants (Gámiz M. 2007). El desenvolupament de la biotecnologia, la química i l’optimització dels processos industrials fan possible que la reutilització de residus sigui una activitat econòmicament viable i que s’estigui utilitzant com a solució a molts problemes derivats de la pressió generada pel desenvolupament humà (O'Brien C. 1999). Un clar exemple d’aplicació de tecnologies netes és el que afecta a la gestió dels residus oliosos. L’any 2005 es van generar a Catalunya unes 63.000 tones d’olis usats segons l’Agència de Residus de Catalunya (http://www.arccat.net/ca/home.asp). A aquests valors cal afegir-hi tots els olis minerals usats com a lubricants en la indústria i el transport terrestre i marítim, els olis 5 minerals usats per aïllament i transmissió de calor, emulsions olioses... (unes 45.000 tones/any a Catalunya). Tot això representa un 1’7% del total de residus produïts a Catalunya (Taula 1). Descripció: tipus de residu Dissolvents i residus líquids amb dissolvents Especials Inerts 111.532 0 No especials 0 Total 111.532 % 1,75 Residus oliosos (olis, greixos i hidrocarburs) Productes químics i fitosanitaris Líquids i banys residuals amb metalls Líquids i banys residuals sense metalls Residus líquids orgànics Pintures, tintes, colorants i coles Residus salins Residus de descontaminació Residus de combustió Llots de depuració Productes caducats i restes de fabricació orgànics Residus animals Residus sanitaris Residus vegetals Plàstics Metalls Productes minerals i ceràmics Envasos industrials Terres contaminades i sediments Varis TOTAL 58.164 1.726 28.458 15.212 63.706 21.113 2.238 187.073 127.540 35.855 9.622 0 27.346 0 0 362 8.563 42.171 1.348 44.058 786.087 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5.017 1.308 6.638 967 14 13.440 34.097 441.022 545.946 1.087.271 412.286 514.237 6.155 552.736 126.442 663.683 391.775 72.574 17.747 690.421 63.181 3.034 35.096 16.179 63.720 34.553 36.335 628.095 673.486 1.123.127 421.908 514.237 33.501 552.736 126.442 664.045 400.338 114.745 19.095 734.479 0,99 0,05 0,55 0,25 1 0,54 0,57 9,86 10,57 17,63 6,62 8,07 0,53 8,68 1,99 10,42 6,28 1,8 0,3 11,53 100 5.583.776 6.369.863 Taula 1.- Classificació dels residus produïts a Catalunya l’any 2005. Dades oficials de l’Agència de Residus de Catalunya Amb la reutilització d’aquests productes de rebuig no només s’evita la possible contaminació que puguin produir, sinó que també es poden obtenir productes amb valor afegit i amb interès biotecnològic com poden ser els tensoactius (Haba E, Espuny MJ et al. 2000), polihidroxialcanoats (Füchtenbusch B., Wullbrandt D. et al. 2000) i lipases (Haba E, Espuny MJ et al. 2000). Per altre banda, es redueixen els costos del tractament d’aquests productes com a residus. Els residus oliosos presenten una gran diversitat. Els petrolis i els hidrocarburs són els més preocupants, doncs les fuites d’oleoductes i els accidents marítims ocasionen grans desastres ecològics amb un impacte mediàtic evident. Això ha portat a desenvolupar processos de bioremediació on 6 s’utilitzen organismes vius per eliminar la contaminació i restablir l’equilibri ecològic amb el menor temps possible. 1.2.1. Biotransformacions: definició i característiques. Una biotransformació és la transformació d’un compost químic en un altre utilitzant un biocatalitzador com a mediador d’aquesta conversió. Aquest mediador pot ser un enzim o bé cèl—lules senceres, viables o no (Bains W. 1993). Aquesta conversió pot constar de més d’una etapa, ja que els microorganismes són molt útils per a fer transformacions que impliquin més d’una reacció enzimàtica en seqüència (Demain A. 2000). Donat que els microorganismes poden catalitzar moltes de les reaccions de la química orgànica, la seva aplicació a nivell industrial esdevé molt interessant i fins i tot necessària per a determinades reaccions. Les característiques més interessants de les biotransformacions són tres: la capacitat de dur a terme reaccions que mitjançant la síntesi química són difícils i molt costoses, com pot ser la producció de productes quirals o la hidroxilació de carbonis no actius; la segona és que permeten evitar les condicions extremes (altes temperatures i pressions) i per últim, redueixen notablement els residus generats. D’altra banda, l’estereoespecificitat d’aquestes reaccions permet la producció d’un sol isòmer òptic d’un producte quiral i la regioespecificitat permet la modificació parcial de molècules grans (Bains W. 1993). Així doncs aquestes dues característiques són molt importants ja que permeten, mitjançant l’ús d’enzims o cèl—lules, evitar els passos de bloqueig i desbloqueig típics de la síntesi orgànica enantioselectiva i regioselectiva de compostos (Ishige T., Honda K. et al. 2005). Tot i què la tendència actual és la d’obtenir biocatalitzadors actius sobre un ampli rang de substrats (Faber K. and Kroutil W. 2005). Malgrat que les bioconversions amb cèl—lules senceres són viables, les dificultats en la predicció dels resultats fan que la seva aplicació a la indústria sigui limitada. Els problemes de permeabilitat de substrats a través de membranes, l’acumulació de productes secundaris i les reaccions paral—leles que poden alterar els productes (Ishige T., Honda K. et al. 2005) o les dificultats en la recuperació i purificació del producte, fan més recomanable 7 treballar amb enzims purificats. Amb aquests, tot i què necessitin condicions de treball més restringides (pH ajustat, presència de cofactors...), les reaccions són més selectives i permeten treballar a concentracions més elevades i/o amb solvents orgànics. Així doncs, i degut als nous avenços de la biotecnologia, el camp de les biotransformacions es troba en una fase de canvi i evolució constant que permet la millora i el desenvolupament de nous sistemes de biocatàlisi (Turner N. and Schneider M. 2000). 1.2.2. Biotransformacions microbianes La diversitat de reaccions que poden dur a terme els microorganismes és molt àmplia i fins i tot poden transformar productes xenobiòtics. Els enzims i les reaccions que aquests podrien catalitzar amb més importància industrial segons el Consorci Suís de Biocatalysi Industrial són, principalment, oxidoreductases i es mostren en la Taula 2 (Leresche J E 2006). Deshidrogenases Deshidrogenases NADH-dependents per a reduccions asimètriques de cetones, cetoàcids i olefins. Oxidacions d’alcohols amb deshidrogenases Oxigenases Monohidroxilacions, especialment hidroxilacions de centres no activats i de substrats no naturals. Millora de la robustesa i fiabilitat del sistema P-450 in vitro o desenvolupament de sistemes alternatius. Peroxidases Transformacions de ribonucleòtids, epoxidacions estereoespecífiques i oxidacions de cetones a èsters i lactones. Liases Formació d’enllaços C-C usant aldolases i hidroxinitril liases, Formació d’enllaços C-N (aminoliases) i C-O (hidratases) Taula 2: Enzims amb més interès industrial i reaccions que poden catalitzar (Leresche J E 2006). Hi ha, però, altres enzims d’importància industrial com són les transferases, les hidrolases o les isomerases. Les transferases catalitzen la transferència d’un grup funcional (acils o fosfats) d’una molècula a una altra. Un exemple n’és l’aminotransferasa present en Vibrio fluvialis (Shin J. and Kim B. 2001). Les hidrolases, com les cel—lulases o lipases, catalitzen reaccions 8 d’hidròlisi (Grogan G., Rippé C. et al. 1997) i les isomerases catalitzen reaccions de isomerització com ara la racemització d’aminoàcids (Kato D. and Mitshuda S. 2003). Quan s’observa l’evolució de les publicacions científiques que fan referència a les biotransformacions en general i a les biotransformacions bacterianes en concret (Figura 1), s’observa un clar increment en l’estudi i posterior aplicacions de les biotransformacions microbianes durant els últims deu anys. Nº de publicacions referents a les biotransformacions vs any de publicació 1800 1600 N d p b a io s º e u lic c n 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 1955 1965 1975 1985 Any de publicació 1995 2005 20 10 0 80 70 60 50 40 30 Biotransformation Microbial biotransformation Figura 1.- Gràfic que il—lustra l’evolució en quan a nombre de publicacions científiques referides a les biotransformacions (font: SciFinder Scholar). Així doncs, la necessitat de millorar els enzims ja coneguts i de trobarne de nous es fa evident si es vol treballar amb tecnologies sostenibles (química verda). Les estratègies que s’estan utilitzant actualment per a trobar nous enzims són dues; la metagenòmica (Steele HL 2009) i l’estudi de nous hàbitats d’on poder aïllar i cultivar nous microorganismes (Teske AP 2005). La metagenòmica, la ciència que es proposa investigar el genoma de comunitats senceres de microorganismes més que no pas la d’espècies individuals, neix de la necessitat d’estudiar els organismes procariotes que no són cultivables o que simplement no creixen en els medis actuals (els microbiòlegs parlen d’un 99 % d’espècies bacterianes no cultivades) (Cowan D 2005). La gran diversitat genètica que representa aquest 99 % és accessible ara, gràcies a la metagenòmica i a les diverses tècniques de rastreig basades en els xips de DNA i desenvolupades durant els últims quinze anys (Ferrer M 2007). Mentre que l’aproximació metagenòmica serveix per a trobar nous 9 enzims, l’evolució dirigida és una altra aproximació per assolir els mateixos objectius. Aquesta estratègia parteix d’un enzim conegut i, a través de repetits cicles de petites variacions i seleccions, s’obté un enzim amb una millora en les funcions desitjades. L’evolució dirigida combina diferents tècniques d'enginyeria genètica per obtenir diversitat genètica, un cribatge d’alt rendiment i avançats mètodes d'anàlisi i de càlcul. En contrast amb la millora enzimàtica clàssica que és lineal, l’evolució dirigida és un procés ramificat que permet l’obtenció ràpida de nous variants de l’enzim escollit (Leresche J E 2006). La varietat de compostos químics presents en la natura és molt àmplia, és per això que la variabilitat de biotransformacions i d’enzims que les catalitzen també ho és. Aquesta memòria es basa en un sol tipus de biotransformació, la hidroxilació, on un enllaç C-H es modifica per a obtenir, finalment, un enllaç C-OH. Aquesta activitat enzimàtica és una de les més esteses i es produeix en totes les formes de vida, des dels bacteris fins als humans. La reacció d’hidroxilació és una part clau en el metabolisme oxidatiu de molts compostos orgànics i ja fa molt temps que s’utilitza, tant en la producció industrial de productes de química fina com en processos de bioremediació. Malgrat la seva ubiqüitat, les reaccions d’hidroxilació han estat de les menys enteses entre les reaccions enzimàtiques, ja que la major part dels enzims hidroxilasa formen part de complexes proteics associats a membranes, això en dificulta l’aïllament i, sovint, un cop es té la proteïna aïllada, aquesta és inestable (Holland HL 2000). Per tal de mostrar la varietat de substrats i de catalitzadors que poden ser usats en els processos d’hidroxilació, en la figura 2 es mostren alguns dels exemples més coneguts d’aquest tipus de biotransformacions: 10 Figura 2.- Diversitat d’hidroxilacions enzimàtiques (Holand HL et al, 2000) . En la figura 2(a) es mostra la conversió de l’indà (Benzocyclopentane) amb un substituent en posició 2 a un sol diastereòmer d’alcohol benzílic, aquesta reacció és catalitzada per la toluè dioxigenasa present en Pseudomonas putida UV4 (Bowers NI 1999). En la figura 2(b) es pot veure la conversió d’àcids grassos de cadena llarga a (R)-2-hidroperoxiacids amb alts nivells d’estereoselectivitat amb un preparat enzimàtic cru de l’alga verda Ulva pertusa usant oxigen molecular com a oxidant (Akakabe Y 1999). La figura 2(c) mostra com l’enzim cloroperoxidasa del fong marí Caldariomyces fumago usa peròxid d’hidrogen per catalitzar l’oxidació propargílica (referent al grup funcional alquil anomenat propargil i amb l’estructura HC≡C−CH2−) estereoselectiva d’acetilens donant (R)-alcohols de moderada a alta puresa enantiomèrica (Hu S. 1999), i en la figura 2(d) s’esquematitza la hidroxilació del C2 de fenols halogenats per Rhodococcus opacus, tot i ser inusual en aquest tipus de productes, es pot donar per halogenació oxidativa sobre C2 (Bondar VS 1999). 1.2.3. Biotransformació de lípids per microorganismes Generalment, en les biotransformacions d’interès industrial, els substrats ideals són aquells barats i renovables dels quals se’n puguin obtenir productes 11 amb un valor afegit. Els factors que condicionen l’èxit de l’aplicació d’una biotransformació a nivell industrial són (Kelly DR 2000): -Viabilitat econòmica de l’enzim o el microorganisme catalitzador de la biotransformació. -Viabilitat d’escalat. -Competitivitat amb els mètodes ja establerts (mètodes químics), -Temps requerit per al procés. -Tractament dels residus i disponibilitat del solvent. -Aprovació legal del procés i del producte. -Percepció i acceptació del consumidor. Els olis vegetals en són un clar exemple ja que presenten aquestes característiques i, a més, els productes que s’obtenen de la seva biotransformació, són aplicables a una gran diversitat d’indústries (Kuo T. and Kaneshiro T. 2002). La composició majoritària dels olis vegetals està formada per quatre àcids grassos: àcid palmític (C16:0), àcid oleic (C18:1∆9), àcid linoleic (C18:2ω6,9) i àcid linolènic (C18:3ω3,6,9), tot i que hi ha més de 200 àcids grassos vegetals descrits (Schultz DJ. and Ohlrogge JB. 2002). La millora en la reactivitat i funcionalitat dels productes de la biotransformació és l’objectiu desitjat. Així doncs es buscarà l’obtenció d’àcids grassos monohidroxilats, dihidroxilats, trihidroxilats, esfingolípids, amides grasses, polièsters, lactones entre d’altres. (Kuo T. and Kaneshiro T. 2002). Les biotransformacions (oxidacions) que es poden donar sobre els àcids grassos poden ser en diferents posicions de la cadena, terminal, subterminal o central (Callaghan AV, Gieg LM et al. 2006). Les dues primeres estan involucrades en les rutes de biosíntesi i biodegradació dels propis àcids grassos, d’alcans i d’hidrocarburs, com ara en la posició 2, la α-hidroxilació de Arthrobacter simplex a l’àcid palmític, generant α-hidroxipalmític (Ikuya Y, Yoshiyaa F et al. 1971), la β-hidroxilació present en els polihidroxialcanoats que sintetitzen una gran varietat de microorganismes (Anderson AJ and Dawes EA 1990), o bé la ω-hidroxilasa de Pseudomonas oleovorans que actua sobre els àcids grassos saturats de 8, 10, 12, 14 i 18 àtoms de C (Kuo T. and Kaneshiro T. 2002). 12 Les reaccions que es donen enmig de la cadena són molt específiques per aquesta zona de la molècula i la disposició d’aquest substrat en el centre actiu de l’enzim que ha de catalitzar la biotransformació, és un pas delicat per a la reacció (Kühn H 2000). Les oxidoreductases catalitzen les que, segurament, són les reaccions més comunes, aquelles on es dóna la transferència d’electrons d’una molècula a una altra. Les lipoxigenases i els citocroms P450 en són els enzims més representatius. Els àcids grassos són força utilitzats com a substrats per a les hidroxilacions per tal d’obtenir derivats hidroxilats que presentin propietats tensioactives, antimicrobianes, o per al seu ús en la producció de lubricants, antibiòtics o fragàncies. S’ha descrit la formació de lactones quirals a partir d’àcid dodecanoic que, mitjançant Mucor sp., és transformat en 11-hidroxi-γdodecalactona (Meyer J and Ladner W 1989). Els àcids grassos insaturats també poden ser hidroxilats, com és el cas de l’àcid oleic que, usant Pseudomonas sp. pot ser transformat en àcid (R,R)-7,10-dihidroxi-8-(E)octadecenoic (Hou CT and Bagby MO 1990) (Knothe G, Bagby MO et al. 1992). El fong Gaeumannomyces graminis pot hidroxilar diversos àcids grassos insaturats en el carboni 8 (Brodowsky ID and Oliw EH 1992). La formació de l’àcid 10-hidroxi-esteàric ha estat descrita a partir de la hidratació de l’àcid oleic en condicions d’anaerobiosi per Pseudomonas sp. Les condicions anaeròbiques fan que l’oxigen del grup alcohol derivi de l’aigua en comptes de l’oxigen molecular (Kuo T. and Kaneshiro T. 2002). Han estat descrites altres biotransformacions com la duta a terme per Bacillus megaterium mitjançant el citocrom P450, sobre l’àcid mirístic i el palmític en posicions ω-1, ω-2 i ω-3 (Holland HL 2000), que actua de forma similar a l’epoxidació de l’àcid palmitoleic per Pseudomonas oleovorans, formant 9,10-epoxipalmitat (Kuo T. and Kaneshiro T. 2002). En el propi grup de treball trobem un clar exemple de biotransformacions de lípids mitjançant microorganismes. La soca Pseudomonas aeruginosa 42A2 excreta al sobrenedant del cultiu l’àcid 10-hidroperòxid-8(E)-octadecenoic i l’àcid 10-hidroxi-8(E)-octadecenoic, compostos derivats de l’àcid oleic. Aquesta mateixa soca està produint l’àcid 7,10-dihidroxi-8(E)-octadecenoic durant la fase logarítmica de creixement i n’atura la producció a l’inici de la fase estacionaria (Guerrero, Casals et al. 1997). La soca Pseudomonas 44T1, aïllada 13 en el mateix grup de treball, produeix, a part de l’àcid dihidroxilat, dos glicolípids (Mercadé, Robert et al. 1988), mentre que una altra soca, la Pseudomonas aeruginosa 47T2, hidroxila l’àcid oleic i l’incorpora, després de petits passos catabòlics, a la ruta de síntesi de ramnolípids (Haba E, Espuny MJ et al. 2000). 1.2.4. Biotransformacions aplicades a la indústria Basant-nos en el mecanisme, la major part dels enzims comercials són hidrolases (incloent proteases, carbohidratases i esterases), mentre que les oxidoreductases en representen una proporció minúscula. Això contrasta amb l'alta incidència d’oxidoreductases a la natura (Burton SG 2003), àmpliament distribuïdes entre microorganismes, plantes i animals. Aquestes catalitzen l'intercanvi d'electrons o equivalents redox entre el donant i el receptor de molècules, en reaccions que impliquen la transferència d'electrons, l’abstracció de protons, l'extracció d'hidrogen, la transferència d'hidrurs, la inserció d'oxigen, o adoptant altres mesures clau (Munro AW., Taylor P. et al. 2000). Són poques les oxidoreductases presents al mercat. L'aplicació d’aquestes pot dividir-se en els camps tècnic-industrial, de síntesi de productes químics especials, al medi ambient, als aliments i als medicaments (Feng X. 2005). Les oxidoreductases que hi ha s’apliquen majoritàriament a la indústria tèxtil i a l’alimentària. Pel que fa a les aplicacions tècnico-industrials, un clar exemple són els avantatges que les oxidoreductases han representat en els sistemes de deslignificació enzimàtica de la pasta de paper tradicionalment basada en compostos químics oxidants basats en el clor o l’oxigen que poden causar seriosos problemes a l’hora d’eliminar-ne els subproductes (Feng X. 2005). La derivatització de carbohidrats com per exemple la D-glucosa que es converteix en 2-keto-D-glucosa usant la glucosa 2-oxidasa i després la keto-glucosa es convertida en D-fructosa per hidrogenació química. Un altre exemple el trobem en l'elaboració de formatge on la lactosa és convertida a àcid lactobiònic, un valuós additiu alimentari, acidulant, quelant, coformulant de drogues, i precursor de polímer, per una carbohidrat-oxidasa (Koka R and et al. 2004). 14 També trobem aplicacions per a la indústria tèxtil (Rodríguez Couto S and TocaHerrera JL 2006) i en la dels detergents (Galante YM and Formantici C 2003). Les aplicacions a la indústria alimentària són moltes, ja que molts substrats de les oxidoreductases són hidrats de carboni, àcids grassos, fenols, tiols i proteïnes continguts en els aliments. La modificació d’aquests pot donar lloc a noves funcionalitats, millores de qualitat, o reducció en el cost de producció (Kirk O, Borchert TV et al. 2002). A més, l’oxigen pot ser perjudicial per a la qualitat de l’aliment o per al seu emmagatzematge, degut a les oxidacions no desitjades que poden modificar les característiques organolèptiques del producte. Així doncs, alguns enzims poden ser utilitzats per a immobilitzar l’oxigen per a un millor emmagatzematge i conservació (Andersson M, Andersson T et al. 2002). Les oxidoreductases tenen molt potencial en aplicacions de protecció de medi ambient, juntament amb les hidrolases, les liases, i les transferases (Gianfreda L, Xu F et al. 1999) (Boyd DR, Sharma ND et al. 2001) (Ahuja SK, Ferreira GM et al. 2004), ja que molts microorganismes poden utilitzar hidrocarburs policíclics aromàtics, compostos clorats, i altres contaminants com a font de carboni, de nitrogen, o d'energia. Les reaccions de degradació catalitzada per aquests enzims inclouen la transferència d'electrons, l'extracció d’hidrogen, i la inserció d’oxigen, que pot induir l'obertura de l'anell, la despolimerització, la mineralització, i altres transformacions. Totes aquestes reacció són de gran interès a l’hora de biodegradar contaminants o en processos de biodetoxificació i biodescontaminació de sòls, aigües i altres ambients (Feng X. 2005). Altres aplicacions que potser no siguin tant evidents però que no per això són menys importants són les d’usar enzims com a biosensors i/o bioreceptors (Feng X. 2005) o les d’aplicar biocatalitzadors en la síntesi orgànica de productes quirals, de molècules d’aplicació mèdica o en la síntesi de polímers. Això és degut a la gran versatilitat, estereoselectivitat, especificitat i a les condicions poc estrictes que demanen les oxidoreductases. El seu potencial d’aplicació en la síntesi asimètrica és molt gran (Boyd DR, Sharma ND et al. 2001) (Van Beilen JB, Duetz WA et al. 2003) (Schoemaker HE, Mink D et al. 2003). 15 1.3. Gènere Pseudomonas El gènere Pseudomonas, proposat l’any 1894 per Migula, pertany a la família de les Pseudomonadaceae que està inclosa en les gammaproteobacteries. Actualment conté 185 espècies i 13 subespècies (Euzéby J.P.) Les Pseudomonas són un grup de bacils gramnegatius rectes o lleugerament corbats, aeròbics i no formadors d’espores. Fan 1.5-5 µm de llarg i 0.5-1 µm d’ample. Posseeixen un metabolisme respiratori amb oxigen com a acceptor final d’electrons, tot i que algunes soques poden créixer sota condicions anaeròbies utilitzant nitrat o arginina com a acceptor final d’electrons. Poden presentar un o més flagels polars que atorguen capacitat de moviment al microorganisme. Els microorganismes aïllats de les mostres clíniques són oxidasa positius (majoritàriament), catalasa positius, creixen en agar Mac Conkey i no fermenten la lactosa. Moltes espècies oxiden la glucosa i converteixen el nitrat a nitrit o a nitrogen gas. És un grup divers pel que fa a la morfologia de la colònia i a la pigmentació. Nutricionalment és un grup versàtil amb capacitat d’usar gran varietat de carbohidrats simples o complexos, alcohols i aminoàcids com a font de carboni. Algunes espècies es poden multiplicar a 4 ºC però la majoria són mesofíliques, amb temperatures òptimes de creixement d’entre 30 i 37 ºC (Kiska D.L. and Gilligan P.H. 2003). Les bactèries integrants del gènere Pseudomonas són ubiqües en la natura. Presenten alta variabilitat d’habilitats metabòliques fet que els permet utilitzar gran diversitat de compostos orgànics i colonitzar gran diversitat d’ambients (Spiers A.J. 2000 ). Són importants com a patògens de plantes i animals. Per tot això, l’ecologia del gènere Pseudomonas ha esdevingut una matèria d’interès remarcable (Yamamoto S. 2000). El criteri classificatori recomanat per a espècies bacterianes és la hibridació DNA-DNA (L. G. WAYNE, D. J. BRENNER et al. 1987), tot i que s’utilitza l’anàlisi de seqüència de l’rRNA 16S com a complement per a l’estimació de distàncies gèniques entre espècies properes (Moore E.R.B. 1996) (Bennasar A. 1998). 16 Pseudomonas aeruginosa presenta un flagel polar; pot produir pigments fluorescents i piocianina. No presenta carotenoids i pot créixer a 41 ºC. És arginina dihidrolasa positiva, oxidasa positiva i denitrificant positiva. És positiva en l’ús de glucosa, 2-ketogluconat, geraniol, L-valina, β-alanina i DL-arginina i és negativa per l’ús de trehalosa i meso-inositol. És productor de pioverdina i piocianina 2003). Es poden observar, principalment, dos tipus de colònies produïdes per aquest microorganisme en medi sòlid comú; una és allargada, suau, amb límits llisos i el centre elevat, i l’altre és petita rugosa i convexa. El material clínic és una bona font per al primer tipus de colònia mentre que el segon tipus sovint és obtingut de fonts ambientals. Un tercer tipus de colònia (mucosa) pot obtenir-se de les vies respiratòries i urinàries (Kiska D.L. and Gilligan P.H. 2003). Es pot aïllar del sòl, de l’aigua i especialment de cultius enriquits per a bacteris desnitrificadors. És un patogen oportunista tant d’animals com de plantes. El percentatge Guanina-Citosina dels seu DNA és del 67.2% i la soca tipus és la ATCC 10145 (NCBI 8296; NCTC 10332) (Euzéby J.P.). i algunes soques poden produir pigment vermell fosc. La temperatura òptima de creixement és 37º C (Kiska D.L. and Gilligan P.H. 17 1.4. Lipoxigenases Les lipoxigenases són una família d’enzims amb activitat dioxigenasa. Són metal—loproteïnes amb ferro, generalment, que no tenen un grup hemo i que oxigenen àcids grassos poliinsaturats amb una o vàries estructures (1Z,4Z)-pentadiè a àcids grassos hidroperoxidats amb grups diè conjugats en conformació cis-trans (Figura 3) com a productes principals (Oliw EH 2002). Figura 3.- Grup 1,4-Z,Z pentadiè sobre el qual reacciona la lipoxigenasa donant com a producte una hidroperoxidació. Són quatre les característiques d’aquests enzims que permeten parlar d’ells com a una família d’enzims: - L’extracció anterofacial de l’hidrogen i l’addició de l’oxigen mostrada en la conversió dels dobles enllaços 1(Z), 4(Z) dels àcids grassos poliinsaturats a 1, 3 (E,Z) - dienil - 5 - hidroperòxid (Kühn H 1986). - La identitat dels alineaments de seqüències per parelles és de 21 27% entre lipoxigenases de plantes i animals, de 43 - 86% entre lipoxigenases de plantes i del 39 - 93% entre lipoxigenases d’animals (Prigge ST 1996). - Els residus que proveeixen els lligands del ferro catalític (Fe2+ - Fe3+) estan altament conservats (Vidal-Mas J 2005). - Diverses lipoxigenases, tant animals com vegetals, presenten similituds importants en l’estructura genòmica (Chen X.S 1994). Tot i que l’estudi de les lipoxigenases es va iniciar a la dècada dels seixanta, no va ser fins l’any 1993 que es va publicar la primera estructura per difracció de raig X d’una lipoxigenasa (Boyington JC., Gaffney BJ. et al. 1993) i el mateix any se’n publicava l’estructura del seu centre catalític (Minor W 1993). Actualment es poden trobar altres estructures de lipoxigenasa tant de 18 l’enzim natiu com de mutacions puntuals d’aquest mateix, com és el cas de la lipoxigenasa de reticulòcit de conill (Choi J. 2008) o la més recent, la lipoxygenassa del corall Plexaura homomolla (Oldham M.L. 2005). Tot i que la bibliografia sobre els diferents rols biològics de les lipoxigenases és abundant (aspecte desenvolupat en apartats posteriors), aquestes funcions estan poc definides. Hi ha documentació relacionada amb l'oxidació, epoxidació, dessulfuració, sulfoxidació, i desalquilació de xenobiòtics per lipoxigenases, però encara són necessaris molts estudis per entendre plenament l'espectre de reaccions catalitzades per les diferents lipoxigenases i les implicacions biològiques de les mateixes (Kulkarni AP 2001). 1.4.1. Classificació i nomenclatura El Comitè de Nomenclatura de la Unió Internacional de Bioquímica i Biologia Molecular va establir com a base per a la classificació de les lipoxigenases la seva especificitat posicional respecte a l’oxigenació de l’àcid araquidònic. Amb aquesta classificació es diferencien quatre famílies: 5-LOX, 8LOX, 12-LOX i 15-LOX (Gaffney BJ 1996) (Brash RA 1999). Aquest sistema però, presenta algunes deficiències que originen controvèrsia en la comunitat científica a mida que es van trobant i descrivint noves lipoxigenases. L’especificitat de posició no és una característica absoluta per a l’enzim ja que paràmetres com l’estructura del substrat, la interacció entre aminoàcids i substrat en el centre actiu, les condicions de reacció o bé les característiques fisicoquímiques del substrat poden afectar a la posició del grup hidroperòxid format. Per altra banda, les subfamílies que es creen a partir d’aquesta classificació ja són prou diverses i cal subclassificar-les per tal d’evitar confusions. Una de les característiques que es pot utilitzar per a classificar les subfamílies és la seva enantioselectivitat. Depenent de la posició relativa que ocupen l’hidrogen que s’elimina i l’oxigen que s’addiciona respecte al pla del doble enllaç entre carbonis, les lipoxigenases es poden subclassificar com a R o S (Kühn H 2000). En el regne animal, l’àcid gras polinsaturat amb més importància fisiològica és l’àcid araquidònic (C20:4 insaturacions), però en plantes són l’àcid 19 linoleic i l’àcid linolenic els àcids grassos polinsaturats més comuns (18 carbonis amb 2 i 3 insaturacions respectivament). Per aquest motiu, la classificació de les lipoxigenases vegetals es basa en l’especificitat posicional respecte l’àcid linoleic, que és oxigenat en el carboni 9 (9-LOX), o bé en el carboni 13 (13LOX) (Gaffney BJ 1996) (Brash RA 1999). Per altra banda, existeix una classificació específica per a les lipoxigenases vegetals basada en la similitud de seqüència i la presència de pèptids senyals en l’extrem N-terminal. En base a això, s’estableixen dos grups de lipoxigenases, les LOX tipus-1, que no tenen pèptid senyal i presenten elevada similitud de seqüència entre elles (més del 75%), i les LOX tipus-2, amb pèptid senyal a l’extrem N-terminal que els permet travessar la membrana dels cloroplasts, i una baixa similitud de seqüència entre elles (aproximadament d’un 35%) (Feussner I and Wasternack C 2002). 1.4.2. Funció biològica Tot i què aquest aspecte de les lipoxigenases encara és objecte de discussió, s’han descrit diverses funcions biològiques per aquesta família d’enzims en funció de l’especificitat, la localització o l’organisme que la contingui. I.- Formació de mediadors biològics o de senyals moleculars. Generalment es caracteritza per la síntesi d’un hidroperòxid específic a partir d’un àcid gras lliure. El producte de la lipoxigenassa pot actuar tant com a intermediari o com a producte final d’una via metabòlica. Alguns exemples on actua com a intermediari en una via metabòlica són: en plantes, la biosíntesi de l’àcid jasmònic o d’aldehids per a la senyalització (Grechkin A 1998) (Turner J.G. 2002), i en animals en la síntesi de leucotriens o lipoxines (Serhan CN 1997). En humans, l’activació de la 5-lipoxigenasa dels leucòcits produeix leucotriens i lípids conjugats de pèptids i dihidroxieicosanoids responsables dels processos de inflamació i broncoconstricció. Els medicaments actuals per a l'asma inclouen els inhibidors de la 5-lipoxigenasa i els antagonistes dels receptors de leucotriens (Drazen JM 1999). La síntesi d’aquests productes és la funció més ben establerta per a les lipoxigenases (Brash RA 1999). 20 Un exemple on els productes de la lipoxigenasa actuen com a producte final és la síntesi de 12-HETE (àcid hidroxieicosatetraeonic) per part de la 12Slipoxigenasa de plaqueta humana. Són moltes les activitats biològiques com a molècules de senyalització discreta que s’atribueixen a HETEs i a HEPTEs (àcid hidroperoxieicosatetraeonic). El producte final pot provocar accions ràpides i potents o bé funcionar com a senyalitzador d’accions lentes. Alguns exemples d’accions ràpides i potents que es donen als receptors o canals de les superfícies cel—lulars són els següents: El 12-HETE i els seus derivats intervenen en la modulació de la neurotransmissió (Piomelli D 1987 ). S’han descrit potents efectes del 12S-HETE en l'adhesió cel—lular, activitat vinculada a la metàstasi del carcinoma de pròstata (Tang DG 1994). També s’ha descrit la influència sobre els fluxos dels ions de calci a través de membrana (Dho S. 1990). Per altra banda, si bé la 12-lipoxigenasa de les plaquetes pot estar produint productes durant hores, les cicloxigenases d’aquestes mateixes cèl—lules generen ràfegues curtes de productes i després s’inactiven. Així doncs, els 12-HETE poden modular processos a llarg termini com efectes sobre la diferenciació cel—lular o la supervivència (Tang D.G. 1996) en lloc de respostes ràpides, com l'agregació plaquetària (Sekhar Rao K.C. and Krishnakantha T.P. 2002). En el cas de les lipoxigenases amb localització nuclear, diversos autors suggereixen que tant la proteïna com el producte de transformació d’aquesta, juguen un paper important en la regulació de l’expressió gènica (Radmark O. 2002) (Brash RA 1999). II.Modificació d’estructures de membrana (reaccions de peroxidació). Normalment aquesta funció s'associa amb el metabolisme de substrats esterificats i sovint produeix una barreja de productes hidroperoxidats. La peroxidació dels lípids de membrana catalitzada per les lipoxigenases indueix canvis estructurals. L'objectiu és induir canvis físics en la cèl—lula o canviar la composició de peròxids de la mateixa. L’estructura d’aquest hidroperòxid no és tan important com els seus efectes. provocant pertorbació en l'estructura de la membrana i provocant oxigenacions secundàries. La 21 hipòtesi de que una lipoxigenasa podria peroxidar lípids de la membrana i tenir un paper important en la maduració de glòbuls vermells induint una sèrie de canvis estructurals programats en la cèl—lula, fou desenvolupada sobre la 15lipoxigenasa dels reticulòcits de mamífers (Schewe T. 1986) (Rapoport SM 1986 ). Podem trobar, en la bibliografia, conceptes similars per a lipoxigenases de plantes intervenint en processos de senescència (Hung K.T. 1997 ). Per tal de determinar la funció de les lipoxigenases s’han realitzat mutants negatius pel gen de la lipoxigenasa en ratolins (Funk C.D. 1996) i en plantes (Narvel J.M. 1998), però els canvis observats són subtils i no s’observen problemes evidents. Per evidenciar aquests canvis cal treballar sota condicions d’estrès fisiològic o patològic (Brash RA 1999). Paral—lelament a les funcions descrites anteriorment, hi ha una qüestió que no és gens clara. La mescla de productes originats per les lipoxigenases són fruit d’una catàlisi imperfecta, o bé es busca promoure l’alliberament lliure de radicals lliures intermediaris? Les 15-lipoxigenasa de reticulòcit catalitzen la peroxidació lipídica, aquest tipus d’activitat de les lipoxigenases dura un o dos minuts i després s’inactiva l’enzim. Per contra, les lipoxigenases que catalitzen la formació neta d'un sol producte poden funcionar amb una taxa lineal durant una hora o més (Brash RA 1999). Una altre de les funcions descrites en plantes és la de la mobilització de lípids per al metabolisme. L’oxigenació d’àcids grassos insaturats esterificats en triglicèrids per part de les lipoxigenases, està implicat en el procés de germinació de plantes oleaginoses (Feussner I. 2001). Tot i que no s’ha trobat una funció equivalent en animals, el cas de les plantes podria servir com a model per tal d’explicar l’alt contingut de lipoxigenases en alguns ovòcits amb futures implicacions en el desenvolupament dels mateixos (Coffa G. 2000). III.- Biotransformació d’endobiòtics i xenobiòtics. La majoria de les reaccions metabòliques disminueixen a mesura que augmenta la toxicitat de productes a transformar. Les biotransformacions representen un element clau a l’hora d’entendre l’eficàcia farmacològica dels medicaments i/o la toxicitat de pesticides, de productes químics industrials o ambientals i de substàncies tòxiques d’origen natural. Tot i què estan descrits 22 els rols desenvolupats pel citocrom P450 de mitocondris i la prostaglandina sintassa en l’oxigenació d’endobiòtics i xenobiòtics, durant els últims anys s’han establert les lipoxigenases com un altre dels principals enzims responsables de l'oxidació de xenobiòtics (Kulkarni AP 2001). S’han descrit quatre mecanismes per a l’oxidació de xenobiòtics mediada per lipoxigenases: la reacció dependent d’hidroperòxid (Hover C.G. 2000), la reacció dependent de radicals peroxils (Naidu A.K. 1991), la reacció dependent de transferència d’electrons (Hu J. 2000) i la reacció d’oxidació directa (Novak M.J. 1999). Malgrat què per a organismes procariotes no s’han descrit clarament les funcions biològiques de les lipoxigenases, alguns autors suggereixen que, en el cas de les lipoxigenases de microorganismes patògens, aquest enzim modula la defensa de l’hoste i la inflamació a través de l’alteració dels mediadors químics locals en animals (Vance R.E 2004) o, en el cas de les plantes, induir una resposta primerenca a la infecció d’un organisme patogen (Oliw EH 2002). D’altra banda, i coneixent les propietats tensioactives dels productes de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa, es podria pensar en una funció d’augmentar la biodisponibilitat de compostos lipòfils per al seu ús com a font de carboni i d’energia per part del microorganisme (Guerrero, Casals et al. 1997). 1.4.3. Mecanisme d’acció El mecanisme d’acció molecular de les lipoxigenases en basa en tres passos consecutius representats en la figura 4. El primer pas consisteix en l’extracció estereoselectiva d’un hidrogen del grup 1,4-cis,cis-pentadiè per a formar un radical pentadienil. El segon pas és aquell on es produeix una redistribució dels electrons en una posició +2 (en direcció al metil-terminal), o bé -2 (en direcció al carboxil terminal) acompanyada de conjugació del grup diè en cis-trans. El tercer i últim pas és el de la inserció de l’oxigen molecular de forma estereoespecífica (S- o R-) i la conseqüent reducció del radical hidroperòxid (Prigge S., J. Boyington et al. 1997). 23 Inserció de l’oxigen molecular en posició 13 (+2) Inserció de l’oxigen molecular en posició 9 (-2) Abstracció d’hidrogen Reordenació del radical Inserció de l’oxigen molecular Figura 4.- Mecanisme de la reacció i regio-especificitat de la lipoxigenasa. Adaptació de Andreou (Andreou A. and Feussner I. 2009). Durant la catàlisi hi ha una activació del substrat mitjançant una pèrdua d’un protó i una inserció de la molècula d’oxigen. Aquest procés d’oxidoreducció s’ajuda de l’ió de Fe3+ activat coordinat en l’enzim per a abstreure l’àtom d’hidrogen que passa a Fe2+ (inactiu). La inserció de l’oxigen fa que es formi un radical C-OO-, que serà el compost que regenerarà el Fe2+ el qual tornarà a passar a la forma de Fe3+, la forma activa. Aquest mecanisme d’auto regeneració de la forma activa de l’àtom de Ferro de la lipoxigenasa es mostra en la figura 5. Catàlisi de la lipoxigenasa Figura 5.- Catàlisi de la lipoxigenasa. Adaptació de Brash (Brash RA 1999). S’han proposat dos mecanismes generals d’interacció del ferro amb el substrat (Prigge S., J. Boyington et al. 1997) (Figura 6). Tots dos mecanismes s’inicien amb la forma activa de la lipoxigenasa, Fe3+. L’activació es dóna per oxidació del Fe2+ a Fe3+ per producte, generant un radical lliure d’una molècula del producte (Corey EJ. and Nagata R. 1987). 24 En el mecanisme que es mostra en la figura 6 (via superior), el Fe3+ oxida el grup 1,4-pentadiè per formar un radical pentadienil. La reacció amb l'oxigen molecular produeix un radical peroxil que reoxida el Fe2+ i forma el producte hidroperoxidat. En el segon mecanisme (figura 6, via inferior) el Fe3+ ajuda a la desprotonació del diè fent un enllaç directe amb el carbanions resultant. La reacció continua amb la inserció de dioxigen a l'enllaç Fe-C seguida per la ruptura de l'enllaç Fe-O. Aquest mecanisme és interessant ja que permet explicar d'una manera natural la regioespecificitat i la estereoespecificitat de l'enzim. En ambdós casos, els dos mecanismos són similars. L’abstracció de l'hidrogen es produeix per la transferència de protons a un grup de base no mostrat en la figura 6, gràcies a la proximitat del Fe3+, ja sigui mitjançant la formació d'un enllaç sigma ferro-carboni o a través de la transferència d'un electró al ferro (resultant en un radical lliure intermediari). O2 H+ - H+ - H+ Fe+3 Fe+3 H+ O2 Figura 6.- Esquema dels dos mecanismes d’interacció Ferro-Substrat proposats per Pridge i Nagata . 1.4.4. 1.4.4.1. Mètodes d’estudi: EPR i Difracció de raig X EPR (Ressonància Paramagnètica Electrònica) A partir de l’anàlisi dels diferents tippus d’espectres d’absorció molecular, podem obtenir coneixament de les estructures moleculars. 25 La tècnica anomenada Ressonància Paramagnètica Electrònica (EPR), sovint anomenada ressonància d'espín d'electrons (ESR), és una branca de l'espectroscòpia. Les transicions d’EPR sorgeixen de la interacció de la radiació electromagnètica amb els moments magnètics d’espin dels electrons no aparellats. Quan un camp magnètic extern s'aplica a una mostra, els nivells d'energia degenerada dels espins es separen. La ressonància paramagnètica electrònica serveix per a l'estudi de les transicions entre aquests estats energètics. Els espectres s'obtenen mesurant l'atenuació de la radiació electromagnètica en passar a través de la mostra i ser absorbida per aquesta. Un experiment d’EPR es porta a terme mitjançant l'aplicació d'una camp magnètic extern (Bo) variable i la radiació electromagnètica (hv) amb una freqüència fixa en el rang de les microones (GHz), que és responsable de les transicions d'un estat de l'electró a un altre. Aquesta energia és absorbida per la mostra (que conté electrons no aparellats) quan el camp magnètic separa els nivells d'energia amb una quantitat d’energia apropiada. La banda obtinguda en un espectre representa la transició entre els nivells d'energia de l'espècie absorbent de la mostra. El camp magnètic de cada banda està relacionat amb la separació d'energia entre els dos nivells. És possible calcular un diagrama de nivells d'energia per a l’espectre i predir la intensitat de varies transicions en el rang de freqüència i camp magnètic de l'experiment. La teoria bàsica d'aquest fenomen s'explica a continuació: Un sol electró té dos estats d’espin amb números quàntics ms ± ½. Les energies d'aquests estats d’espin en un camp magnètic estan donades per l'equació 1. L'energia d'aquesta transició donada per l'equació 1 és l'energia de Zeeman. Εms = gµBBoms (Eq. 1) 26 Aquí, Bo, és la intensitat del camp magnètic extern, amb la unitat del sistema internacional tesla (T) o gauss (1 G = 0,0001 T), ms és una projecció de l’espin en el camp (ms = ± 1 / 2 per un electró lliure) i µB és el magnetó de Bohr ( B = |eh / 4πme|= 9.2740 x 10-24 J/T, on e i me són la càrrega de l’electró i la massa, respectivament, i h, la constant de Planck). El paràmetre g, la relació entre Bo i Ems, que per electrons lliures (ge) té el valor de 2,0023193. Quan hi ha altres interaccions dels electrons, el g-valors efectiu (geff) serà diferent. geff = (0.07144775 x frequencia (MHz)) / Camp magnètic (mT) Per a la majoria dels radicals orgànics i ions radicals, els valors de geff són propers a 2, però per als metalls de transició el càlcul d’aquest valor és més complicat ja que depenen dels camps elèctrics circumdants dels lligands. Si la mostra d'interès conté més d'un electró desacoblat, cal considerar la interacció d'aquests electrons. Aquesta interacció es reflecteix en la incorporació d'un segon factor (S • E • S) a la fórmula descrita anteriorment per a l’espín hamiltonià de la següent manera: Hs = βB · g · S + S · D · S (Eq. 2) El Fe3+ d’alt spín té la configuració de 3d5 amb S = 5/2. L'equació 2 descriu aquest espín hamiltonià de primer ordre. Pel que fa l'estudi del ferro de la lipoxigenasa i les histidines que actúen com a lligands, és important emfatitzar dos aspectes que afecten a aquesta equació. La primera és que el paràmetre D dóna informació sobre com de covalents són les interaccions entre el Fe3+ i els lligands. En altres paraules, aquest paràmetre mostra com n’és d’important la influència d'aquests lligands sobre els electrons del ferro. El paràmetre D i la relació E / D, defineix l'energia i la simetria del compost. La variació en aquesta relació canvia les energies i les probabilitats de cada transició i la forma dels espectres (Figura 7). 27 A la figura 7 es pot observar l'efecte de la relació E / D en la forma dels espectres. El rang de camp magnètic que es mostra és normal per a la majoria d’espectròmetres d’EPR que operen a 9 ± 0,4 GHz. Figura 7.- Espectres obtinguts per simulació amb el programa XSophe, comercialitzat per Bruker i desenvolupat per GR Hanson i companys de treball, per Fe3+ per S = 5/2 a 3,5 K i en diferents E/D. L'orientació de la molècula en l'espai es descriu per tres eixos, x, y i z. Una mostra congelada té totes les direccions possibles de x, y i z i els espectres que s’obtenen amb EPR són la suma dels espectres de totes les orientacions moleculars. Per a E/D igual a zero, podem observar un pic predominant ja que sota aquesta condició l'espín de l'electró està dominat per l'eix z, i els eixos x i y són iguals. Això s'anomena simetria axial a diferència de la simetria ròmbica (quan tots els eixos són diferents). Quan y i x no són iguals, es pot observar un pic per a cada eix i, com que el valor d'E/D augmenta, els pics es troben més separats. El valor màxim d'E/D és 1/3, i el pic que és dominant correspon a les transicions d'energia de nivell mitjà i totes les direccions molecular (eixos z, x, y) absorbeixen a la mateixa freqüència. 28 Figure 8.- Diagrama de nivells d’energia per al Fe3+ S=5/2 I espectre amb variacions del valor de D. Com que paràmetre D és una empremta única per a cada molècula, és interessant veure com afecta aquesta variació a l’espectre. Com es pot observar en l'espectre de la figura 8, la reducció del valor de D resulta en una major separació dels pics corresponents als eixos y i x i un canvi en la posició cap als camps magnètics més alts. Finalment, apareixen nous pics corresponents a transicions secundaries. Això és degut a que a valors de D menors, la separació dels estats dins de cada nivell d'energia es redueix i, per una mateixa freqüència, la transició tindrà lloc en un camp magnètic superior. Com es pot veure en l'esquema de la figura 8, la fletxa que representa la transició a una freqüència específica és sempre igual, però el camp magnètic en què s'observa la transició canvia. 29 Com que els experiments d’EPR en ions metàl.lics necessiten temperatures baixes, és interessant veure com afecta aquest paràmetre en l'espectre. La temperatura és inversament proporcional a la intensitat del senyal: a temperatures més baixes, la intensitat és més alta (Figura 9). Com es pot veure a la figura 9, la intensitat del senyal (fletxes) disminueix a mesura que augmenta la temperatura. Figure 9.- Espectre obtingut per simulació amb el programa XSophe, comercialitzat per Bruker i desenvolupat per GR Hanson i companys de treball, per Fe3+ amb S = 5/2 i E/D 0.065 a diferents temperatures. Això és interessant perquè a temperatures més altes és possible observar transicions d'ambdós nivells d’energia, mitjà i baix. En el cas de Fe3+ presents a la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa a 3,5 K, s’observa un pic a 114 mT de camp magnètic corresponent a la transició del nivell mitjà de l'energia. Les transicions en els nivells més baixos cobreixen un ampli rang començant amb un màxim de 91 mT. Les diferències de les senyals obtingudes a 3,5 K i 0,01 K ressalten clarament el pic corresponent a la transició mitjana, 30 com es pot veure a la figura 10, ja que a temperaturas baixes, els nivells d'energia mitjana es despoblen. Figure 10.- Substarcció del senyal obtingut a 0.01 K al senyal obtingut a 3.5 K per a remarcar la presència de les transicions a nivells d’energia intermitjos. 1.4.4.2. Difracció de raig X L’any 1912, Von Laue, Friedrich i Knipping, descobreixen la difracció de raigs X dels cristalls demostrant la naturalesa ondulatòria d’aquests raigs. W. L. Bragg va ser el primer en utilitzar aquesta tècnica per resoldre la primera estructura cristal—lina. Bragg va demostrar amb els seus estudis, que la distribució angular de la radiació dispersada es podia entendre considerant que els raigs difractats es comportaven com si fossin reflectits per plans, passant per punts de la xarxa cristal—lina (Figura 11). L’angle d’incidència de la radiació és igual a l’angle de reflexió d’on es deriva la llei de Bragg: n λ = 2 dhkl sin θhkl on n = ordre de difracció, λ = longitud d’ona de la radiació incident, dhkl = espaiat entre plans de difracció i θhkl = angle d’incidència de la radiació. 31 Figure 11.- Llei de Bragg. Difracció d’una família de plans amb índex de Miller hkl i espai inerplanar dhkl. Ko és la direcció de l’ona incident i K és la direcció difractada (Mc Pherson A. 2003). Per tal d’obtenir i estudiar detalladament l’estructura d’una proteïna és necessari utilitzar una radiació de longitud d’ona comparable o més petita que les dimensions dels àtoms. Aquesta radiació són els raigs X, d’una longitud d’ona entre 0.1 i 100 Å, que poden ser difractats pels electrons. Quan els raigs X xoquen amb un àtom, el camp elèctric de la radiació posa els electrons de l’àtom en oscil—lació amb el seu nucli. Aquesta oscil—lació té la mateixa freqüència que la radiació incident i, quan aquesta és dispersada pels electrons, hi ha un desfasament de 180º a la radiació. Aquest desfasament és el mateix per a tots els àtoms del cristall. Així doncs quan es fa incidir una radiació monocromàtica de raigs X sobre un cristall únic, la difracció observada serà només a uns angles d’incidència concrets. La xarxa on s’obtenen les reflexions s’anomena reticle recíproc. Cada punt del reticle recíproc o intensitat de difracció ve d’un pla de difracció específic amb uns únics índexs de Miller (hkl). Per entendre millor la relació entre la llei de Bragg i el cristall físic, Ewald, l’any 1921, va desenvolupar la construcció coneguda com l’esfera d’Ewald que permet saber quines reflexions de Bragg s’observaran coneixent l’orientació del cristall respecte el raig incident. Si durant aquesta rotació un punt del reticle recíproc toca la circumferència de l’esfera d’Ewald, es satisfà la llei de Bragg. Les ones de la radiació interfereixen de manera constructiva quan la llei de Bragg es compleix, detectant així una intensitat de radiació. Les diferents intensitats de les reflexions s’expliquen amb l’estructura atòmica de la proteïna. El patró de 32 difracció és la transformada de Fourier del cristall, expressió matemàtica que relaciona les ones difractades amb la distribució dels àtoms en el cristall. Tot cristall presenta un ordre en les tres dimensions que el defineixen. Aquest ordre està definit per la simetria que conforma el cristall que es forma a partir d’una unitat asimètrica (conjunt d’àtoms de la molècula a estudiar a partir dels quals es pot construir tot el cristall aplicant les operacions de simetria) que, aplicant-hi una simetria donada pel grup espacial, conforma la cel—la unitat, el paral—lelepípede més petit que defineix els paràmetres de la cel—la: a, b i c (eixos) i α, β i γ (angles). Els espaiats entre les reflexions, el patró de difracció, indiquen el tipus de cel—la que es té i les dimensions d’aquesta. Per tant, la distribució de les reflexions i les seves intensitats donen tota la informació que es necessita del cristall. 1.4.5. Estructura Tot i que fa més de 60 anys que s’estan estudiant les lipoxigenases, no va ser fins l’any 1993 que es va cristal—litzar i difractar la primera lipoxigenasa (Boyington JC., Gaffney BJ. et al. 1993), la “arachidonic acid 15-lipoxygenase” de soja. Posteriorment, a l’any 1996, es va refinar l’estructura fins a 1.4 Ǻ (Minor W. 1996). Més recentment s’han anat cristal—litzant altres lipoxigenases de soja, com la 3-lipoxigenasa, i diversos complexes. L’any 1997 es publica l’estructura cristal—lina de la primera lipoxigenasa animal, la de reticulòcit de conill, que és una 15-lipoxigenasa (Gillmor SA., Villasenor A. et al. 1997). L’última lipoxigenasa cristal—litzada és la del corall Plexaura homomolla l’any 2005 (Oldham M.L. 2005). Les lipoxigenases presenten una sola cadena polipeptídica (són monomèriques) amb una massa molecular d’aproximadament 75-80 kDa per a les animals, entre 660 i 680 aminoàcids (Funk C.D. 1996), i de 94-104 kDa per a les vegetals (Brash RA 1999), entre 839 i 923 aminoàcids (Shibata D. and Axelrod B. 1995). Les lipoxigenases tant d’origen animal com vegetal descrites fins avui, presenten dos dominis. El domini N-terminal és el més petit i consta de 8 fulles β disposades de forma antiparal—lela. Aquest domini es coneix com a domini 33 PLAT (polycystin-1, lipoxygenase i alpha-toxin) o LH2 (Lipoxygenase homology). En les lipoxigenases d’origen vegetal, aquest domini està format per, aproximadament, els primers 150 residus de la banda aminoterminal de la cadena polipeptídica (Boyington JC 1993) (Figura 12). En el cas de les lipoxigenases d’origen animal, aquest domini està format per uns 115 residus (Oldham M.L. 2005) (Figura 13). La funció d’aquest domini és desconeguda, però alguns autors han proposat funcions relacionades amb la membrana o amb l’adquisició del substrat (May C. 2000) (Tatulian S.A. 1998). Figura 12.- Estructura de la lipoxigenasa L-1 de soja (Glycine max) obtinguda a 1.4 Ǻ de resolució (codi PDB 1YGE). De color groc el domini N-terminal i en verd el domini catalític carboxi terminal. L’esfera vermella representa l’àtom de ferro coordinat en el centre actiu de la proteïna. Figura 13.- Estructura de la 8R-lipoxigenasa de Plexaura homomolla obtinguda a 3.2 Ǻ de resolució (codi PDB 2FNQ). De color groc el domini N-terminal i en verd el domini catalític carboxi terminal. L’esfera vermella representa l’àtom de ferro coordinat en el centre actiu de la proteïna. 34 L’altre domini és el més gran, és el que presenta l’activitat catalítica de l’enzim i el que conté el centre actiu del mateix. Consisteix en 23 hèlix α i 2 fulles β antiparal—leles en el cas de la lipoxigenasa de soja (Youn B., Sellhorn GE. et al. 2006), la més representativa de les lipoxigenases vegetals, o en 18 hèlix α interrompudes per una fulla β molt petita en el cas de les lipoxigenases d’origen animal (Kuhn H., Saam J. et al. 2005). En el nucli d’aquest domini hi ha dues hèlix llargues (hèlix α 9 i 18 en el cas de la lipoxigenasa de soja) que contenen les histidines que lligaran l’àtom de ferro a la proteïna (veure secció 1.4.5.1.) (Gaffney BJ 1996). 1.4.5.1. Lligands del ferro - Centre actiu El ferro està lligat a la proteïna mitjançant cinc aminoàcids i, en alguns casos, per un grup hidroxil. Per a les lipoxigenases vegetals, els cinc aminoàcids són tres histidines, una asparagina i el grup carboxil de la isoleucina terminal. En el cas de la lipoxigenasa de soja (Glycine max) aquests cinc aminoàcids són les histidines 499 i 504 de la hèlix α 9, la histidina 690 i l’asparagina 694 de la hèlix α 18 i la isoleucina 839 de l’extrem carboxi terminal (Figura 14) (Gaffney BJ 1996). Figura 14.- Esfera de coordinació de l’àtom de ferro de la lipoxigenasa L-1 de soja (Glycine max) obtinguda a 1.4 Ǻ de resolució (codi PDB 1YGE). De color groc el grup hidroxil i en vermell l’àtom de ferro. En taronja l’hèlix 9, en blau l’hèlix 21 i en groc part de la cadena de residus que situa la isoleucina terminal en la posició adequada. 35 En el cas dels mamífers, la lipoxigenasa té el ferro coordinat per quatre histidines i, de nou, per la isoleucina terminal (Andreou A. and Feussner I. 2009). Aquests aminoàcids i el grup hidroxil presenten un arranjament octaèdric formant una bipiràmide inclinada (Brash RA 1999). Per estudiar la segona esfera de coordinació del ferro s’han fet estudis sobre la lipoxigenasa de soja. La segona esfera de coordinació consisteix en dos aminoàcids, la glutamina (Q) 495 i la glutamina (Q) 697, que formen una xarxa d'enllaços d'hidrogen entre la cavitat del substrat i la primera esfera de coordinació (asparagina 694). S’ha vist que mutants de la lipoxigenasa-1 de soja (figura 15) com Q495E, Q495A, Q697N i Q697E afecten l’activitat enzimàtica ja que la xarxa de ponts d’hidrogen es veu modificada afectant la ruptura de l’enllaç C-H (figura 15, b, c, d i e). Una ruptura eficient d’aquest enllaç s’aconsegueix mitjançant la correcta posició del substrat amb interaccions esteàriques amb la cadena lateral de la Gln495 (figura 15, a). La xarxa de ponts d’hidrogen definida per Gln495, Gln697 i Asn694 (figura 15, a) serà la responsable de la reordenació dels ponts d’hidrogen després de la unió del substrat (Tomchick DR, Phan P et al. 2001). El nucli del domini catalític conté dues hèlixs llargues centrals una de les quals adopta una conformació d'hèlix π per a diversos residuos. Aquestes seccions helicoïdals contenen quatre dels cinc lligands de ferro de la lipoxigenasa (His 499, His 504, His 690, His 694). 36 Figura 15: Geometria de la coordinació del Fe+2 de la lipoxigenasa-1 de soja (Sloane D. and Leung R.), lipoxigenasa nativa (a), Q697N (b), Q697E (c), Q495E (d), i Q495A (e). Els enllaços entre el ferro i la primera esfera de coordinació es dibuixen com línies continues, i les interaccions amb hidrogen es dibuixen com línies discontínues. Els àtoms d’oxigen es dibuixen en vermell, els de nitrogen en blau, i els de carboni en groc. L'àtom de ferro és de color cian. Les conformacions alternatives de la His 499 es mostren en color rosa (Tomchick DR, Phan P et al. 2001). 37 1.4.5.2. Cavitat Com que la lipoxigenasa de soja (Glicine max) és la més ben estudiada d’entre totes les lipoxigenases, a l’hora d’introduir l’estudi d’aquesta zona de la proteïna el millor és prendre les cavitats de la lipoxigenassa de soja (Glicine max) com a referència. Aquesta proteïna presenta dues cavitats que varen ser identificades l’any 1993. Totes dues es troben en el domini carboxi terminal, el domini catalític de la proteïna (Boyington JC., Gaffney BJ. et al. 1993). La cavitat I és una invaginació cònica amb una obertura d’uns 10Ǻ a la superfície de la proteïna (Figura 16). Està definida pel grup carbonil de la serina 498 i les cadenes laterals de la treonina 503, la leucina 689 i la valina 693, en aquest punt la invaginació permet la presència d’una molècula d’aigua. Aquesta zona es troba a 8Ǻ de l’àtom de ferro. La part final de la cavitat es trobaria en una línia que acabi a l’àtom de ferro i que talli la línia entre les histidines 499 i 690, a prop de l’esfera de coordinació de l’àtom de ferro (Minor W. 1996). Figura 16.- Estructura de la lipoxigenasa de soja (Glicine max). En taronja, la cavitat I; en groc, el domini N-terminal esquematitzat i en verd el domini Cterminal. En vermell el ferro amb els 5 residus que el coordinen. Els residus que defineixen aquesta cavitat són: Cys357, Val358, Ile359, Arg360, Tyr409, Ile412, Tyr493, Met497, Ser498, Leu501, Asn502, Thr503, 38 Val570, Asn573, Trp574, Val575, Asp578, Gln579, Leu581, Asp584, Lys587, Arg588, Tyr610, Trp684, Leu689 i Val693. Tot i que en l’article de Boyington de l’any 1993 es comenta que la major part dels residus que defineixen la cavitat I són hidrofòbics, és un error creure que aquesta cavitat és hidrofòbica ja que s’hi han trobat molècules d’aigua formant ponts d’hidrogen amb la proteïna (Minor W. 1996). Segons Boyington, les característiques d’aquesta cavitat la fan ideal per a permetre el pas d’oxigen molecular de fora de la proteïna cap a un dels dos llocs de coordinació del ferro desocupats (Boyington JC., Gaffney BJ. et al. 1993). Contràriament a les conclusions de Boyington, segons Minor, el pas d’aquest oxigen molecular necessitaria d’una reordenació substancial de l’estructura de la proteïna ja que no seria suficient una reorientació de la cadena lateral del residu Asn 694 per a facilitar l’accés al ferro. De tot allò exposat anteriorment se’n dedueix que la cavitat I no és la ideal per a permetre el pas de l’oxigen molecular cap al centre actiu. La alternativa més plausible seria la cavitat II, que permet un accés directe al ferro (Minor W. 1996). La cavitat II, de 40Ǻ de longitud, s’estén en dues direccions (a i b) des de la zona propera a l’àtom de ferro (Figura 17). L’extrem més allunyat de la cavitat està definit per les cadenes laterals dels residus 341 (metionina) i 480 (leucina) que estan a una distància aproximada del ferro de 30Ǻ. La cavitat II té dues subunitats separades per un pas estret de 3’5Ǻ determinat per l’arginina 707 i la valina 354. Així doncs, es parla de la cavitat IIa i la IIb, la primera és la més propera al ferro i probablement la que lliga l’àcid gras que actua com a substrat. Les dues es troben intercalades entre dues capes d’hèlix, la 9 i la 11 per un costat i la 2, la 6, la 18 i la 21 per l’altra. Els residus que defineixen la cavitat IIa són: Tyr214, Leu255, Glu256, Gly258, Thr259, Leu496, His499, Trp500, His504, Ile538, Leu541, Ala542, Ile547, Ile553, Val564, Ser567, i Ile839. 39 Figura 17.- Estructura de la lipoxigenasa de soja (Glicine max). Imatge superior: en taronja, domini N-terminal esquematitzat, en verd domini C-terminal. En cian, la cavitat IIa i en vermell el ferro amb els 5 residus que el coordinen. Els residus que defineixen la cavitat IIb són: Trp340, Met341, Glu345, Phe346, Glu349, Met350, Gly353, Val354, Asn355, Val358, Ile359, Leu407, Leu480, Lys483, Ala484, Val486, Ile487, Asn490, Tyr700, Met705, Asn706, Arg707, Pro708, i Tyr734 (Minor W. 1996). 1.4.6. Especificitat posicional i de substrat Hi ha dos aspectes de les lipoxigenases que determinen l’especificitat posicional i de substrat. El primer és degut a les característiques dels substrats d’aquests enzims i el segon és el mecanisme d’acció de l’enzim. En funció de l’hidrogen que sigui abstret en el primer pas de la reacció, de com tingui lloc el reordenament electrònic del segon pas de la reacció i de com s’insereixi l’oxigen molecular en el tercer pas. Podrem parlar doncs, de la regioespecificitat i estereoquímica de la reacció (Neau DB., Gilbert NC. et al. 2009). La regioespecificitat vindrà definida en funció de quin dels dobles enllaços del grup 1,4–cis,cis-pentadiè es reordeni i canviï de posició. És a dir, depèn de la posició absoluta de l’abstracció de l’hidrogen i de la inserció de 40 l’oxigen. En el cas del linoleic, l’atac es dóna sobre el carboni 11 i en funció del doble enllaç que es reordeni es formarà l’isomer 9-hidroperòxid o l’isòmer 13hidroperòxid (Figura 18). En el cas de l’àcid linolènic que conté tres insaturacions. El radical es podria formar en el carboni 11 o en el carboni 14 (primer grau de regioespecificitat), el segon grau de regioespecificitat dependria del doble enllaç que es reordenés i de la posició de la inserció de l’oxigen molecular. Els isòmers possibles serien 9 o 13 en un cas i 12 o 16 en l’altre (Andreou A. and Feussner I. 2009). El cas de l’àcid araquidònic (abundant en animals) que conté quatre insaturacions, presentaria tres possibles carbonis (7, 10 i 13) susceptibles de patir l’abstracció electrònica. Això faria possible la hidroperoxidació en sis carbonis diferents de la molècula, els que es troben en posició 5, 8, 9, 11, 12 i 15. Només les hidroperoxidacions en posició 5, 8, 12 i 15 són estables i han estat descrites (Kuhn H., Walther M. et al. 2002). Les hidroperoxidacions en posició 9 i 11 no s’han observat mai, degut segurament, a la inestabilitat de la unió enzim-substrat en la posició necessària per a què tingui lloc la reacció en aquesta posició. Figura 18.- Reacció de la lipoxigenassa sobre àcid linoleic que il—lustra la regioespecificitat i la estereoquímica del mecanisme. L’estereoquímica deriva de la formació del grup hidroperòxid que dóna lloc a un centre quiral. La configuració d’aquest centre quiral pot ser R o S en 41 funció de la posició on hagi tingut lloc l’abstracció de l’oxigen i la inserció de l’oxigen molecular. Tot i què majoritàriament les lipoxigenases són S, enantiomèricament parlant, s’han descrit lipoxigenases R en mamífers (Boeglin WE., Kim RB. et al. 1998) (McDonnella M. 2001), en fongs (Su C. 1995) i en invertebrats marins (Brash AR. 1996). Estudis recents demostren que és un únic residu el que determina l’estereoselectivitat de la reacció. Una revisió acurada dels alineaments ha permès determinar la presència d’una diferència conservada a nivell de seqüència aminoacídica entre les lipoxigenases S i les R. Mentre que per a les lipoxigenases S en la posició determinada es presenta una alanina, per a les lipoxigenases R hi trobem una glicina. Això s’observa en la figura 19 on es presenta l’alineament de diverses lipoxigenases S i R i es remarca l’aminoàcid responsable de la estereoselectivitat de la reacció (Coffa G. 2004). Figura 19.- Aliniament de lipoxigenases R i S i identificació d’un aminoàcid potencialment estereodeterminant (Coffa G. 2004). En la figura 20 es mostra la formació de quatre productes diferents en funció d’aquest aminoàcid que determina la estereospecificitat de la reacció. En la lipoxigenasa 8R i en la 12S (part superior de la figura), l’orientació del substrat és la mateixa i l’abstracció de l’hidrogen es dóna en la mateixa posició però, la presència de la glicina en la posició crítica a la zona proximal del lloc actiu, permet la reacció d'oxigenació anterofacial a l'extrem proximal de la 42 pentadiè en la configuració 8R (part superior esquerra). La substitució d’aquesta glicina per una alanina, que és un residu més gran, impedeix la inserció de l'oxigen al carboni 8 i l'oxigenació anterofacial es dóna en una zona més profunda de la cavitat amb la configuració del 12S (part superior dreta). En les lipoxigenases 8S (part inferior esquerra) i 12R (part inferior dreta), el substrat entra a la cavitat amb l'extrem carboxil en primer lloc, cosa que permet l'abstracció de l’hidrogen del carboni 10. La presència d’una glicina permet l'oxigenació a l’extrem proximal del substrat donant com a resultat la configuració 12R (part inferior dreta), mentre que el residu més gran, l’alanina ho impedeix, i l'oxigenació anterofacial es produeix en una zona més profunda de la cavitat en la configuració de la 8S (part inferior esquerra) (Coffa G., Schneider C. et al. 2005). Figura 20.- Lipoxigenases R i S. Acció de l’aminoàcid estereodeterminant (Coffa 2005). L’estudi de l’especificitat del substrat ha portat a definir tres idees bàsiques que determinen aquesta especificitat: La primera és que la profunditat de la cavitat on s’introdueix el substrat per a la unió amb la proteïna és important per a l’especificitat posicional. Algunes prediccions estructurals pronostiquen una mida de la cavitat un 5% 43 més gran per a 12 lipoxigenases que per a les 15 lipoxigenases (Gillmor SA., Villasenor A. et al. 1997). La segona idea és que l’orientació d’entrada del substrat a la cavitat té una influència directa sobre l’especificitat posicional (Kühn H 2000). L’orientació normal és la de l’entrada de l’extrem metil terminal a la cavitat, mentre que l’orientació invertida és la de l’entrada de l’extrem carboxil terminal a la cavitat. La tercera idea deriva dels treballs dels últims anys que identifiquen una sèrie d’aminoàcids crítics per a l’especificitat posicional (Liavonchanka A. and I. 2006) (Schneider C., Pratt D.A. et al. 2007). En funció d’aquests s’estableixen dos models conceptuals per a explicar l’especificitat posicional de les lipoxigenases, el model depenent de l’orientació, i el model depenent de l’espai (Figura 21) (Andreou A. and Feussner I. 2009). Figura 21.- Comparació dels dos models existents per explicar l’especificitat posicional de substrat de les lipoxigenases. El model depenent de l’espai (Sloane D. and Leung R. 1995) diu que l’entrada de l’àcid gras a la cavitat sempre es dóna per l’extrem metilterminal, d’aquesta manera és el volum de la cavitat, la profunditat, el que determina l’especificitat posicional ja que en funció d’aquesta profunditat serà un carboni o un altre el que quedarà exposat a la hidroxilació (Andreou A. and Feussner I. 2009). Així doncs, per a les 15-lipoxigenases amb una cavitat menys profunda, la hidroxilació es dóna sobre un carboni més proper al costat metilterminal, mentre que per a les 5-lipoxigenases amb una cavitat més profunda, la reacció 44 es dóna en un carboni més allunyat del costat metilterminal (figura 21, Spacerelated model). D’altra banda, el model depenent de l’orientació diu que l’entrada de l’àcid gras a la cavitat es pot donar tant pel costat metilterminal com pel costat carboxiterminal (Kuhn H., Walther M. et al. 2002). D’aquesta manera, per a les 12 i 15 lipoxigenases, l’àcid araquidònic entra a la cavitat amb l’extrem metilterminal per davant, mentre que per a les 8 i 5 lipoxigenases entra amb el carboxiterminal per davant (figura 21, Orientation-dependent model). Tot i què aquest model s’ha estudiat en el cas de les lipoxigenases vegetals (Gardner 1989) amb l’àcid linoleic, durant els últims anys pren força un model que combini els dos models anteriors (model orientació - espai). En aquest cas, l’especificitat posicional s’explicaria tenint en compte tant l’espai de la cavitat com l’orientació del substrat (figura 21, columna de la dreta). Aquesta orientació es veuria condicionada tant per l’espai com per la càrrega dels residus que conformin la cavitat (Hornung E., Walther M. et al. 1999). Aquest model combinat explica que en treballs de mutagènesi dirigida en lipoxigenases vegetals s’observi que l’especificitat posicional estigui condicionada per diferents factors (Hughes RK, Lawson DM et al. 2001). La diversitat de substrats sobre els quals poden treballar les lipoxigenases és àmplia en l’àmbit dels àcids grassos insaturats tot i què la preferència per a àcids grassos lliures és notable, sobretot en el cas de les lipoxigenases d’origen vegetal (Siedow JN. 1991). També s’observa activitat sobre àcids grassos poliinsaturats tant lliures com esterificats en fosfolípids (Hildebrand DF 1989) i en triglicèrids (Fuller MA, Weichert H et al. 2001) (Feussner I and Wasternack C 2002). Hi ha altres substrats de les lipoxigenases que no són àcids grassos. És el cas de les lipoproteïnes de baixa densitat que són oxidades per 15 lipoxigenases de mamífers (Niki E. 2004) o l’exemple mostrat per Kulkarni (Kulkarni AP 2001) de co-oxidacions sobre compostos xenobiòtics que activen determinats compostos tòxics i en permeten la seva degradació. 45 1.4.7. Anàlisi filogenètic La funció d’una proteïna està altament relacionada amb la seva estructura, per tant, la determinació de les seqüències aminoacídiques de moltes proteïnes hauria de permetre descriure les relacions evolutives entre aquestes. Idealment, els alineaments a realitzar per a fer estudis evolutius, haurien de fer-se amb la seqüència de la proteïna i respectant la disposició en l’espai d’aquesta mateixa per a comparar la seva estructura terciària. Ara bé, com que no disposem de l’estructura de la majoria de proteïnes, això no és possible i, per tant, l’anàlisi filogenètic cal fer-lo partint dels alineaments de les seqüències nucleotídiques o aminoacídiques de les diferents proteïnes descrites. Figura 22.- Arbre filogenètic de lipoxigenases vegetals (fons blau) i de mamífers (fons rosa) (Brash RA 1999). 46 Per a realitzar l’anàlisi filogenètic o evolutiu d’una família de proteïnes s’analitzen les mutacions produïdes al llarg del temps sobre una seqüència. En els diferents estudis filogenètics realitzats amb la família de les lipoxigenases s’observen diferents agrupacions d’aquestes depenent del seu origen, de la seva localització o bé de la seva especificitat, ja que aquesta, en darrer terme, ve determinada per la seqüència de residus situada en el centre actiu. En la figura 22, es presenta un arbre filogenètic per a les lipoxigenases vegetals i de mamífers on clarament s’observa la separació d’aquests dos grans grups i la formació de subgrups. És remarcable que la formació d’un producte concret de la catàlisi de la lipoxigenasa no necessàriament està associat a seqüències similars. Per contra, les proteïnes amb homologia funcional de diferents espècies situades en diferents subgrups, presenten identitats de seqüència d’entre el 70% i el 95% (Brash RA 1999). Tot i que en les en les bases de dades de seqüències nucleotídiques apareixen diverses seqüències descrites com a possibles lipoxigenases o com a lipoxigenases per a organismes unicel—lulars (bacteris i fongs), són molt poques les publicacions fetes sobre aquest camp. La més recent posa de manifest la presència de lipoxigenases en organismes procariotes i suggereix que les lipoxigenases trobades en cianobacteries (Nostoc punctiforme) podrien ser les precursores evolutives de les lipoxigenases 13-LOX dels plastidis de les plantes (Lang I., Göbel C. et al. 2008) i que els fenomens de transferència horitzontal entre les cianobacteries i altres bacteris haurien estat els responsables de la dispersió d’aquest gen entre els bacteris (Lang I., Göbel C. et al. 2008). 47 Figura 23.- Analisi filogenètic de les seqüències de NspLOX i de lipoxigenases de mamífers, plantes, coralls, algues i bacteris, usant el programa PHYLIP 3.5 (Lang I., Göbel C. et al. 2008). Accession numbers: (i)Musmusculus (Moore E.R.B.): 5-LOX AAC37673; 8-LOX CAA75003; 12R LOX CAA74714; l12-LOX AAA20658; p12LOX AAA20659; e12LOX NP663717; (ii)P. homomalla : PhAOS–LOX O16025; (iii)Arabidopsis thaliana type 2 LOX: LOX2 At1 Q06327; LOX2 At2 CAB56692; LOX2 At3 CAC19364; LOX2 At4 CAG38328; (iv)Physcomitrella patens (Pp):CAE47464; (v)Solanum tuberosum: St1 CAA5572; St2 AAD09202; St3 AAB31252; St4 CAA64766; St5 CAA64765; St6 AAB67860; (vi) A. thaliana type 1 9-LOX: LOX1 At1 NP175900; LOX1 At2 NP188879; (vii) Lycopersicon esculentum: Le1 P38415; (viii) Nicotiana tabacum: Nt1 CAA58859; (ix) Glycine max: Gm1 CAA47717; Gm2 P09439; Gm3 CAA31664; Gm4 P38417; Gm5 AAB67732; Gm6 AAA96817; Gm7 AAC49159; (x) Pisum sativum: Ps1 AAB71759; Ps2 CAA55318; (xi) Lens culinaris: Lc1 CAA50483; (xii) Porphyra purpureum: Ppu AAA61791; (xiii) Pseudomonas aeruginosa : AF479686; (xiv) Nitrosomonas europaea : BX321860; (xv) Shewanella denitrificans OS-217: Q3P217; (xvi) Photobacterium profundum 3TCK: ZP 01218321; (xvii) M. xanthus: DK 1622 hypothetical protein MXAN 1745 YP 629995; (xviii) N. punctiforme (PCC73102): NpLOX1 ZP 00106490; NPLOX2 ZP 00107030; (xvix) Nostoc sp. SAG 25.82: NspLOX NP 478445. L’arbre filogenètic de la figura 23 posa de manifest l’agrupació filogenètica de les lipoxigenases vegetals (grups 13-LOX type 2, 9-LOX type 1 i 13-LOX type 1), de les lipoxigenases animals representades només per les dels mamífers i per l’agrupació de les lipoxigenases d’origen procariota que formen un grup no gaire compacte que es troba entre les lipoxigenases animals i les vegetals (Lang I., Göbel C. et al. 2008). Aquests resultats concorden amb els obtinguts per Porta i Rocha-Sosa l’any 2001 (Porta H. and Rocha-Sosa M. 2001) en un estudi filogenètic menys detallat. 48 2. OBJECTIUS 2. Objectius El present treball para la s’emmarca producción dins de els projectes d’investigació poliméricos: microbianos “Biocatalizadores 60749/PPQ” i emulsionantes de consorcios optimización del sistema y desarrollo de nuevos productos, CTQ 2007“Aislamiento, caracterización degradadores de hidrocarburos y prospección de genes en una genoteca metagenomica, PHB 2006-0038-PC” que tenen com a objectiu l’estudi de l’oxidació biològica de lípids, l’estudi de consorcis microbians, la prospecció de nous gens que intervenen en aquestes funcions i l’estudi dels mateixos. L’any 2005 es publica el clonatge i expressió de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa 42A2 (Vidal-Mas J 2005) sobre la que es desenvolupa l’estudi que es presenta en aquesta tesi. Donat que aquesta és la primera lipoxigenasa d’origen procariota que es clona i s’expressa, els objectius d’aquesta tesi se centren en aquesta proteïna. Els objectius plantejats per a la realització d’aquesta tesi són: 1.- Cristal—lització de la lipoxigenasa recombinant de Pseudomonas aeruginosa 42A2 i resolució de la seva estructura. 2.- Estudi de les característiques paramagnètiques de l’enzim. 3.- Aplicació de la tècnica dels microarrays al rastreig de noves lipoxigenases en mostres de sòls. 4.- Estudi evolutiu de les lipoxigenases bacterianes a partir d’anàlisis filogenètics mitjançant recursos bioinformàtics. 51 3. CAPÍTOL 1: Estructura de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa 42A2 3.1. 3.1.1. Material i mètodes Producció de la lipoxigenasa recombinant de Pseudomonas aeruginosa 42A2. La sobreexpressió de la lipoxigenasa recombinant en Escherichia coli BL21 s’ha realitzat utilitzant matrassos Erlemeyer d’un litre de capacitat amb osques i que contenien 200 ml de medi de cultiu LB (Luria-Bertani). S’han inoculat amb un volum del 2% (4 ml) de suspensió bacteriana d’Escherichia coli que conté la proteïna recombinant amb una densitat òptica de 2 mesurada a 580 nm. S’han incubat durant aproximadament 2 hores en agitació orbital (150 rpm) a 37ºC fins que han assolit la fase exponencial primerenca (densitat òptica a 580nm entre 0’3 i 0’5). La inducció de la sobreexpressió de la proteïna s’ha realitzat mitjançant l’addició al cultiu d’isopropil-β-D-tiogalactòsid (IPTG) (Sigma) a una concentració final de 0’1 mM. El cultiu s’ha mantingut durant 18 hores en agitació orbital (150 rpm) a 18 ºC per tal d’evitar la formació de cossos d’inclusió. 3.1.2. Purificació de la lipoxigenasa recombinant de Pseudomoanas aeruginosa 42A2. Amb l’objectiu de purificar la proteïna sobreexpressada, s’han recuperat les cèl—lules per centrifugació (10 minuts a 8000 rpm a 4 ºC) i el sediment obtingut s’ha resuspès en 10 ml de tampó fosfat sòdic 20 mM a pH 7’5, que conté 100 mM de clorur sòdic i una mescla d’antiproteases (Complete mini EDTA free, Roche diagnostics, Mannheim, DE). Seguidament aquesta suspensió s’ha congelat a -30 ºC durant una nit, després s’ha descongelat a temperatura ambient, i s’ha sotmès a un procés de sonicació de tres cicles de 30 segons a 60V a 4ºC amb un processador ultrasònic (Branson Ultrasonics, Co, USA). Per a les mostres d’EPR el procés de lisi cel—lular ha estat diferent. En aquest cas, després de la centrifugació del cultiu es resuspèn el sediment amb la solució BPer (BPer cell lysis detergent mixture, Pierce Chemical Co) i es torna a centrifugar a 14000 rpm durant 15 minuts i a 4ºC. Al sobrenedant resultant 55 s’hi afegeix un 30 % (pes/volum) de sulfat d’amoni, es dissol bé i es sotmet de nou a una centrifugació en les mateixes condicions que abans. De nou s’afegeix sulfat d’amoni al sobrenedant, aquesta vegada fins assolir un 60 % de saturació. Es centrifuga de nou en les mateixes condicions i el sediment resultant es resuspèn en 10 ml de tampó fosfat sòdic 20 mM a pH 7’5, que conté 100 mM de clorur sòdic i una mescla d’antiproteases (Complete mini EDTA free, Roche diagnostics, Mannheim, DE). Aquesta solució es filtra amb filtres de xeringa de 0.2 m, s’aplica en una columna HiTrap Ni-Chelating de 1 ml (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrada amb una solució tampó 20 mM de KH2PO4 a pH 7.4 amb 500 mM de NaCl (tampó A) i activada amb 2 ml de 0.1M NiSO4. Seguidament la columna és rentada amb 10 volums de tampó A que conté 10 mM d’imidazol. L’el—lució de la proteïna es fa a un flux de 1 ml/minut amb un gradient d’imidazol entre 10 i 500 mM. Es recullen fraccions d’un mil—lilitre que són analitzades per electroforesi en gels de poliacrilamida. Aquelles fraccions que presenten activitat lipoxigenasa són concentrades amb concentradors 10,000 MWCO HY (Vivaspin concentrators) fins a un volum de 500 µl. A continuació, la proteïna concentrada (500 µl) s’aplica a una columna de gel filtració Superdex 200 (10/30 GL) equilibrada amb tampó fosfat potàssic 50 mM a pH 7.0 (KPi), amb NaCl 150 mM. Es recullen fraccions de 750 µl que s’analitzen amb gels d’electroforesi natius i desnaturalitzants. La concentració final de la proteïna és determinada pel mètode de Bradford usant sèrum d’albúmina bovina (BSA) com a estàndard. 3.1.3. Detecció de l’activitat lipoxigenasa. Mètode espectrofotomètric. També conegut com a “low ethanol method”, és el mètode més utilitzat per a la determinació de l’activitat lipoxigenasa. Es basa en la mesura de l’increment d’absorbància a 234 nm. El grup diè conjugat hidroperòxid absorbeix a aquesta longitud d’ona. La velocitat de la reacció es pot determinar mesurant la formació del producte a través del canvi de l’absorbància a aquesta longitud d’ona. Es defineix una unitat lipoxigenasa (ULOX) com l’augment de 0,001 unitats d’absorbància per minut a l’utilitzar el substrat dissolt en tampó borat 0,2M a pH 9,0. Per a utilitzar aquesta metodologia, descrita per Ben-Aziz 56 (Ben-Aziz A., Grossman S. et al. 1970), és necessari preparar la solució de substrat (50 µl d’àcid linoleic, 50 µl d’etanol 95% en 50 ml finals de tampó borat 0,2M, pH 9.0). Aquesta solució es manté a 4ºC protegida de la llum per evitar el fenomen de la fotooxidació de l’àcid linoleic. Per a l’assaig es prepara un solució fresca diluïda 6 vegades en tampó borat 0,2M, pH 9.0 S’han utilitzat cubetes de 1,5 ml de volum final i de 10mm de pas de llum. Com a control s’ha utilitzat una mescla de 0,660 ml de solució de substrat i 0,340 ml de tampó borat 0,2M, pH 9. Per a determinar l’activitat lipoxigenasa, s’addicionen 10 µl de la suspensió de proteïnes a la mescla de 0,66 ml de solució de substrat i 0,33 ml de tampó borat 0,2M. Es mesura la variació de l’absorbància a una longitud d’ona de 234 nm durant 3 minuts respecte la cubeta control. Al llarg de la zona lineal es calcula el pendent, a partir de la qual es podrà calcular les unitats lipoxigenasa presents en la mostra. Les mesures s’han realitzat en un espectrofotòmetre UVIKON 922 (Kotron Instruments, Itàlia) La concentració final d’àcid linoleic utilitzant el linoleic al 60% (Sigma, cat. nº L-1376) en la cubeta és de 213 µM i la concentració d’etanol, del 0,1%. 3.1.4. Electroforesi de proteïnes en gels de poliacrilamida. Aquesta tècnica es basa en la separació de les proteïnes al llarg d’un gel de poliacrilamida, usat com a sedàs, mitjançant l’aplicació d’una diferència de potencial entre els dos extrems del gel. Són varis els factors que afecten a aquesta separació (mida, plegament, càrrega, proporció dels monòmers d’acrilamida, pH) al llarg del gel. S’ha utilitzat el sistema de gels MINIPROTEANII (BioRad SA) acoblat a una font d’energia Power Pac 300 (BioRad SA). Hi ha dos tipus de gels de poliacrilamida, els gels desnaturalitzants i els natius. Els primers contenen SDS (sodi dodecil sulfat), un detergent que desnaturalitza les proteïnes, mentre que els segons no en contenen. Els gels desnaturalitzants separen les proteïnes basant-se en el seu pes molecular (Laemmli UK. 1970) ja que l’SDS s’uneix al llarg de tota la cadena aminoacídica de la proteïna fent que sigui proporcional al seu pes molecular (Bollag D. and Edelstein S. 1991). El procediment i les solucions necessàries per a preparar 10 ml d’aquests gels s’expliquen a continuació. 57 En primer lloc cal ajustar els volums d’aigua i de solució de poliacrilamida (Acrilamida 29% - bisacrilamida 1%) en funció de si estem preparant el gel d’apilament o de separació (taula 3), seguidament s’afegeix el tampó corresponent (Tampó de separació: Tris-HCl 1,5M a pH 8.8 o tampó d’apilament: Tris-HCl 1,0M a pH 6.8) i després s’afegeix 0.1 ml de solució de SDS al 10 % (pes/volum). A aquesta solució cal afegir-hi el TEMED (N,N,N’,N’tetra-methyl-ethylenediamine, iniciador de la polimerització) i la solució de persulfat d’amoni al 10% (pes/volum) per a catalitzar la polimerització. Per a carregar les mostres al gel s’utilitzarà un tampó de càrrega 5 vegades concentrat amb la següent composició: Tris-HCl 250mM pH 6.8; 500 mM DTT, 10% SDS, 1% blau de bromofenol; 50% glicerol. Els gels usats per a electroforesis desnaturalitzants són de 0.75 mm de gruix al 5% de mescla d’acrilamida per al gel d’apilament, i del 12% per al gel de separació. La proporció d’aquests dos tipus de gels es poden veure en la taula RRR (Sambrook J., Fritsch E. et al. 1989). Gel apilador 5% (5 ml de gel) Solució d’acrilamida 30% 0,83 ml Tampó d’apilament 0,63 ml Solució SDS 50 µl Persulfat amònic 50 µl TEMED 5 µl Aigua destil—lada 3,4 ml Gel separador 12% (10 ml gel) Solució d’acrilamida 30% 4,0 ml Tampó de separació 2,5 ml Solució SDS 100 µl Persulfat amònic 100 µl TEMED 4 µl Aigua destil—lada 3,3 ml Taula 3.-Proporció dels gels apiladors i separadors. Les mostres carregades als gels desnaturalitzants han estat mesclades amb tampó de càrrega (5X) i incubades a 96ºC durant 5 minuts abans de la seva càrrega. L’electroforesi s’ha dut a terme a 200 V durant 50 minuts en tampó d’electroforesi amb un 0’1% de SDS (pes/volum). El marcador de pes molecular usat ha estat el SigmaMarkerTM Wide Molecular Weigth Range (Sigma), que permet veure bandes de 205; 116; 97; 84; 66; 55; 45 i 36 KDa. La composició dels gels natius només difereix dels desnaturalitzants en què en els gels apiladors i separadors els 50 i 100 µl de solució de SDS s’han substituït per aigua, el tampó de càrrega no conté SDS ni DTT (agents desnaturalitzants) i el tampó d’electroforesi no conté SDS. 58 Per tal de poder detectar les possibles bandes en que se separen les proteïnes cal tenyir-les. La tècnica més usada és la tinció amb Blau de Comassie, mètode que permet la fixació de les proteïnes en el gel amb metanol i àcid acètic glacial i, al mateix temps Brillant Blue R250 (Sigma). La tinció del gel es fa per immersió de 10 minuts, a temperatura ambient i en agitació lleugera, en una solució de tinció (10% àcid acètic glacial, 45% metanol, 0,1% blau de Comassie R250, en aigua destil—lada). L’eliminació de l’excés de colorant es fa amb una solució rentat (10% metanol, 10% àcid acètic glacial en aigua destil—lada) a temperatura ambient i en agitació fins a observar bé les bandes en el gel (Bollag D. and Edelstein S. 1991). 3.1.5. Cristal—lització de la lipoxigenasa de tenyir-les amb el colorant Comassie Pseudomonas aeruginosa 42A2. Per tal d’obtenir un cristall cal assolir una solució en situació de supersaturació. Aquesta situació s’obté quan la solució sobrepassa el límit de solubilitat de la proteïna (equilibri entre la fase sòlida i la dissolta del solut), la solució doncs, està en situació de no equilibri i tendirà a l’equilibri passant molècules en solució a estat sòlid. És sota aquestes condicions que poden créixer els cristalls. L’estratègia normal per aconseguir aquest estat de supersaturació passa per disminuir lentament la solubilitat del sistema a cristal—litzar, modificant la concentració de precipitant. En aquest cas s’ha utilitzat el mètode de difusió de vapor en gota pendent. 3.1.5.1. Mètode de difusió de vapor en gota pendent Es disposa d’un sistema tancat en el qual hi ha un reservori (solució que conté el precipitant, 1 ml) i una gota (2 µl) en la què hi ha la mostra a cristal—litzar juntament amb altres components com poden ser sals, tampó de base aquosa i precipitant. La gota sempre conté menys precipitant que el reservori i, com que es troba en un sistema tancat, aquest tendeix a equilibrar les concentracions de precipitant a través de la difusió de vapor que té lloc mitjançant l’evaporació d’aigua de la gota, en el cas de precipitants no volàtils 59 com el PEG (polietilenglicol); o bé a través de la difusió del propi precipitant en el cas de precipitants volàtils com poden ser l’etanol o l’isopropanol. La tècnica de la gota pendent requereix tractar els cobreobjectes on es dipositaran les gotes submergint-los en un bany de silà (netejant després amb banys d’aigua i finalment amb etanol per assecar) per tal d’inertitzar-los i que la seva superfície sigui hidrofòbica i la gota s’hi pugui quedar penjada. Les cristal—litzacions s’han dut a terme en plaques Linbro que disposen de 24 pous (s’hi poden fer 24 gotes). Les gotes tenen un volum de 2 µl (1 µl de solució de proteïna i 1 µl de solució precipitant). La mescla es fa sobre el cobreobjectes, després es gira i es col—loca sobre el pou prèviament omplert amb 1 ml de solució precipitant. El sistema quedarà segellat amb l’ajuda de silicona (Figura 24). Figura 24.- Esquema de la difusió de vapor en gota penjant en plaques Linbro (Mc Pherson A. 1999). 3.1.5.2. Condicions de cristal—lització. Com que és extremadament difícil poder predir les condicions apropiades per a la nucleació o el creixement de cristalls ben ordenats, en la pràctica es realitzen cribatges, assajant diverses condicions de cristal—lització. Això permet trobar una o més condicions en les quals s’afavoreixi la formació de cristalls de la proteïna. En aquests cribatges, es realitzen múltiples combinacions de la proteïna a estudiar amb mescles de diferents agents precipitants, com ara sals (fosfats, citrats, sulfat amònic...), alcohols (metilpentendiol, isopropanol...), tampons glicerol...), (Hepes, Tris...) i d’altres precipitants (polietilenglicol (PEG), ajustats a diferents pHs. Tots aquests compostos s’usen amb la finalitat de disminuir la solubilitat de les molècules a cristal—litzar. Durant la realització d’aquesta tesi s’han provat 760 condicions de cristal—lització diferents 60 que corresponen a diferents cribatges comercialitzats per l’empresa Hampton Research (Annex 1). El nom d’aquests diferents cribatges es mostren a la taula 4 juntament amb el número de condicions diferents que conté el cribatge. Nom del cribatge Ammonium sulfate grid screen Crystal Screen Lite Crystal Screen I Crystal Screen II Natrix PEG 6000 Grid Screen Wizard 1 Wizard 2 Complex Screen MPD grid screen PEG 6000/LiCl grid screen PEG/Ion screen MembFac Quik phosphate grid screen NaCl grid screen Index SaltRx Número de condicions del cribatge 24 48 48 48 48 24 48 48 40 24 24 48 48 24 24 96 96 Taula 4.- Nom dels diferents cribatges provats per a la cristal—lització de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa i numero de condicions de cristal—lització diferents que conté cada cribatge. Totes les cristal—litzacions que s’han dut a terme durant la realització d’aquesta tesi s’han realitzat a 20ºC amb dues concentracions de proteïna, 15 mg/ml i 30 mg/ml, a la Plataforma Automatitzada de Cristal—lografia de l’Institut de Biologia Molecular de Barcelona (IBMB) i del Institute for Research in Biomedicine (IRB) del CSIC al Parc Científic de Barcelona (PCB) sota la supervisió del Dr. Fita (Investigador Principal) i del Dr. Carpena (PostDoc) usant el robot CARTESIAN Microsys 4000 XL, que permet la miniaturització a nivell de nanolitres del procés cristal—logràfic. Un cop s’han obtingut els cristalls adequats es congelen amb nitrogen líquid. Per això s’ha utilitzat un criollaç o cryoloop (llaç de niló subjectat a una vareta metàl—lica). En funció de la mida del cristall s’usa un llaç d’una mida o una altra. Es captura el cristall amb el criollaç i ràpidament se submergeix en 61 nitrogen líquid quedant congelat instantàniament (Rudman R. 1976). Treballar a baixes temperatures comporta molts avantatges, permet la conservació dels cristalls durant molt de temps, minimitza els danys de la radiació, es redueix la dispersió i en pot millorar la resolució. Per altra banda, cal evitar l’aparició de gel en els espectres de difracció, per això s’usen crioprotectors com el glicerol. En aquest estudi s’ha utilitzat un criotampó consistent en la solució precipitant adient amb un 20% de glicerol. 3.1.6. Difracció del cristall de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa 42A2. Per a obtenir les dades de difracció, s’ha disposat de rajos X durs, d’alta energia. S’ha usat radiació de sincrotró a l’ESRF (European Synchrotron Radiation Facility), a Grenoble (França). Per tal d’obtenir un bona estructura d’un cristall cal superar diverses etapes: -Recollida de dades -Indexat, processat i escalat -Reemplaçament molecular Per a obtenir una bona difracció cal situar un detector en línia amb la sortida dels rajos X i del cristall. Això implica situar el cristall de manera que durant la seva rotació no es desalinii. Al final de la recollida de les intensitats registrades s’obté una imatge digitalitzada que s’anomena difractograma (Figura 25). 62 Figura 25.- Difractograma i detall del mateix, obtinguts en difractar els cristalls de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa 42A2. Per a indexar i processar les dades obtingudes a partir dels diversos difractogrames obtinguts s’ha utilitzat el programa DENZO (Otwinowski Z and Minor W 1997) que permet determinar la simetria, les dimensions de la cel—la i el grup espacial del cristall. L’escalat de les dades s’ha fet amb el programa SCALEPACK (Otwinowski Z and Minor W 1997), un programa que corregeix el valor de les intensitats tenint present el soroll de fons, el factor de polarització, d’absorció i la possible malmesa del cristall. El programa utilitzat per dur a terme el procediment de reemplaçament molecular ha estat el MOLREP (Vagin A and Teplyakov A 1997). La construcció manual de l’estructura s’ha realitzat amb el programa de gràfics COOT (Emsley P and Cowtan K 2004) i per afinar l’estructura s’ha utilitzat el programa REFMAC (Murshudov G N, Vagin A A et al. 1997). 3.1.7. EPR: Ressonància Paramagnètica Electrònica Per als experiments d’EPR, les mostres de lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa 42A2 amb el ferro en estat +3 han estat preparades per addició de 13S-HPODE. 63 El 13S-HPODE, produït amb la lipoxigenasa de soja LOX-1, s’ha purificat en una columna Supelcosil LC-SI (5 µm, 25 x 0.46 cm) eluïda a un flux de 1 ml/min amb hexà/iso-propanol/àcid acètic (100/2/0.1 en volum). El 13SHPODE purificat ha estat dissolt a una concentració entre 10 i 30 mM en tampó borat sòdic 0.1 M a pH 9.1, una aliquota de volum apropiat ha estat afegida a la solució de proteïna just abans de realitzar l’experiment d’EPR. Les mostres van ser de concentracions d’entre 0,1 i 0,4 mM de proteïna dissolta en tampó fosfat de potassi 0,2 M sense crioprotector. Els espectres d’EPR s’han obtingut en un espectròmetre Varian E 109 treballant a ~9.2 GHz (X-band) equipat amb una bomba Oxford Instruments ESR9/10, el flux d’heli líquid del criostat s’ha fixat a 3’5 K. La temperatura es mesura amb un sensor Cernox situat just sota el tub de quars de 4 mm de diàmetre que conté la mostra. La configuració estàndard dels instruments per a tots els espectres s’ha realitzat a 5 mW de potència de microones a un temps d’escaneig de 30 min/200G i un a constant de temps de 0,5 segons. 64 3.2. 3.2.1. Resultats i discussió Purificació de la lipoxigenasa i obtenció de cristalls La solució de proteïna obtinguda de la sonicació del sediment del cultiu i del filtrat amb filtres de xeringa de 0.2 m, és carregada en una columna HiTrap Ni-Chelating d’1 ml (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrada amb una solució tampó 20 mM de KH2PO4 a pH 7.4 amb 500 mM de NaCl (tampó A) i activada amb 2 ml de 0.1M NiSO4. Seguidament la columna és rentada amb 10 volums de tampó A que conté 10 mM d’imidazole. L’elució de la proteïna es realitza amb un gradient d’imidazol que va de 10 mM a 300mM a un flux de 1 ml/min i recollint fraccions d’1 ml. LoxHisTrapAlbert28gen08001:10_UV1_280nm LoxHisTrapAlbert28gen08001:10_Fractions mAU LoxHisTrapAlbert28gen08001:10_UV2_260nm LoxHisTrapAlbert28gen08001:10_Logbook LoxHisTrapAlbert28gen08001:10_Conc %B 100 4000 80 3000 60 2000 40 1000 20 0 0.0 10.0 F3 20.0 Waste 34 6 8 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 42 44 46 48 50 52 30.0 40.0 50.0 60.0 Waste ml 0 Figura 26.- Perfil d’alliberació de la proteïna de la columna HiTrap Ni-Chelating amb gradient d’imidazol de 10 mM a 300mM, amb l’absorbància a 280 nm (blau) i a 260 nm (vermell). L’eix vertical blau indica les unitats d’absorbància (Moore E.R.B. 1996) i l’eix vertical verd indica el percentatge de tampó B (tampó A amb imidazol a una concentració de 300 mM). El perfil de proteïna eluïda en cada moment es mostra en la figura 26 on s’observa que la proteïna s’allibera a una concentració d’imidazol d’entre 135 mM i 210 mM. El màxim d’absorbància a 280 nm (màxima elució de proteïna) es dóna a una concentració d’imidazol de 150 mM, s’obté una màxima 65 absorbància al centre del pic. Les lectures d’activitat lipoxigenasa per a les fraccions (23 - 35) corresponents al pic, són positives. Entre les fraccions 8 i 15 apareix un doble pic que no presenta activitat lipoxigenasa. En la figura 27, es mostra un gel de poliacrilamida desnaturalitzant on es pot comprovar que la proteïna s’ha purificat pràcticament fins a l’homogeneïtat. S’han carregat mostres de les fraccions 23 a 35, una mostra de la solució de proteïna no purificada carregada a la columna (L) i un marcador de pes molecular (M) que mostra bandes de 205, 116, 97, 84, 66, 55, 45 i 36 KDa. Comparant les postres de les fraccions amb la mostra carretada a la columna es pot veure com el procés de purificació és altament efectiu ja que tot i que apareixen altres bandes a part de la corresponent a la de la lipoxigenasa, aquestes tenen una mida molt petita i no apareixen en el perfil d’alliberació de la proteïna de la columna. Figura 27.- Gel de poliacrilamida de les fraccions 23 a 35 que conformen el pic mostrant la puresa del mateix. En el carril L mostra carretada a la columna HisTrap i en el carril M marcador de pes molecular (de dalt a baix: 205, 116, 97, 84, 66, 55, 45 i 36 KDa). Tot i què aquesta lipoxigenasa és la primera d’un organisme procariota que se sobreexpressa, els resultats en quant a producció de proteïna són similars als obtinguts per a la lipoxigenasa de soja LOX-1 i per a la lipoxigenasa de Gaeumannomyces graminis que han estat sobreexpresades de forma heteròloga, la primera en Escherichia coli i la segona en el llevat Pichia pastoris. En ambdós casos la producció fou de 30 mg de proteïna per litre de cultiu, però amb la diferència que la primera era expressada al medi de cultiu (Cristea M., Engström A. et al. 2005), mentre que en la segona l’expressió era intracel—lular (Steczko J., Donoho GA. et al. 1991). S’han sobreexpressat lipoxigenases de 66 mamífers utilitzant altres sistemes com pot ser el cas de la 15-LOX d’origen humà, on el sistema d’expressió està basat en cèl—lules d’insecte (Spodoptera frugiperda Sf-9) transfectades amb un baculovirus que conté la seqüència de la proteïna obtenint entre 25-50 mg de proteïna soluble i activa per litre de cultiu. Aquest mètode però, necessita (Kühn H., Barnett J. et al. 1993). Les condicions a les que s’ha obtingut el cristall (Figura 28) que s’ha difractat són les següents: Sal: Precipitant: Tampó: Concentració de proteïna: Temps: Cl2Mg 0.05M PEG 3350 10% Hepes 7.5pH 0.1M 15 mg/ml 10 - 20 dies incubacions prèvies a la infecció amb el baculovirus de 24 hores, i 3 dies de incubació per a la producció de la proteïna Figura 28.- Detall del cristall de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa obtingut sota les condicions anteriorment esmentades. El creixement del cristall resultant es pot observar en la sèrie d’imatges següents (Figura 29) on es pot veure com, al llarg del temps (els cristalls triguen a formar-se entre 10 i 20 dies) i a partir d’una gota sense cristalls, aquests s’hi formen i hi creixen. 67 Figura 29.- Formació i creixament de cristalls de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa en una gota de cristal—lització. En la imatge es veu una mateixa gota a diferents temps des de la seva preparació. D’esquerra a dreta: dia 0, dia 10 i dia 20. Tot i que s’han obtingut cristall sota sis condicions diferents més (en tampó HEPES 0,1 M a pH 7,5 amb 0,2 M de citrat trisòdic deshidratat i 30% v/v de MPD o en tampó MES 0,1 M a pH 6,5 amb fosfat de sodi dihidrogenat 0,1 M i 12% pes/v de PEG 20.000 o en tampó HEPES 0,1 M a pH 7,5 amb 0,5 M de sulfat d’amoni i 30% v/v de MPD o en tampó MES 0,1 M a pH 6 i amb clorur de liti 1M o en citrat trisòdic deshidratat 0,1 M a pH 5 amb un 10 % v/v de MPD o en tampó TRIS 0,1 M a pH 8,5 amb clorur de magnesi hexahidratat 0.2 M amb un 25% v/v PEG 3350), tots els cristalls obtinguts eren més fràgils que el que es va decidir difractar. Aquesta és la raó principal per la qual es va escollir aquest cristall per a ser difractat. Cal tenir present que la manipulació del cristall és un pas crític del procés, com més fràgil és, més fàcil és que es trenqui i què, per tant no es pugui difractar bé. 3.2.2. Paràmetres del cristall. Per tal d’obtenir un bona estructura d’un cristall cal superar diverses etapes: -Recollida de dades -Indexat, processat i escalat -Reemplaçament molecular 68 Recollida de dades: Per a una bona recollida de dades hi ha tres paràmetres que són importants conèixer: l’orientació del cristall, per tal d’aconseguir situar-lo en el centre del feix de raigs X i que no surti d’aquest durant la rotació, l’angle d’oscil—lació (oscil—lació que es dóna en cada foto recollida al llarg de tot el rang recollit) i la distància al detector i el temps d’exposició. La distància al detector està molt lligada a la resolució de l’espectre (Dauter Z. 1997) i el temps d’exposició (temps de recollida de la foto) també afecte a la resolució ja que no totes les reflexions tenen la mateixa intensitat, això pot provocar que a un determinat temps algunes reflexions quedin saturades i no es puguin utilitzar. Una manera de resoldre aquest problema seria fer dues o més recollides de dades del mateix cristall, una a una distància llunyana del detector i un temps d’exposició curt (per recollir bé la baixa resolució) i una altra més a prop del detector i amb un temps d’exposició més llarg (per obtenir les taques d’alta resolució). Indexat, processat i escalat: L’objectiu del pas anomenat indexat és determinar la simetria del cristall, les dimensions de la cel—la del cristall i el grup espacial. El programa utilitzat per predir la simetria és el DENZO (Otwinowski Z and Minor W 1997). En primer lloc es decideix el sistema cristal—lí o classe de cristall (triclínic, monoclínic, ortoròmbic, trigonal, tetragonal, hexagonal o cúbic) i com està centrada la cel—la (P, A, B, C, F, I ). Un cop sabent això es calculen les dimensions de la cel—la a, b, c, α, β i γ, es detecta el grup de simetria del cristall. Amb aquest anàlisi es determinarà la cel—la i grup espacial del cristall. Un cop s’ha obtingut aquesta informació, s’extreu la informació de les fotografies recollides i s’ha processat amb el programa DENZO i després s’ha escalat amb el programa SCALEPACK (Otwinowski Z and Minor W 1997). Aquest programa corregeix el valor de les intensitats tenint present el soroll de fons, el factor de polarització, d’absorció i la possible malmesa del cristall. Reemplaçament molecular: El reemplaçament molecular, descrit per primer cop per Rossmann i Blow (1962), és un dels mètodes més utilitzats per a resoldre estructures de macromolècules. Aquest mètode es veu limitat per la necessitat de partir d’un model semblant al que es vol resoldre. En el cas d’aquesta tesi s’ha utilitzat l’estructura de la lipoxigenasa de Plexaura homomolla amb el domini N-terminal truncat (498-1066) com a model (codi 69 PDB: 2FNQ). L’objectiu és portar l’estructura coneguda del model al cristall de l’estructura desconeguda. Aquest mètode consta de dues etapes: una rotació on es determina l’orientació espacial de la molècula coneguda respecte la desconeguda, i una translació on la molècula correctament orientada es superposa a l’altra. El programa utilitzat per dur a terme aquest procediment ha estat el MOLREP (Vagin A and Teplyakov A 1997). La construcció manual de l’estructura s’ha realitzat amb el programa de gràfics COOT (Emsley P and Cowtan K 2004). Per afinar l’estructura s’ha utilitzat el programa REFMAC (Murshudov G N, Vagin A A et al. 1997). En la taula següent (Taula 5) es mostren els paràmetres cristal—logràfics obtinguts de la difracció de raigs X del cristall de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa. Recol·lecció de dades i validació Data collection Space group Cell dimensions a, b, c (Å) α, β, γ (º) Resolution (Å) Rsym I / σ(I) Completeness (%) P21212 132.7, 116.0, 42.6 90, 90, 90 20 – 1.75 (1.81 -- 1.75)* 9.1 (63.0) 10.7 (2.5) 97.9 (97.0) Refinement Resolution (Å) No. reflections Rwork / Rfree No. atoms Protein Phospholipid Glycerol Water B-factors (Å2) Protein Phospholipid Glycerol Water R.m.s. deviations Bond lengths (Å) Bond angles (º) 20 – 1.75 (1.79 --1.75) 62,559 (4,440) 19.2 / 23.3 (25.7/29.3) 4,890 47 66 600 8.9 15.1 29.4 11.9 0.012 1.54 Taula 5.- Taula de paràmetres cristal—logràfics del cristall de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa. Els valors en parèntesi són per als valors amb alta resolució. 70 El grup espacial assignat a aquest cristall, P21212 (la descripció de la simetria del cristall), correspon a un sistema de cristall ortoròmbic. Aquest sistema de cristall ortoròmbic és el resultat de l’extensió d’una xarxa cúbica al llarg de dos dels seus tres eixos per dos factors diferents, originant un prisma rectangular. Els tres eixos que defineixen el prisma són de diferent longitud i es creuen en angles de 90º. El cristall té una resolució de 1.75 Ǻ. Altres cristalls de lipoxigenases com és el cas de la lipoxigenasa de Plexaura homomolla o de Glycine max, presenten altres grups espacials (P21, sistema de cristall monoclínic), però això pot ser degut a les diferències en les condicions de cristal—lització. No és estrany que proteïnes de la mateixa família presentin grups espacials diferents podent-se donar el cas que, una mateixa proteïna cristal—litzada en diferents condicions, presenti grups espacials diferents. 3.2.3. Estructura general. L’obtenció de l’estructura cristal—lina de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa permet fer un estudi fi de les cavitats que presenta, del centre actiu i dels residus que actuen com a lligands del ferro. Les dades cristal—logràfiques indiquen que els 49 primers aminoàcids de l’extrem N-terminal de la seqüència no presenten estructura (estan altament desordenats) i no és fins l’aminoàcid 50, una isoleucina, on comença a estructurar-se la proteïna en forma de cristall. Aquest ordenament de l’estructura es manté fins a l’últim aminoàcid de la seqüència, la isoleucina en posició 685 de l’extrem carboxiterminal amb l’excepció de sis aminoàcids (Thr 201, Gln 202, Gly 203, Gly 204, Gln 205 i Gly 206). Són vàries les diferències observades en aquest cristall respecte les altres estructures ja descrites de lipoxigenases. La diferència més important a nivell d’estructura que presenta el cristall de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa respecte les lipoxigenases vegetals i animals descrites fins al moment (Figura 30), és l’absència del domini PLAT N-terminal format per 8 fulles β antiparal—leles, un domini no catalític present en totes les lipoxigenases eucariotes descrites fins el moment d’entre 71 110 i 150 residus (Neau DB., Gilbert NC. et al. 2009). La presència d’una inserció de 90 aminoàcids (des de l’Alanina 126 fins a la Valina 200) que s’estructura formant dues hèlix α antiparal—leles (hèlix α 2A i hèlix α 2B) de 36 i 38 residus respectivament és el que modifica l’estructura general de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa fent-la una proteïna d’un sol domini, el domini catalític o C-terminal, ja que el domini PLAT N-terminal es perd (figura 30). Figura 30.- Sobreposició de les estructures de les lipoxigenases de Plexaura homomolla (2fnq), en color blau, i de Pseudomonas aeruginosa 42A2, en color verd, on s’observa com la part corresponent al domini catalític de la lox de Plexaura homomolla es sobreposa molt bé sobre la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa 42A2. En color rosat es mostren les dues hèlix (α2A i α2B) formades per α la inserció de 90 residus detectada en la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa 42A2, en color blau turquesa es mostra el domini N-terminal PLAT present en la lipoxigenassa de Plexaura homomolla però absent en la de Pseudomonas aeruginosa 42A2. 72 La presència d’aquesta inserció es pot observar perfectament en un alineament estructural de seqüència (figura 31) entre la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa i les de Plexaura homomolla (2FNQ), reticulòcit de conill (1LOX) i la de Glycine max (1YGE). En la figura 31 es remarca en blau i sobre la seqüència de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa (Pa_Lox) la part d’inserció corresponent a les hèlix α 2A i hèlix α 2B. Un altra detall a destacar de l’estructura obtinguda és l’absència d’estructura des de l’aminoàcid 201 fins l’aminoàcid 206 (ambdós inclosos), aquests sis aminoàcids correspondrien a un “loop” d’unió entre l’hèlix α 2A i l’hèlix α 3 (Figura 31). Aquesta absència d’estructura indica que aquests residus tenen una gran mobilitat, això fa pensar que aquesta estructura de dues hèlix antiparal—leles pot moure’s damunt la proteïna talment com una tapa que obre i tanca la cavitat per on s’introdueix el substrat per fer-lo arribar fins al centre actiu de la proteïna. És remarcable que aquests sis aminoàcids sense estructura no són comparables ni visibles en cap de les estructures ja descrites donat que no presenten aquestes dues hèlix α antiparal—leles. En la figura 31 es poden veure marcats amb taronja aquests sis aminoàcids (TQGGQG), just després de les dues hèlix α 2A i 2B. Un aspecte de l’alineament mostrat en la figura 31 i que mereix ser destacat, és la baixa homologia de seqüència (22%) entre la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa i la de Plexaura homomolla (estructura utilitzada per a fer el reemplaçament molecular). Aquesta baixa homologia contrasta amb la gran homologia estructural (veure la sobreposició de les dues estructures en la figura 30) del domini catalític de les dues proteïnes, això fa pensar que aquesta estructura és la única possible que permet lligar un ferro i, a la vegada, permetre l’entrada d’un àcid gras poliinsaturat, ja sigui lliure o esterificat, per tal de modificar-lo introduint un grup hidroperòxid. Per altra banda, el fet que en la coordinació de l’àtom de ferro hi intervingui l’aminoàcid carboxiterminal, requereix aquesta alta conservació de l’estructura ja que, com que la isoleucina terminal no forma part de cap estructura més “robusta”, com podria ser una hèlix α o un fulla β, la probabilitat de no situar correctament aquest residu en una estructura menys conservada seria molt elevada. 73 Figura 31.- Alineament estructural de les lipoxigenases de Pseudomonas aeruginosa 42A2 (Pa_Lox), de Plexaura homomolla (2FNQ), reticulòcit de conill (1LOX) i la de Glycine max (1YGE). Es mostra l’estructura secundària determinada per a la Pa_Lox. Els residus mostrats en taronja són aquells que es perden en l’alineament respecte les altres estructures. L’absència del domini PLAT juntament amb la inserció (en blau) després de la hèlix α2 es fa més que evident. Els punts negres indiquen els residus que coordinen l’àtom de ferro. 74 Un altre aspecte novador d’aquesta estructura és l’observació d’un fosfolípid a l’interior de la proteïna, un fet inèdit fins el moment, doncs cap dels complexes de lipoxigenases descrits fins a l’actualitat contenen fosfolípids, i només en el cas de la lipoxigenasa de soja trobem un complex modelat amb àcid 13(S) hidroperòxid - 9(Z), 11(E) octadecenoic (Codi Protein Data Bank 1IK3) en el centre actiu (Skrzypczak-Jankun E, Bross RA et al. 2001). La relació enzim-substrat es tracta més profundament en l’apartat 4.2.5. 3.2.4. Esfera de coordinació del ferro. La coordinació de l’àtom de ferro és una estructura altament conservada en les lipoxigenases tant d’origen animal com d’origen vegetal, per tant, no ha de sorprendre que en aquesta lipoxigenasa d’origen bacterià, també resulti conservada. Així doncs, el centre catalític en la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa manté les característiques essencials descrites per a altres enzims lipoxigenasa (Brash RA 1999); (Boyington JC., Gaffney BJ. et al. 1993); (Minor W. 1996); (Choi J. 2008); (Neau DB., Gilbert NC. et al. 2009): un àtom de ferro no hemo amb una coordinació octaèdrica lleugerament distorsionada (figura 32). Els sis lligands de ferro corresponen als tres àtoms de nitrogen de les següents histidines: His377, His382 i His555 amb distàncies de coordinació de 2.24 Å, 2.18 Å and 2.15 Å, respectivament, a l'àtom d’oxigen de l’asparagina Asn559 a 2.37 Å, a un àtom d'oxigen del grup carboxilat de la isoleucina terminal Ile685 a 2.30 Å i a l'aigua (W1) a 2.26 Å (Figura 32). El segon oxigen carboxilat de la isoleucina Ile685 estableix un pont d’hidrogen amb l’aigua W1 molt fort i curt (2,46 Å), completant així la geometria característica de la primera esfera de coordinació de ferro en les lipoxigenases. Els angles d’unió dels lligands del ferro de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa són comparables amb els publicats per a altres lipoxigenases (taula 6). 75 P. aeruginosa LOX Distàncies lligand-metall Fe-His 499 N / Fe-His 377 N Fe-His 504 N / Fe-His 382 N Fe-His 690 N / Fe-His 555 N Fe-Ile 839 O / Fe-Ile 685 O Angles lligand-metall-lligand His499N-Fe-His504N / His377N-Fe-His382N His N-Fe-His N / His N-Fe-His N His N-Fe-His N / His N-Fe-His N His690N-Fe-Ile839O / His555N -Fe-Ile685O His N-Fe-Ile O / His N -Fe-Ile O His N-Fe-Ile O / His N -Fe-Ile O 499 839 377 685 504 839 382 685 504 690 382 555 499 690 377 555 G. max 1-LOX 2.24 Ǻ 2.18 Ǻ 2.15 Ǻ 2.30 Ǻ 2.29 Ǻ 2.13 Ǻ 2.19 Ǻ 2.07 Ǻ 102,6 º 100,9 º 104,0 º 78,1 º 106,0 º 150,8 º 92,0 º 102,2 º 93,7 º 85,1 º 92,6 º 171,7 º Taula 6.- Comparació entre les distàncies dels lligands del ferro al ferro i els angles que formen entre la lipoxigenasa de Pseudomonas aerurinosa i la de Glycine max (1-LOX). Els factors de temperatura atòmica i el mapa de densitat electrònica (comunicació personal del Dr. Carpena) suggereixen que l’àtom de ferro es troba en estat ferrós (Fe 2+). Figura 32.- Centre catalític de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa. Es mostren els 5 residus i l’aigua que coordinen l’àtom de ferro (H377, H382, H555, N559, I685 i W1) i els ponts d’hidrogen i de coordinació (línies discontinues) de la segona esfera de coordinació (Q562 i E373). També es mostra l’aproximació de cinc carbonis de la cadena 1 (groc) del fosfolípid, al ferro tot apilant-se a dues histidines de l’esfera de coordinació. En vermell es mostres els àtoms d’oxigen i en blau els de nitrogen. 76 La conservació d’aquesta estructura es posa de manifest en l’alineament de les seqüències aminoacídiques que es poden observar en la figura 33 on es veu que els aminoàcids que coordinen l’àtom de ferro són els mateixos, a excepció de l’asparagina Asn559 de la lipoxigenasa de reticulòcit de conill que es veu modificada per una histidina, la His544. Es pot veure com la distància en seqüència entre les dues primeres histidines de l’esfera de coordinació del ferro, es manté constant en les diferents seqüències (separació de quatre aminoàcids). El mateix passa en la segona parella d’aminoàcids de la coordinació del ferro (His-His per a la lipoxigenasa de conill o His-Asn per a la resta de lipoxigenases) que estan separats per a tres aminoàcids. Cal esmentar la intervenció de l’aminoàcid terminal en la coordinació de l’àtom de ferro com un aspecte també molt conservat. 1LOX 2FNQ NSPLOX 1YGE 1LOX 2FNQ NSPLOX 1YGE 1LOX 2FNQ NSPLOX 1YGE 1LOX 2FNQ NSPLOX 1YGE 1LOX 2FNQ NSPLOX 1YGE 1LOX 2FNQ NSPLOX 1YGE 1LOX 2FNQ NSPLOX 1YGE LPTDPP-------MVWLLAKCWVRSSDFQVHELNSHLLRGHLMAEVFTVATMRCLPSIHP PHEENE-------HDWMMAKFWLGVAESNFHQLNTHLLRTHLTTESFALSTWRNLASAHP RPAESESDL---YWGWQMAKTVVQVAEENYHEMFVHLAQTHLVSEAFCLATQRTLAPSHP SQVVLPAKEGVESTIWLLAKAYVIVNDSCYHQLMSHWLNTHAAMEPFVIATHRHLSVLHP * * VFKLIVPHLRYTLEINVRARNGLVSDFGIFDQIMSTGGGGHVQLLQQAGAFLTYRSFCPP VFKLLQPHIYGVLAIDTIGRKELIGSGGIVDQSLSLGGGGHVTFMEKCFKEVNLQDYHLP LHVLLAPHFEGTLFINEGAARILLPSAGFIDVMFAAPIQDTQATAGGNRLGFDFYRGMLP IYKLLTPHYRNNMNINALARQSLINANGIIETTFLPS-KYSVEMSSAVYKNWVFTDQALP DDLADRGLLG------------VESSFYAQDALRLWEIISRYVQGIMGLYYKTDEAVRDD NALKKRGVDDPSK---------LPGFYYRDDGLALWEAIETFIGEIIAIFYKNDDDVKRD ESLKARNVDDPAA---------LPDYPYRDDGLLVWNAIRQWAADYVAVYYASDGDVTAD ADLIKRGVAIKDPSTPHGVRLLIEDYPYAADGLEIWAAIKTWVQEYVPLYYARDDDVKND LELQSWCREITEIGLQG---AQKQGFPTSLQSVAQACHFVTMCIFTCTGQHSSIHLGQLD NEIQSWIYDVHKNGWRVNPGHQDHGVPASFESREQLKEVLTSLVFTFSCQHAAVNFSQKD VELAAWVGEVIGSGKVAG--------FRPITGRSQLVEVLTMVIFTASAQHAAVNFPQPS SELQHWWKEAVEKGHGDLK---DKPWWPKLQTLEDLVEVCLIIIWIASALHAAVNFGQYP * WFTWVPNAPCTMRLPPPTTK--------DATLETVMATLPNLKQSSLQMSIVWQLGRDQP HYGFTPNAPAVLRHPPPKKKG-------EATLQSILSTLPSKSQAAKAIATVYILTKFSE MMTYAPAICAMSAAPAPDSPS-------GKSEADWLKMMPPTLVALEKVNIYHLLGSVYH YGGLIMNRPTASRRLLPEKGTPEYEEMINNHEKAYLRTITSKLPTLISLSVIEILSTHAS ----IMVPLGQHQEEYFSGP---EPRAVLEKFREELAIMDKEIEVRNEK----------L ----DERYLGNYSATAWEDK---DALDAINRFQDKLEDISKKIKQRNEN----------L GRLGDYRQTGFPYAPVFSDRRVTASGGPLERFQARLKEVEATIRTRNQA----------R ----DEVYLGQRDNPHWTSD--SKALQAFQKFGNKLKEIEEKLVRRNNDPSLQGNRLGPV DIPYEYLRPSI--------VENSVAI EVPYIYLLPER--------IPNGTAI RKPYEYLLPSR--------IPASTNI QLPYTLLYPSSEEGLTFRGIPNSISI * 662 699 685 839 384 414 401 523 444 474 461 582 492 525 512 642 549 585 564 699 601 638 617 759 644 681 667 813 Figura 33.- Alineament de la seqüència aminoacídica de part del domini carboxiterminal de les lipoxigenases de Pseudomonas aeruginosa 42A2 (NSPLOX), de Plexaura homomolla (2FNQ), reticulòcit de conill (1LOX) i la de Glycine max (1YGE). Els residus mostrats en vermell indiquen els residus que coordinen l’àtom de ferro. 77 3.2.5. Cavitats i substrat. Donada l’alta resolució a la que s’ha obtingut el cristall, en la lipoxigenasa de Pseudomones aeruginosa es poden veure definides clarament dues cavitats. Una per al substrat (que està formada per dues subcavitats) i l’altra per a permetre l’arribada de l’oxigen molecular fins al centre catalític de la proteïna. La primera és la cavitat del substrat que es subdivideix en dues cavitats perfectament definides per la presència d’un fosfolípid (Figura 34). Figura 34.- Secció de la cavitat del substrat de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa mostrant el mapa de densitat electrònica de la fosfatidiletanolamina que defineix les dues subcavitats del substart. Es pot observar com el cap polar del fosfolípid queda molt proper a les dues hèlix α, α2A i α2B (rosat). Donada la bona qualitat del mapa de densitat electrònica obtingut del fosfolípid, aquest es pot identificar com a una fosfatidiletanolamina amb una cadena de 18 carbonis en la posició 1 i una altra de 14 carbonis en la posició 2 (Figura 34). La cadena de 18 carbonis podria correspondre a un àcid vaccènic (C18:1 cis 11) característic de les membranes d’Escherichia coli (Ratledge C. and Wilkinson SG. 1988). Aquest fosfolípid s’ha d’haver incorporat a la lipoxigenasea durant la seva sobreexpressió en Escherichia coli i després, s’ha d’haver mantingut, amb 78 plena ocupació, durant tots els passos de la purificació i la cristal—lització. Cada una d’aquestes cadenes ocupa una de les subcavitats que conformen la cavitat del substrat. Aquesta cavitat és quasi completament hidròfoba a excepció de la presència de l’aigua W1, que actua com a lligand del ferro, i dels residus Tyr609 i Asn607 que es troben a la part inferior de les subscavitats 1 i 2 (respectivament) de la cavitat del substrat. Figura 35.- Representació de la superfície de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa on s’observa la cavitat de la fosfatidiletanolamina i el cap polar d’aquesta mateixa (entre la zona rosada que representa les dues hèlix α (α2A i α α2B) i la resta de la proteïna, en blanc). Marcat amb taronja es mostra l’entrada del canal que pot permetre l’entrada d’oxigen molecular fins al centre actiu. La següent cavitat que s’observa és un canal fortament hidrofòbic (no hi ha aigües visibles en el seu interior) que s’inicia a la superfície de la proteïna i arriba fins a la subcavitat 1, prop del carboni 15 de la cadena de 18 carbonis de la fosfatidiletanolamina (zona ataronjada de la figura 35 i de la figura 36). Aquest canal sembla molt adequat per permetre l'entrada d'oxigen al centre actiu de manera similar a la situació discutida per a altres lipoxigenases (Youn B., Sellhorn GE. et al. 2006). Els aminoàcids que defineixen aquest canal són: Val86, Gly88, Leu383, Glu386, Asn417, Ala421 i Gln443. 79 Figura 36.- Representació de l’aproximació del canal (marró) que permet l’arribada de l’oxigen molecular al centre actiu de la lipoxigenassa des de la superfície d’aquesta (blau) fins la cavitat del substrat ocupada per la cadena 1 de la fosfatidiletanolamina (groc). Amb vermell es representa l’àtom de ferro mostren també els residus que el coordinen. i es L’empaquetament observat en els extrems de les cadenes alifàtiques del fosfolípid suggereix que ambdues subcavitats podrien acomodar cadenes de dos o quatre carbonis més com és el cas de l’àcid araquidònic (C20:5,8,11,14). La cadena alifàtica en posició 1 (C1) presenta una conformació doblegada amb l’extrem metil corbat cap al cap polar del lípid (Figura 34), la distància entre el carboni 1 i el carboni 18 d’aquesta cadena és de 13,56 Ǻ. Els cinc carbonis que es troben entre el carboni 10 i el carboni 14 equidisten del ferro uns 5,14 Ǻ (de mitjana) i de l’aigua que coordina el ferro, uns 3,69 Ǻ. La geometria determinada per aquesta cadena, tenint en compte que la posició dels dobles enllaços no ha estat directament observada degut a que la resolució del cristall no ho permet, suggereix que la cavitat on es troba, afavoreix una conformació cis, generalment associada amb els enllaços insaturats dels àcids grassos. Entre els carbonis en posició 11-12 i en posició 14-15, trobem una desviació del pla de 16º i 50º respectivament. El suposat doble enllaç entre els carbonis 11 i 12 és el més proper al ferro i els hidrògens associats a aquests carbonis es troben a la banda oposada a la del metall. Els carbonis 14 i 10 es situen sobre els anells dels residus His382 i His377 respectivament, a una distància de 3,9 Ǻ del nitrogen d’aquests lligands del ferro. Pel que fa al suposat doble enllaç que hauria d’haver entre els carbonis 14 i 15 necessari per a formar el grup 80 pentadiè, els 50º de desviació del pla entre l’un i l’altre n’indiquen l’absència, això fa que el substrat no sigui l’adequat per a aquest enzim, el que explicaria per què seguim trobant aquest constructe enzim-substrat consolidat i sense reaccionar. La geometria per a la segona cadena d’àcid gras de la fosfatediletanolamina que està ocupant la subcavitat 2 de la cavitat del substrat, la cadena de 14 carbonis en posició 2, no ha estat descrita en cap altre estructura de lipoxigenasa. Aquesta geometria suggereix que la conformació cis entre els àtoms de carboni 5 i 6, seria la més afavorida tot i que en aquest cas, la desviació del pla entre l’un i l’altre és de 31º, cosa que, de nou, n’indicaria la seva absència. Sobre aquestes bases, el fosfolípid unit a la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa més probable és O-(sn-1-cis-vaccenil-sn-2-miristoilsn-glicèric-3-fosforil) etanolamina, encara que una cadena sn-1-estearoil també és possible. L’àcid cis-vaccènic és un àcid gras d’Escherichia coli que pot ser particularment abundant en cultius incubats a baixa temperatura. Una cadena tan curta com l’observada de 14 carbonis ocupant la posició sn-2 del glicerolípid no és comú. El cap polar de la fosfatidiletanolamina es troba parcialment exposat al dissolvent i també forma dos enllaços iònics amb la proteïna (figura 37). El primer, entre el grup fosfat de la fosfatidiletanolamina i el grup guanidina del residu Arg422, i el segon entre el grup amino terminal de la fosfatidiletanolamina i el grup carboxílic del residu Asp190 de l’α hèlix 2B. La presència de la contigüitat espacial dels residus Asp190 i Arg422 (Figura 37) semblaria indicar que aquesta lipoxigenasa és molt adequada per a captar fosfolípids zwitterions, en particular, amb petits grups carregats positivament en posició terminal com és el cas de la fosfatidiletanolamina observada en el cristall. 81 Figura 37.- Enllaços iònics entre el cap polar del fosfolípid i els residus Asp190 i Arg422 de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa que suggereixen una especificitat per fosfolípids zwitterionics. La cadena lateral del residu Arg422 presenta flexibilitat cosa que ofereix versatilitat a l’hora d’unir-se als grups àcids dels diferents substrats. De fet, en la majoria de les seqüències de lipoxigenases, en la posició equivalent a l’arginina 422 de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa, o en el residu previ, sol haver-hi una arginina (figura 33), podent interactuar amb el grup carboxilat dels àcids grassos corresponents del substrat (Coffa G. 2004). 3.2.6. EPR: Ressonància paramagnètica electrònica. Les dues formes oxidades del ferro (ferrós Fe2+ i fèrric Fe3+) són intermediaris en la catàlisi de la lipoxigenasa. Mostres de la lipoxigenasa purificada a concentracions que van de 0.1mM a 0.4mM no presenten senyal d’EPR fet que recolza la idea que quan la lipoxigenasa està inactiva, la forma de ferro que conté és la de l’estat ferrós (Fe2+) que en el seu estat fonamental no és un paramagnètic i per tant no és detectable mitjançant la tècnica de l’EPR. En afegir a la mostra de proteïna 13S-HPODE (13S-hydroperoxy-9Z,11Eoctadecadienoic àcid), s’observen senyals d’EPR de l’estat fèrric d’alt espin (figura 38) tot i que l’oxidació és relativament lenta i requereix uns deu minuts a temperatura ambient per a completar la reacció (figura 38A i B). 82 Figura 38.- Espectre d’EPR del ferro en estat fèrric de la lipoxigenasa oxidada de Pseudomonas aeruginosa. Es mostra l’espectre d’EPR en la zona baixa del camp magnètic de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa del ferro en estat fèrric d’alt spin. L’agent oxidant és 13S HPODE. (A i B): espectre quan s’afegeix un sol equivalent de l’agent oxidant, la intensitat màxima del senyal s’obté als deu minuts a temperatura ambient (A: després d’1 min; B: després de 10 min), (C) amb deu vegades més agent oxidant (10 min) s’obté la màxima intensitat de senyal, que resulta en dos components de senyal d’EPR després de l’addició d’etanol a l’1%. per a l’estat fèrric del ferro, (D) L’oxidació completa del ferro (de Fe 2+ a Fe 3+ ) ha estat confirmada per comparació (Figura 39) amb l’espectre de la lipoxigenasa LOX-1 de Glycine max (Gaffney BJ, Mavrophilipos DV et al. 1993). Es requereix un excés de 10 equivalents de HPODE per tal d’obtenir una intensitat de senyal màxima d’EPR (Fig 38C). Tot i que els espectres obtinguts són lleugerament diferents amb diferents buffers, s’observa un canvi notable quan s’afegeix etanol a la mostra (la mostra usada per a la figura 38C, dóna la figura 38D quan s’hi afegeix etanol a l’1%). Els senyals d’EPR corresponen a dues espècies de Fe(III) amb simetries diferents, de les quals una d’elles, la de simetria ròmbica, és dominant. (figura 38 a-c). La transició entre els doblets de Kramers més baix i mitjà dóna lloc a una ressonància a g = 7.23 i g ~ 2 pel doblet d’energia més baix (veure l’escala superior de la figura 38 i figura 39) i la banda ampla amb màxim a 136 mT i mínim a 160 mT, centrada a g = 4.2, pel doblet d’energia mitjà. L’adició d’etanol a la mostra dóna com a resultat una alteració de 83 l’espectre (figura 38D). En el nou espectre apareixen amb una intensitat elevada dos nous pics a g ~ 103 mT i g ~ 106 mT, disminuint en part el pic corresponent a g = 7.23. La interpretació d’aquests resultats és que el centre de l’àtom de ferro de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa té una simetria axial, amb diferents graus de distorsió ròmbica essent influenciada per la mateixa proteïna i per una feble afinitat amb alguns components del dissolvent. La presència del fosfolípid en la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa usada per a fer experiments d’EPR ha estat confirmat per anàlisi d’ICP-MS de P/Fe obtenint una relació de 0,8 per a la lipoxigenasa de Pseudomonas i absència de P per a la lipoxigenasa LOX1 de soja (soroll de fons del tampó substret). És remarcable que l’espectre d’EPR per aquesta lipoxigenasa que conté un fosfolípid s’assembla molt als d’altres lipoxigenases que, inicialment, tenen les cavitats del substrat buides (Gaffney BJ, Mavrophilipos DV et al. 1993). Figura 39.- Comparació de l’espectre d’EPR del ferro en estat fèrric de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa (Pa_LOX) i de la lipoxigenasa de Glicine max (Soy LOX-1). Totes dues mostres dels espectres estaven a una concentració de 0,118 mM en tampó fosfat potassi 0,2 M a pH 7,0. Ambdues proteïnes s’han oxidat amb 13S-HPODE, se n’ha utilitzat un equivalent per oxidar la LOX-1 i deu equivalents per a oxidar la Pa_LOX 84 3.2.7. Consideracions globals La diferència més evident entre la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa i les lipoxigenases d’organismes eucariotes descrites fins aquest moment és l’absència del domini PLAT N-terminal i la presència de dues hèlix α antiparal—leles conformat una inserció de 90 aminoàcids no observada en cap altre lipoxigenasa. Aquestes dues hèlix se situen sobre el què, en les lipoxigenases eucariotes, és el domini catalític de la proteïna i; sobre l’obertura a la superfície de la cavitat del substrat. La situació d’aquestes dues hèlix, juntament amb l’absència d’estructura per al loop d’unió entre aquestes dues hèlix i la resta de la proteïna, fa pensar que aquesta inserció actua com a “tapa” de la cavitat del substrat ja que l’absència d’estructura en aquest loop està indicant que és una zona amb una alta mobilitat. Aquesta mobilitat permetria que, amb un moviment de rotació sobre la hèlix α2A, la cavitat del substrat quedés més exposada a l’exterior permetent, així, l’entrada del substrat a la cavitat. Aquesta hipòtesi es veu reforçada si tenim en compte que les interaccions d’aquestes dues hèlix es donen exclusivament entre elles mateixes i amb la hèlix 2 de manera que el moviment d’aquesta estructura està poc limitat. Un altre aspecte molt interessant d’aquesta nova estructura descrita per aquesta lipoxigenasa d’origen procariota i que recolza la hipòtesi exposada anteriorment, és que el substrat observat, la branca alifàtica de 14 carbonis que ocupa la subcavitat més allunyada del centre actiu, interactua amb aquestes dues hèlix. A més a més, la branca alifàtica de 14 carbonis del fosfolípid interactua amb l’hèlix α 2 mentre que el cap polar del fosfolípid es troba parcialment exposat al dissolvent i forma dos enllaços iònics amb la proteïna, un d’ells amb el residu Asp190 que forma part de l’hèlix α2B. Les interaccions entre la cadena alifàtica de 14 carbonis i la proteïna, permetrien “ancorar” el fosfolípid a la proteïna de manera que l’altre cadena alifàtica (cadena més llarga de 18 carbonis) tendiria a entrar a l’altre subcavitat que s’acosta al centre catalític de l’enzim per tal que tingués lloc la reacció d’hidroperoxidació. Per altra banda, les unions del cap polar del fosfolípid amb l’hèlix α2B farien que, quan aquestes 85 dues hèlix antiparal—leles fessin el moviment d’”obertura”, tot el fosfolípid fos “estirat” cap a l’exterior de manera que aquestes interaccions ajudarien en el procés d’alliberació del substrat, un cop hidroperoxidat. Així doncs, l’estructura descrita anteriorment i la presència dels residus Asp190 (carrega negativa) i Arg422 (càrrega positiva) amb un a disposició espacial específica semblen indicar d’un que aquesta lipoxigenasa (compost permet químic perfectament l’acomodació fosfolípid zwitterió elèctricament neutre però que té càrregues formals positives i negatives en àtoms diferents) en la cavitat del substrat i particularment fosfolípids amb petits grups carregats positivament com pot ser el cas d’aquesta fosfatidiletanolamina observada en el cristall, amb una càrrega positiva en el grup amino terminal (formant un enllaç iònic amb l’àcid aspàrtic en posició 190). L’absència del domini PLAT planteja diverses qüestions ja que, per aquest domini que és present en totes les lipoxigenases d’origen eucariota, s’ha suggerit una interacció depenent de Ca2+ directa amb la membrana per a lipoxigenases vegetals i altres interaccions proteïna-proteïna i proteïna-lípid per analogia amb les lipases (Ponting CP. and Aravind L. 1999). Així doncs, si aquesta lipoxigenasa no presenta cap estructura que l’associï a membranes o a proteïnes de membrana, quina funció o rol biològic té aquest enzim? La inserció observada en aquesta lipoxigenasa procariota pot ser present en altres lipoxigenases procariotes com és el cas de la de Burkolderia thailandensis E263 però el paper biològic d’aquesta lipoxigenasa tampoc ha estat descrit. Un altre aspecte que planteja qüestions és l’alta conservació que es detecta en la primera esfera de coordinació del ferro. Això fa pensar que aquesta estructura és l’única que permet dur a terme la reacció d’hidroperoxidació sobre un grup pentadiè d’un àcid gras. Les diferents lipoxigenases produeixen diverses addicions d’oxigen en cadenes poliinsaturades i de forma específica. El mecanisme d’addició implica un protó-electró acoblat a la transferència d’un hidrogen, pas que presenta un dels principals efectes isotòpics cinètics observats durant la reacció. S’ha fet un progrés considerable en la comprensió d'aquests aspectes de la catàlisi de les 86 lipoxigenases mitjançant el modelatge de substrats dins les diferents estructures de lipoxigenases i amb estudis cinètics i de mutació. No obstant això, no ha estat fins aquesta tesi que s’ha obtingut una estructura amb un àcid gras no oxidat ocupant totalment la cavitat del centre actiu. La geometria determinada en la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa del lípid de la cadena 1C del fosfolípid descrit (cadena de 18 carbonis) suggereix que un veritable substrat per a lipoxigenases, aquell que contingui un grup 1-4, Z-Z, pentadiè, podria reaccionar amb aquesta lipoxigenasa si fos activa (Fe3+-OH) per tal de formar un sistema intermediari radical deslocalitzat de cinc carbonis (pentadienil) amb el sistema π recolzat sobre els anells de dos histidines que es troben lligant el ferro a la proteïna. La planitud d’aquest radical intermediari forçaria que un dels extrems del radical pentadienil es trobés lluny del ferro cosa que facilitaria la posterior addició regioselectiva de l’oxigen. El suposat doble enllaç en posició 11/12 de la cadena 1C es troba en la mateixa posició que el penúltim doble enllaç de l’àcid araquidònic i, amb l’àcid araquidònic com a substrat, l’hidrogen s’abstreuria en el carboni 13. El mecanisme general acceptat de les lipoxigenases té l’hidroxil lligand del ferro (aigua) com a acceptor final de la transferència de l’hidrogen. En l’estructura obtinguda en aquesta tesi, els dos hidrògens del carboni 13 de la cadena 1C del fosfolípid s’estimen a una distància de 3,96 i 5,06 Ǻ de l’aigua, que actua com a lligand del ferro, i a 5,80 i 6,52 Ǻ de distància del ferro. Alternativament, i prenent el suposat doble enllaç C11/12 de la cadena 1C com a model del doble enllaç de C12/13 de l’àcid linoleic, els hidrògens del carboni 10 serien els del carboni 11 del linoleat que es troben a 2,97 i 3,48 Ǻ de l’aigua (4,73 i 5,52 Å del ferro), distàncies notablement més curtes que les anteriorment esmentades i que permetrien que l’hidroxil de l’aigua acceptés l’hidrogen transferit. En el cicle catalític de les lipoxigenases generalment acceptat és inherent la necessitat que, en el cicle del ferro, fèrric-ferrós-fèrric, l’estat ferrós natiu ha de ser preactivat mitjançant el consum d’un equivalent de HPODE (Kulkarni AP 2001). Els resultats dels estudis d’EPR de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa està d’acord amb aquestes premisses bàsiques, però s’observen 87 diferències quan es comparen amb els resultats obtinguts amb la lipoxigenasa de soja LOX-1 (Gaffney BJ, Mavrophilipos DV et al. 1993). L’espectre d’EPR de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa té dos components amb uns paràmetres E/D (paràmetre que dóna informació sobre l’energia i la simetria del component) essencialment idèntiques a les trobades per la lipoxigenasa de la soja tot i què difereixen de dues maneres diferents. En primer lloc, la forma de la línia en l'espectre d'EPR de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa s'obté d’igual manera ja sigui oxidant l'enzim amb HPODE o si reacciona amb l'àcid linoleic com a substrat (aquest espectre persisteix durant hores i hores d'emmagatzematge de mostres a 4°C). Amb la soja, un espectre similar, és a dir sense segon component substancial, només s'observa fent una ràpida congelació de les proteïnes a baixes concentracions (≤ 0,1 mM), després de l'oxidació amb 13S HPODE pur. En segon lloc, el nombre d'equivalents de HPODE necessaris per proporcionar la màxima intensitat de senyal de l’estat fèrric del ferro en l’EPR és d’1 per a la lipoxigenasa de soja i de 10 per a la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa. Altres estudis d'espectroscòpia (Solomon EI., Zhou J. et al. 1997) han comparat els espectres d’EPR de la forma fèrrica del ferro de la lipoxigenasa de soja, amb compostos de ferro model, amb la conclusió que la forma de ferro amb una distorsió ròmbica més gran (la forma que s’observa en la figura 4 dels espectres 4 A, B i C) correspon a un ferro coordinat amb cinc lligands. L’enllaç entre el residu Asn559 i el ferro de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa té una longitud de 2,37 Å però en altres estructures de lipoxigenases de soja oscil—la entre 2.87-3.3 Å (Boyington JC., Gaffney BJ. et al. 1993);(Minor W. 1996; Youn B., Sellhorn GE. et al. 2006). A partir d’'aquestes observacions es pot suggerir que l'espectre d'EPR característic (Figura 38C) és el resultat de que l'enllaç Fe-Asn559 en la primera forma fèrrica (Fe3+) de l’intermediari en la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa que no pas en la lipoxigenasa inactiva en estat ferrós (Fe2+). El fet que el ferro de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa pugui ser oxidat per un àcid gras HPODE planteja una qüestió interessant sobre la possible entrada de substrat o HPODE a la cavitat del substrat quan aquesta ja 88 està ocupada per una cadena de lípids. La baixa solubilitat dels fosfolípids en aigua fa poc probable que el fosfolípid present en la lipoxigenasa sigui completament eliminat de la proteïna quan s’està canviant l’estat del ferro de Fe2+ a Fe3+ (oxidació de ferrós a fèrric). S’ha discutit molt sobre com es dóna l’entrada del substrat a la cavitat buida, si ho fa amb l’extrem metil per davant, o si ho fa amb l’extrem carbonil per davant. Doncs bé, vista la reactivitat que es dóna quan s’ajunten la lipoxigenasa amb el fosfolípid en la cavitat i el 13SHPODE (màxima intensitat de senyal d’EPR quan es treballa amb 10 equivalents de 13S-HPODE per un de lipoxigenasa amb fosfolípid) i la forma de la cavitat del substrat, que s’acosta al ferro i després fa un gir acostant-se a la superfície de la proteïna (Neau DB., Gilbert NC. et al. 2009); (Choi J. 2008); (Youn B., Sellhorn GE. et al. 2006), és fàcil suggerir que l’entrada del substrat es dóna amb l’extrem metil terminal per davant. La gran cavitat d’unió de substrat que presenta la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa i que conté un fosfolípid sembla especialment dissenyada per a acceptar els fosfolípids zwitteriònics. A més a més, l'especificitat de les lipoxigenases cap a fosfolípids poliinsaturats, que poques vegades són presents en els bacteris, obre un nou marc d’estudi en la recerca de les funcions biològiques de les lipoxigenases procariotes. La secreció de les lipoxigenases de bacteris podria permetre la modificació dels fosfolípids de les cèl—lules eucariotes de les proximitats dels bacteris. Aquest nou rol funcional de les lipoxigenases procariotas, podria complementar les activitats atribuïdes a un grup especial de toxines microbianes enzimàtiques, en particular, fosfolipases bacterianes i esfingomielinases, actuant a nivell de membrana de la cèl—lula hoste (Montes LR, Ibarguren M et al. 2007). 89 4. CAPÍTOL 2: Prospecció metagenòmica de noves lipoxigenases 4.1. 4.1.1. Material i mètodes Recollida de mostres i extracció de DNA de sòls. Les mostres de sòl per a la generació de la biblioteca metagenòmica van ser recollides en una àrea propera al Departament de Tecnologia de l’escola de Ciències Agràries i de Medicina Veterinària de la Universitat de l’Estat de Sao Paulo (UNESP - Jaboticabal / Brasil). Aquesta àrea ha estat cultivada des de l’any 1996 amb Eucalyptus spp. En total es van recollir 20 mostres de sòl en vint punts diferents (de 0 a 20 centímetres de profunditat). L’estratègia de mostreig fou per atzar en zigzag. Les mostres varen ser homogenitzades resultant una única mostra representativa dels 20 punts de mostreig. Posteriorment, amb 0.5 grams d’aquesta mostra, es va procedir a l’extracció de DNA metagenòmic amb el kit Fast DNA Spin Kit for Soil (Q Bio gene), d’acord amb les instruccions del fabricant. 4.1.2. Construcció d’una llibreria metagenòmica amb còsmids. La llibreria metagenòmica utilitzada per a aquest estudi va ser construïda usant el kit pWEB-TNC™ Cosmid Cloning Kit (Epicentre Biotechnologies). El DNA metagenòmic es va fragmentar pipetejant-lo repetidament amb una pipeta P20 fins obtenir la mida desitjada d’insert, entre 20 i 40 Kb. Aquests fragments van ser separats per electroforesi en gel d’agarosa, es van extreure les bandes compreses entre els 20 i els 40 Kb, es va purificar el DNA i es va lligar en el vector còsmid pWEB-TNC™. La mescla de lligació es va empaquetar en un fag lambda usant el kit MaxPlax Lambda Packaging Extracts (Epicentre). Seguidament es va transformar la soca Escherichia coli EPI100™-T1R, els transformants es van seleccionar en plaques d’agar Luria-Bertani amb 70 g/ml d’ampicil—lina. Les g/ml d’ampicil—lina. colònies transformades es van transferir en plaques microtiter de 96 pous (Nalgene, Rochester, NY) amb medi Lauria-Bertani amb 70 Es van incubar durant 22 hores a 37ºC i a 180 rpm, posteriorment es van 93 congelar a -80ºC prèvia addició de glicerol com a criprotector. La mida final de la biblioteca metagenòmica és de 9024 clones (94 plaques x 96 clons). 4.1.3. Gels d’agarosa S’ha utilitzat la electroforesi en gel d’agarosa per a separar els diferents fragments de DNA obtinguts en les extraccions de DNA de sòls, per a la seva fragmentació i per a la selecció de productes resultants de les reaccions de PCR en funció de la seva mida. Variant la concentració d’agarosa s’obté una major eficiència en la separació dels fragments de DNA (Sambrook J., Fritsch E. et al. 1989). S’han utilitzat gels a l’1% d’agarosa (Pronadisa) i 1µg/ml de bromur d’etidi (Sigma) en tampó TAE mitjançant una cubeta d’electroforesi minisub DNA Cell (BioRad SA, Madrid). El tampó TAE es prepara concentrat 50 vegades (1L: 242 g Tris, 57,1 ml àcid acètic glacial i 100 ml EDTA 0,5M a pH 8.0) i s’utilitza per diluir l’agarosa i com a tampó d’electroforesi a una concentració final de 40mM de Tris-Acètic i 1 mM d’EDTA. Les mostres es mesclen amb un tampó de càrrega en proporció 5:1 (volum:volum), que conté un 30% de glicerol, un 0,25% de blau de bromofenol i un 0,25% de xilencianol. Per determinar la mida dels fragments de DNA es compara la seva mobilitat electroforètica amb uns marcadors “1Kb Ladder” (Promega) i “Analytical Marker DNA Wide Range” (Promega) en funció de la mida de banda buscada. El primer presenta bandes que van de 10000 fins a 250 parells de bases, mentre que el segon les presenta de 29950 fins a 702 parells de bases. Un cop realitzada l’electroforesi, per visualitzar els fragments de DNA, els gels d’agarosa es submergeixen durant 15 minuts en una dissolució de bromur d’etidi (Sigma, EEUU) a una concentració de 0,75 Passat aquest temps, mitjançant la llum g/ml en aigua destil—lada. d’un sistema ultraviolada d’ImageMaster® (Pharmacia Biotech, Suïssa), es poden observar els fragments de DNA ja que el bromur d’etidi té la capacitat d’intercalar-se entre les bases de l’àcid nucleic i emetre fluorescència en ser irradiat amb llum UV. 94 La concentració de DNA present en les mostres s’ha determinat mitjançant un espectrofotòmetre NanoDrop 1000 (Thermo Scientific).La recuperació de les bandes de DNA s’ha fet amb el kit Wizadr SV Gel and PCR CleanUp System (Promega) basat en el principi d’adsorció del DNA a una resina de sílica, prèvia fusió de l’agarosa, i l’el·lució d’aquest per la diferència de pH i la concentració de sals dels tampons utilitzats (Volgestein B. and Gillespie D. 1979). 4.1.4. Disseny d’encebadors específics i degenerats. Els encebadors específics es van dissenyar amb el programa Gene Runner a partir de la seqüència de la lipoxigenassa de Pseudomonas aeruginosa 42A2 (Accés GenBank AF479686.2 i GI:283788580) sense el pèptid senyal. Els encebadors degenerats es van dissenyar amb el programa DePict 2.0 a partir de les seqüències de lipoxigenases bacterianes extretes del GeneBank (taula 7) i sota les següents condicions: Seqüències alineades i carregades amb format Clustal Rang de longitud permesa de l’encebador: 18 – 25 pb Rang de longitud del producte de PCR permès: 300 a 5000 pb Encebadors produïts amb extrems cohesius Degeneració màxima acceptada: 1024 Organisme Myxococcus xanthus DK 1622 Deltaproteobacteria Polyangium cellulosum Deltaproteobacteria Pseudomonas aeruginosa PAO1 Gammaproteobacteria Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14 Gammaproteobacteria Shewanella woodyi ATCC 51908 Gammaproteobacteria Shewanella woodyi ATCC 51908 Gammaproteobacteria Shewanella woodyi ATCC 51908 Gammaproteobacteria Shewanella denitrificans OS217 Gammaproteobacteria Photobacterium profundum 3TCK Gammaproteobacteria Nitrosomonas europaea ATCC 19718 Betaproteobacteria Nitrosospira multiformis ATCC 25196 Betaproteobacteria Burkholderia thailandensis E264 Betaproteobacteria Nostoc sp. PCC 7120 Cyanobacteria Cyanothece sp. CCY0110 Cyanobacteria Acc. Number - GI NC_008095.1 - 108756767 AAY32974.1 - 63099951 NC_002516.2 - 110645304 CP000438.1 - 115583796 NZ_AAUO01000010.1 - 118072427 NZ_AAUO01000023.1 - 118073771 ZP_01543473.1 - 118075346 NC_007954.1 - 91791369 ZP_01218321.1 - 90410305 NP_841292.1 - 30249222 NC_007614.1 - 82701135 CP000086.1 - 83652219 NP_478445.1 - 17227394 NZ_AAXW01000016.1 - 126658225 Taula 7.- Lista de seqüències usades per al disseny dels encebadors degenerats 95 4.1.5. 4.1.5.1. PCR i PCR de seqüenciació. PCR La reacció en cadena de la polimerasa o PCR amb encebadors degenerats i específics, s’ha realitzat a un volum final de 20 µl en dos tipus de termocicladors diferents: el 2720 Thermal Cycler (Applied Biosystems) i el Veriti 96 Well Thermal Cycler (Applied Biosystems). Per a les PCRs amb encebadors degenerats i amb encebadors específics s’han usat les següents condicions: Mescla de reactius per a la PCR Encebadors Tampó (x10) MgCl2 25 mM dNTP’s Taq Polimerasa 5U/µl DNA motlle Aigua Milli-Q autoclavada 100-200 pM 2 µl 0,8 µl 0,4 µl 0,2 µl 60-80 ng fins a 20 µl El programa de PCR aplicat en el termociclador en el cas de la reacció amb encebadors degenerats (taula 8) i el programa per a encebadors específics (taula 9) són els següents: Programa de la reacció d’amplificació amb encebadors degenerats Cicles 1 40 Temperatura 95 ºC 95 ºC 48 ºC 72 ºC 1 1 72 ºC 4 ºC Temps 5 min 1 min 1,5 min 2 min 5 min ∞ Taula 8.- Programa de la reacció d’amplificació amb encebadors degenerats. 96 Programa de la reacció d’amplificació amb encebadors específics Cicles 1 40 Temperatura 95 ºC 95 ºC 48 ºC 72 ºC 1 1 72 ºC 4 ºC Temps 5 min 1 min 1,5 min 2 min 5 min ∞ Taula 9.- Programa de la reacció d’amplificació amb encebadors específics. 4.1.5.2, PCR de seqüenciació Durant la primera etapa de seqüenciació s’ha seguit el mètode de Sanger i modificat per Prober i col—laboradors. Aquest mètode consisteix en fer una reacció en cadena de la polimerasa barrejats amb els un sol encebador i amb dideoxinucleòtids (ddNTP) amb deoxinucleòtids. D’aquesta manera, quan la polimerasa incorpori a la cadena de DNA un ddNTP, aquesta no trobarà cap grup hidroxil 3’ lliure sobre el qual afegir el següent nucleòtids per a continuar elongant la cadena, aturant així, la polimerització de la mateixa. Així doncs, al final de la reacció de PCR, obtindrem una població de cadenes de DNA de longituds diferents i amb increments d’una base cada cop, amb la característica comuna de que totes hauran incorporat un ddNTP en el seu extrem 3’. La potència d’aquesta tècnica consisteix en que cada un dels quatre ddNTP’s (ddA, ddT, ddC, ddG) està marcat amb un fluorocrom diferent, de manera que podem separar els fragments de DNA i detectar el color corresponent a cada fragment. Obtenim la seqüència del nostre DNA d’interès simplement llegint per ordre d’aparició les bandes de l’electroforesi capil—lar i traduint el color de cada banda al nucleòtid corresponent. Per fer la PCR de seqüenciació s’ha utilitzat el kit de seqüenciació automàtica BigDye® Terminator v3.1 (Applied Biosystems, EEUU) que ja incorpora la DNA polimerasa termoestable, els dNTPs i els ddNTP’s marcats en el tampó adequat. Les condicions emprades per a les diferents reaccions de PCR de seqüenciació han estat les següents: 97 Mescla de reactius per a la PCR de seqüenciació 1 µl de Ready reaction mix 1 µl de tampó Big Dye® 10X X µl d’ADN 3.2 pmols d’encebador forward o backward Aigua milli-Q autoclavada fins a 10 µl Programa de la reacció d’amplificació Cicles 1 25 Temperatura 94 ºC 96 ºC Tª d’hibridació específica per a l’encebador 60 ºC 1 4 ºC Taula 9.- Programa de la PCR de seqüenciació. Temps 1 min 30 seg 15 seg 4 min ∞ Quan ha acabat la reacció de seqüenciació (taula 9), són els Serveis Cientifico-Tècnics de la Universitat de Barcelona, situats a la Unitat de Genòmica del Parc Científic de Barcelona, els que s’encarreguen de la purificació i precipitació del DNA per a la posterior seqüenciació. La seqüència de nucleòtids s’obté mitjançant el sistema analític CEQTM 8000 amb el seqüenciador ABI Prism® DNA377 (Perkin Elmer, EEUU). 4.1.6. Extracció dels clons de DNA cosmídic de les plaques de cultiu de 96 pous. Per tal d’extreure els còsmids cal, en primer lloc, tenir un cultiu de 3 ml de cada clon. Per això, cada clon de la llibreria metagenòmica es transfereix a un pou d’una placa de 96 pous de 3 ml de capacitat (deep 96-well plate de Nalgene, Rochester, NY) on s’incuba en medi líquid Luria-Bertani amb 70 d’ampicil—lina en agitació a 180 rpm a 37ºC durant una nit. g/ml 98 Un cop han crescut les cèl—lules, són centrifugades a 4000 rpm durant 5 minuts i els còsmids són extrets seguint els següents passos: 1er.- Resuspensió de les cèl—lules en 240 µl de solució GET (20 % de glucosa, EDTA 0,5 M a pH 8,0 i 1M Tris-HCl pH 7,4 esterilitzat) per a cada mil—lilitre de cultiu. 2on.- Centrifugació de la solució a 4000 rpm durant 8,5 minuts, descartar el sobrenadant i deixar la placa tombada sobre un paper absorbent durant 5 minuts. 3er.- Resuspendre les cèl—lules en 80 µl de GET i transferir 60 µl d’aquesta suspensió en un pou d’una placa de 96 pous (96-well plate, Nalgene, Rochester, NY). Afegir-hi 2,5 µl de RNAse (10mg/ml) i 80 µl de solució de lisi (NaOH 0,2N i SDS 1%). Seguidament es segella la placa i s’agita per inversió 30 vegades. 4art.- S’incuba la placa 10 minuts a temperatura ambient i s’afegeix 80 µl d’una solució 3 M de KOAc a 4 ºC. S’agita per inversió 20 vegades. S’incuba 10 minuts més a temperatura ambient i es centrifuga a 4000 rpm. 5è.- Es destapa la placa i s’incuba 30 minuts a 90 ºC. Es segella de nou i es centrifuga a 4000 rpm durant 15 minuts a 20 ºC. 6è.- Es filtren 170 µl de la solució en plaques “multi screen filter” que s’adapten a les plaques microtiter de 96 pous. La filtració es fa per centrifugació a 4000rpm durant 6 minuts a 20 ºC. 7è.- S’afegeixen 100 µl d’isopropanol a la solució filtrada. Es segellen les plaques i es mescla la barreja per inversió. Seguidament es centrifuga a 20 ºC durant 45 minuts i a 4000 rpm. El sobrenedant és descartat i el sediment es renta amb 200 µl d’etanol al 70%. 8è.- Es centrifuga la placa durant 5 minuts a 20 ºC i a 4000 rpm. Es descarta el sobrenedant i es deixen assecar les plaques a temperatura ambient 99 en una cambra de flux laminar durant una hora. El DNA cosmídic obtingut es dilueix en 50 µl d’aigua milli-Q estèril. 4.1.7. Construcció d’un microarray usant DNA clonat en còsmids. La impressió del microarray s’ha fet amb un robot model GMS 417 Arrayer (Affymetrix Inc., Clear Saint, HERE, USES) del Departament de Tecnologia de l’Escola de Ciències Agràries i de Medicina Veterinària de la Universitat de l’Estat de Sao Paulo (UNESP-Jaboticabal/Brasil). El microarray s’ha preparat sobre un portaobjectes prèviament tractat amb aminosilà (GMT-GAPS, Corning, Cat. nº 40004). Els punts d’impressió es troben separats per 250 m. S’han imprès quatre plaques (6, 71, 85 i 89) i cada còsmid (cada clon) s’ha imprès per duplicat generant així un microarray amb 768 punts d’impressió (spots). El clon en posició 1A de la placa 85 ha estat substituït per el plàsmid que conté la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa per usar-ho com a control positiu en el revelat de l’array. Els còsmids impresos han estat rehidratats amb un bany de vapor amb aigua a 70ºC durant 10 segons i, seguidament, sotmesos a 70 ºC durant un minut. Després s’ha fixat el DNA al portaobjectes amb llum ultraviolada en un UV croslinker amb una energia de 1300 x 100 buit fins que s’hagi de fer la hibridació. 4.1.8. Disseny i producció de les sondes per a revelar el microarray Per a revelar el microarray s’han utilitzat dues sondes generades a partir d’una PCR amb la seqüència gènica del gen de la lipoxigenasa com a DNA motlle i amb els encebadors específics en un cas i amb els degenerats en l’altre. J/cm2. Un cop fixat el DNA es torna a sotmetre el microarray a 70ºC durant dues hores i després es guarda al Encebadors específics: Encebador forward LoxPAFWD: 5’ TAATCCGCTGCTGATCCG 3’ Encebador reverse LoxPAREV: 5’ CCAGGTGGACGAACATCTC 3’ 100 Encebadors degenerats: Encebador forward LoxF: 5’ CCSGTRGCSATYCARTGC 3’ Encebador reverse LoxR: 5’ GCRTTCCAVAYYAGBAGG 3’ Tant la sonda específica (la que ha estat produïda amb els primers específics) com la sonda degenerada (la que ha estat produïda amb els primers degenerats) s’han produït mitjançant una PCR feta sota les condicions exposades anteriorment en l’apartat 5.1.5.1. La sonda específica te una longitud de 411 parells de bases i representa el 19,5 % del gen de la lipoxigenase de Pseudomonas aeruginosa mentre que la sonda degenerada te una longitud de 488 parells de bases i representa el 22,8 % del gen. Així doncs, les dues sondes cobreixen un 36,15 % del gen. 4.1.9. Marcatge fluorescent de les sondes El marcatge de 100 ng del producte de la PCR s’ha realitzat usant el kit BioPrime DNA Labeling Kit (Invitrogen, Carlsbad,CA) seguint les instruccions del fabricant. El producte de la PCR que produeix les sondes es dissol a 100 ng/µl i s’incuba a 95ºC durant 5 minuts. Després es refreda ràpidament a 4 ºC. Cada 25 µl de mostra de DNA es mesclen amb 4 µl de first strand buffer 5X (Invitrogen) que conté una mescla de random primers, amb 2 µl de DTT 100 mM, amb 2 amb 1 L de mescla de dNTPs (5 mM dATP, dGTP, dCTP i 2 mM dTTP), l de Cy3-dUTP 25 mM (marcació fluorescent verda, l de Klenow i 1 532 nm) o Cy5-dUTP 25 mM (marcació fluorescent vermella, 635 nm) (Amershan Pharmacia Biotech). Aquesta mescla es deixa incubar a 25ºC durant 2 hores en absència de llum i després es neutralitza la reacció amb el tampó d’aturada del kit. Les mostres que contenen els fragments de DNA marcat es purifiquen en dues etapes: primer s’afegeixen 400 però amb 200 l de tampó TE (10:1) i es centrifuga durant 10 minuts a 10ºC i a 8000 r.p.m., la segona etapa és un rentat igual l de tampó TE (10:1). Després el filtre es canvia a un tub l de TE (10:1) i es centrifuga durant 10 eppendorff net i s’hi afegeixen 20 101 minuts a 10 ºC a 12000 r.p.m. en una columna tipus Microcon YM-100 (Millipore). 4.1.10. Hibridació o revelat del microarray Els experiments d’hibridació del microarray s’han fet per triplicat en totes les condicions d’hibridació assajades. Les sondes, es mesclen a parts iguals i, a 67,5 µl d’aquesta mescla, se li afegeixen 32,5 µl de solució d’hibridació (8 µL de reactiu líquid de bloqueig RPN3601 (Amershan), 19 µL de SSC 20x (citrat trisodic deshidratat) i 5,5 µl de Sodi Dodecil Sulfat (SDS) al 2 %), després es desnaturalitzen a 95ºC durant 2 minuts (Rhee SK., Liu X. et al. 2004). La hibridació es du a terme en una estació d’hibridació “GeneTac Hybridization” (Genetic Microsystems), on els portaobjectes de vidre on hi ha impresos els microarrays, hi són dipositats. La solució d’hibridació es diposita directament al damunt dels microarrays que estan coberts amb uns cobreobjectes. S’han realitzat tres hibridacions a diferents condicions. Dues s’han fet a 42ºC i a 55ºC durant 14 hores i a una concentració de sonda de 25 ng/ml. La tercera hibridació s’ha realitzat a 64ºC durant 14 hores i a una concentració de sonda final de 100 ng/ml incorporant un rentat final únicament amb aigua. Després de la hibridació, el microarray és sotmès a tres solucions de rentat de forma seqüencial. La primera és SSC 2x amb el 0,5% de SDS, la segona és SSC 0,5x i la tercera, SSC 0,05x. Tots tres rentats es duen a terme a 25°C. Cada rentat s’aplica durant 15 minuts amb 10 segons de flux i 20 segons d’incubació durant 10 cicles. Cada microarray es deixa assecar durant 15 minuts en absència de llum (Park SJ., Kang CH. et al. 2008). 4.1.11. Obtenció d'imatges i anàlisi de dades Les imatges dels senyals fluorescents generats amb els marcatges fluorescent de les sondes amb els fluoròfors Cy3 i Cy5, s’han obtingut amb un escàner de microarrays GMS-418 Array Scanner (Affymetrix). Les lectures s’han fet a dues longituds d'ona diferents, per a permetre l'excitació dels dos 102 marcadors fluorescents de les sondes, a 532 nm (Verdnick D., Handran S. et al.) per excitar el fluoròfor Cy3 i a 635 nm (vermell) per excitar el fluoròfor Cy5. Les imatges resultants per a cada fluoròfor s’han tractat amb el programa informàtic ImaGene 5.5 (Biodiscovery). Aquest programa permet la superposició d’imatges de manera que es pot generar una imatge que sigui el resultat de la combinació de les dues imatges escanejades a 532 nm i a 635 nm i analitzar i determinar la densitat de píxels (intensitat) per a cada spot (DNA d’un clon específic de la llibreria metagenòmica imprès en el microarray) del microarray. Amb el programa es crea una xarxa de cercles ImaGene 5.5 independents (Grid) que defineix cada spot del microarray per tal de poder assignar-li un valor d’intensitat específic que quantifiqui l’spot. Aquesta xarxa es grava en format .gal cosa que permet exportar-la a un altra programa d’anàlisi d’imatges, el GenePix Pro 6. Amb el programa GenePix Pro 6 s’aplica la xarxa Grid sobre les imatges sobreposades dels dos canals (532 nm i 635 nm) i quantifiquem cada spot calculant la intensitat mitjana de tots els píxels de l’spot del senyal d'hibridació. Aquells píxels irregulars (no circulars), són descartats, igual que aquells que tinguin un mida inferior al 50% o superior al 200% de la mida del control positiu. Es fa l’anàlisi i els spots que contenen menys de 100 píxels es marquen com a “no trobats” obtenint un arxiu .gpr que conté tots els valors descrits anteriorment per a cada spot. Cal fer un anàlisi estadístic amb el programa informàtic Bioconductor Limma (Smyth GK. 2004), un paquet de programari per a l’anàlisi de dades de microarrays, de les dades contingudes en l’arxiu .gpr . L’eliminació del soroll de fons es realitza amb el mètode normexp (Ritchie ME., Silver J. et al. 2007) integrat en el paquet Limma. La normalització és el mecanisme que ens permet comparar dades d’origen diferent (un mateix experiment realitzat diverses vegades, en aquest cas, tres vegades). El factor de normalització usat en aquest estudi és aquell valor que, multiplicat a la mitjana d’intensitats per al canal verd del control positiu, faci que la relació d’intensitats “vermell/verd” sigui igual a 1, de manera que el logaritme amb base dos d’aquesta relació sigui 0. S’ha calculat un factor de normalització per a cada microarray 103 (experiment per triplicat) havent eliminat el soroll de fons a les dades d’intensitat. La intensitat de cada spot ha estat multiplicada pel factor de normalització de cada microarray. Cal aplicar un filtratge a les dades obtingudes. En aquest cas, i donat que les dades generades són poques degut a que els microarrays són petits (només conté 768 spots), els filtres qualitatius aplicats seran suaus. Aquest filtratge consisteix en fer complir a les dades les cinc obligacions següents: - els spots no marcats (no trobats) o marcats com a molt bo (controls positius) són eliminats. - els spots tenen més del 50% dels píxels saturats. - la mitjana de la intensitat de cada canal, com a mínim, doble la mitjana de la intensitat del “background”. - la relació de les mitjanes i la relació de les regressions no pot presentar una diferència superior al 20%. - la relació de regressions sigui superior a 0’5. L’anàlisi es va dur a terme de tres maneres diferents: filtrant únicament les dades del canal vermell a complir les obligacions, filtrant únicament les dades del canal verd a complir les obligacions i filtrant els dos canals a complir les obligacions. 4.1.12. SNR (Signal-to-Noise Ratio) A l’hora de determinar si un spot presenta o no una hibridació positiva, és a dir, si la intensitat observada és deguda o no a la presència d’una seqüència complementària (amb major o menor mesura) a la de les sondes aplicades, cal determinar un llindar de senyal a partir del qual es pugui classificar l’spot com a positiu o negatiu per a la hibridació. El criteri comunament acceptat per a determinar el llindar de senyal d’intensitat (senyal mínim) o SNR (Signal-to-Noise Ratio) ha estat calculat segons el mètode de Verdnick (Verdnick D., Handran S. et al. 2002) on l’SNR és igual a la diferència entre la intensitat de senyal i el soroll de fons 104 (background) dividit entre la desviació mitjana del soroll de fons (Park SJ., Kang CH. et al. 2008). SNR = (Intensitat de senyal- Background) / SD background El valor llindar per a l’índex SNR és 3 tot i que cal tenir present que, factors com la mida del DNA imprès en el microarray o la quantitat de sonda marcada aplicada durant la hibridació, poden modificar aquests valors i per tant, el valor de SNR òptim, pot veure’s modificat (Rhee SK., Liu X. et al. 2004). L’anàlisi realitzat en base a l’índex SNR ha seguit els següents passos i premisses: - Anàlisi del canal verd i del canal vermell de manera independent. - Eliminació d’aquells spots que presentaven menys de 150 píxels. - Com a mesura d’intensitat de cada spot, s’ha usat la mediana del senyal de l’spot menys la mediana del soroll de fons (per a cada spot hi ha sis rèpliques entre els tres microarrays). - Per a calcular el background que s’ha d’aplicar a la fórmula per a determinar l’índex SNR (calculat de manera independent per a cada canal en cada microarray), s’han usat dos mètodes diferents: 1) El background és la mitjana de totes les intensitats dels spots de la placa 85 (escollida com a control negatiu ja que en les PCR amb un conjunt de clons d’aquesta placa, realitzades tant amb primers específics com degenerats, no es generava cap banda d’amplificació) excepte el control positiu. També s’ha calculat la desviació estàndard d’aquest background. 2) El background és la mitjana de totes les intensitats dels spots (de les quatre plaques) excepte el control positiu. També s’ha calculat la desviació estàndard d’aquest background. 105 - Càlcul de l’índex SNR per a cada spot usant la mitjana del background i la desviació estàndard corresponent a cada microarray i a cada canal. - Comprovació que cap spot de la placa 85 té un valor de SNR superior a 3. No el té en cap cas. - Càlcul de la mitjana i de la desviació estàndard de l’índex SNR pertanyents als punts amb el mateix nom (mateix clon), per a cada canal. -Seleccionar aquells clons amb valors de l’índex SNR superiors a 3. 106 4.2. Resultats i discussió La prospecció metagenòmica de noves lipoxigenases s’ha realitzat en el marc del projecte “Aislamiento, caracterización de consorcios microbianos degradadores de hidrocarburos y prospección de genes en una genoteca metagenomica, PHB 2006-0038-PC” al Departament de Tecnologia de l’Escola de Ciències Agràries i de Medicina Veterinària de la Universitat de l’Estat de Sao Paulo (UNESP - Jaboticabal / Brasil), sota la supervisió de la Dra. Lemos. La feina experimental que comporta aquesta part de la tesi, s’ha realitzat durant el segon semestre de l’any 2007 implicant una important limitació de temps. La prospecció metagenòmica s’ha dut a terme de dues maneres diferents per a poder comparar-ne els resultats. Mitjançant l’ús de la reacció en cadena de la polimerassa i mitjançant el disseny i revelat de microarrays. En aquest últim cas, l’estudi estadístic realitzat sobre les dades obtingudes s’ha fet per dos mètodes diferents, definint i filtrant les dades obtingudes de manera que les podem categoritzar com a “vàlides” o “no vàlides”, i mitjançant l’ús d’un índex (SNR, signal noise ratio) extret de les dades obtingudes i definint un valor llindar per aquest mateix índex. 4.2.1. Encebadors Els encebadors específics dissenyats amb el programa Gene Runner utilitzats han estat els següents: Encebador forward LoxPAFWD: 5’ TAATCCGCTGCTGATCCG 3’ Encebador reverse LoxPAREV: 5’ GCCAGGTGGACGAACATCTC 3’ L’encebador forward (LoxPAFWD) hibrida en la posició 674 de la seqüència nucleotídica AF479686.2 del GenBank corresponent a la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa 42A2, mentre que l’encebador reverse (LoxPAREV) ho fa en la posició 1085 de la mateixa seqüència generant així, un producte de PCR de 411 parells de bases. Aquesta parella de primers presenten una temperatura de melting òptima de 60,3 ºC. 107 Els encebadors degenerats dissenyats amb el programa DePiCt 2.0 utilitzats en aquesta tesi han estat els següents: Encebador forward degFWD: Encebador reverse degREV: 5’ CCSGTRGCSATYCARTGC 3’ 5’ GCRTTCCAVAYYAGBAGG 3’ S’han obtingut a partir de cinc de les catorze seqüències que, de partida, es van aplicar al programa DePiCt 2.0. Aquest programa genera grups de seqüències en funció de la seva homologia i dissenya primers degenerats per a cada un dels grups obtinguts. D’aquesta manera, els primers resultants presenten menor degeneració respecte els que es generarien per al conjunt de seqüències inicial, tot i reduir la capacitat de detecció de seqüències més diverses. Aquestes cinc seqüències són les següents: -Pseudomonas aeruginosa PA01 -Pseudomonas aeruginosa PA14 -Burkholderia thailandensis E246 -Photobacterium profundum 3TCK -Shewanella denitrificans OS217 Nº d’accés a GenBank: NC_002516.2 GI:110645304 Nº d’accés a GenBank: CP000438.1 GI:115583796 Nº d’accés a GenBank: CP000086.1 GI:83652219 Nº d’accés a GenBank: ZP_01218321.1 I:90410305 Nº d’accés a GenBank: NC_007954.1 GI:91791369 L’encebador degFWD hibrida en la posició 931 de la seqüència nucliotídica AF479686.2 del GenBank corresponent a la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa 42A2, mentre que l’encebador degREV ho fa en la posició 1418 de la mateixa seqüència generant així, un producte de PCR de 488 parells de bases. La degeneració per a l’encebador forward és de 32 (S = C o G; Y = C o T; R = A o G), és a dir de 22, mentre que per a l’encebador reverse és de 72 (R = A o G; V = A, C o G no T; Y = C o T; B = C, T o G no A), és a dir 23x32. 4.2.2. Resultat de les PCR dels pools de clons i plaques escollides per a la generació del microarray. Donat que el procés d’extracció i purificació dels còsmids és molt laboriós i que el temps de que s’ha disposat al laboratori del Departament de Tecnologia de l’escola de Ciències Agràries i de Medicina Veterinària de la Universitat de l’Estat de Sao Paulo (UNESP-Jaboticabal/Brasil) ha estat tant limitat (sis mesos), es decideix fer una primera prospecció eliminatòria amb els primers degenerats sobre el 108 conjunt de clons (cada un dels hostes que conté un còsmid amb part del DNA metagenòmic clonat) que formen cada una de les plaques (pool) que conformen la biblioteca metagenòmica. Cada placa conté 96 clons. D’aquesta manera només caldrà fer 96 PCRs (la biblioteca metagenòmica consta de 96 plaques amb 96 clons cada una) i fer l’extracció de còsmids clon a clon, per aquelles plaques que més probabilitats tinguin de contenir noves lipoxigenases. Els resultats d’aquesta prospecció preliminar es poden observar en la figura 40 on es poden veure diferents pools de placa amplificats amb els encebadors degenerats. Els pools 6, 71 i 89 presenten una banda de mida similar a la del control positiu (C+, producte resultant de la PCR amb encebadors degenerats usant la seqüència de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa 42A2 com a motlle) mentre que la del pool 85 no la presenta i per tant, aquests encebadors no amplifiquen una seqüència que, per longitud, coincidiria amb la d’una lipoxigenasa bacteriana. És per aquesta raó que la placa 85 es va incloure en el microarray, per tal de poder tenir un control negatiu de la hibridació, mentre que les altres plaques, la 6, la 71 i la 89 es van escollir com a possibles positius. M C+ 6 C+ 71 MM C+ 85 89 M Figura 40.- Amplificació amb encebadors degenerats dels pools de clons de les plaques 6, 71, 85 i 89. Les plaques 6, 71 i 89 presenten una banda a la mateixa alçada que el control positiu (cercle groc), mentre que la placa 85 no la presenta (cercle vermell). C+ control positiu (amb lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa), CN control negatiu, M marcador de 1000 pb fins a 100 pb de Biotools. Les amplificacions de les plaques 6, 71, 85 i 89 amb encebadors específics (figura 41) mostren com l’elecció de la placa 85 com a control negatiu és correcte, doncs no presenta banda a l’alçada del control positiu i, en canvi, si que la presenten les plaques 89 i 71. És cert que altres plaques com la 88, la 82, la 79, la 70 i d’altres no mostrades en la figura, també presenten la 109 mateixa banda però, per qüestió de temps no ha estat possible processar tot el volum de clons que això suposava. C+ 89 88 87 86 85 84 83 82 81 80 1Kb C+ 79 78 77 76 75 74 73 72 71 70 1Kb Figura 41.- Amplificació amb encebadors específics dels pools de les plaques 70 a 89. C+, control positiu (amb lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa); 1Kb, marcador 1000 bp DNA Ladder de 1Kb de Biotools. Pel que fa a la placa 6, la figura 42. mostra una amplificació amb encebadors específics de cada un dels clons que conformen aquesta placa. Aquest anàlisi en detall es va realitzar per tal de poder comparar resultats entre les dues metodologies de rastreig de la biblioteca metagenòmica utilitzades. A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11A12 M B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11E12 M F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11C12 M D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10 G11G12 M H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 H12 Figura 42.- Amplificació de tots els clons de la placa 6 de la biblioteca metagenòmica amb encebadors específics. M, marcador de 100 pb DNA ladder (Invitrogen) de 2072 pb a 100pb. Fletxa groga, banda de la mateixa mida que l’obtinguda amb la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa. 110 Es pot observar com el clon D2 presenta una banda de la mida del control positiu, això ratifica el resultat obtingut anteriorment amb la PCR realitzada sobre el pool de clons d’aquesta placa amb els encebadors degenerats i a la vegada indica que és el clon D2 el que conté la seqüència buscada. 4.2.3. Producció de sondes i marcatge La sonda produïda amb els encebadors específics ha estat marcada amb el fluorocrom Cy5 que, al ser excitat amb una longitud d’ona de 635 nm, emet fluorescència vermella. Aquesta sonda és la següent: TAATCCGCTGCTGATCCGCCGCGTCGATGCGCTGCCGGCCAACTTTCCGCTGGGCGAAGAGCAGTTC CGCCGGGTGATGGGCGCCGACGACAGCTTGCTGGAAGCCGCCGCCAGCCGCCGCCTGTACCTGCTGG ACTACGCCGAGCTGGGCAAGCTGGCGCCGTCGGGAGCGGTGGACAAACTGCTCACCGGGACGGGCTT CGCCTATGCGCCGATCGCCCTGTTCGCCCTTGGCAAGGATCGGGCGGGGCTGTTGCCGGTGGCCATC CAGTGCGGCCAGGACCCCGCTACCCATCCGATGTTCGTGCGTCCCGCGGAGTCGGAGAGTGATCTGT ACTGGGGTTGGCAGATGGCCAAGACGGTGGTCCAGGTCGCCGAGGAGAACTACCACGAGATGTTCGT CCACCTGGC La sonda produïda amb els encebadors degenerats ha estat marcada amb el fluorocrom Cy3 que, al ser excitat amb una longitud d’ona de 532 nm, emet fluorescència verda. Aquesta sonda és la següent: CCGGTGGCCATCCAGTGCGGCCAGGACCCCGCTACCCATCCGATGTTCGTGCGTCCCGCGGAGTCGG AGAGTGATCTGTACTGGGGTTGGCAGATGGCCAAGACGGTGGTCCAGGTCGCCGAGGAGAACTACCA CGAGATGTTCGTCCACCTGGCCCAGACCCACCTGGTGAGCGAGGCGTTCTGCCTGGCCACCCAGCGC ACCCTGGCGCCCAGCCATCCGCTGCACGTCCTGCTCGCCCCGCACTTCGAGGGCACCCTGTTCATCA ACGAGGGGGCGGCGCGGATCCTGTTGCCCAGCGCGGGCTTCATCGACGTGATGTTCGCCGCGCCGAT CCAGGACACCCAGGCCACCGCCGGCGGCAACCGGCTGGGTTTCGACTTCTACCGCGGCATGTTGCCG GAGAGCCTGAAGGCGCGGAACGTCGACGACCCGGCCGCGTTACCGGACTACCCCTACCGCGACGACG GCCTGCTGGTGTGGAATGC Les dues sondes juntes cobreixen un 36,15% del gen de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa 42A2, així doncs, i en el cas que existeixin altres lipoxigenases semblants a aquesta, aquestes dues sondes n’haurien de cobrir un percentatge similar. A falta de tenir una zona altament conservada en el gen que s’està estudiant, una major cobertura del gen per part de les sondes, fa 111 incrementar les possibilitats d’hibridació de les mateixes sobre possibles seqüències diana. Donada la dificultat de trobar zones conservades en aquest tipus de seqüències de lipoxigenases, s’ha intentat que una part de la seqüència que correspon a la primera esfera de coordinació del ferro, (zona, estructuralment parlant, més conservada de les lipoxigenases) de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa 42A2, quedés coberta amb les sondes. Així doncs, els nucleòtids que cobreixen els dos primers aminoàcids d’aquesta esfera de coordinació (His 377 i His 382) són presents en la sonda verda que també cobreix el residu His 372 altament conservat. La sonda vermella cobreix únicament els aminoàcids His 372 i His 377. 4.2.4. Hibridació S’han provat tres temperatures d’hibridació diferents, 42ºC, 55ºC i 64ºC. La que millor ha funcionat ha estat la de 64ºC que és la més astringent, això vol dir que és la que permet menys unions sonda-diana errònies i la que presentarà una menor intensitat de senyal per al soroll de fons. Respecte la durada del procés d’hibridació sempre ha estat de 14 hores (Wu L., Thompson DK. et al. 2004) que és un temps estàndard per les hibridacions dels microarrays. S’han provat dues concentracions de sonda per a la hibridació, 25 ng/ml i 100 ng/ml. La segona concentració és la que millor resultat ha donat. Tot i que els protocols estàndard de rentat dels microarrays. Un cop fetes les hibridacions, consten de tres rentats (amb una primera solució de SSC 2x amb el 0,5% de SDS, una segona solució de SSC 0,5x i una tercera de SSC 0,05x), en la optimització de la hibridació s’ha afegit un últim rentat amb aigua destil—lada esterilitzada. En la majoria d’experiments amb microarrays on s’utilitzen dues sondes marcades amb diferents colorants fluorescents, el que es pretén és observar una expressió diferencial del gen per al qual s’ha dissenyat la sonda i detectar aquells spots que tenen unes relacions entre les dues sondes significativament diferents a 0 (Park SJ., Kang CH. et al. 2008). Aquest, però, no és el cas que es presenta. En aquest estudi, el que es vol, és trobar un gen determinat, un gen d’una lipoxigenasa. 112 Per tal de detectar aquests gens, cal detectar aquells clons que tenen una hibridació similar per a les dues sondes dissenyades (la marcada amb fluorocrom verd i la marcada amb fluorocrom vermell), és per això que cal revelar l’array amb els dos canals (canal verd, figura 43; canal vermell, figura 44) i sobreposar les imatges d’aquets dos canals (figura 45). D’aquesta manera, aquells clons que presentin una hibridació similar de les dues sondes, emetran una fluorescència groga que serà el resultat de la combinació de les fluorescències observades quan s’excita l’array amb una radiació de 635 nm (fluorescència vermella) i amb una radiació de 532 nm (fluorescència verda). Això indica que el clon corresponent a l’spot groc, conté les dues seqüències o seqüències similars a les de les sondes i, per tant, que el còsmid conté una seqüència semblant a la de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa 42A2. Figura 43.- Imatge fluorescent del canal verd del microarray hibridat. El control positiu es pot observar a la primera columna d’spots, a la primera i cinquena fila (fletxes grogues). Una altra informació que ens aporta la observació de les imatges obtingudes amb la hibridació, és la forma i regularitat dels spots. Aquest factor 113 és important ja que, uns spots irregulars, com és el cas que aquí es presenta, fan més difícil l’aplicació de la xarxa (grid) que ha de definir els spots per tal d’extreure’n les dades d’intensitat d’hibridació. Tal com s’observa en la figura 45, molts dels spots no són rodons sinó que semblen tres o quatre spots. Aquest problema d’irregularitat en els spots pot comportar una menor qualitat en les dades obtingudes ja que, el nombre de píxels que defineixen cada spot pot variar molt fent incrementar la variància interna de cada spot i alterant el valor de soroll de fons de cada spot. Figura 44.- Imatge fluorescent del canal vermell del microarray hibridat. El control positiu es pot observar a la primera columna d’spots, a la primera i cinquena fila (fletxes grogues). Aquesta irregularitat observada en aquest microarray, molt probablement sigui deguda a un problema en les agulles del robot GMS 417 Arrayer (Affymetrix Inc., Clear Saint, HERE, USES) que, per una raó no coneguda, no han dipositat de manera regular la solució que conté el còsmid en el portaobjectes. 114 La xarxa de cercles independents (grid) que delimiten cada un dels spots del microarray, s’ha creat amb el programa ImaGene 5.5, i permet ajustar cada un d’aquest cercles a la mida de cada un dels spots per tal de poder assignar-li un valor d’intensitat específic que el quantifiqui. Aquesta xarxa es grava amb un format especial (.gal) que permet exportar-la a altres programes d’anàlisi d’imatges. Figura 45.- Imatge resultant de la superposició de les imatges obtingudes amb el canal vermell i el canal verd del microarray hibridat. El control positiu es pot observar a la primera columna d’spots, a la primera i cinquena fila (fletxes grogues). 4.2.5. Resultats del microarray: valoració estadística Així doncs, idealment, es pretén detectar aquells spots on hi ha una hibridació igual de la sonda marcada amb verd i de la sonda marcada amb vermell, això correspondria amb un spot que presenti igual intensitat per al canal verd com per al canal vermell i, per tant, que les dues sondes hi hagin hibridat en igual proporció. Aquest fet indica que el clon que correspon a aquell spot, conté una seqüència similar a la de les dues sondes i que, per tant, pot 115 contenir una lipoxigenasa. Cal però, tenir present que, donada l’alta diversitat de seqüències que presenta el grup de les lipoxigenases, es pot donar el cas que només una de les dues sondes hibridi bé amb el nou gen de lipoxigenasa detectat i, per tant, només es vegi intensitat suficient per a una de les dues sondes, és a dir per a un dels dos canals, verd o vermell. Hi ha, encara, una altra possibilitat que generi aquesta mateixa situació d’hibridació parcial, i és que és possible que a l’hora de generar la biblioteca metagenòmica, de la qual s’extrauran els còsmids que constituiran el material genètic que s’imprimirà al portaobjectes per a fer el microarray, la seqüència del gen de la nova lipoxigenasa hagi estat partit i, per tant, estigui incomplert i només una de les dues sondes hi hibridi. És degut a tot això que, durant la realització de l’anàlisi de les dades obtingudes del microarray, s’han definit els filtres descrits en el punt 4.1.11, i que cada spot ha estat imprès per duplicat en cada array podent, així, seleccionar aquells còsmids on els dos spots superen les condicions dels filtres imposats. La figura 46 mostra les dades obtingudes (Annex 2) directament de l’escaneig del tres arrays hibridats (15, 16 i 20). Aquests tres array són idèntics entre ells, s’ha imprès per triplicat per tal de validar-ne els resultats. El número que els identifica, correspon al codi de barres que proporciona el fabricant per a la seva identificació. Així doncs, cada un dels arrays conté tots els clons per duplicat de les plaques 6, 71, 85 i 89. La relació establerta entre les dues intensitats detectades (la del canal vermell i la del canal verd) és el logaritme amb base dos de la relació de la intensitat del canal vermell respecte el verd (R/G). Un valor positiu per a aquest índex indica una relació R/G de valor més gran que 1 i per tant una intensitat de senyal vermella superior a la verda. Un valor de zero indicaria una igual hibridació de la sonda verda i de la sonda vermella mentre que un valor negatiu representa una relació R/G de valor inferior a 1 i per tant una intensitat de senyal verda superior a la vermella. En la figura 47 es pot observar la mateixa representació de les dades però amb l’eliminació del soroll de fons (background) en cada un dels spots de l’array. 116 Figura 46.- Gràfica representativa de les dades per a cada un dels tres arrays (15, 16 i 20) hibridats sense cap tractament i amb les corresponents desviacions estàndard. Figura 47.- Gràfica representativa de les dades per a cada un dels tres arrays (15, 16 i 20) hibridats amb l’eliminació del soroll de fons (background) i amb les corresponents desviacions estàndard. 117 Aquestes gràfiques aporten informació sobre la homogeneïtat de la hibridació en cada un dels arrays indicant si hi ha o no repetibilitat en el resultat de l’experiment. Es pot observar que, en tots tres arrays, la hibridació ha estat força semblant. L’array 16 és el que més es diferencia però, la major desviació estàndard ja ens indica una major dispersió de les dades que explicaria aquesta petita diferència. El fet que aquestes diferències es mantinguin en la figura 46 indica que el soroll de fons és similar en els tres microarrays, fet que ja és normal i característic d’un mateix funcionament de la hibridació en els tres microarrays permetent, així, comparacions entre ells després d’un procés de normalització de les dades. Tal com s’ha explicat anteriorment, aquestes dades han estat normalitzades i filtrades. Els filtres s’han aplicat de tres maneres diferents, només a les dades d’intensitat del canal vermell, només a les dades del canal verd i a les dades dels dos canals a la vegada. Aquestes dades es mostren, de forma gràfica, en les figures 48, 49 i 50 (les dades filtrades només pel canal verd), en les figures 51, 52 i 53 (les dades filtrades només pel canal vermell) i en les figures 54, 55 i 56 (les dades filtrades pels dos canals). En totes aquestes figures s’hi representen aquells spots que han superat els filtres de tres maneres diferents, únicament amb la correcció del soroll de fons, amb les dades normalitzades i amb les dades normalitzades i filtrades (aquestes dues representacions són iguals però els programes informàtics que tracten aquesta classe de dades expressen, per defecte, les dades d’aquesta manera). També es mostra la distribució dels spots que han superat el filtratge en funció del bloc on es troben. El factor de normalització aplicat a cada un dels arrays és aquell valor que permet igualar la ratio R/G del control positiu a 1 i és indiferent si s’aplica al canal verd o al vermell. En aquest cas s’ha aplicat al canal verd. Per a l’array 15 el factor de normalització és 8,43, per a l’array 16 és 8,56 i per a l’array 20, 11,79. Aquests valors dels factors de normalització indiquen una clara diferència en la hibridació de les dues sondes. La sonda vermella ha hibridat molt millor que no pas la verda i això pot indica que la seqüència sobre la que està hibridant la sonda vermella és més conservada que no pas la de la sonda verda. Tal com mostren els tres microarrays, aquests valors dels factors de normalització es mantene en les tres rèpliques descartant la possibilitat d’un 118 error en la hibridació. Altrament, observant les figures 43 i 44, ja s’intueix una major intensitat detectada per al canal vermell que no pas per al canal verd. Un altre factor que indica la repetitivitat de la hibridació, és el fet que la distribució dels spots que superen els filtratges de dades es manté igual entre els diferents arrays. 119 Figura 48.- Dades del microarray 15 amb les intensitats del canal verd filtrades. Background corrected: Dades amb el soroll de fons eliminat, Normalized: Dades amb el soroll de fons eliminat normalitzades, Normalized and Filtered: Dades amb el soroll de fons eliminat normalitzades i filtrades, Normalized (only good spots): Representació de les dades del gràfic Normalized and Filtered en funció del bloc del microarray on es troben els spots corresponents. M = log2R - log2G i (log2R + log2G) on R fa referència al canal vermell i G al canal verd. A = ½ x 120 Figura 49.- Dades del microarray 16 amb les intensitats del canal verd filtrades. Background corrected: Dades amb el soroll de fons eliminat, Normalized: Dades amb el soroll de fons eliminat normalitzades, Normalized and Filtered: Dades amb el soroll de fons eliminat normalitzades i filtrades, Normalized (only good spots): Representació de les dades del gràfic Normalized and Filtered en funció del bloc del microarray on es troben els spots corresponents. M = log2R - log2G i (log2R + log2G) on R fa referència al canal vermell i G al canal verd. A = ½ x 121 Figura 50.- Dades del microarray 20 amb les intensitats del canal verd filtrades. Background corrected: Dades amb el soroll de fons eliminat, Normalized: Dades amb el soroll de fons eliminat normalitzades, Normalized and Filtered: Dades amb el soroll de fons eliminat normalitzades i filtrades, Normalized (only good spots): Representació de les dades del gràfic Normalized and Filtered en funció del bloc del microarray on es troben els spots corresponents. M = log2R - log2G i (log2R + log2G) on R fa referència al canal vermell i G al canal verd. A = ½ x 122 Figura 51.- Dades del microarray 15 amb les intensitats del canal vermell filtrades. Background corrected: Dades amb el soroll de fons eliminat, Normalized: Dades amb el soroll de fons eliminat normalitzades, Normalized and Filtered: Dades amb el soroll de fons eliminat normalitzades i filtrades, Normalized (only good spots): Representació de les dades del gràfic Normalized and Filtered en funció del bloc del microarray on es troben els spots corresponents. M = log2R - log2G i (log2R + log2G) on R fa referència al canal vermell i G al canal verd. A = ½ x 123 Figura 52.- Dades del microarray 16 amb les intensitats del canal vermell filtrades. Background corrected: Dades amb el soroll de fons eliminat, Normalized: Dades amb el soroll de fons eliminat normalitzades, Normalized and Filtered: Dades amb el soroll de fons eliminat normalitzades i filtrades, Normalized (only good spots): Representació de les dades del gràfic Normalized and Filtered en funció del bloc del microarray on es troben els spots corresponents. M = log2R - log2G i (log2R + log2G) on R fa referència al canal vermell i G al canal verd. A = ½ x 124 Figura 53.- Dades del microarray 20 amb les intensitats del canal vermell filtrades. Background corrected: Dades amb el soroll de fons eliminat, Normalized: Dades amb el soroll de fons eliminat normalitzades, Normalized and Filtered: Dades amb el soroll de fons eliminat normalitzades i filtrades, Normalized (only good spots): Representació de les dades del gràfic Normalized and Filtered en funció del bloc del microarray on es troben els spots corresponents. M = log2R - log2G i (log2R + log2G) on R fa referència al canal vermell i G al canal verd. A = ½ x 125 Figura 54.- Dades del microarray 15 amb les intensitats dels dos canals filtrades. Background corrected: Dades amb el soroll de fons eliminat, Normalized: Dades amb el soroll de fons eliminat normalitzades, Normalized and Filtered: Dades amb el soroll de fons eliminat normalitzades i filtrades, Normalized (only good spots): Representació de les dades del gràfic Normalized and Filtered en funció del bloc del microarray on es troben els spots corresponents. M = log2R - log2G i (log2R + log2G) on R fa referència al canal vermell i G al canal verd. A = ½ x 126 Figura 55.- Dades del microarray 16 amb les intensitats dels dos canals filtrades. Background corrected: Dades amb el soroll de fons eliminat, Normalized: Dades amb el soroll de fons eliminat normalitzades, Normalized and Filtered: Dades amb el soroll de fons eliminat normalitzades i filtrades, Normalized (only good spots): Representació de les dades del gràfic Normalized and Filtered en funció del bloc del microarray on es troben els spots corresponents. M = log2R - log2G i (log2R + log2G) on R fa referència al canal vermell i G al canal verd. A = ½ x 127 Figura 56.- Dades del microarray 20 amb les intensitats dels dos canals filtrades. Background corrected: Dades amb el soroll de fons eliminat, Normalized: Dades amb el soroll de fons eliminat normalitzades, Normalized and Filtered: Dades amb el soroll de fons eliminat normalitzades i filtrades, Normalized (only good spots): Representació de les dades del gràfic Normalized and Filtered en funció del bloc del microarray on es troben els spots corresponents. M = log2R - log2G i (log2R + log2G) on R fa referència al canal vermell i G al canal verd. A = ½ x 128 4.2.6. Classificació dels resultats Aquells spots que han superat els filtratges en qualsevol de les tres formes que s’han aplicat (sobre els dos canals, només sobre el canal verd o només sobre el canal vermell, Annex 2), s’han classificat com a 1 mentre que els que no els han superat han estat classificats com a 0. Els filtratges són: - eliminació dels spots no marcats (no trobats) o marcats com a molt bo (controls positius). - que els spots tinguin més del 50% dels píxels saturats. - que la mitjana de la intensitat de cada canal, com a mínim, dobli la mitjana de la intensitat del “background”. - que la relació de regressions sigui superior a 0’5. - que la relació de les mitjanes i la relació de les regressions no presenti una diferència superior al 20%. Aquells clons que com a mínim tenen un 1 en qualsevol columna dels spots que han superat el filtratge en els dos canals (X_BothOK) o un 1 en cada una de les rèpliques dels spots que han superat el filtratge en el canal verd i en el canal vermell per separat (X-RedOK i X_GreenOK), representats en groc en la taula 10, són els següents: 85A1, 71F5, 89D7, 71E3, 85A12, 71D3, 71H1 i 71H3. Aquells clons que com a mínim tenen un 1 en cada una de les rèpliques dels spots per al filtratge en el canal vermell (X-RedOK), representats en vermell en la taula 10, són els següents: 06G7, 06G3, 06B3, 06C1, 06G4, 85G7, 71F4, 85F1 i 85E3. Aquells clons que com a mínim tenen un 1 en alguna de les rèpliques dels clons per a algun dels tres tipus de filtratges que s’han realitzat, representats en blanc en la taula 10, són els següents: 89G7, 85G11, 89A5, 85D3, 71C7, 85B3, 85A9, 71E10, 85E7, 06C3, 89F2, 85H8 i 06C8. Cal destacar l’absència de clons que únicament presentin un 1 en el filtratge realitzat en el canal verd. Això pot estar indicant, de nou, que la seqüència sobre la que es va dissenyar aquesta sonda realment és molt més variable que no pas la de l’altra sonda i que, per tant, la hibridació és molt més difícil. 129 15_GreenOK 16_GreenOK Clon 85_A1 1 1 1 1 1 1 85_A1 1 1 1 1 1 1 71_F5 1 1 1 1 1 1 71_F5 1 1 0 1 1 0 89_D7 1 0 0 1 1 0 89_D7 0 1 0 1 1 1 71_E3 0 1 0 0 1 0 71_E3 1 0 0 1 0 0 85_A12 0 1 0 1 1 0 85_A12 0 0 0 1 1 1 71_D3 0 0 0 1 1 0 71_D3 1 0 0 1 0 0 71_H1 0 0 0 0 1 0 71_H1 0 0 0 1 1 0 71_H3 0 0 0 1 0 0 71_H3 1 0 0 1 0 0 06_G7 0 0 0 1 1 0 06_G7 0 0 0 1 1 0 06_G3 0 0 0 1 1 0 06_G3 0 0 0 1 1 0 06_B3 0 0 0 1 1 0 06_B3 0 0 0 1 0 1 06_C1 0 0 0 1 1 1 06_C1 0 0 0 1 0 0 06_G4 0 0 0 0 0 1 06_G4 0 0 0 0 1 1 85_G7 0 0 0 1 1 0 85_G7 0 0 0 0 1 0 71_F4 0 0 0 0 1 0 71_F4 0 0 0 1 1 0 85_F1 0 0 0 1 0 0 85_F1 0 0 0 1 0 0 85_E3 0 0 0 1 0 0 85_E3 0 0 0 0 1 0 89_G7 0 0 0 1 0 0 85_G11 0 0 0 1 1 0 89_A5 0 1 0 0 1 0 85_D3 0 0 0 0 1 0 71_C7 0 0 0 0 1 0 85_B3 0 0 0 1 0 0 85_A9 0 0 0 1 0 0 71_E10 0 0 0 1 0 0 85_E7 0 0 0 0 0 1 06_C3 0 0 0 0 1 0 89_F2 0 0 0 0 1 0 85_H8 0 0 0 0 1 0 06_C8 0 0 0 0 0 1 Taula 10.- Taula de classificació dels resultats del microarray. 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 = superació de 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 les cinc condicions de filtratge, 0 = NO superació de les condicions de filtratge. 130 20_GreenOK 15_BothOK 16_BothOK 20_BothOK 15_RedOK 16_RedOK 20_RedOK 4.2.7. Anàlisi amb SNR (Signal-to- Noise Ratio) Tal com ja s’ha comentat en l’apartat 4.1.12, l’anàlisi de les dades resultants de la hibridació dels microarrays s’ha fet calculant el background de dues maneres diferents. En el primer cas, s’ha agafat com a background la mitjana de la intensitat de senyal de tots els spots corresponents als clons de la placa 85 excepte el control positiu. La raó de l’elecció d’aquesta placa com a punt de partida per a calcular el background és que les PCR amb un conjunt de clons d’aquesta placa, realitzades tant amb primers específics com degenerats, no generaven cap banda d’amplificació de mida semblant a la de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa, és a dir, que la hibridació detectada en els spots corresponents a aquesta placa no hauria de correspondre a la detecció de cap seqüència homologa a les de les sondes, fent possible assimilar aquesta hibridació detectada, a la del background. En la figura 57 es presenten els resultats dels SNR calculats amb aquest background tant pel canal verd com pel canal vermell. Figura 57.- Clons que presenten un valor de SNR superior a 3 tant per al canal verd (en verd) com per al canal vermell (en vermell). Entre parèntesis es mostra el número d’spots utilitzats en cada un dels clons per al càlcul d’aquest índex. Es mostra també la desviació estàndard. 131 En el segon cas s’ha calculat el background a partir de tots els spots impresos al microarray excepte el control positiu. En la figura 58 es presenten els resultats dels SNR calculats amb aquest background tant pel canal verd com pel canal vermell. Figura 58.- Clons que presenten un valor de SNR superior a 3 tant per al canal verd (en verd) com per al canal vermell (en vermell). Entre parèntesis es mostra el número d’spots utilitzats en cada un dels clons per al càlcul d’aquest índex. Es mostra també la desviació estàndard. Comparant els resultats entre la determinació de l’SNR calculat amb un background obtingut a partir dels clons de la placa 85 o a partir de tots els clons s’observa que, en el primer cas, el nombre d’spots que superen el valor llindar de 3 per a l’índex SNR és de tretze per al canal verd i de tres per al 132 canal vermell mentre que, per al segon cas, no n’hi ha cap per al canal verd i dos per al canal vermell. Això vol dir que la sonda verda ha hibridat sensiblement menys en els spots provinents de la placa 85 (control negatiu) que no pas respecte els altres. Aquest fet ja és lògic tenint en compte que la PCR feta sobre el grup de clons de la placa 85 amb els encebadors utilitzats per a sintetitzar aquesta sonda (encebadors degenerats) no genera cap banda de mida esperada en el cas de contenir lipoxigenases del tipus de la de Pseudomonas aeruginosa. El fet de no obtenir cap clon amb un SNR superior a 3 quan es treballa amb un backgraound calculat a partir de tots els clons, fa pensar, de nou, que aquesta sonda s’ha dissenyat en una zona de la seqüència molt poc conservada. Respecte a la sonda vermella, la situació és diferent ja que, en el cas del background obtingut a partir dels clons de la placa 85, s’obtenen tres clons amb un valor de SNR superior a 3 mentre que quan es realitza el mateix anàlisi amb el background obtingut a partir de tots els clons s’observa que són dos clons (coincidents amb dos dels tres anteriors) els que superen el valor de tres per a l’índex SNR. Aquests resultats indiquen que el background per aquesta sonda és més homogeni, és a dir, que no presenta moltes diferències si es calcula a partir de la placa 85 o a partir de totes les plaques, fet que indica que probablement la hibridació hagi estat més específica ja que la zona de la seqüència que cobreix aquesta sonda presenta més conservació que no pas l’altra. 4.2.8. Seqüenciació dels clons candidats Els clons que, un cop aplicats els diferents anàlisis de dades, han estat classificats com a possibles candidats a presentar una lipoxigenasa del tipus de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa, trentanou en total, són els següents: 85A1, 71F5, 89D7, 71E3, 85A12, 71D3, 71H1, 71H3, 06G7, 06G3, 06B3, 06C1, 06G4, 85G7, 71F4, 85F1, 85E3, 89G7, 85G11, 89A5, 85D3, 71C7, 85B3, 85A9, 71E10, 85E7, 06C3, 89F2, 85H8, 06C8, 89A1, 89A2, 89A5, 89A3, 06D12, 89H12, 89F1, 89G1 i 06C12. Tot ells han estat seqüenciats i en tots els casos s’han obtingut seqüències que, un cop aplicades a la base de dades GenBank han donat com a resultat uns aliniaments amb identitats d’entre el 93 133 i el 99 % amb les lipoxigenases de diverses soques de Pseudomonas aeruginosa (PA01, PA7, LESB58, PA14 i PA42A2). 4.2.9. Consideracions globals L’objectiu principal d’aquest estudi era el de fer una prospecció massiva de lipoxigenases per tal de trobar-ne de noves. Els resultats obtinguts indiquen que el baix nombre de seqüències classificades com a lipoxigenases presents al GenBank i la gran diversitat d’aquestes, han dificultat assolir l’objectiu proposat. Malgrat això, l’aplicació de la metodologia del microarray ha estat un èxit ja que els resultats positius detectats amb aquesta tècnica eren, efectivament, lipoxigenases. Cal doncs, tenir present que quan es fa una prospecció metagenòmica per a cercar noves lipoxigenases, l’èxit de la mateixa dependrà, en gran mesura, de com de conservada estigui la seqüència de les lipoxigenases de les que es parteix (Park SJ., Kang CH. et al. 2008). En aquest cas, la conservació d’aquesta seqüència és molt baixa i hi ha el problema afegit de que el desconeixement sobre les lipoxigenases d’origen bacterià és important i la informació sobre aquestes, és escassa (Kuhn H. and Thiele BJ. 1999). Per altra banda, hi ha molt poca bibliografia referent a estudis de rastreig de nous gens amb microarrays construïts amb còsmids. Un dels estudis més recents és el de Park i col—laboradors, de l’any 2008 (Park SJ., Kang CH. et al. 2008) i posterior a les dates de realització d’aquest l’estudi. Aquest estudi avalua l’especificitat i la sensibilitat d’aquesta metodologia i demostra que, aquest tipus d’arrays, poden ser utilitzat amb èxit per a la detecció de gens específics en una biblioteca metagenòmica oferint, així, una aplicació potencial molt interessant com a eina de detecció d’alt rendiment de noves seqüències. El fet que per a dissenyar primers degenerats només s’hagin pogut dissenyar a partir de cinc de les catorze seqüències aplicades al programa DePiCt 2.0, ja indica que realment, la diversitat de seqüència d’aquest grup de lipoxigenases és elevada. Si bé és cert que aquest fet pot ser degut al baix nombre de seqüències de lipoxigenases presents a les bases de dades i a la gran diversitat de grups taxonòmics d’aquestes, no és casual que les cinc 134 seqüències a partir de les quals s’han dissenyat els primers degenerats siguin d’organismes dels gèneres Pseudomonas, Photobacterium, Burkholderia i Shewanella filogenèticament propers. Així doncs, aquests són els millors encebadors degenerats possibles i, per tant, són els que poden generar la sonda amb la que es pugui detectar major quantitat de seqüències semblants a les de les lipoxigenases. El fet que les sondes utilitzades cobreixin part de la seqüència corresponent a la part de la lipoxigenasa més conservada estructuralment (primera esfera de coordinació del ferro), ja indica que realment l’elecció dels primers ha estat la correcta i que les sondes són les més adequades tenint en compte l’alta diversitat de seqüència de les lipoxigenases bacterianes. El problema de treballar amb primers degenerats es pot veure en la figura 40 on es mostra el resultat de l’amplificació de diversos grups de clons (plaques). Es pot veure com aquest tipus d’encebedors genera diverses bandes cosa que vol dir que estan hibridant en vàries zones a la vegada. En la figura 42 però, podem veure que quan es treballa amb material metagenòmic aquest fenomen també es dóna en el cas dels encebedors específics. En aquesta imatge s’observa com el clon D2 de la placa 6 presenta una banda a la mateixa alçada que la generada amb aquests mateixos primers sobre la seqüència de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa. El fet que també la presenta amb una amplificació amb encebadors degenerats (figura 40) és el motiu per al qual s’ha utilitzat aquesta placa com a control positiu en el disseny del microarray. Les particularitats de l’experiment realitzat amb els microarrays han determinat els mètodes utilitzats per a identificar els spots positius. Cal tenir present que allò que es vol detectar en aquests microarrays són els còsmids que contenen seqüències complementàries de les sondes, però aquestes seqüències poden presentar diversos graus de degeneració respecte les sondes. Per altra banda, hi ha la possibilitat de trobar seqüències amb les dues sondes hibridades o amb una de sola i, a més a més, els nivells d’hibridació dependran dels graus de degeneració. Així doncs, la relació R/G ens pot indicar quina sonda ha hibridat en un còsmid determinat i també pot indicar el grau de degeneració de la seqüència. 135 Hi ha dos aspectes de l’experiment que cal tenir presents. Primerament, és difícil aplicar els mètodes de normalització quan el nombre d’spots on podem suposar que hi ha una relació R/G de 1, és baix i aquests no estan distribuïts a l’atzar (Verdnick D., Handran S. et al. 2002). En segon lloc, el fet que molts spots no siguin rodons, són com tres o quatre spots petits, dificulta molt la definició de l’spot per tal de calcular-ne la intensitat. Tots aquests condicionants són els que han fet recomanable el doble anàlisi de les dades. Un anàlisi amb els valors d’intensitat dels dos canals vinculats (log2 R/G) i un altre sense relació entre els dos canals (SNR). Les figures 46 i 47 aporten informació sobre la homogeneïtat de la hibridació en cada un dels arrays indicant si hi ha o no repetibilitat en el resultat de l’experiment. Es pot observar que, en tots tres arrays, la hibridació ha estat força semblant. Tots tres arrays presenten una mitjana d’intensitat semblant, l’array 16 és el que més es diferencia, això s’explica per una major dispersió de dades que es tradueix en una major desviació estàndard en aquest grup de dades. El fet que aquestes diferències es mantinguin en la figura 46 està indicant que el soroll de fons és similar en els tres arrays, fet que és característic d’un funcionament equivalent de la hibridació en cada un dels microarrays i que aporta qualitat a la repetibilitat de l’experiment i, a la vegada, permet normalitzar les dades i fer-les comparables. Els valors dels factors de normalització obtinguts (8.43, 8.56 i 11.79) indiquen, de forma inequívoca, una clara diferència entre la hibridació de les dues sondes. La sonda vermella ha hibridat molt millor que no pas la sonda verda i, donat que les condicions d’astringència eren les mateixes ja que la solució d’hibridació incloïa les dues sondes i, per tant, la hibridació era simultània, i que la relació molar entre aquestes era molt propera a 1, la causa real d’aquesta diferència observada entre les intensitats produïdes per les dues sondes, només pot ser deguda a una menor hibridació de la sonda verda (entre 8 i 10 vegades més hibridació de la sonda vermella que no pas de la verda). L’explicació més plausible per a aquesta diferència és que la sonda vermella presenta millor homologia se seqüència per a les lipoxigenases que no pas la verda i per tant, sota unes mateixes condicions d’hibridació, és la sonda vermella la que millor hibrida. El fet que la sonda verda hagi estat generada 136 amb encebadors degenerats dissenyats a partir de cinc seqüències de lipoxigenases bacterianes (anteriorment citades) podria explicar aquesta diferència ja que, si bé és cert que aquets primers representarien la part de les seqüències més conservades de les cinc lipoxigenases utilitzades, la part amplificada entre aquest dos encebadors no ha de perquè estar conservada. Val la pena remarcar, de nou, dos aspectes d’aquest experiment. En primer lloc, observant les figures 43 i 44 ja s’intueix una major intensitat per al canal vermell que no pas per al canal verd, i en segon lloc un altra factor que indica la repetibilitat de la hibridació és el fet que la distribució dels spots que superen els filtratges de dades es manté igual entre els diferents arrays. Cal destacar l’absència de clons que únicament presentin un 1 en el filtratge realitzat en el canal verd. Això pot estar indicant, de nou, que la seqüència sobre la que es va dissenyar aquesta sonda realment és molt més variable que no pas l’altre sonda i que per tant la hibridació és molt més difícil. Els resultats dels anàlisis mitjançant l’índex SNR (Signal-to-Noise Ratio) presenten unes diferències clares en funció del background que utilitzem per a calcular l’índex. En el cas d’utilitzar els spots corresponents a la placa 85 per a calcular el background molts més clons superen el valor llindar de 3 per a l’índex SNR. Això és degut a que els valors de SNR amb un background calculat a partir dels spots provinents dels clons de la placa 85, són més elevats ja que el background és més petit per aquesta placa que no pas per el conjunt de totes les plaques, i la desviació estàndard d’aquest també ho és. El resultat d’això és que els valors de SNR són més elevats en el cas d’aplicar un background calculat a partir de la placa 85 i per tant, més clons superen el valor llindar de 3 que no pas si es calcula amb totes les plaques. Aquests resultats són perfectament raonables tenint en compte que la placa 85 va ser escollida com a control negatiu ja que en les PCR realitzades sobre el conjunt de còsmids dels clons que conformaven la placa, no es va observar l’amplificació de cap banda usant els encebadors dissenyats. Així doncs, ja és normal que la placa 85 presenti un background més petit i una desviació estàndard més petita comparada amb el background i la desviació estàndard calculada a partir de totes les plaques. 137 S’observa la mateixa tendència quan es miren els resultats obtinguts per al canal vermell, tot i que en aquest cas, amb menor evidència. Analitzant les dades amb un background calculat a partir de la placa 85, tres clons superen el valor llindar de 3 mentre que amb un background obtingut a partir de totes les plaques, són dos dels tres anteriors clons els que el superen. En aquest cas, la raó és la mateixa però aplicada al canal vermell. Els valors de SNR per a aquests clons són notablement més elevats que no pas per als clons del canal verd que superaven el valor llindar fet que, novament, indica una major hibridació atribuïble a una major homologia de seqüència entre la sonda vermella i les seqüències dels clons “positius” que no pas en el cas de la sonda verda. Comparant els resultats entre els dos tipus d’anàlisis realitzats, l’anàlisi mitjançant el filtratge de les dades i l’anàlisi usant l’índex SNR, és interessant veure com aquells clons que presenten major intensitats superen els dos anàlisis. És el cas dels clons 71F5, 06G7 i 06G3. Aquest fet aporta credibilitat al resultat ja que, tant analitzant les dades d’una manera més objectiva, com és el cas de l’ús d’un índex numèric, com en el cas d’una manera més subjectiva, com és el cas de l’establiment d’uns criteris per a filtrar i seleccionar unes dades, els resultats són els mateixos i per tant més fiables. La semblança en els resultats obtingut amb els dos tipus d’anàlisi es fa visible, també, en el fet que en l’anàlisi a partir de filtratges, cap clon supera aquests quan s’apliquen únicament sobre el canal verd. El mateix passa quan s’analitzen els SNR del canal verd imposant un background que respon a la realitat del conjunt de l’array i no pas únicament al background del que, inicialment, s’havia determinat com a control negatiu de l’experiment. Els resultats de les seqüenciacions dels clons que han superat els anàlisis, resultats que en tots els casos mostren que aquella seqüència detectada correspon a la d’una lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa, posen de manifest dues qüestions. En primer terme, demostren de forma inequívoca, l’efectivitat de la tècnica del microarray a l’hora de detectar gens específics en material metagenòmic, doncs cap dels clons seleccionats ha resultat ser un falç positiu. En segon terme, es posa de manifest la dificultat per aplicar aquesta tècnica en gens que presenten una baixa conservació de 138 seqüència. És cert que, altres estratègies com poden ser l’ús de més sondes de menor longitud, o l’ús de sondes molt més específiques per a cada tipus de gen present en les bases de dades, són opcions que encara no s’han provat però que, en cap cas, modifiquen l’essència de la tècnica del microarray tot i que suposin un major cost en materials, en temps experimental i en temps d’anàlisi de les dades. Un altra aspecte interessant a comentar és el del valor llindar a aplicar en l’anàlisi de les dades a partir de l’SNR. Alguns estudis (Wu L., Thompson DK. et al. 2004) indiquen que el valor llindar pot variar en funció de la complexitat del genoma de l’espècie, del portaobjectes utilitzat per a imprimir l’array i/o de les condicions d’hibridació. Així doncs, el valor llindar de SNR de 3, utilitzat com a estàndard en aquests i en la majoria d’estudis, podria no ser un valor universal i per tant, es podria perdre informació. Aquest fet juntament amb la mida reduïda de l’array dissenyat en aquest experiment fan difícil poder modificar aquest paràmetre per a aquestes dades però en treballs futurs seria interessant definir un interval de valor SNR com a òptim, de manera que es poguessin excloure els clons amb valors superiors de SNR dels de l’interval, ja que la probabilitat d’estar detectant allò que ja coneixem és elevada, i excloure també els que presenten valors inferiors dels de l’interval. Aquest plantejament podria ser l’ideal a l’hora de detectar gens que presenten una diversitat de seqüència important. 139 5. CAPÍTOL 3: Filogènia de les lipoxigenases 5.1. Material i mètodes 5.1.1. Seqüències de lipoxigenases utilitzades en l’anàlisi filogenètic Per a l’estudi filogenètic de les lipoxigenases s’han utilitzat seqüències d’aquestes proteínes d’origen animal, vegetal, de fongs, d’algues i de bacteris. El codi de la base de dades Genbank per a cadascuna d’aquestes seqüències i l’organisme que la conté es referencien seguidament: Bacteris Myxococcus xanthus DK 1622 Pseudomonas aeruginosa PAO1 Pseudomonas aeruginosa 42A2 Shewanella woodyi ATCC 51908 Shewanella woodyi ATCC 51908 Shewanella woodyi ATCC 51908 Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14 Nitrosomonas europaea ATCC 19718 Photobacterium profundum 3TCK Shewanella denitrificans OS217 Nitrosospira multiformis ATCC 25196 Burkholderia thailandensis E264 Pseudomonas aeruginosa PA7 Pseudomonas aeruginosa LESB58 Animals Bos taurus Homo sapiens Rattus norvegicus Canis familiaris Mus musculus Pan troglodytes Gallus gallus Danio rerio Plexaura homomolla Plantes Oryza sativa (japonica cultivar-group) Populus deltoides Cucumis sativus Medicago truncatula Zea mays Solanum tuberosum Citrus jambhiri Brassica napus Arabidopsis thaliana Pisum sativum Versió i GI NC_008095.1 NC_002516.2 AAL85880.2 ZP_01543473.1 CP000438.1 NP_841292.1 ZP_01218321.1 NC_007954.1 NC_007614.1 CP000086.1 NC_009656.1 NC_011770.1 GI:108756767 GI:110645304 GI:283788581 GI:118075346 GI:115583796 GI:30249222 GI:90410305 GI:91791369 GI:82701135 GI:83652219 GI:152988702 GI:218892867 NZ_AAUO01000023.1 GI:118073771 NZ_AAUO01000010.1 GI:118072427 Versió i GI AAD39096.1 GI:5070263 NM_001141.2 GI:85067500 NP_695213.1 GI:23463277 XP_546603.1 GI:57086637 NP_033791.1 GI:40363263 XP_511865.2 GI:114669183 XP_423676.2 GI:118116654 NP_001038796.1 GI:113673261 AAC47283.1 GI:1477763 Versió i GI NP_001067011.1 GI:115489048 AAZ57445.1 GI:71999171 AAA79186.1 GI:1017772 ABE89490.2 GI:140059856 AAL73499.1 GI:18481649 CAA65268.1 GI:1495802 BAB84352.1 GI:18461098 AAO03559.1 GI:27372775 CAB56692.1 GI:6002055 CAA55318.1 GI:493730 143 Fongs Gibberella zeae Chaetomium globosum Neurospora crassa Aspergillus fumigatus 5.1.2. Programes bioinformàtics Versió i GI XP_382392.1 GI:46110669 XP_001225066.1 GI:116198509 CAD37061.1 GI:21622514 XP_746844.1 GI:70982632 S’utilitzen diversos programes bioinformàtics per a fer els alineaments, els arbres filogenètics i els estudis evolutius de les seqüències a estudiar. 5.1.2.1. Programes usats per a fer els alineaments Per a fer els alineaments de les diverses seqüències empredes per a la realització d’aquesta tesi s’ha utilitzat el programa bioinformàtic Clustal W2 (http://www.ebi.ac.uk/embnet.news/vol4_3/clustalw1.html), programa d'alineació de seqüències nucleotídiques o aminoacídiques que produeix alineaments múltiples de seqüències divergents biològicament significatius. Aquest programa calcula el millor alineament per a les seqüències seleccionades, i mostra les identitats, similituds i diferències obtingudes en funció d’aquest. Els alineaments aplicats al conjunt de programes PAML 4.3 (veure punt 6.1.2.3) han estat modificats eliminant de totes les seqüències, aquells codons que només codifiquen per a dues o menys seqüències (és a dir, que en la resta de seqüències, el programa d’alineament hi ha introduït gaps). 5.1.2.2. Programes i mètodes per a fer els arbres filogenètics. A partir de les seqüències alineades, mitjançant el programa MEGA 4 (Tamura K., Dudley J. et al. 2007) que té integrat el programa CLUSTAL W, es generen els arbres filogenètics per a les seqüències analitzades. S’han obtingut utilitzant la matriu de distàncies de Jukes-Cantor i el mètode d’agrupament Neigbour-Joining, de manera que els arbres no presenten arrel i només mostren les relacions genètiques entre les diferents seqüències. El nivell de confiança de l’arbre s’ha determinat mitjançant un anàlisis de “bootstrapping” de 1000 rèpliques (el programa mostra els valors obtinguts als nodes de la figura). 144 5.1.2.3. PAML 4.3: Anàlisi filogenètic per màxima versemblança. PAML (Phylogenetic Analysis by Maximum Likelihood) és un conjunt de programes bioinformàtics per a l’anàlisi de DNA o de seqüències aminoacídiques que utilitza el mètode de la màxima versemblança. Aquest sistema pot ser usat per estimar paràmetres i provar hipòtesis per a estudiar els processos evolutius als que han estat sotmesos un conjunt de seqüències (Yang Z. 2007). PAML inclou BASEML, BASEMLG, CODEML, Evolved, PAMP, YN00, MCMCTREE, i CHI2. Aquests programes poden ser usats per a avaluar una col—lecció d'arbres obtinguts mitjançant altres programes com el MEGA (Tamura K., Dudley J. et al. 2007). La força de PAML és a la varietat i sofisticació dels models de substitució, característica molt útil quan es pretén entendre el procés d'evolució de les seqüències en estudi. Exemples d’anàlisi que es poden realitzar utilitzant PAML són (Yang Z. 2007): - Comparació i anàlisi d'arbres filogenètics (BASEML i CODEML). - Estimació de paràmetres en els models de substitució, inclosos models amb taxes variables entre diferents llocs i els models per a l'anàlisi combinat de diversos gens (BASEML i CODEML). - Proves de raó de versemblança de les hipòtesis mitjançant la comparació dels models estadístics niuats (BASEML, CODEML, CHI2) que permeten el càlcul de LRTs (Likelihood ratio test). - Estimació de les taxes de substitució sinònimes (dS) i no sinònimes (dN) i la detecció de la selecció darwiniana positiva en seqüències codificadores de proteïnes de l'ADN (YN00 i CODEML). - Estimació de les matrius de substitució d’aminoàcids (CODEML). - Estimació de temps de divergència d'espècies en virtut dels models de rellotge mundial i local usant el mètode de la màxima versemblança (BASEML i CODEML). - Reconstrucció de seqüències ancestrals (BASEML i CODEML). Els estudis filogenètics realitzats sobre les seqüències de lipoxigenases realitzats en aquesta tesi s’han dut a terme amb el programa CODEML. 145 5.1.2.3.1. CODEML: anàlisi dels models evolutius El programa CODEML permet l’estudi de l’evolució d’una proteïna en funció de les substitucions acumulades durant el temps d’evolució. Hi ha un gran nombre de tipus de substitució de codons. A continuació s’introdueixen quatre d’aquest tipus on es poden aplicar diversos models estadístics: el bàsic, el de branques, el de sites i el de branques-sites. El model bàsic més utilitzat és una versió simplificada del model de Goldman i Yang de l’any 1994 que especifica la taxa de substitució d’un codó i a un codó j (qij) com (Yang Z. and Nielsen R. 1998): qij = 0 si els dos codons difereixen en més d’una posició qij = πj per a transversions sinònimes qij = κπj per a transicions sinònimes qij = ωπj per a transversions no sinònimes qij = ωκπj per a transicions no sinònimes La freqüència d’equilibri del codó j (πj) pot ser considerada un paràmetre lliure però també pot ser calculada a partir de les freqüències dels nucleòtids en les tres posicions del codó. Sota aquest model, la relació entre sinònims i no sinònims és ω que és igual a dN/dS. La taxa ω és una mesura de la selecció natural que està actuant en la proteïna. Bàsicament, uns valors de ω < 1, = 1, i > 1 signifiquen selecció purificadora negativa, evolució neutra i selecció positiva respectivament. No obstant això, la proporció mitjana sobre tots els llocs i tots els llinatges gairebé mai és superior a 1 ja que, si bé la selecció positiva és probable que afecti a tot arreu,ho farà a través de temps molt prolongats. És per això que l’interès es centre en la detecció de la selecció positiva que afecta només a alguns llocs o llinatges. El model de branques permet que la taxa ω variï entre les diferents branques de l’arbre filogenètic i és útil per a detectar la selecció positiva actuant en llinatges particulars (Yang Z. 1998; Yang Z. and Nielsen R. 1998). El model 1 del model de branques (en el programa CODEML), assumeix un valor de ω independent per a cada branca. En el model 2, es permet treballar amb 146 diverses ω havent d’especificar amb quantes taxes diferents es vol treballar i a quines branques s’aplicaran. El model de sites permet que ω variï entre els diferents llocs (entre els codons o aminoàcids en les proteïnes) (Yang Z. and Nielsen R. 1998; Yang Z., Nielsen R. et al. 2000). Per a aquest model s’han ajustat els models d’hipòtesis ajustant els paràmetres per a cada hipòtesi (taula 11). Model M0 (hip. nul—la) M1a (neutra) M2a (selecció positiva) M7 (ω general) M8 (ω>1) NSsites 0 1 2 7 8 p 1 2 4 2 4 Parametres ω p0 (p1 = 1 – p0), ω0 < 1, ω1 = 1 p0, p1 (p2 = 1 – p0 – p1), ω0 < 1, ω1 = 1, ω2 > 1 p, q p0 (p1 = 1 – p0), p, q, ωs > 1 Taula 11.- on p és el nombre de paràmetres lliures en la distribució de ω (entre parèntesis els paràmetres que no són lliures i que per tant no han de ser comptats com a tals. En aquest cas el model M0 és la hipòtesi nul—la contra la que comparar els altres models M1a (selecció neutre) i M2a (selecció positiva), mentre que els models M7 i M8 (selecció positiva amb distribució β) es comparen entre ells. Dos parells de models semblen ser particularment útils. El primer compara M1a (Neutral) i M2a (Selecció positiva), mentre que el segon es compara M7 i M8. El programa CODEML utilitza el càlcul del valor BEB (Bayes empirical Bayes) per a determinar la probabilitat que un site estigui sotmès a selecció positiva sempre que l’LRT sigui significatiu (Yang Z., Wong WSW. et al. 2005). El model branques-sites permet variar ω tant entre els diferents sites de la proteïna com entre les diferents branques de l’arbre amb l’objectiu de detectar la selecció positiva que afecta a uns pocs sites de llinatges particulars. La taxa de substitucions sinònimes (llocs sinònim, dS), la taxa de substitucions no sinònimes (lloc no sinònims, dN) i la relació dN / dS (ω) s’han calculat utilitzant el mètode de Nei-Gojobori (Nei M. and Gojobori T. 1986) implementat en el programa CODEML del paquet de programari PALM 4. Els models estàndard de substitució de codons s’han aplicat a les dades amb el programari PAML i les taxes de màxima versemblança (LRT) s’han utilitzat per a 147 determinar l’ajust dels models niats jeràrquicament. Els valors estadístics LRT (2∆l = 2 (l1 - l0) ) on l1 representa el logaritme de la LRT del model corresponent a la hipòtesi alternativa i l0 és el logaritme de la LRT conforme al model que s’utilitza com a hipòtesi nul—la, s’han comparat amb una distribució χ2 on la diferència en el nombre de paràmetres de tots dos models dóna els graus de llibertat. Els model que s’ha provat és el model branques-sites que inclou una combinació de la selecció en diferents sites dins de llinatges específics. 148 5.2. 5.2.1. Resultats i discussió Anàlisi dels gens de lipoxigenases Per a la realització d’aquesta tesi s’han utilitzat 14 seqüències de lipoxigenases d’origen bacterià, 9 seqüències de lipoxigenases d’origen animal, 10 seqüències de lipoxigenases d’origen vegetal i 4 seqüències de lipoxigenases de fongs. Com que no totes aquestes seqüències de lipoxigenases han estat confirmades experimentalment, en el cas de les seqüències bacterianes i de fongs, s’ha confirmat la seva naturalesa de lipoxigenases detectant, mitjançant alineaments, els aminoàcids altament conservats que coordinen l’àtom de ferro (Solomon EI., Zhou J. et al. 1997) i una seqüència aminoacídica característica de les lipoxigenases, la W - - AK (Gaffney BJ 1996). En les dues taules següents es mostren les posicions dels aminoàcids que conformen els lligands del ferro per a les seqüències de les lipoxigenases bacterianes i les de fongs i que queden ben alineats dins dels grups corresponents. Espècie Burkholderia thailandensis E264 Myxococcus xanthus DK 1622 Nitrosomonas europaea ATCC 19718 Nitrosospira multiformis ATCC 25196 Photobacterium profundum 3TCK Pseudomonas aeruginosa 42A2 Pseudomonas aeruginosa PAO1 Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14 Shewanella denitrificans OS217 Shewanella woodyi ATCC 51908 Shewanella woodyi ATCC 51908 Shewanella woodyi ATCC 51908 accés al GenBank CP000086.1 NC_008095.1 NP_841292.1 NC_007614.1 ZP_01218321.1 AAL85880.2 NC_002516.2 CP000438.1 NC_007954.1 ZP_01543473.1 NZ_AAUO01000023.1 NZ_AAUO01000010.1 pb gen 2088 2028 1698 1662 1845 2058 2058 2058 1857 2145 2271 2178 aa gen 695 675 565 553 614 685 685 685 618 714 756 725 W--AK 368 WQMAK 372 346 WLAAK 350 244 WLAAK 248 232 WLTAK 236 289 WQAAM 293 357 WQMAK 361 357 WQMAK 361 357 WQMAK 361 293 WQAAM 297 384 WQMAK 388 422 WKMAK 426 383 WQIAK 387 Lligands del Fe 388 H, 393 H, 565 H, 569 N i 695 I 366 H, 371 H, 549 H, 553 N i 675 V 264 H, 269 H, 445 H, 449 N i 565 V 352 H, 357 H, 433 H, 437 H i 553 I 309 H, 314 H, 487 H, 491 N i 614 I 377 H, 382 H, 555 H, 559 N i 658 I 377 H, 382 H, 555 H, 559 N i 658 I 377 H, 382 H, 555 H, 559 N i 658 I 313 H, 318 H, 491 H, 495 N i 618 I 403 H, 407 H, 593 H, 597 R i 714 N 441 H, 445 H, 635 H, 639 N i 756 N 403 H, 408 H, 600 H, 604 N i 725 I Taula 12.- Alineament i posició dels aminoàcids que lliguen l’àtom de ferro i de la seqüència característica de les lipoxigenases (W- - AK) de totes les seqüències d’origen bacterià utilitzades en aquesta tesi. 149 En el cas de les seqüències bacterianes cal remarcar algunes singularitats presents en les seqüències de Shewanella woodyi ATCC 51908. En aquest cas, el quart lligand que normalment pot variar entre una asparagina (N) o una histidina (H) és substituït, en el cas d’una de les tres possibles lipoxigenases codificades en el genoma de Shewanella woodyi ATCC 51908, per una arginina (R). El cinquè lligand, l’aminoàcid C-terminal, també es veu alterat en dues de les tres seqüències, en aquesta posició habitualment hi ha una isoleucina (I) o una valina (V) mentre que per a aquest organisme, en dos de les tres seqüències, hi trobem una asparagina (N) (Taula 12). Respecte la seqüència característica de les lipoxigenases W - - A K s’observa clarament l’alta conservació dels residus W (triptòfan) i A (alanina) i, en menor mesura en el cas de les seqüències d’origen bacterià, de la K (lisina) que es pot veure modificada per una M (metionina) (Taules 12 i 13). Espècie Gibberella zeae Chaetomium globosum Neurospora crassa Aspergillus fumigatus accés al GenBank XP_382392.1 XP_001225066.1 CAD37061.1 XP_746844.1 pb gen 2238 2256 2268 2235 aa gen 745 751 755 744 W--AK 387 WRYAK 391 409 WRYAK 413 411 WRYAK 415 398 WRYAK 402 Lligands del Fe 407 H, 412 H, 596 H, 600 N i 745 I 429 H, 434 H, 611 H, 615 N i 751 I 431 H, 436 H, 615 H, 619 N i 755 I 418 H, 423 H, 603 H, 607 N i 744 I Taula 13.- Alineament i posició dels aminoàcids que lliguen l’àtom de ferro i de la seqüència característica de les lipoxigenases (W- - AK) de totes les seqüències de fongs utilitzades en aquesta tesi. De la resta de seqüències, les d’origen animal i vegetal, no ha calgut ferne la comprovació de que són lipoxigenases ja que estan molt ben estudiades i, en alguns casos com és el de la lipoxigenasa de Plexaura homomolla, fins i tot se’n disposa de l’estructura cristal—lina (Brash AR. 1996). 5.2.2. Arbres filogenètics Com que les referències bibliogràfiques que parlen de la presència de lipoxigenases en procariotes són molt escasses, i per tal de situar la posició relativa de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa respecte a les d’altres orígens, s’han representat dos arbres filogenètics (figures 59 i 60) on es pot observar clarament com s’agrupen les lipoxigenases d’origen animal, les d’origen vegetal, les d’origen fúngic i les bacterianes per separat. 150 Figura 59.- Arbre filogenètic consens construït amb el programa MEGA4 amb el mètode Neighbor-Joining amb un bootstrap de 1000 repeticions i amb el model de p-Distance (càlcul de distància) a partir d’un alineament de les seqüències aminoacídiques. Les posicions que contenen gaps han estat eliminatdes del conjunt de dades (opció Complete deletion). Vermell, lipoxigenases vegetals; Blau, lipoxigenases animals; Negre lipoxigenases fúngiques i Verd lipoxigenases bacterianes. Les diferències que s’observen quan es fa el mateix arbre però a partir les seqüències nucleotídiques no són significatives. 151 Figura 60.- Arbre filogenètic consens construït amb el programa MEGA4 amb el mètode Neighbor-Joining amb un bootstrap de 1000 repeticions i amb el model de Jukes-Cantor (càlcul de distància) a partir d’un alineament de les seqüències nucleotídiques. Totes les posicions que contenen gaps han estat eliminats del conjunt de dades (opció Complete deletion). En vermell, lipoxigenases vegetals; en blau, lipoxigenases animals; en negre lipoxigenases fúngiques i en verd lipoxigenases bacterianes. 152 Tal com es pot observar en els arbres filogenètics, les lipoxigenases formen una família heterogènia d’enzims amb subfamílies clarament diferenciades, corresponents a organismes animals, organismes vegetals, organismes fúngics i organismes bacterians. Aquest tipus d’agrupació entre lipoxigenases animals, vegetals i bacterianes ja va ser descrita l’any 2006 (Koeduka T., Kajiwara T. et al. 2007) i aquí es confirma amb l’addició de noves lipoxigenases bacterianes, les de Nitrospira, Nitrosomonas, Photobacterium i de Shewanella woodyi. Hi ha diversos aspectes interessants a comentar respecte aquests dos arbres filogenètics. En primer lloc, els arbres estan fets a partir de diferents models de càlcul de distància (arbre de la figura 59, model p-distance, i arbre de la figura 60, model Jukes-Cantor) on en el cas del model p-distance la distància és la proporció (p) de nucleòtids diferents entre les dues seqüències comparades i, en el cas del model Jukes-Cantor, la distància es calcula amb la fórmula d = -3/4 x ln (1 - 4/3p), suposant una igualtat de les taxes de substitució entre llocs i de les freqüències de nucleòtids. Aquesta diferència però, únicament es reflexa en el grup de les lipoxigenases fúngiques que, en el cas de l’arbre amb model de p-distance, equidista de les lipoxigenases animals i vegetals mentre que, en el cas del model calculat amb distància Jukes-Cantor, aquest grup és més proper a les lipoxigenases d’origen animal que no pas a les vegetals. En tot cas, aquesta diferència no és significativa ja que l’altíssima diversitat de seqüència fa que aquest gen no sigui prou conservat per a establir relacions filogenètiques. Un altre aspecte a remarcar d’aquests arbres és, el cas de Myxococcus xanthus que, en els dos arbres, queda fora del grup de les lipoxigenases bacterianes situant-se en una posició més propera a les lipoxigenases animals que no pas de les vegetals, fenomen que ja s’havia publicat l’any 2008 (Lang I., Göbel C. et al. 2008) i podria fer pensar, tal com es va proposar l’any 2001, en un cas de transferència horitzontal (Porta H. and Rocha-Sosa M. 2001). El mateix cas es dóna per a la lipoxigenasa de Plexaura homomolla que ja apareix fora del grup de les lipoxigenases animals en un arbre filogenètic publicat l’any 2006 (Koeduka T., Kajiwara T. et al. 2007). 153 El cas de les dues Shewanella woodyi (a i b) que apareixen clarament fora del grup de lipoxigenases bacterianes (en el primer cas) no ha estat mai publicat i sembla força raonable atribuir-ho a un cas d’error en l’anotació d’aquests gens, doncs tot i que conserven la seqüència típica (W - - A K) de les lipoxigenases, no presenten la valina o isoleucina terminal típica de la seqüència aminoacídica de les lipoxigenases. El conjunt de les lipoxigenases de bacteris no presenten graus de similitud com els grups de les lipoxigenases animals i vegetals però el subgrup format per les lipoxigenases de Pseudomonas, Burkholderia, Shewanella denitrificans i Photobacterium si que presenta una diversitat equiparable a la de les lipoxigenases animals i vegetals, i tots aquests organismes són proteobacteries. Cal doncs tenir en compte dos aspectes claus a l’hora de fer una anàlisi d’aquest tipus. En primer lloc, cal verificar la qualitat de les seqüències amb les que es vol treballar i en segon lloc, es recomanable disposar d’un elevat número de seqüències. En el cas d’aquesta tesi, aquest segon aspecte no és millorable donada les poques seqüències classificades com a lipoxigenases presents en les bases de dades i, pel que fa el primer aspecte es posa de manifest que, tot i que algunes seqüències compleixen amb les característiques més típiques de les seqüències de lipoxigenases, poden no ser-ho. 5.2.3. Evolució de les lipoxigenases bacterianes Per tal d’estudiar l’evolució de les lipoxigenases d’origen bacterià, s’ha realitzat un alineament de les 14 seqüències generant un alineament de 2670 sites. Tenint en compte que la seqüència més llarga és de 2271 nucleòtids (Shewanella woodyi ATCC 51908), aquesta diferència tant important en la longitud de l’alineament, ja indica una diversitat important entre les seqüències. Per analitzar aquest alineament amb el programa CODEML, cal eliminar el codó stop i, seguint les recomanacions del manual del programa, també s’han eliminat tots aquells sites on hi havia menys de tres seqüències que presentaven algun triplet de nucleòtids codificador d’aminoàcid. El resultat d’aquestes modificacions es tradueix en l’obtenció d’un alineament de 2457 sites que només representa la pèrdua d’un 8 % d’informació respecte la 154 longitud total de l’alineament. Aquest alineament modificat presenta 47 sites que no varien i un percentatge de G + C que va del 68’2 % en Myxococcus xanthus fins al 42’1 % en Shewanella woodyi (GI:118072427), amb una mitjana del 55’9 %. Pel que fa a les lipoxigenases de les cinc soques de Pseudomonas aeruginosa, el percentatge G + C és del 66’5 % amb una desviació estàndard de 0’38 mentre que pel conjunt de les 14 seqüències la desviació estàndard és de 5’45. Aquesta dada ens indica, de nou, una gran diversitat de seqüència dins del grup de les lipoxigenases bacterianes. Aquest procediment s’ha aplicat d’igual manera als altres grups de lipoxigenases (animals, vegetals i fongs). La taxa mitjana de transicions/transversions de l’alineament modificat és de 0’76, és a dir, hi ha més transversions (canvi d’una base púrica, adenina o guanina, per una base pirimidínica, citosina o timina) que no pas transicions (canvi d’una base púrica a una altra base púrica, o canvi d’una base pirimidínica a una altra base pirimidínica). La figura 61 mostra la taxa de substitucions (transversions i transicions) respecte a la distància calculada amb el mètode Jukes-Cantor (JC) per al grup de les lipoxigenases d’origen bacterià. Transicions i transversions vs JC 0,6 Transicions i Transversions 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 distància JC Transicions Transversions 1,2 1,4 1,6 1,8 2 Figura 61.- Gràfic que mostra la saturació de les lipoxigenases bacterianes estudiades. substitucions (transicions i transversions) respecte la distància filogenètica (Jukes-Cantor) de l’alineament de 155 Aquest gràfic mostra una forta saturació de substitucions (quadrats, transicions; triangles, transversions) a partir de valors de divergència de 0’3 indicant l’ocurrència de múltiples substitucions i fins i tot de l’existència d’un fenomen d’homoplàsia (similituds entre espècies amb un ancestre diferent com a resultat d’una evolució convergent) (Farfán M., Miñana-Galbis D. et al. 2009). Mitjançant el mètode de Jukes-Cantor i amb una comparació per parelles de seqüències, s’han estimat les taxes de substitucions sinònimes (dS) i les no sinònimes (dN) tant per a les lipoxigenases d’origen bacterià com les d’origen animal i vegetal. Aquests valors es mostren en la figura 62 on es pot observar clarament com el grup de les lipoxigenases procariotes (triangles taronges) queda clarament diferenciat de les eucariotes (rombes blaus, animals i quadrats verds, plantes). dN vs dS 2,5 2 1,5 dN 1 0,5 0 0 0,5 1 1,5 dS animals plantes bacteris 2 2,5 3 Figura 62.- Gràfic de l’estimació de les taxes de substitució sinònimes (dS) versus les no sinònimes (dN) a partir d’un alineament realitzat mitjançant el mètode de la màxima versemblança. Els triangles taronges representen les lipoxigenases bacterianes, els quadrats verds, les de plantes i els rombes blaus, les d’animals. Aquests resultats encaixen perfectament amb els arbres filogenètics obtinguts en aquest estudi i mostrats en l’apartat 6.2.2 ja que confirmen que 156 les lipoxigenases d’origen procariota presenten diferències notables a nivell de seqüència nucleotídica respecte les d’origen eucariota. A partir de les taxes de substitució sinònimes i no sinònimes es defineix la taxa ω com el quocient entre la taxa de substitució no sinònima i la taxa de substitució sinònima (dN/dS). En la figura 63 es representa la relació entre ω i la distància filogenètica obtinguda aplicant el mètode Jukes-Cantor (JC). Aquesta figura ens permet veure tres grups de dades diferenciats corresponents a les lipoxigenases animals, vegetals i bacterianes. dN/dS (w) vs JC 1,200 1,000 0,800 w 0,600 0,400 0,200 0,000 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 distància JC animals plantes bacteris Figura 63.- Gràfic de l’estimació de les ω (dN/dS) versus la distància filogenètics calculada pel mètode de Jukes-Cantor a partir de l’alineament de les lipoxigenases estudiades. Els triangles taronges representen les lipoxigenases bacterianes, els quadrats verds, les de plantes i els rombes blaus, les d’animals. El comportament d’aquests grups de dades presenten diferències importants. En el cas de les lipoxigenases la recta de regressió (no mostrada en la figura 63) presenta un pendent de 0,1424 mentre que per a les lipoxigenases de plantes i animals és de 0,2789 i 0,2976 respectivament fet que indica que la taxa dN/dS (ω) ja s’ha saturat per a les lipoxigenases bacterianes i en canvi no ho ha fet per a les lipoxigenases animals i vegetals. Gràficament es pot observar clarament com a partir d’un valor 1,3 de distància Jakes-Cantor, els 157 valors d’ω per a les lipoxigenases d’origen bacterià, ja no varien gaire indicant que, tot i que la distància filogenètica entre aquestes seqüències incrementi, la relació entre canvis no sinònims i sinònims no varia i que per tant, l’acumulació de canvis s’ha saturat. Per altra banda, el major pendent dels altres grups de lipoxigenases, vegetals i animals, indica que encara no s’ha arribat a la saturació. És a dir que mentre que les lipoxigenases d’origen animal i vegetal encara estan acumulant canvis que influeixen en la seva evolució, les lipoxigenases d’origen bacterià, tot i poder patir canvis, aquests ja no afecten a la seva evolució. La interpretació de saturació encaixa perfectament amb els elevats valors obtinguts per a dS i l’àmpli rang d’aquests mateixos (figura 62) i amb la figura 61 on es mostra una clara saturació de transicions i transversions per a valors de divergència superiors a 0,5. Aquesta interpretació de les figures 62 i 63 però, està fortament condicionada per les seqüències amb que s’ha fet l’estudi, i és que aquest conjunt de seqüències de lipoxigenases no representa la diversitat real d’aquestes. Cal tenir present que les lipoxigenases més estudiades són les de mamífers (en el cas de les lipoxigenases animals) i les de plantes amb interès comercial. En el cas de les seqüències bacterianes atribuïdes a lipoxigenases, com ja s’ha dit anteriorment, la representativitat de la diversitat d’aquest grup és molt limitada i, a més a més, estan poc estudiades. Per tal de verificar la naturalesa de la pressió selectiva que està actuant sobre l’alineament amb el qual s’ha treballat s’han utilitzat diversos models desenvolupats per Nielsen i Yang (Nielsen R. and Yang Z. 1998; Yang Z., Nielsen R. et al. 2000). Aquets models estan integrats en el programa CODEML del paquet PAML. Els models M0, M1, M2, M7 i M8 que assumeixen variacions d’ω entre sites però no entre llinatges, han estat aplicats a l’alineament. El model utilitzat, l’estimació dels paràmetres i el valor de loglikelihood es mostren a la taula 14. 158 cleandata 1 Model M0 M1 M2 M7 M8 p 1 2 4 2 4 l ω 0,08039 -13369,71177 1,0000 -13751,52324 0,92342 -13751,51963 0,04706 -13307,37354 0,93942 -13751,52324 k 1,65319 2,19726 2,19726 1,70077 2,19726 Estimació de paràmetres w = 0.08039 p0 = 0.00001 w0 = 0 p1 = 0.99999 w1 = 1 p0 = 0; p1 = 1; p2 = 0 w0 = 0; w1 = 1; w2 = 1 p = 1.82107; q = 15.60717 p0 = 0.00001; p = 0.00500; q = 1.88239; p1 = 0.99999; w = 1 Sites seleccionats positivament i p (w>1) 127 R 0.988 127 R 0.992 cleandata 0 Model M0 M1 p 1 2 ω 0,10265 0,23539 l -25039,04654 -24968,70447 k 1,6681 2,19726 Estimació de paràmetres w = 0,10265 p0 = 0.00001 w0 = 0 p1 = 0.99999 w1 = 1 p0 = 0,83; p1 = 0,0536; p2 = 0.1163 w0 = 0,0788; w1 = 1; w2 = 1 p = 1,48857; q = 9,62348 p0 = 0,95910; p = 1,70908; q = 13.34477 p1 = 0,04090; w = 1 Sites seleccionats Positivament i p (w>1) - M2 M7 M8 4 2 4 0,326123 0,130452 0,200475 -24968,70447 -24914,88305 -24910,60091 1,86405 1,77087 1,79986 373 R 554 L 576 A 768 R 0.602* 0.715 0.632 0.691 Taula 14.- Taula de resultats de l’aplicació del programa CODEML en funció del model aplicat. p, nombre de paràmetres lliures per a cada model. ω , mitjana dels valors d’ω de tots els sites de l’alineament de les lipoxigenases bacterianes estudiades. l, loglikelihood per a cada model. k, taxa transisions/transversions. L’aplicació del programa CODEML s’ha realitzat de dues maneres diferents, en funció de si s’aplica el paràmetre cleandata 0 o 1. En el cas d’aplicar el programa amb cleandata 0, l’alineament utilitzat no pateix cap modificació, però quan es treballa amb un cleandata 1, aquest alineament pateix una modificació consistent en l’eliminació de tots aquells sites que presenten algun gap. Aquesta opció comporta l’eliminació de molta informació de l’alineament (passem de 2457 sites a 1083 sites) però el manual del programa en recomana la seva aplicació i a més a més, tal com es pot observar en la taula 14, només treballant d’aquesta manera s’obtenen sites amb una selecció positiva (és a dir, sites que presenten una ω > 1 amb una probabilitat superior a 0,95) ja que el programa tracta els gaps detectats com a dades ambigües i això fa disminuir molt els valors d’ω. És per aquesta raó que, quan es treballa amb un cleandata 0, els valors d’ω són més baixos que no pas si es treballa amb un cleandata 1, l’eliminació dels sites amb algun gap fa incrementar el valor de dS i per tant, la ratio dN/dS (ω) pren valors més baixos. 159 Els resultats de les proves LRT, restringides a models niats on el model més senzill és un cas especial del model més complex (Johnson JB. and Omland KS. 2004), es mostren en la taula 15. Amb aquestes proves es pot determinar quin dels dos models que s’estan provant s’ajusta millor a les dades aplicades al programa (és a dir a l’alineament aplicat al programa). cleandata1 Hipòtesi Alternativa M0 M2 M7 Hipòtesi Nul·la M2 M1 M8 2∆ l 763,615714 0,00722 762,299396 Graus de llibertat 3 2 2 p-valor 3.3643 x 10-165 9,861800652 2.943 x 10-166 Taula 15.- Taula de valors de LRT (Likelihood Ratio Test) per a diversos models evolutius implementats en el programa CODEML. 2∆l = 2 (l1-l0). p-valor obtingut a ∆ partir d’una χ2 calculada amb els graus de llibertat mostrats en la taula. Aplicant el model més senzill (M0) que assumeix una ω uniforme per a tots els codons de l’alineament, el valor l (logaritme del valor de màxima versemblança) que s’obté és de -3369,71177 amb una ω estimada de 0,08039. El model M1 pressuposa una pressió selectiva variable entre els sites però no una selecció positiva. És el model M2 el que pressuposa una selecció positiva. Els valors de l per als models M1 i M2 són, respectivament, de -13751,52324 i de -13751,51963 i amb unes ω de 1,0 i 0,92342 respectivament. Els valors de k (taxa transicions/transversions) per als cinc models aplicats és constant, independentment de si s’ha aplicat un cleandata de 1 o de 0, i és que aquest paràmetre generalment es manté constant quan el gen es troba saturat (figura 61). Per tal de determinar quin dels tres models (M0, M1, M2) s’ajusta millor a les dades, s’aplica la prova LRT ( 2∆l = 2 (l1 - l0) ) un test de bondat d’ajustament, una χ2, al valor obtingut de 2∆l, el p-valor obtingut indicarà si s’accepta o no la hipòtesi alternativa (taula 2). Així doncs, el p-valor per a LRT (2∆l) entre els models M1 (selecció casi neutre) i M2 (selecció positiva) que es pot veure en la taula 15 és de 9,861800652 que és molt superior a una significança de 0,001 fet que indica que s’accepta la hipòtesi alternativa, és a dir que el model que millor s’ajusta a les dades és el model M2 (selecció 160 positiva). Amb la mateixa prova realitzada entre els models M0 i M2 s’obté un p-valor de 3,3643 x 10-165, molt inferior a 0,001 i per tant és la hipòtesi nul—la, el model M2, la que s’ajusta a les dades (taula 15). En el cas dels models M0 i M1, cap dels aminoàcids estudiats són seleccionats amb una probabilitat superior al 95%. Aquest fet és lògic ja que el model que millor s’ajusta és el model de selecció positiva (M2). En el cas d’aquest model, l’aminoàcid 127, que és una arginina (R), presenta una probabilitat del 0.988 d’haver evolucionat sota una pressió de selecció positiva (taula 14). Aquest mateix aminoàcid queda seleccionat també quan s’aplica el model M8 que assumeix una distribució beta amb una ω superior a 1. Així doncs, es pot dir que només l’aminoàcid 127 segueix una evolució amb selecció positiva mentre que la resta d’aminoàcids estudiats segueixen una evolució amb selecció neutre o purificadora. Com que les proves LRT només es poden aplicar entre models niats, cal determinar el valor 2∆l comparant el model M8 contra el model M7 que ∆ únicament pressuposa una distribució beta (distribució de probabilitat contínua amb dos paràmetres a i b amb una funció de densitat amb valors entre 0 i 1). Els valors l per als models M8 i M7 són -13751,52324 i -13307,37354 respectivament, obtenint un p-valor per a LRT (2∆l) entre els models M7 i M8 és de 2,943 x 10-166 (taula 15), aquest valor permet acceptar la hipòtesi nul—la, o sigui que les dades aplicades al programa s’ajusten millor al model M8. Com que els models M2 i M8 no estan niuats no es pot aplicar una χ2 per tal de determinar quin dels dos models s’ajusta millor a les dades. Cal, aleshores, fixar-se amb el valor l i aquell model que presenti un valor més alt per aquest paràmetre, serà el que millor s’hi ajusti. En aquest cas és el model M8, que presenta una probabilitat més alta (0,992) per a l’aminoàcid seleccionat tot i que no gaire diferent de la del model M2 (0,988). Sota el model M8, la mitjana d’ω entre els 361 codons estudiats és de 0,9394 amb una variança de 0,1915. La figura 6 mostra la distribució d’ω en els 361 codons seguint una distribució β amb una ω en la majoria de sites que es troba entre 0,5 i 1,0 suggerint que la força d’evolució predominant és la purificadora (ω < 1) o la neutre (ω = 1). De tots aquells sites que presenten 161 valor d’ω superiors a 1 només un (marcat en vermell en la figura 64) presenta una probabilitat de 0,992 que supera la significança del 99% i que indica que aquest site (aminoàcid 127 R) segueix una distribució β amb una ω superior a 1 que vol dir que ha estat sotmès a una evolució de selecció positiva. Distribució d’ω Model 8 4,5 4 3,5 3 ω 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 50 100 150 200 250 300 350 núm. aminoàcid Figura 64.- Distribució de les ω obtingudes per a cada site de l’alineament de les lipoxigenases d’origen bacterià aplicat al programa CODEML sota el model M8 on s’utilitza una distribució beta. En vermell la ω corresponent a l’aminoàcid 127. Aquest fet es veu recolzat per l’obtenció dels mateixos resultats amb l’aplicació del model M2, tot i que en aquest cas la probabilitat d’aquest fenomen (0,988) no superi la significança del 99% però si la del 95%. Així doncs, aquests resultats confirmen la pressió de selecció neutre o purificadora per a la major part del gen i la selecció positiva per a l’aminoàcid 127. Aquest aminoàcid correspon a l’arginina 325 de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa 42A2. Les diferències en els resultats obtinguts aplicant l’opció de cleandata 1 i 0 demostren que, tot i tenir cert impacte en l’estimació dels paràmetres del model (M8 en aquest cas), no semblen influir en la identificació dels sites sotmesos a selecció positiva. No obstant això, les insercions i delecions poden 162 tenir un paper important en la divergència dels diferents grups de lipoxigenases definits en aquest estudi (lipoxigenases animals, vegetals i bacterianes). La detecció de l’aminoàcid 325 (figura 65) com a únic aminoàcid sotmès a una pressió de selecció positiva, obre noves preguntes sobre l’estructura de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa 42A2. Figura 65.- Localització de l’aminoàcid 325 (aminoàcid de color taronja encerclat amb vermell) en l’estructura de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa 42A2. L’esfera vermella representa el ferro i en groc es representa el fosfolípid situat en la cavitat del substrat de l’enzim. Aquest aminoàcid es troba en la superfície de la proteïna i força allunyat del centre actiu d’aquesta. Això fa pensar que, la funció d’aquest aminoàcid, està més relacionada amb l’estructura de la proteïna que no pas amb la seva activitat tot i que sempre és difícil separar aquests dos aspectes. Aquests resultats obren una sèrie de qüestions per tal d’explicar el sentit biològic d’aquesta singular selecció positiva localitzada en una situació, aparentment, sense influència previsible en l’estructura-funció de la lipoxigenasa. Tenint en 163 compte que la glicina és l’aminoàcid més petit possible, suggereix que probablement la mida de l’aminoàcid que ocupa aquest espai sigui clau en el moment del plegament de la proteïna i que, d’una altra manera, es vegi afectada la funció de l’enzim. Per a resoldre aquestes qüestions, serien necessaris els estudis de mutagènesi dirigida per a poder veure com afecta un canvi sobre aquest aminoàcid en l’activitat d’aquesta lipoxigenasa o en l’estructura de la mateixa. 164 6. CONCLUSIONS 6. Conclusions 1.- S’ha obtingut el primer cristall d’una lipoxigenasa bacteriana, i s’ha determinat un nou model cristal—logràfic per a les lipoxigenases. Les característiques generals d’aquest cristall amb sistema ortoròmbic són: -Estructura formada per un sol domini a diferència de les lipoxigenases descrites fins al moment, que en presenten dos. -Presència d’una estructura consistent en dues hèlix α antiparal—leles adjacents a l’obertura de la cavitat del substrat que podria actuar com a “tapa” de la mateixa i que no s’havia descrit anteriorment. -Presència d’una segona cavitat amb forma de canal que permetria l’accés de l’oxigen molecular al centre actiu de l’enzim. 2.- La determinació de l’estructura del cristall ha posat de manifest una forta interacció entre la cavitat catalítica de l’enzim i un molècula de fosfolípid (O-(sn-1-cis-vaccenil-sn-2-miristoil-sn-glicèric-3-fosforil) etanolamina). La cadena alifàtica de 18 carbonis del fosfolípid arriba fins al centre actiu de l’enzim mentre que l’altre cadena alifàtica (14 carbonis) interacciona amb la nova estructura de dues hèlix α antiparal—leles. 3.- La lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa 42A2 presenta uns senyals d’EPR iguals als d’altres lipoxigenases estudiades mitjançant aquesta tècnica però una velocitat d’oxidació més lenta, degut a les transicions més baixes, característica que fa molt atractiu aquest enzim per a futurs estudis sobre el mecanisme de reacció de les lipoxigenases. 167 4.- L’aplicació de la tècnica del microarray sobre les mostres de sòl, ha demostrat ser eficaç però molt sensible a les sondes dissenyades per a treballar en el cas de les lipoxigenases que presenten una alta diversitat de seqüència. 5.- S’ha confirmat l’existència d’una subfamília de lipoxigenases bacterianes. Aquesta subfamília presenta una diversitat més elevada que no pas en les corresponents a lipoxigenases eucariotes. 6.- L’estudi de l’evolució de les lipoxigenases bacterianes demostren una pressió de selecció majoritàriament purificadora o neutre en tot el gen de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa 42A2 excepte en el cas de l’aminoàcid 325 (una arginina) que s’hauria seleccionat després d’un episodi de selecció positiva. 168 7. BIBLIOGRAFIA 7. Bibliografia Ahuja SK, Ferreira GM, et al. (2004). "Utilization of enzymes for environmental applications." Crit Rev Biotechnol 24: 125-154. Akakabe Y, M. K., Kajiwara T (1999). " Enantioselective a-hydroperoxylation of long-chain fatty acids with crude enzyme of marine green alga Ulva pertusa. ." Tetrahedron Lett 40: 1137-1140. Anderson AJ and Dawes EA (1990). "Occurrence, metabolism, metabolic role, and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates." Microbiol Rev. 54 (4): 450-472. Andersson M, Andersson T, et al. (2002). "Toward an enzyme-based oxygen scavenging laminate. Influence of industrial lamination conditions on the performance of glucose oxidase." Biotechnol Bioeng 79 (1): 37-42. Andreou A. and Feussner I. (2009). "Lipoxygenases – Structure and reaction mechanism." Phytochemistry 70: 1504-1510. Bains W. (1993). "Biotechnology, from A to Z." Ben-Aziz A., Grossman S., et al. (1970). "Linoleate oxidation induced by lipoxygenase and heme proteins: A direct spectrophotometric assay." Analytical Biochemistry 34: 88-100. Bennasar A., G. J., Lalucat J. (1998). "Molecular methods for the detection and identification of Pseudomonas stutzeri in pure culture and environmental samples." Microb Ecol 35: 22-53. Boeglin WE., Kim RB., et al. (1998). "A 12R-lipoxygenase in human skin: Mechanistic evidence, molecular cloning, and expression " Proc Natl Acad Sci 95(12): 6744-9. Bollag D. and Edelstein S. (1991). Protein Methods. New York. Bondar VS, B. M., van Berkel WJH, Finkelstein ZI, Golovlev EL, Baskunov BP, Vervoort J, Golovleva LA, Rietjens IM (1999). "Preferential oxidative dehalogenation upon conversion of 2-halophenols by Rhodococcus opacus 1G." FEMS Microbiology Letters 181: 73-82. Bowers NI, B. D., Sharma ND, Goodrich PA, Groocock MR, Blacker AJ, Goode P, Dalton H (1999). "Stereoselective benzylic hydroxylation of 2-substituted indanes using toluene dioxygenase as biocatalyst." J Chem Soc Perkin Trans 1: 1453-1461. Boyd DR, Sharma ND, et al. (2001). "Aromatic dioxygenases: molecular biocatalysis and applications " Curr Opin Biotechnol. 12: 564-573. Boyington JC, G. B., Amzel LM (1993). "The three-dimensional structure of an arachidonic acid 15-lipoxygenase." Science 260: 1482-1486. Boyington JC., Gaffney BJ., et al. (1993). "The three-dimensional structure of an arachidonic acid 15-lipoxygenase." Science 260 1482-1486. Brash AR., B. W., Chang MS., Shieh BH. (1996). "Purification and molecular cloning of an 8R-lipoxygenase from the coral Plexaura homomalla reveal the related primary structures of R- and S-lipoxygenases." J Biol Chem. 271(34): 20949-57. Brash RA (1999). "Lipoxygenases: occurrence, functions, catalysis, and acquisition of substrate." The journal of biological chemestry 274(34): 23679-23682. Brodowsky ID and Oliw EH (1992). "Metabolism of 18:2(n-6), 18:(n-3), 20:4(n6) and 20:5(n-3) by the fungus Gaeumannomyces graminis: identification of metabolites formed by 8-hydroxylation and by ω2 and ω3 oxygenation." Biochim. Biophys. Acta 1124: 59-65. Brundtland GH. (1991). "Sustainable Development: A viable strategy for global change." Int. J. Global Energy Issues 2: 113-116. 171 SG (2003). "Oxidizing enzymes as biocatalysts." TRENDS in Biotechnology 21: 543-549. Busquets M, D. V., Vidal-Mas J, Rodríguez E, Guerrero A, Manresa A. (2004). "Isolation and characterization of a lipoxygenase from Pseudomonas 42A2 responsible for the biotransformation of oleic acid into ( S )-( E )10-hydroxy-8-octadecenoic acid." Antonie Van Leeuwenhoek. 85(2): 129-39. Callaghan AV, Gieg LM, et al. (2006). "Comparison of Mechanisms of Alkane Metabolism under Sulfate-Reducing Conditions among Two Bacterial Isolates and a Bacterial Consortium " Applied and Environmental Microbiology 72 (6): 4274-4282. Chen X.S, K. U., Nancy A. Jenkins, Neal G. Copelands, Colin D. FunkSn (1994). "cDNA Cloning, Expression, Mutagenesis of C-terminal Isoleucine, Genomic Structure, and Chromosomal Localizations of Murine 12Lipoxygenase." THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 269(19): 13979-13987. Choi J., C. J. K., Kim S., Shin W. (2008). "Conformational flexibility in mammalian 15S-lipoxygenase: Reinterpretation of the crystallographic data." Proteins 70: 1023-1032 Clift R. (1997). "Lean technology - The idea and the practice." J. Chem. Tech. Biotechnol. 68: 347-350. Coffa G., Schneider C., et al. (2005). "A comprehensive model of positional and stereo control in lipoxygenases." Biochemical and Biophysical Research Comunications 338: 87 - 92. Coffa G., B. A. (2004). "A single active site residue directs oxygenation stereospecificity in lipoxygenases: Stereocontrol is linked to the position of oxygenation." PNAS 101 (44): 15579–15584. Coffa G., H. E. M. (2000). "Discovery of an 11(R)- and 12(S )-Lipoxygenase Activity in Ovaries of the Mussel Mytilus edulis." Lipids 35: 1195–1204. Corey EJ. and Nagata R. (1987). "Evidence in favor of an organoiron-mediated pathway for lipoxygenation of fatty acids by soybean lipoxygenase." J. Am. Chem. Soc. 109 (26): 8107-8108. Cowan D, M. Q., Stafford W, Muyanga S, Cameron R, Wittwer P (2005). "Metagenomic gene discovery : past, present and future." Trends in biotechnology 23(6): 321-329. Cristea M., Engström A., et al. (2005). "Expression of manganese lipoxygenase in Pichia pastoris and site-directed mutagenesis of putative metal ligands." Archives of Biochemistry and Biophysics 434: 201-211. Dauter Z. (1997). "Macromolecular Crystallography Part A " Methods in Enzymology 276: 326-344 Demain A. (2000). "Microbial biotechnology." Trends in Biotechnology 18: 2631. Dho S., G. S. (1990). "Hepoxilin A, induces changes in cytosolic calcium, intracellular pH and membrane potential in human neutrophils." Biochemical Journal 266: 63-68. Drazen JM, I. E., O'Byrne PM (1999). "Treatment of Asthma with Drugs Modifying the Leukotriene Pathway." Engl. J. Med. 340 (3): 197-206. Emsley P and Cowtan K (2004). "Coot: model-building tools for molecular graphics." Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60 (Pt 12 Pt 1): 2126-32. Faber K. and Kroutil W. (2005). "New enzymes for biotransformations." Current Opinion in Chemical Biology 9: 181-187. Farfán M., Miñana-Galbis D., et al. (2009). "Divergent evolution and purifying selection of the flaA gene sequences in Aeromonas." Biology Direct 4 (23). Burton 172 Feng X. (2005). "Applications of oxidoreductases: Recent progress." Industrial Biotechnology 1 (1): 38-50. Ferrer M, B. A., Golyshin PN (2007). "Microbial metagenomes: moving forward industrial biotechnology." Journal of Chemical Technology and Biotechnology 82: 421–423. Feussner I and Wasternack C (2002). "The lipoxygenase pathway." Annual Review of Plant Biology 53: 257-297. Feussner I., K. H., Wasternack C. (2001). "Lipoxygenase-dependent degradation of storage lipids." TRENDS in Plant Science 6 No.6 268-273. Füchtenbusch B., Wullbrandt D., et al. (2000). "Production of polyhydroxyalkanoic acids by Ralstonia eutropha and Pseudomonas oleovorans from an oil remaining from biotechnological rhamnose production." Appl. Microbiol. Biotechnol. 53: 167-172. Fuller MA, Weichert H, et al. (2001). "Activity of soybean lipoxygenase isoforms against esterified fatty acids indicates functional specificity. ." Arch. Biochem. Biophys. 388: 146 - 54. Funk C.D. (1996). "The molecular biology of mammalian lipoxygenases and the quest for eicosanoid functions using lipoxygenase-deficient mice " Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Lipids and Lipid Metabolism 1304: 65-84. Gaffney BJ (1996). "Lipoxigenases: structural principles and spectroscopy." Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25: 431-59. Gaffney BJ, Mavrophilipos DV, et al. (1993). "Access of Ligands to the Ferric Center in Lipoxygenase-1." Biophys. J. 64: 773-783. Galante YM and Formantici C (2003). "Enzyme Applications in Detergency and in Manufacturing Industries." Current Organic Chemistry 7(13): 13991422. Gámiz M. (2007). "Tecnologías sostenibles para la gestión de residuos en Ventanilla (Lima). Aprovechamiento energético del Biogás (PFC)." Barcelona, Universitat Politècnica de Catalunya. Gardner, H. (1989). "Soybean lipoxygenase -1 enzymatically forms both 9(S)and 13(S)-hydroperoxides from linoleic acid by a pH dependent mechanism." Biochimica et Biophysica Acta 1001: 274-281. Gianfreda L, Xu F, et al. (1999). " Laccases: A useful group of oxidoreductive enzymes." Bioremediation J. 3: 1-25. Gillmor SA., Villasenor A., et al. (1997). "The structure of mammalian 15lipoxygenase reveals similarity to the lipases and the determinants of substrate specificity. ." Nat. Struct. Biol. 4 1003–1009. . Grechkin A (1998). "Recent developments in biochemestry of the plant lipoxygenase pathway." Prog. Lipid Res. 37 (5): 317-352. Grogan G., Rippé C., et al. (1997). "Biohydrolysis of substituted styrene oxides by Beauveria densa CMC 3240." Journal of Molecular Catalysis B 3: 253257. Guerrero, A., I. Casals, et al. (1997). "Oxidation of oleic acid to (E)-10hydroperoxy-8-octadecenoic acid and (E)-10-hydroxy-8-ocatadecenoic acids by Pseudomonas sp. 42A2." Biochimica et Biophysica Acta 1347: 75-81. Haba E, Espuny MJ, et al. (2000). "Screening and production of rhamnolipids by Pseudomonas aeruginosa 47T2 NCIB 40044 from waste frying oil." J. Appl. Microbiol. 88: 379–387. Hildebrand DF (1989). "Lipoxygenases." Physiol. Plant 76 249 - 53 Holland HL, W. H. (2000). "Enzymatic hydroxylation reactions." Current Opinion in Biotechnology 11(6): 547–553 173 Hornung E., Walther M., et al. (1999). "Conversion of cucumber linoleate 13lipoxygenase to a 9-lipoxygenating species by site-directed mutagenesis." Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 4192 - 4197. Hou CT and Bagby MO (1990). "Microbial production of dihydroxy octadecenoic acid from oleic acid." Chem. Abstr. 114: 205567j. Hover C.G., K. A. P. (2000). "Hidroperoxide specificity of plant and human tissue lipoxygenase: an in vitro evaluation using N-demethilation of phenothiazines." Biochim. Biophys. Acta 1475: 256-264. Hu J., K. A. P. (2000). "Metabolic fate of chemical mixtures. I. Shuttle oxidant effect of lipoxygenase-generated radical of chlorpromazine and related phenothiazines of the oxidation of benzidine and other xenobiotics." Teratog. Care. Mut. 20: 195-208. Hu S., H. L. P. (1999). "Highly enantioselective propargylic hydroxylations catalyzed by chloroperoxidase. ." J Am Chem Soc 121: 872-873. Hughes RK, Lawson DM, et al. (2001). "Mutagenesis and modelling of linoleatebinding to pea seed lipoxygenase." European Journal of Biochemistry 268 (4): 1030-1040. Hung K.T. , K. C. H. (1997 ). "Senescence of rice leaves XXXV. Promotive effects of jasmonates." Bot. Bull. Acad. Sin. 89: 85-89. Ikuya Y, Yoshiyaa F, et al. (1971). "α-Oxidation of long-chain fatty acids in cellfree extracts of Arthrobacter simplex " 239 (3): 513-516. Ishige T., Honda K., et al. (2005). "Whole organism biocatalysis." Current Opinion in Chemical Biology 9: 174-180. Johnson JB. and Omland KS. (2004). "Model selection in ecology and evolution." Trends in Ecology and Evolution 19 (2): 101-108. Kato D. and Mitshuda S. (2003). "Microbial deracemization of α-substituted carboxylic acids: substrate specificity and mechanistic investigation." Journal of Organic Chemistry 68: 7234-7242. Kelly DR, Ed. (2000). Biotransformations II. Biotechnology, Wiley-VCH). Kirk O, Borchert TV, et al. (2002). "Industrial enzyme applications " Curr Opin Biotechnol 13: 345-351. Kiska D.L. and Gilligan P.H. (2003). "Pseudomonas. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C." Knothe G, Bagby MO, et al. (1992). "7,10-Dihydroxy-8-(E)-octadecenoic acid: stereochemestry and a novel derivative, 7,10-dihydroxy octadecenoic acid." J. Am. Oil Chem. Soc. 69: 367-371. Koeduka T., Kajiwara T., et al. (2007). "Cloning of Lipoxygenase Genes from a Cyanobacterium, Nostoc punctiforme, and Its Expression in Eschelichia coli " CURRENT MICROBIOLOGY Vol. 54 (2007), pp. 315–319 54: 315319. Koka R and et al. (2004). US Patent 20040151802-A1. Kühn H (2000). "Structural basis for the positional specificity of lipoxygenases." Prostaglandins and other lipid mediators 62: 255-270. Kühn H, S. T., Rapaport SM (1986). "The stereochemestry of the reactions of lipoxygenase and their metabolites. Proposed nomenclature of lipoxigenases and related enzymes." Adv. Enzymol. 88: 273-311. Kühn H., Barnett J., et al. (1993). "Overexpression, purification and characterization of human recombinant 15-lipoxygenase." Biochimica et Biophysica Acta 1169 (1): 80-89. Kuhn H., Saam J., et al. (2005). "Structural biology of mammalian lipoxygenases: Enzymatic consequences of targeted alterations of the 174 protein structure." Biochemical and Biophysical Research Communications 338: 93-101. Kuhn H. and Thiele BJ. (1999). "The diversity of the lipoxygenase family: Many sequence data but little information on biological significance " FEBS letters 449 (1): 7-11. Kuhn H., Walther M., et al. (2002). "Mammalian arachidonate 15lipoxygenases: Structure, function, and biological implications." Prostaglandins & other Lipid Mediators 68 - 69: 263 - 290. Kulkarni AP (2001). "Lipoxygenase – a versatile biocatalyst for biotransformation of endobiotics and xenobiotics." CMLS, Cell. Mol. Life Sci. 58: 1805–1825. Kuo T. and Kaneshiro T. (2002). Microbiological conversions of fatty acids to value-added products. New York Marcel Deker Inc. L. G. WAYNE, D. J. BRENNER, et al. (1987). "Report of the Ad Hoc Committee on Reconciliation of Approaches to Bacterial Systematics." International Journal of Systematic Bacteriology 37 (4): 463-464. Laemmli UK. (1970). "Cleavage of structural proteins during the assembly of head of bacteriophageT4." Nature 277: 680-685. Lang I., Göbel C., et al. (2008). "A lipoxygenase with linoleate diol synthase activity from Nostoc sp. PCC 7120." Biochem J. 410: 347-357. Leresche J E , M. H. P. (2006). "Chemocatalysis and Biocatalysis (Biotransformation): Some Thoughts of a Chemist and of a Biotechnologist." Organic Process Research & Development 10(3): 572580. Liavonchanka A. and F. I. (2006). "Lipoxygenases: occurrence, functions and catalysis." J. Plant Physiol. 163: 348-357. May C., H. M., Gnau P., Schwennesen K., Kindl H. (2000). "The N-terminal Bbarrel structure of lipid body lipoxygenase mediates its binding to liposomes and lipid bodies." Eur. J. Biochem. 267: 1100-1109. Mc Pherson A. (1999). "Crystallization of Biological Macromolecules. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York." Mc Pherson A. (2003). "Introduction to Macromolecular Crystallography. WileyLiss, Inc., New Jersey." McDonnella M., D. W., Lia H., Funka CD. (2001). "Characterization of the murine epidermal 12/15-lipoxygenase." Prostaglandins & other Lipid Mediators 63: 93–107. Mercadé, M. E., M. Robert, et al. (1988). "New surfactant isolated from Pseudomonas sp 42A2." JAOCS 65: 1915-1916. Meyer J and Ladner W (1989). "Microbial manufacture of 11-hydroxy-γdodecalactone." Chem. Abstr. 112: 196710e. Minor W, S. J., Bolin JT, Otwinowski Z, Axelrod B (1993). "Cristallographic determination of the active site iron and its ligands in soybean lipoxygenase-1." Biochemestry 32(6320-6323). Minor W., S. J., Stec B., Otwinowski Z., Bolin J.T., Walter R., et al., (1996). "Crystal structure of soybean lipoxygenase L-1 at 1.4 Å resolution." Biochemistry 35: 10687-10701. Montes LR, Ibarguren M, et al. (2007). "Leakage-free membrane fusion induced by the hydrolytic activity of PlcHR2, a novel phospholipase C/sphingomyelinase from Pseudomonas aeruginosa." Biochimica et Biophysica Acta 1768: 2365–2372. Moore E.R.B., M., M., Arnscheidt, A., Bosttger, E. C., Hutson, R. A., Collins, M. D., Van de Peer, Y., De Wachter, R. & Timmis, K. N. (1996). "The determination and comparison of the 16S rRNA gene sequence of species 175 of the genus Pseudomonas (sensu stricto) and estimation of the natural intrageneric relationships. ." Syst Appl Microbiol 19: 478-492. Munro AW, Taylor P, et al. (2000). "Structures of redox enzymes." Current Opinion in Biotechnology 11: 369-376. Munro AW., Taylor P., et al. (2000). "Structures of redox enzymes." Curr Opin Biotechnol 11: 369-376. Murshudov G N, Vagin A A, et al. (1997). "Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method." Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography 53: 240-255. Naidu A.K., K. A. P. (1991). "Role of lipoxygenase in xenobiotic metabolism: sulfoxidation of thiobenzamide by purified soybean lipoxygenase." Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 71: 175-188. Narvel J.M., F. W. R., Welke G.A. (1998). "Agronomic and Seed Traits of Soybean Lines Lacking Seed Lipoxygenases." Crop Sci 38: 926-928. Neau DB., Gilbert NC., et al. (2009). "The 1.85A° Structure of an 8RLipoxygenase Suggests a General Model for Lipoxygenase Product Specificity." Biochemistry 48: 7906–7915. Nei M. and Gojobori T. (1986). "Simple methods for estimating the numbers of synonymous and nonsynonymous nucleotide substitutions." Mol Biol Evol 3: 418-426. Nielsen R. and Yang Z. (1998). "Likelihood models for detecting positively amino acid sites and applications to the HIV-1 envelope gene." Genetics 148: 929-936. Niki E. (2004). "Antioxidants and atherosclerosis." Biochemical Society Transactions 32 (1): 156 - 159. Novak M.J. (1999). "New minimal substrate structural requirements in the enzymtic peroxidation of alkenes with soybean lipoxygenase." Bioorg. Med. Chem. Lett. 9: 31-34. O'Brien C. (1999). "Sustainable production – a new paradigm for a new millennium." Int. J. Production Economics 60-61: 1-7. Oldham M.L., B. A. R., Newcomer M.E. (2005). "Insights from the X-ray crystal structure of coral 8R-lipoxygenase: calcium activation via a C2-like domain and a structural basis of product chirality." J Biol Chem. 2 280(47): 39545-52. Oliw EH (2002). "Plant and fungal lipoxygenases." Prostaglandins and other lipid mediators 68-69: 313-323. Otwinowski Z and Minor W (1997). Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode. Methods in Enzymology: Macromolecular Crystallography, part A. J. C.W. Carter and R. M. Sweet, Academic Press. 276: 307-326. Park SJ., Kang CH., et al. (2008). "Metagenome microarray for screening of fosmid clones containing specific genes." FEMS Microbiol Lett. 284 (1): 28-34. Piomelli D, V. A., Dale N, Siegelbaum SA, Kandel ER, Schwartz JH, Belardetti F. (1987 ). "Lipoxygenase metabolites of arachidonic acid as second messengers for presynaptic inhibition of Aplysia sensory cells." Nature. 328(6125): 38-43. Ponting CP. and Aravind L. (1999). "The cytoplasmic helical linker domain of receptor histidine kinase and methyl-accepting proteins is common to many prokaryotic signaling proteins." FEMS Microbiol Lett. 176: 111– 116. Porta H. and Rocha-Sosa M. (2001). "Lipoxygenase in bacteria: a horitzontal transfer event?" Microbiology 147: 3199-3200. 176 Prigge S., J. Boyington, et al. (1997). "Structure and mechanism of lipoxygenases." Biochimie 79: 629-636. Prigge ST, B. J., Gaffney BJ, Amzel LM (1996). "Structure conservation in lipoxygenases: structural analysis of soybean lipoxygenase-1 and modeling of human lipoxygenases." Proteins. 24(3): 275-91. Radmark O. (2002). "Arachidonate 5-lipoxygenase." Prostaglandins and other lipid mediators 68-69: 211-234. Rapoport SM, S. T. (1986 ). "The maturational breakdown of mitochondria in reticulocytes." Biochim Biophys Acta. 864(3-4): 471-95. Ratledge C. and Wilkinson SG. (1988). "Microbial lipids Volume 1, Chapter 7: Gram-negative bacteria." Rhee SK., Liu X., et al. (2004). "Detection of biodegradation and biotransformation genes in microbial communities using 50-mer oligonucleotide microarrays. ." Appl. Environ. Microl. 70: 4303-4317. Ritchie ME., Silver J., et al. (2007). "A comparison of background correction methods for two-colour microarrays." Bioinformatics 23: 2700-2707. Rodríguez Couto S and Toca-Herrera JL (2006). "Lacasses in the textile industry." Biotechnology and Molecular Biology Review 1(4): 115-120. Rudman R. (1976). "Low temperature X-ray difraction. Plenum Press, New York." Sambrook J., Fritsch E., et al. (1989). "Molecular cloning: A laboratory Manual." Schewe T., R. S. (1986). "Enzymology and physiology of reticulocyte lipoxygenase. Comparison with other lipoxygenases." Advances in Enzymology 58: 191-271. Schneider C., Pratt D.A., et al. (2007). "Control of oxygenation in lipoxygenase and cyclooxygenase catalysis." Chem. Biol. 14: 473–488. Schoemaker HE, Mink D, et al. (2003). "Dispelling the Myths - Biocatalysis in Industrial Synthesis " Science 299 (5613): 1694-1697. Schultz DJ. and Ohlrogge JB. (2002). Metabolic engineering of fatty acid biosynthesis. New York Marcel Deker Inc. Sekhar Rao K.C. , D. S., Appu Rao A.G., Karanth N.G., Suneetha W.J. , and S. A. P. Krishnakantha T.P. (2002). "Asperenone: an inhibitor of 15lipoxygenase and of human platelet aggregation from Aspergillus niger." Biotechnology Letters 24: 1967–1970. Serhan CN (1997). "Lipoxins and novel aspirin-triggered 15-epi-lipoxins (ATL): a jungle of cell-cell interactions or a therapeutic opportunity?" Prostaglandins. 53(2): 107-37. Shibata D. and Axelrod B. (1995). "Plant lipoxygenases." J. Lipid Mediators Cell Signalling 12: 213 - 228. Shin J. and Kim B. (2001). "Comparison of the ω-transminases from different microorganisms and application to production of chiral amines." Bioscience Biotechnology and Biochemistry 65: 1782-1788. Siedow JN. (1991). "Plant lipoxygenase - structure and function." Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 145–88. Skrzypczak-Jankun E, Bross RA, et al. (2001). "Three-dimensional structure of a purple lipoxygenase." J Am Chem Soc. 123(44): 10814-20. Sloane D. and Leung R. (1995). "Conversion of human 15-lipoxigenase to an efficient 12-lipoxygenase: the side-chain geometry amino acids 417 and 418 determine positional specificity." Protein Engineering 8: 275-282. Smyth GK. (2004). "Linear models and empirical Bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments." Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology 3 (1): Article 3. 177 Solomon EI., Zhou J., et al. (1997). "New insights from spectroscopy into the structure/function relationships of lipoxygenases." Chemestry and Biology 4 (11): 795-808. Spiers A.J., B. A., Rainey P.B. (2000 ). "The causes of Pseudomonas diversity. Microbiology." Microbiology 146: 2345-2350 Steczko J., Donoho GA., et al. (1991). "Effect of ethanol and low-temperature culture on expression of soybean lipoxygenase L-1 in Escherichia coli." Protein Expression and Purification 2 (2-3): 221-227. Steele HL, J. K., Daniel R, Streit WR. (2009). "Advances in Recovery of Novel Biocatalysts from Metagenomes. ." J Mol Microbiol Biotechnol 16: 25-37. Su C., B. I., Oliw EH. (1995). "Studies on linoleic acid 8R-dioxygenase and hydroperoxide isomerase of the fungus Gaeumannomyces graminis." Lipids. 30(1): 43-50. Tamura K., Dudley J., et al. (2007). "MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0." Molecular Biology and Evolution 24: 1596-1599 Tang D.G., C. Y. Q., Honn K.V. (1996). "Arachidonate lipoxygenases as essential regulators of cell survival and apoptosis." Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 5241-5246. Tang DG, H. K. (1994). "12-Lipoxygenase, 12(S)-HETE, and cancer metastasis." Ann N Y Acad Sci. 744: 199-215. Tatulian S.A., S. J., Minor W. (1998). "Uncovering a calcium-regulated membrane-binding mechanism for soybean lipoxygenase-1." Biochemestry 37: 15481-15490. Teske AP (2005). "The deep surfaces biosphere is alive and well." Trends in microbiology 13(9): 402-404. Tomchick DR, Phan P, et al. (2001). "Structural and Functional Characterization of Second-Coordination Sphere Mutants of Soybean Lipoxygenase-1." Biochemistry 40: 7509-7517. Turner J.G., E. C., Devoto A. (2002). "The jasmonate signal pathway." The Plant Cell Supplement 2002: 153-164. Turner N. and Schneider M. (2000). "Biocatalysis and biotransformation. Biocatalysis-molecular, structural and synthetic advances." Current Opinion in Chemical Biology 4: 65-67. Vagin A and Teplyakov A (1997). "MOLREP: an automated program for molecular replacement." Journal of Applied Crystallography 30: 10221025. Van Beilen JB, Duetz WA, et al. (2003). "Practical issues in the application of oxygenases " Trends in Biotechnology 21(4): 170-177 Vance R.E, H. S., Gronert K., Serhan C.N., Mekalanos J.J. (2004). "The opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa carries a secretable arachidonate 15-lipoxygenase." PNAS 101 (7): 2135-2139. Verdnick D., Handran S., et al. (2002). DNA Array Image Analysis - Chapter 5: Key Considerations for Accurate Microarray Scanning and Image Analysis., DNA Press). Vidal-Mas J, B. M., Manresa A (2005). "Cloning and expression of a lipoxygenase from Pseudomonas aeruginosa 42A2." Antonie van Leeuwenhoek 87: 245–251. Volgestein B. and Gillespie D. (1979). "Preparative end analytical purification of DNA from agarose." Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America 76: 615-619. Wu L., Thompson DK., et al. (2004). "Development and Evaluation of Microarray-Based Whole-Genome Hybridization for Detection of 178 Microorganisms within the Context of Environmental Applications." Environ. Sci. Technol. 38: 6775-6782. Yamamoto S., K. H., Arnold D.L., Jackson R.W., Vivian A., Harayama S. (2000). " Phylogeny of the genus Pseudomonas: intrageneric structure reconstructed from the nucleotide sequences of gyrB and rpoD genes." Microbiology 146: 2385–2394. Yang Z. (1998). "Likelihood ratio test for detecting positive selection and aplication to primate lysozyme evolution." Molecular Biology and Evolution 15: 568-573. Yang Z. (2007). "PAML 4: a program package for phylogenetic analysis by maximum likelihood." Mol Biol Evol 24: 1586-1591. Yang Z. and Nielsen R. (1998). "Synonymous and nonsynonymous rate variation in nuclear genes of mammals." Journal of Molecular Evolution 46: 409-418. Yang Z., Nielsen R., et al. (2000). "Codon-substitution models for heterogeneous selection pressure at amino acid sites." Genetics 155: 431-449. Yang Z., Wong WSW., et al. (2005). "Bayes empirical Bayes inference of amino acid sites under positive selection." Molecular Biology and Evolution 22: 1107-1118. Youn B., Sellhorn GE., et al. (2006). "Crystal structures of vegetative soybean lipoxygenase VLX-B and VLX-D, and comparisons with seed isoforms LOX-1 and LOX-3." Proteins 65(4): 1008-20. 179 8. ANNEXES 8.1. Annex 1: Composició dels tampons provats per a la cristal—lització de la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa Ammonium sulfate grid screen Buffer Tri-sodium citrate dihydrate Tri-sodium citrate dihydrate MES HEPES Tris bicine Tri-sodium citrate dihydrate Tri-sodium citrate dihydrate MES HEPES Tris bicine Tri-sodium citrate dihydrate Tri-sodium citrate dihydrate MES HEPES Tris bicine Tri-sodium citrate dihydrate Tri-sodium citrate dihydrate MES HEPES Tris bicine 6 7 8 9 5 4 9 8 7 2,4 2,4 2,4 3,2 3,2 3,2 3,2 3,2 3,2 6 2,4 5 2,4 4 2,4 9 1,6 8 1,6 7 1,6 M M M M M M M M M M M M M M M 6 1,6 M 5 1,6 M 4 1,6 M 9 0,8 M 8 0,8 M 7 0,8 M 6 0,8 M 5 0,8 M ammonium sulfate ammonium sulfate ammonium sulfate ammonium sulfate ammonium sulfate ammonium sulfate ammonium sulfate ammonium sulfate ammonium sulfate ammonium sulfate ammonium sulfate ammonium sulfate ammonium sulfate ammonium sulfate ammonium sulfate ammonium sulfate ammonium sulfate ammonium sulfate ammonium sulfate ammonium sulfate ammonium sulfate ammonium sulfate ammonium sulfate 4 0,8 M ammonium sulfate pH [Precipitant] [Precipitant] units Precipitant M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M Number [Buffer] [Buffer] units A1 0,1 A2 0,1 A3 0,1 A4 0,1 A5 0,1 A6 0,1 A7 0,1 A8 0,1 A9 0,1 A10 0,1 A11 0,1 A12 0,1 B1 0,1 B2 0,1 B3 0,1 B4 0,1 B5 0,1 B6 0,1 B7 0,1 B8 0,1 B9 0,1 B10 0,1 B11 0,1 B12 0,1 185 186 Crystal Screen Lite [Buffer] 0,1 0,2 0,2 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 M M M M M imidazole tri-sodium citrate dihydrate HEPES Cacodylate M HEPES Sodium acetate trihydrate M Tris M Cacodylate M Sodium acetate trihydrate M Tris M Cacodylate M Tris 8,5 6,5 8,5 4,6 6,5 8,5 7,5 4,6 6,5 5,6 7,5 6,5 M HEPES 7,5 M Cacodylate 6,5 M HEPES 7,5 14 15 0,75 15 10 15 12,5 15 15 15 10 0,5 15 10 15 M Tris 8,5 15 M HEPES 7,5 15 M tri-sodium citrate dihydrate 5,6 0,5 M Sodium acetate trihydrate 4,6 15 M tri-sodium citrate dihydrate 5,6 15 %w/v %w/v M %v/v %v/v %v/v %w/v M % % %v/v %w/v %v/v %w/v %v/v %v/v M %v/v %v/v %w/v M Cacodylate 6,5 15 %v/v M Cacodylate 6,5 0,7 M M Tris 8,5 15 %w/v M HEPES 7,5 15 %v/v MPD polyethylene glycol 4000 sodium acetate trihydrate iso-propanol polyethylene glycol 4000 polyethylene glycol 4000 Ammonium dihydrogen phosphate iso-propanol polyethylene glycol 400 polyethylene glycol 400 polyethylene glycol 8000 lithium sulfate anhydre polyethylene glycol 4000 polyethylene glycol 8000 iso-propanol polyethylene glycol 4000 MPD polyethylene glycol 4000 polyethylene glycol 400 iso-propanol sodium acetate trihydrate MPD iso-propanol polyethylene glycol 8000 M Tris 8,5 1 M M M M Sodium acetate trihydrate 4,6 15 %v/v MPD Potassium sodium tartrate tetrahydrate Ammonium dihydrogen phosphate Ammonium sulfate [Buffer]units Buffer pH [Precipitant] [Precipitant]units Precipitant Nº [Salt] [Salt]units Salt A1 0,02 M Calcium chloride dihydrate A2 A3 A4 A5 0,2 M tri-Sodium citrate dihydrate A6 0,2 M magnesium chloride A7 A8 0,2 M tri-sodium citrate dihydrate A9 0,2 M ammonium acetate A10 0,2 M ammonium acetate A11 A12 0,2 M magnesium chloride B1 0,2 M tri-Sodium citrate dihydrate B2 0,2 M Calcium chloride dihydrate B3 0,2 M ammonium sulfate B4 B5 0,2 M lithium sulfate anhydre B6 0,2 M magnesium acetate tetrahydrate B7 0,2 M ammonium acetate B8 0,2 M ammonium sulfate B9 0,2 M magnesium acetate tetrahydrate B10 0,2 M sodium acetate trihydrate B11 0,2 M magnesium chloride B12 0,2 M Calcium chloride dihydrate C1 C2 0,2 M ammonium acetate C3 0,2 M tri-Sodium citrate dihydrate C4 0,2 M sodium acetate trihydrate C5 15 15 1 2 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 1 0,1 10 0,1 10 10 15 0,1 0,1 0,1 0,1 M Tris M Sodium acetate trihydrate 4,6 8,5 M Cacodylate 6,5 M Cacodylate 6,5 9 9 1 1 2 M HEPES 7,5 5 M tri-sodium citrate dihydrate 5,6 10 M %v/v %w/v %v/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v M M %w/v M HEPES 7,5 2 %v/v M HEPES 7,5 0,7 M M Sodium acetate trihydrate 4,6 4 %w/v M Tris 8,5 4 %w/v M HEPES 7,5 0,8 M M sodium acetate trihydrate 4,6 1 M M sodium formate sodium formate Na/K phosphate polyethylene glycol 8000 polyethylene glycol 4000 tri-sodium citrate dihydrate polyethylene glycol 400 ammonium sulfate iso-propanol polyethylene glycol 4000 iso-propanol polyethylene glycol 4000 polyethylene glycol 8000 polyethylene glycol 1500 polyethylene glycol 8000 polyethylene glycol 8000 Ammonium sulfate M Ammonium sulfate %w/v polyethylene glycol 4000 %w/v polyethylene glycol 8000 0,1 M HEPES 7,5 0,4 M Potassium sodium tartrate tetrahydrate C6 0,2 M ammonium sulfate C7 0,2 M ammonium sulfate C8 C9 C10 C11 C12 D1 D2 D3 D4 D5 D6 0,05 M dipotassium hydrogen phosphate D7 D8 0,2 M zinc acetate dihydrate D9 0,2 M calcium acetate hydrate D10 D11 Ammonium dihydrogen phosphate polyethylene glycol 8000 D12 0,5 M lithium sulfate anhydre 187 188 Crystal Screen I [Buffer] 0,1 0,4 0,4 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 M M M M M M HEPES Sodium acetate trihydrate imidazole tri-sodium citrate dihydrate HEPES Cacodylate M Tris M Cacodylate M M Tris Sodium acetate trihydrate M Cacodylate M Tris M HEPES 7,5 8,5 6,5 8,5 4,6 6,5 8,5 7,5 4,6 6,5 5,6 7,5 6,5 M Cacodylate 6,5 M HEPES 7,5 M Tris 8,5 M HEPES 7,5 M tri-sodium citrate dihydrate 5,6 1 30 30 28 30 1,5 30 20 30 25 30 30 30 20 1 30 20 30 M Sodium acetate trihydrate 4,6 30 M tri-sodium citrate dihydrate 5,6 30 M Cacodylate 6,5 30 M Cacodylate 6,5 1,4 M %v/v %w/v %w/v M %v/v %v/v %v/v %w/v M %w/v %w/v %v/v %w/v %v/v %w/v %v/v %v/v M %v/v %v/v %w/v M Tris 8,5 30 %w/v M HEPES 7,5 30 %v/v M Tris 8,5 2 M M M M Sodium acetate trihydrate 4,6 30 %v/v MPD Potassium sodium tartrate tetrahydrate Ammonium dihydrogen phosphate Ammonium sulfate MPD polyethylene glycol 4000 sodium acetate trihydrate iso-propanol polyethylene glycol 4000 polyethylene glycol 4000 Ammonium dihydrogen phosphate iso-propanol polyethylene glycol 400 polyethylene glycol 400 polyethylene glycol 8000 lithium sulfate anhydre polyethylene glycol 4000 polyethylene glycol 8000 iso-propanol polyethylene glycol 4000 MPD polyethylene glycol 4000 polyethylene glycol 400 iso-propanol sodium acetate trihydrate MPD iso-propanol polyethylene glycol 8000 [Buffer]units Buffer pH [Precipitant] [Precipitant] units Precipitant number [Salt] [Salt]units Salt A1 0,02 M Calcium chloride dihydrate A2 A3 A4 A5 0,2 M tri-Sodium citrate dihydrate A6 0,2 M magnesium chloride hexahydrate A7 A8 0,2 M tri-sodium citrate dihydrate A9 0,2 M ammonium acetate A10 0,2 M ammonium acetate A11 A12 0,2 M magnesium chloride hexahydrate B1 0,2 M tri-Sodium citrate dihydrate B2 0,2 M Calcium chloride dihydrate B3 0,2 M ammonium sulfate B4 B5 0,2 M lithium sulfate anhydre B6 0,2 M magnesium acetate tetrahydrate B7 0,2 M ammonium acetate B8 0,2 M ammonium sulfate B9 0,2 M magnesium acetate tetrahydrate B10 0,2 M sodium acetate trihydrate B11 0,2 M magnesium chloride hexahydrate B12 0,2 M Calcium chloride dihydrate C1 C2 0,2 M ammonium acetate C3 0,2 M tri-Sodium citrate dihydrate C4 0,2 M sodium acetate trihydrate C5 30 30 2 4 0,1 0,1 0,8 0,1 0,1 0,1 0,1 2 0,1 20 0,1 M HEPES 7,5 10 20 20 30 2 0,1 0,1 0,1 0,1 M Tris M M Cacodylate Sodium acetate trihydrate M Cacodylate 6,5 6,5 4,6 8,5 18 18 2 2 M tri-sodium citrate dihydrate 5,6 20 M HEPES 7,5 2 M HEPES 7,5 1,4 M %v/v M %v/v %w/v %v/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v M M M Sodium acetate trihydrate 4,6 8 %w/v M Tris 8,5 8 %w/v M M HEPES 7,5 0,8 M M sodium acetate trihydrate 4,6 2 M M M sodium formate sodium formate %w/v Ammonium sulfate %w/v 0,1 M HEPES 7,5 0,8 M Potassium sodium tartrate tetrahydrate polyethylene glycol 8000 polyethylene glycol 4000 C6 0,2 M ammonium sulfate C7 0,2 M ammonium sulfate C8 C9 C10 C11 sodium dihydrogen phosphate potassium dihydrogen phosphate polyethylene glycol 8000 polyethylene glycol 4000 tri-sodium citrate dihydrate polyethylene glycol 400 ammonium sulfate iso-propanol polyethylene glycol 4000 iso-propanol polyethylene glycol 4000 polyethylene glycol 8000 polyethylene glycol 1500 polyethylene glycol 8000 polyethylene glycol 8000 polyethylene glycol 8000 Ammonium sulfate Ammonium dihydrogen phosphate C12 D1 D2 D3 D4 D5 D6 0,05 M di-potassium hydrogen phosphate D7 D8 1 M lithium sulphate anhydre D9 0,2 M zinc acetate dihydrate D10 0,2 M calcium acetate hydrate D11 D12 189 190 Natrix [Buffer] 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 M M M M M M M M sodium cacodylate sodium cacodylate sodium cacodylate sodium cacodylate sodium cacodylate sodium cacodylate sodium cacodylate sodium cacodylate M sodium cacodylate M sodium cacodylate 6 6 6 6 6 6 6 6,5 6,5 6,5 M MES 6 M MES 6 10 5 1 1,8 1,7 15 5 30 10 1,3 2 10 M MES 6 0,6 M MES 6 15 M MES 5,6 20 %w/v %v/v M %v/v %w/v M M M %v/v %v/v %v/v %w/v M M %v/v M MES 5,6 5 %w/v M MES 5,6 10 %v/v M MES 5,6 20 %v/v MPD polyethylene glycol 400 polyethylene glycol 8000 polyethylene glycol 8000 iso-propanol sodium chloride polyethylene glycol 400 polyethylene glycol 4000 lithium sulfate monohydrate lithium sulfate monohydrate ammonium sulfate iso-propanol MPD MPD polyethylene glycol 4000 lithium sulfate monohydrate ammonium sulfate iso-propanol M MES 5,6 2,5 M M MES 5,6 2 M [Buffer] units Buffer pH [Precipitant] [Precipitant]units Precipitant lithium sulfate monohydrate ammonium sulfate Nº [Salt] [Salt]units Salt A1 0,01 M magnesium chloride A2 0,01 M magnesium acetate tetrahydrate A3 0,1 M magnesium acetate tetrahydrate A4 0,2 M potassium chloride 0,01 M magnesium sulfate A5 0,2 M potassium chloride 0,01 M magnesium chloride A6 0,1 M ammonium sulfate 0,01 M magnesium chloride A7 0,02 M magnesium chloride A8 0,1 M ammonium acetate 0,005 M magnesium sulfate A9 0,1 M potassium chloride 0,01 M magnesium chloride A10 0,005 M magnesium sulfate A11 0,01 M magnesium chloride A12 0,01 M magnesium sulfate B1 0,015 M magnesium acetate tetrahydrate B2 0,1 M potassium chloride 0,025 M magnesium chloride B3 0,04 M magnesium chloride B4 0,04 M magnesium acetate tetrahydrate B5 0,2 M potassium chloride 0,01 M calcium chloride dihydrate B6 0,01 M magnesium acetate tetrahydrate B7 0,01 M magnesium sulfate B8 0,1 M ammonium acetate 0,015 M magnesium acetate tetrahydrate B9 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 M M M M HEPES HEPES HEPES HEPES M HEPES M HEPES M HEPES 7 7 7 7 7 7 7 M HEPES 7 M HEPES 7 25 20 30 15 5 10 20 5 5 M HEPES 7 1,6 M HEPES 7 4 M HEPES 7 1,6 M sodium cacodylate 6,5 30 %w/v M M M %v/v %w/v %w/v %v/v %v/v %v/v %v/v %w/v %w/v M sodium cacodylate 6,5 10 %w/v M sodium cacodylate 6,5 30 %w/v M sodium cacodylate 6,5 10 %w/v M sodium cacodylate 6,5 10 %w/v M sodium cacodylate 6,5 15 %v/v 0,2 M potassium chloride 0,05 M sodium cacodylate 6,5 10 %w/v 1,6-hexanediol polyethylene glycol 400 polyethylene glycol 4000 polyethylene glycol 4000 polyethylene glycol 4000 polyethylene glycol 8000 polyethylene glycol 8000 lithium sulfate monohydrate lithium chloride ammonium sulfate polyethylene glycol MME 550 1,6-hexanediol 1,6-hexanediol MPD polyethylene glycol 400 polyethylene glycol 400 polyethylene glycol 200 polyethylene glycol 4000 polyethylene glycol 8000 0,005 M magnesium chloride B10 0,08 M magnesium acetate tetrahydrate B11 0,2 M potassium chloride 0,01 M magnesium chloride B12 0,2 M ammonium acetate 0,01 M calcium chloride dihydrate C1 0,08 M magnesium acetate tetrahydrate C2 0,2 M potassium chloride 0,1 M magnesium acetate tetrahydrate C3 0,2 M ammonium acetate 0,01 M magnesium acetate tetrahydrate C4 0,05 M magnesium sulfate C5 0,01 M magnesium chloride C6 0,01 M magnesium chloride C7 0,005 M magnesium chloride C8 0,2 M potassium chloride 0,01 M magnesium chloride C9 0,2 M ammonium chloride 0,01 M magnesium chloride C10 0,1 M potassium chloride 0,005 M magnesium sulfate C11 0,1 M potassium chloride 0,01 M magnesium chloride C12 0,1 M potassium chloride 0,01 M calcium chloride dihydrate D1 0,2 M potassium chloride 0,025 M magnesium sulfate D2 0,2 M ammonium acetate 0,15 M magnesium acetate tetrahydrate D3 0,1 M ammonium acetate 0,02 M magnesium chloride 191 192 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 M tris hydrochloride 8,5 30 M tris hydrochloride 8,5 30 M tris hydrochloride 8,5 35 %w/v %v/v %w/v M tris hydrochloride 8,5 1,8 M M tris hydrochloride 7,5 10 %w/v M tris hydrochloride 7,5 10 %v/v MPD polyethylene glycol 4000 ammonium sulfate 1,6-hexanediol polyethylene glycol 400 polyethylene glycol 4000 M tris hydrochloride 7,5 5 %v/v iso-propanol M tris hydrochloride 7,5 10 %v/v M tris hydrochloride 7,5 1,6 M ammonium sulfate polyethylene glycol MME 550 D4 0,01 M magnesium chloride D5 0,1 M potassium chloride 0,015 M magnesium chloride D6 0,01 M magnesium acetate tetrahydrate D7 0,05 M ammonium acetate 0,01 M magnesium chloride D8 0,2 M potassium chloride 0,05 M magnesium chloride D9 0,025 M magnesium sulfate D10 0,005 M magnesium sulfate D11 0,1 M potassium chloride 0,01 M magnesium chloride D12 0,2 M ammonium chloride 0,01 M calcium chloride dihydrate PEG 6000 Grid Screen Buffer Tri-sodium citrate dihydrate Tri-sodium citrate dihydrate MES HEPES Tris bicine Tri-sodium citrate dihydrate Tri-sodium citrate dihydrate MES HEPES Tris bicine Tri-sodium citrate dihydrate Tri-sodium citrate dihydrate MES HEPES Tris bicine Tri-sodium citrate dihydrate Tri-sodium citrate dihydrate MES HEPES Tris bicine 6 7 8 9 5 4 9 8 20 20 30 30 30 30 30 30 7 20 6 20 5 20 4 20 9 10 8 10 %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v 7 10 %w/v 6 10 %w/v 5 10 %w/v 4 10 %w/v 9 5 %w/v 8 5 %w/v 7 5 %w/v 6 5 %w/v 5 5 %w/v polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 4 5 %w/v polyethylene glycol 6000 pH [Precipitant] [Precipitant] units Precipitant Number [Buffer] [Buffer] units A1 0,1 M A2 0,1 M A3 0,1 M A4 0,1 M A5 0,1 M A6 0,1 M A7 0,1 M A8 0,1 M A9 0,1 M A10 0,1 M A11 0,1 M A12 0,1 M B1 0,1 M B2 0,1 M B3 0,1 M B4 0,1 M B5 0,1 M B6 0,1 M B7 0,1 M B8 0,1 M B9 0,1 M B10 0,1 M B11 0,1 M B12 0,1 M 193 194 Wizard 1 [Buffer] [Buffer]units Buffer 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 M M M M Tris Tris CHES CAPS M imidazole M Tris M HEPES M imidazole M Tris M imidazole M sodium acetate trihydrate 4,5 8 7 8 7,5 8,5 8 7 8,5 9,5 10,5 M Na/K phosphate 6,2 M imidazole 8 M cacodylate 6,5 M cacodylate 6,5 1,26 1 10 2,5 30 1 20 0,4 1,6 20 10 15 35 30 10 1,2 M imidazole 8 20 M MES 6 20 M Tris 7 20 M sodium acetate trihydrate 4,5 1 M %w/v %v/v %w/v M M %w/v M %w/v M %w/v M M %w/v %v/v %v/v %v/v %v/v %w/v M M Tri-sodium citrate dihydrate 5,5 2 M M MES 6 10 %w/v M Tri-sodium citrate dihydrate 5,5 20 %w/v M CAPS 10,5 30 %v/v M imidazole 8 35 %v/v MPD polyethylene glycol 400 polyethylene glycol 3000 polyethylene glycol 8000 Ammonium sulfate di-ammonium hydrogen phosphate polyethylene glycol MME 2000 1,4-butanediol polyethylene glycol 1000 Ammonium sulfate Tri-sodium citrate dihydrate polyethylene glycol 3000 sodium cloride polyethylene glycol 8000 Potassium sodium tartrate tetrahydrate polyethylene glycol 1000 sodium dihydrogen phosphate di-potasium hydrogen phosphate polyethylene glycol 8000 Iso-propanol Ethanol MPD polyethylene glycol 400 polyethylene glycol 3000 sodium dihydrogen phosphate M CHES 9,5 15 %v/v Ethanol M HEPES 7,5 10 %v/v Iso-propanol M CHES 9,5 20 %w/v polyethylene glycol 8000 pH [Precipitant] [Precip.]units Precipitant Nº [Salt] [Salt]units Salt A1 A2 0,2 M sodium chloride A3 A4 0,2 M magnesium chloride A5 A6 A7 0,2 M zinc acetate A8 A9 A10 A11 0,2 M lithium sulfate anhydre A12 0,2 M calcium acetate hydrate B1 B2 B3 0,2 M lithium sulfate anhydre B4 B5 0,2 M lithium sulfate anhydre B6 0,2 M sodium chloride B7 B8 0,2 M sodium chloride B9 B10 B11 0,2 M magnesium chloride B12 0,2 M sodium chloride C1 0,2 M magnesium chloride C2 C3 0,2 M lithium sulfate anhydre 0,8 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 M sodium acetate trihydrate M Tris M imidazole 8 8,5 4,5 M sodium acetate trihydrate 4,5 M sodium acetate trihydrate 4,5 M Na/K phosphate 6,2 M Tris 7 15 35 30 20 10 1,26 20 M CHES 9,5 30 M MES 6 10 M phosphate citrate 4,2 20 %w/v %v/v %w/v %v/v %v/v %v/v %w/v %w/v M %w/v M CHES 9,5 1 M M imidazole 8 2,5 M M imidazole 8 1 M M sodium acetate trihydrate 4,5 20 %v/v M imidazole 8 1 M M CAPS 10,5 2 M M Na/K phosphate 6,2 10 %w/v Ammonium sulfate di-ammonium hydrogen phosphate 1,4-butanediol tri-sodium citrate dihydrate sodium cloride M phosphate citrate 4,2 20 %w/v polyethylene glycol 8000 polyethylene glycol 3000 M sodium acetate trihydrate 4,5 1,26 M Ammonium sulfate M CHES 9,5 10 %w/v polyethylene glycol 8000 M HEPES 7,5 20 %w/v polyethylene glycol 3000 M di-potasium hydrogen phosphate C4 0,2 M sodium chloride C5 0,2 M sodium chloride C6 0,2 M sodium chloride C7 0,2 M sodium chloride C8 C9 0,2 M lithium sulfate anhydre C10 C11 C12 D1 D2 0,2 M lithium sulfate anhydre Potassium sodium tartrate tetrahydrate polyethylene glycol 1000 Iso-propanol polyethylene glycol 3000 ethanol MPD polyethylene glycol 400 polyethylene glycol 3000 polyethylene glycol 8000 Ammonium sulfate polyethylene glycol 1000 D3 0,2 M lithium sulfate anhydre D4 0,2 M calcium acetate hydrate D5 D6 D7 D8 0,2 M calcium acetate hydrate D9 D10 0,2 M calcium acetate hydrate D11 0,2 M lithium sulfate anhydre D12 0,2 M zinc acetate dihydrate 195 196 COMPLEX SCREEN Buffer tri-sodium citrate dihydrate MES HEPES tri-sodium citrate dihydrate MES HEPES tri-sodium citrate dihydrate MES HEPES tri-sodium citrate dihydrate MES HEPES tri-sodium citrate dihydrate MES HEPES tri-sodium citrate dihydrate MES HEPES tri-sodium citrate dihydrate MES HEPES tri-sodium citrate dihydrate MES HEPES tri-sodium citrate dihydrate MES HEPES tri-sodium citrate dihydrate pH 5,6 6,5 7,5 5,6 6,5 7,5 5,6 6,5 7,5 5,6 6,5 7,5 5,6 6,5 7,5 5,6 6,5 7,5 5,6 6,5 7,5 5,6 6,5 7,5 5,6 6,5 7,5 5,6 [Precipitant] 10 10 10 20 20 20 10 10 10 20 20 20 15 15 15 30 30 30 15 15 15 25 25 25 10 10 10 10 [Precip.]units %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %v/v %v/v %v/v %v/v %v/v %v/v %w/v %w/v %w/v %w/v Precipitant polyethylene glycol MME 5000 polyethylene glycol MME 5000 polyethylene glycol MME 5000 polyethylene glycol MME 5000 polyethylene glycol MME 5000 polyethylene glycol MME 5000 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 400 polyethylene glycol 400 polyethylene glycol 400 polyethylene glycol 400 polyethylene glycol 400 polyethylene glycol 400 MPD MPD MPD MPD MPD MPD polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 8000 Nº E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12 G1 G2 G3 G4 [Buffer] 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 [Buffer]units M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M G5 G6 G7 G8 G9 G10 G11 G12 H1 H2 H3 H4 MES HEPES TRIS TRIS TRIS TRIS TRIS TRIS TRIS TRIS TRIS TRIS 6,5 7,5 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 10 10 10 20 10 20 15 30 15 25 10 10 %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %v/v %v/v %w/v %w/v polyethylene glycol 8000 polyethylene glycol 8000 polyethylene glycol MME 5000 polyethylene glycol MME 5000 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 400 polyethylene glycol 400 MPD MPD polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 8000 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 M M M M M M M M M M M M 197 198 Crystal Screen II [Buffer] [Buffer] units Buffer pH 10 0,01 25 35 5 1 10 10 10 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 M M M M M MES MES MES MES MES M MES M MES M MES M M tri-sodium citrate dihydrate tri-sodium citrate dihydrate M tri-sodium citrate dihydrate M tri-sodium citrate dihydrate M tri-sodium citrate dihydrate 5,6 5,6 5,6 5,6 5,6 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 M tri-sodium citrate dihydrate 5,6 M sodium acetate trihydrate 4,6 30 2 1 4 35 10 2,5 1,6 2 12 10 30 1,8 30 25 M sodium acetate trihydrate 4,6 30 M sodium acetate trihydrate 4,6 1 M sodium acetate trihydrate 4,6 30 M sodium acetate trihydrate 4,6 2 %v/v M %v/v M %v/v %w/v M M %v/v %v/v %v/v M M M %w/v %v/v %v/v M %w/v %v/v %w/v %w/v M %v/v %v/v dioxane iso-propanol imidazole pH 7 polyethylene glycol 1000 polyethylene glycol 8000 ethanol sodium chloride MPD 1,6 hexanediol polyethylene glycol 400 polyethylene glycol monomethyl ether 2000 ammonium sulfate lithium sulfate monohydrate ethylene imine polymer tert-butanol jeffamine M-600 1,6 hexanediol magnesium sulfate heptahydrate sodium chloride polyethylene glycol 20,000 dioxane jeffamine M-600 ammonium sulfate polyethylene glycol monomethyl ether 5000 polyethylene glycol monomethyl ether 550 %v/v ethylene glycol M % [Precipitant] [Precip.]units Precipitant Polyethylene glycol 6000 hexadecyltrimethylammonium bromide Nº [Salt] [Salt]units Salt E1 2 M sodium chloride E2 0,5 M sodium chloride E3 E4 E5 2 M ammonium sulfate E6 E7 E8 1,5 M sodium chloride E9 E10 0,2 M sodium chloride E11 0,01 M cobaltous chloride hexahydrate E12 0,1 M cadmium chloride dihydrate F1 0,2 M ammonium sulfate F2 0,2 M potassium sodium tartrate tetrahydrate F3 0,5 M ammonium sulfate F4 0,5 M sodium chloride F5 F6 0,01 M ferric chloride hexahydrate F7 F8 F9 0,1 M sodium dihydrogen phosphate F10 F11 1,6 M ammonium sulfate F12 0,05 M cesium chloride G1 0,01 M cobaltous chloride hexahydrate G2 0,2 M ammonium sulfate G3 0,01 M zinc sulfate heptahydrate G4 0,1 0,1 5 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 8 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 M bicine M bicine M bicine M tris 8,5 9 9 9 M tris 8,5 M tris 8,5 M tris 8,5 12 50 20 20 30 2 2 10 M tris 8,5 1 M tris 8,5 25 M tris 8,5 3,4 M HEPES 7,5 20 %w/v M %v/v M %v/v %v/v %v/v %w/v %v/v M %v/v %w/v %v/v M HEPES 7,5 10 %w/v M HEPES 7,5 4,3 M M HEPES 7,5 70 %v/v MPD sodium chloride polyethylene glycol 8000 ethylene glycol polyethylene glycol 10,000 1,6 hexanediol tert-butanol lithium sulfate monohydrate glycerol anhydrous MPD ethanol polyethylene glycol MME 2000 polyethylene glycol MME 550 magnesium chloride hexahydrate dioxane polyethylene glycol 20,000 M HEPES 7,5 1 M M HEPES 7,5 2 M sodium formate sodium acetate trihydrate M HEPES 7,5 1,6 M ammonium sulfate M HEPES 7,5 20 %v/v jeffamine M-600 %v/v MPD M HEPES 7,5 10 %w/v polyethylene glycol 6000 M HEPES 7,5 30 %v/v MPD 1,6 M tri-sodium citrate dihydrate pH 6.5 G5 0,5 M ammonium sulfate G6 G7 G8 0,1 M sodium chloride G9 G10 0,05 M cadmium sulfate hydrate G11 G12 H1 H2 H3 0,2 M magnesium chloride hexahydrate H4 H5 0,01 M nickel chloride hexahydrate H6 1,5 M ammonium sulfate H7 0,2 M ammonium dihydrogen phosphate H8 H9 0,01 M nickel chloride hexahydrate H10 0,1 M sodium chloride H11 H12 199 200 MPD grid screen Buffer Tri-sodium citrate dihydrate Tri-sodium citrate dihydrate MES HEPES Tris bicine Tri-sodium citrate dihydrate Tri-sodium citrate dihydrate MES HEPES Tris bicine Tri-sodium citrate dihydrate Tri-sodium citrate dihydrate MES HEPES Tris bicine Tri-sodium citrate dihydrate Tri-sodium citrate dihydrate MES HEPES Tris bicine 5 6 7 8 9 4 9 8 7 6 40 40 40 40 65 65 65 65 65 65 5 40 4 40 9 20 8 20 7 20 6 20 %v/v %v/v %v/v %v/v %v/v %v/v %v/v %v/v %v/v %v/v %v/v %v/v %v/v %v/v %v/v %v/v 5 20 %v/v 4 20 %v/v 9 10 %v/v 8 10 %v/v 7 10 %v/v MPD MPD MPD MPD MPD MPD MPD MPD MPD MPD MPD MPD MPD MPD MPD MPD MPD MPD MPD MPD MPD 6 10 %v/v MPD 5 10 %v/v MPD 4 10 %v/v MPD pH [Precipitant] [Precipitant] units Precipitant M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M Number [Buffer] [Buffer] units C1 0,1 C2 0,1 C3 0,1 C4 0,1 C5 0,1 C6 0,1 C7 0,1 C8 0,1 C9 0,1 C10 0,1 C11 0,1 C12 0,1 D1 0,1 D2 0,1 D3 0,1 D4 0,1 D5 0,1 D6 0,1 D7 0,1 D8 0,1 D9 0,1 D10 0,1 D11 0,1 D12 0,1 PEG 6000/LiCl grid screen [Buffer] 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 M bicine M Tris M HEPES M MES M M Tri-sodium citrate dihydrate Tri-sodium citrate dihydrate M bicine M Tris M HEPES 7 8 9 4 5 6 7 8 9 M MES 6 M Tri-sodium citrate dihydrate 5 M Tri-sodium citrate dihydrate 4 20 20 20 20 20 20 30 30 30 30 30 30 M bicine 9 10 M Tris 8 10 M HEPES 7 10 M MES 6 10 M Tri-sodium citrate dihydrate 5 10 M Tri-sodium citrate dihydrate 4 10 M bicine 9 0 %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v M Tris 8 0 %w/v M HEPES 7 0 %w/v M MES 6 0 %w/v M Tri-sodium citrate dihydrate 5 0 %w/v M Tri-sodium citrate dihydrate 4 0 %w/v [Buffer] units Buffer pH [Precipitant] [Precipitant] units Precipitant polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 Number [Salt] [Salt] units Salt C1 1 M lithium chloride C2 1 M lithium chloride C3 1 M lithium chloride C4 1 M lithium chloride C5 1 M lithium chloride C6 1 M lithium chloride C7 1 M lithium chloride C8 1 M lithium chloride C9 1 M lithium chloride C10 1 M lithium chloride C11 1 M lithium chloride C12 1 M lithium chloride D1 1 M lithium chloride D2 1 M lithium chloride D3 1 M lithium chloride D4 1 M lithium chloride D5 1 M lithium chloride D6 1 M lithium chloride D7 1 M lithium chloride D8 1 M lithium chloride D9 1 M lithium chloride D10 1 M lithium chloride D11 1 M lithium chloride D12 1 M lithium chloride 201 202 PEG/Ion screen Salt sodium flouride potassium flouride ammonium flouride lithium chloride anhydre magnesium chloride hexahydrate sodium chloride Calcium chloride dihydrate potassium chloride ammonium chloride sodium iodide potassium iodide ammonium iodide sodium thiocyanate potassium thiocyanate lithium nitrate magnesium nitrate hexahydrate sodium nitrate potassium nitrate ammonium nitrate magnesium formate sodium formate potassium formate ammonium formate lithium acetate dihydrate magnesium acetate tetrahydrate zinc acetate dihydrate sodium acetate trihydrate calcium acetate hydrate 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v 20 %w/v 20 %w/v 20 %w/v 20 %w/v 20 %w/v 20 %w/v 20 %w/v 20 %w/v 20 %w/v polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 [Precipitant ] [Precipitant] units Precipitant Number [Salt] [Salt] units E1 0,2 M E2 0,2 M E3 0,2 M E4 0,2 M E5 0,2 M E6 0,2 M E7 0,2 M E8 0,2 M E9 0,2 M E10 0,2 M E11 0,2 M E12 0,2 M F1 0,2 M F2 0,2 M F3 0,2 M F4 0,2 M F5 0,2 M F6 0,2 M F7 0,2 M F8 0,2 M F9 0,2 M F10 0,2 M F11 0,2 M F12 0,2 M G1 0,2 M G2 0,2 M G3 0,2 M G4 0,2 M G5 ammonium acetate lithium sulfate monohydrate magnesium sulfate heptahydrate sodium sulfate decahydrate potassium sulfate ammonium sulfate di-sodium tartate dihydrate potassium sodium tartrate tetrahydrate di-ammonium tartrate sodium dihydrogen phosphate monohydrate di-sodium hydrogen phosphate dihydrate potassium dihydrogen phosphate di-potassium hydrogen phosphate ammonium dihydrogen phosphate di-ammonium hydrogen phosphate tri-lithium citrate tetrahydrate tri-sodium citrate dihydrate tri-potassium citrate monohydrate di-ammonium hydrogen citrate 20 20 20 20 20 20 20 %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v 20 %w/v 20 %w/v 20 %w/v 20 %w/v 20 %w/v 20 %w/v 20 %w/v 20 %w/v 20 %w/v 20 %w/v polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 20 %w/v polyethylene glycol 3350 20 %w/v polyethylene glycol 3350 0,2 M potassium acetate 20 %w/v polyethylene glycol 3350 G6 0,2 M G7 0,2 M G8 0,2 M G9 0,2 M G10 0,2 M G11 0,2 M G12 0,2 M H1 0,2 M H2 0,2 M H3 0,2 M H4 0,2 M H5 0,2 M H6 0,2 M H7 0,2 M H8 0,2 M H9 0,2 M H10 0,2 M H11 0,2 M H12 0,2 M 203 204 Wizard 2 [Buffer] 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 M M M M HEPES CHES cacodylate M HEPES imidazole M imidazole M M MES sodium acetate trihydrate M phosphate citrate M Tris M Tris 7 7 4,2 6 4,5 8 7,5 8 7,5 9,5 6,5 M CHES 9,5 M HEPES 7,5 M Na/K phosphate 6,2 20 1,26 1 2,5 20 1,6 0,4 15 35 10 15 30 35 30 10 M tri-sodium citrate dihydrate 5,5 15 M cacodylate 6,5 30 M cacodylate 6,5 10 M Tris 8,5 1 M phosphate citrate 4,2 2 M M %v/v %v/v %v/v %w/v M M M %w/v M M %v/v %v/v %v/v %v/v %w/v %v/v %v/v %w/v M Na/K phosphate 6,2 10 %w/v M Tris 7 30 %w/v M phosphate citrate 4,2 10 %v/v M HEPES 7,5 20 %v/v M cacodylate 6,5 2 M M Tris 8,5 20 %w/v M MES 6 35 %v/v MPD polyethylene glycol 8000 ammonium sulfate 1,4-butanediol Iso-propanol polyethylene glycol 3000 polyethylene glycol 8000 ammonium sulfate di-ammonium hydrogen phosphate Iso-propanol polyethylene glycol 400 ethanol polyethylene glycol 1000 ammonium sulfate tri-sodium citrate dihydrate sodium chloride polyethylene glycol 3000 sodium dihydrogen phosphate di-potassium hydrogen phosphate ethanol MPD Iso-propanol ethanol polyethylene glycol 8000 MPD polyethylene glycol 400 polyethylene glycol 3000 M sodium acetate trihydrate 4,5 10 %w/v [Buffer]units Buffer pH [Precipitant] [Precip.]units Precipitant polyethylene glycol 3000 Nº [Salt] [Salt]units Salt E1 0,2 M zinc acetate dihydrate E2 0,2 M lithium sulfate anhydre E3 0,2 M magnesium chloride E4 0,2 M sodium chloride E5 0,2 M sodium chloride E6 0,2 M lithium sulfate anhydre E7 0,2 M sodium chloride E8 0,2 M sodium chloride E9 E10 E11 0,2 M zinc acetate dihydrate E12 0,2 M lithium sulfate anhydre F1 0,2 M lithium sulfate anhydre F2 0,2 M sodium chloride F3 F4 F5 0,2 M magnesium chloride F6 0,2 M calcium acetate hydrate F7 F8 0,2 M zinc acetate dihydrate F9 F10 F11 0,2 M magnesium chloride F12 0,2 M sodium chloride G1 0,2 M sodium chloride G2 G3 0,2 M magnesium chloride G4 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 1,2 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 M MES M imidazole 8 6 M imidazole 8 M MES 6 M cacodylate 6,5 20 1,26 1 2,5 1 M Tris 7 10 M HEPES 7,5 30 M Tris 7 2 M imidazole 8 20 M CAPS 11 20 %w/v %w/v M %v/v %w/v %w/v M M M M M sodium acetate trihydrate 4,5 2,5 M M Tris 7 1 M M phosphate citrate 4,2 10 %w/v M M sodium acetate trihydrate 4,5 0,8 M M imidazole 8 10 %w/v M tri-sodium citrate dihydrate 5,5 1 M M Tris 8,5 20 %w/v M Tris 7 1 M tri-sodium citrate dihydrate polyethylene glycol 1000 M imidazole 8 20 %v/v 1,4-butanediol M CHES 9,5 1,26 M ammonium sulfate 0,2 M calcium acetate hydrate 0,1 M MES 6 20 %w/v polyethylene glycol 8000 G5 0,2 M sodium chloride G6 0,2 M zinc acetate dihydrate G7 0,2 M sodium chloride G8 G9 0,2 M sodium chloride di-ammonium hydrogen phosphate polyethylene glycol 8000 sodium dihydrogen phosphate di-potassium hydrogen phosphate polyethylene glycol 3000 potassium sodium tartrate tetrahydrate sodium chloride polyethylene glycol 8000 polyethylene glycol 3000 ammonium sulfate polyethylene glycol 400 polyethylene glycol 8000 polyethylene glycol 1000 ammonium sulfate di-ammonium hydrogen phosphate sodium chloride potassium sodium tartrate tetrahydrate G10 G11 G12 0,2 M sodium chloride H1 0,2 M lithium sulfate anhydre H2 0,2 M lithium sulfate anhydre H3 0,2 M sodium chloride H4 0,2 M zinc acetate dihydrate H5 0,2 M lithium sulfate anhydre H6 0,2 M sodium chloride H7 0,2 M magnesium chloride H8 0,2 M magnesium chloride H9 H10 0,2 M sodium chloride H11 0,2 M zinc acetate dihydrate H12 205 206 MembFac [Buf.] 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 M M M M ADA ADA ADA ADA M ADA M ADA M M M tri-sodium citrate dihydrate tri-sodium citrate dihydrate tri-sodium citrate dihydrate M tri-sodium citrate dihydrate M tri-sodium citrate dihydrate 5,6 5,6 5,6 5,6 5,6 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 M tri-sodium citrate dihydrate 5,6 M tri-sodium citrate dihydrate 5,6 M tri-sodium citrate dihydrate 5,6 10 12 1 12 12 4 0,1 4 1 12 2 1 12 12 1 M tri-sodium citrate dihydrate 5,6 12 M tri-sodium citrate dihydrate 5,6 18 M sodium acetate trihydrate 4,6 12 M sodium acetate trihydrate 4,6 12 M sodium acetate trihydrate 4,6 1 M %w/v %w/v %v/v %w/v %v/v %v/v M %w/v %w/v %v/v M %v/v M %w/v %v/v M %w/v %v/v M M sodium acetate trihydrate 4,6 18 %v/v M sodium acetate trihydrate 4,6 1 M M sodium acetate trihydrate 4,6 1 M M sodium acetate trihydrate 4,6 12 %w/v M sodium acetate trihydrate 4,6 12 %v/v iso-propanol polyethylene glycol 4000 ammonium sulfate magnesium sulfate heptahydrate polyethylene glycol 400 ammonium dihydrogen phosphate polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 6000 polyethylene glycol 400 polyethylene glycol 4000 iso-propanol MPD magnesium sulfate heptahydrate polyethylene glycol 4000 polyethylene glycol 6000 MPD sodium chloride polyethylene glycol 400 ammonium sulfate polyethylene glycol 4000 iso-propanol di-ammonium hydrogen phosphate polyethylene glycol 6000 MPD magnesium sulfate hydrate M sodium acetate trihydrate 4,6 10 %w/v M sodium acetate trihydrate 4,6 12 %w/v M sodium acetate trihydrate 4,6 12 %v/v MPD polyethylene glycol 4000 polyethylene glycol 4000 [Buf]units Buffer pH [Precipitant] [Precip.]units Precipitant Nº [Salt] [Salt]unt. Salt E1 0,1 M sodium chloride E2 0,1 M zinc acetate dihydrate E3 0,2 M ammonium sulfate E4 0,1 M sodium chloride E5 E6 E7 E8 0,1 M magnesium chloride hexahydrate E9 0,1 M lithium sulfate monohydrate E10 0,1 M sodium chloride E11 0,1 M magnesium chloride hexahydrate E12 0,1 M sodium chloride F1 0,1 M lithium sulfate monohydrate F2 0,1 M tri-sodium citrate dihydrate F3 0,1 M sodium chloride F4 F5 0,1 M sodium chloride F6 0,1 M lithium sulfate monohydrate F7 0,1 M magnesium chloride hexahydrate F8 F9 0,1 M lithium sulfate monohydrate F10 F11 0,1 M lithium sulfate monohydrate F12 G1 0,1 M magnesium chloride hexahydrate G2 G3 0,1 M lithium sulfate monohydrate G4 0,1 0,5 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,5 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 M tris M tris M tris M tris 8,5 8,5 8,5 8,5 M tris 8,5 M tris 8,5 M tris 8,5 0,1 0,1 12 0,4 0,2 0,5 5 M tris 8,5 0,5 M tris 8,5 12 M HEPES 7,5 0,1 M %v/v M M M M %w/v M M M %v/v M HEPES 7,5 4 %v/v M HEPES 7,5 4 %v/v M HEPES 7,5 1 M M HEPES 7,5 12 %v/v MPD tri-sodium citrate dihydrate polyethylene glycol 400 MPD M HEPES 7,5 10 %w/v M HEPES 7,5 18 %v/v M HEPES 7,5 1 M M HEPES 7,5 18 %v/v M HEPES 7,5 10 %w/v polyethylene glycol 4000 polyethylene glycol 400 M M HEPES 7,5 0,5 M di-sodium hydrogen phosphate 0,3 M lithium sulfate monohydrate 0,1 M ADA 6,5 4 %v/v polyethylene glycol 400 di-potassium hydrogen phosphate G5 0,1 M ammonium sulfate G6 0,1 M sodium chloride G7 0,1 M magnesium chloride hexahydrate G8 potassium sodium tartrate tetrahydrate polyethylene glycol 400 polyethylene glycol 4000 G9 0,1 M ammonium sulfate G10 0,1 M ammonium sulfate G11 0,1 M tri-sodium citrate dihydrate G12 H1 0,6 M magnesium sulfate hydrate H2 0,6 M magnesium sulfate hydrate H3 0,1 M lithium sulfate monohydrate potassium sodium tartrate tetrahydrate MPD di-sodium hydrogen phosphate di-potassium hydrogen phosphate sodium acetate trihydrate sodium chloride polyethylene glycol 6000 magnesium sulfate hydrate lithium sulfate monohydrate ammonium sulfate polyethylene glycol 400 H4 0,1 M lithium sulfate monohydrate H5 0,1 M di-ammonium hydrogen phosphate H6 H7 H8 0,1 M di-ammonium hydrogen phosphate H9 0,1 M potassium sodium tartrate tetrahyd. H10 H11 H12 0,1 M tri-sodium citrate dihydrate 207 208 Quik phosphate grid screen [Buffer] 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 1 1 1 1 1 1 1,4 1,4 1,4 1,4 1,4 1,4 1,8 1,8 1,8 1,8 1,8 1,8 M M M M M M M M M M Na/K phosphate Na/K phosphate Na/K phosphate Na/K phosphate Na/K phosphate Na/K phosphate Na/K phosphate Na/K phosphate Na/K phosphate Na/K phosphate M Na/K phosphate M Na/K phosphate M Na/K phosphate M Na/K phosphate M Na/K phosphate M Na/K phosphate M Na/K phosphate 5,6 6,3 6,9 7,5 8,2 5 5,6 6,3 6,9 7,5 8,2 5 5,6 6,3 6,9 7,5 8,2 M Na/K phosphate 5 M Na/K phosphate 8,2 M Na/K phosphate 7,5 M Na/K phosphate 6,9 M Na/K phosphate 6,3 M Na/K phosphate 5,6 M Na/K phosphate 5 [Buffer] units Buffer Ph E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 Number E10 E11 E12 F10 F11 F12 NaCl grid screen Buffer Tri-sodium citrate dihydrate Tri-sodium citrate dihydrate MES HEPES Tris bicine Tri-sodium citrate dihydrate Tri-sodium citrate dihydrate MES HEPES Tris bicine Tri-sodium citrate dihydrate Tri-sodium citrate dihydrate MES HEPES Tris bicine Tri-sodium citrate dihydrate Tri-sodium citrate dihydrate MES HEPES Tris bicine 6 7 8 9 5 4 9 8 3 3 4 4 4 4 4 4 7 3 6 3 5 3 4 3 9 2 8 2 M M M M M M M M M M M M M M 7 2 M 6 2 M 5 2 M 4 2 M 9 1 M 8 1 M 7 1 M 6 1 M Sodium Chloride Sodium Chloride Sodium Chloride Sodium Chloride Sodium Chloride Sodium Chloride Sodium Chloride Sodium Chloride Sodium Chloride Sodium Chloride Sodium Chloride Sodium Chloride Sodium Chloride Sodium Chloride Sodium Chloride Sodium Chloride Sodium Chloride Sodium Chloride Sodium Chloride Sodium Chloride Sodium Chloride Sodium Chloride 5 1 M Sodium Chloride 4 1 M Sodium Chloride pH [Precipitant] [Precipitant] units Precipitant M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M Number [Buffer] [Buffer] units G1 0,1 G2 0,1 G3 0,1 G4 0,1 G5 0,1 G6 0,1 G7 0,1 G8 0,1 G9 0,1 G10 0,1 G11 0,1 G12 0,1 H1 0,1 H2 0,1 H3 0,1 H4 0,1 H5 0,1 H6 0,1 H7 0,1 H8 0,1 H9 0,1 H10 0,1 H11 0,1 H12 0,1 209 210 Index [Buffer] 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 M tris 8,5 M HEPES 7,5 M bis-tris 6,5 M bis-tris 5,5 0,3 0,5 0,5 0,3 0,9 0,1 0,35 0,65 0,04 0,96 0,1 M HEPES 7,5 1,4 1,8 0,8 1,5 2,8 3,5 M tris 8,5 3 M HEPES 7,5 3 M bis-tris 6,5 3 M bis-tris 5,5 3 M 4,5 3 M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M 3,5 3 M M tris 8,5 2 M M HEPES 7,5 2 M M bis-tris 6,5 2 M M bis-tris 5,5 2 M M 4,5 2 M ammonium sulfate ammonium sulfate ammonium sulfate ammonium sulfate ammonium sulfate sodium chloride sodium chloride sodium chloride sodium chloride sodium chloride sodium chloride magnesium formate magnesium formate magnesium formate magnesium formate sodium dihydrogen phosphate di-potassium hydrogen phosphate sodium dihydrogen phosphate di-potassium hydrogen phosphate sodium dihydrogen phosphate di-potassium hydrogen phosphate tri-sodium citrate dihydrate tri-ammonium citrate pH 7.0 succinic acid pH 7.0 Malonic Acid pH 7.0 sodium acetate trihydrate pH 7.0 sodium formate pH 7.0 M citric acid sodium acetate trihydrate 3,5 2 M ammonium sulfate [Buf.]units Buffer pH [Precipitant] [Precip.]units Precipitant 1 citric acid sodium acetate trihydrate Nº [Salt] [S.]units Salt A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 C1 C2 2,4 35 60 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 25 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,05 M M M M M M M bis-tris bis-tris HEPES tris bis-tris HEPES HEPES M bis-tris M bis-tris M bis-tris M bis-tris M tris 8,5 6,5 6,5 5,5 6,5 5,5 6,5 7,5 8,5 6,5 7,5 7,5 M HEPES 7,5 M bis-tris 6,5 M bis-tris 5,5 25 25 25 25 20 28 45 45 45 45 45 45 30 30 35 M 4,5 25 M citric acid sodium acetate trihydrate 3,5 25 M HEPES 7 30 M HEPES 7 30 %w/v %v/v %v/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %v/v %v/v %v/v %v/v %v/v %v/v %v/v %v/v %v/v M HEPES 7 2 %w/v M HEPES 7 0,5 %w/v M HEPES 7 1 %w/v M HEPES 7 0,5 %v/v M bis-tris 5,5 1 %w/v M tris 8,5 0,5 %w/v M bis-tris 6,5 1,5 M ammonium sulfate polyethylene glycol MME 5000 polyethylene glycol 3350 %v/v tacsimate pH 7.0 %v/v tacsimate pH 7.0 M Malonic Acid pH 7.0 1,1 M di-ammonium tartrate pH 7.0 C3 C4 C5 C6 0,1 M sodium chloride C7 0,8 M potassium sodium tartrate tetrahydrate C8 1 M ammonium sulfate C9 1,1 M Malonic Acid pH 7.0 jeffamine ED-2001 reagent pH 7.0 polyethylene glycol MME 2000 polyethylene glycol 8000 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 1500 jeffamine M-600 reagent pH 7.0 jeffamine ED-2001 reagent pH 7.0 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol MME 5000 polyethylene glycol MME 2000 MPD MPD MPD MPD MPD MPD polyethylene glycol MME 550 polyethylene glycol MME 550 pentaerythritol propoxylate (5/4 PO/OH) C10 1 M succinic acid pH 7.0 C11 1 M ammonium sulfate C12 15 %w/v tacsimate pH 7.0 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 0,2 M calcium chloride dihydrate E1 0,2 M calcium chloride dihydrate E2 0,2 M ammonium acetate E3 0,2 M ammonium acetate E4 0,2 M ammonium acetate E5 0,2 M ammonium acetate E6 0,05 M calcium chloride dihydrate E7 0,05 M magnesium chloride hexahydrate E8 0,2 M potassium chloride 211 212 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 M HEPES 7,5 12 %w/v M HEPES 7 10 %w/v M tris 8,5 20 %w/v M HEPES 7,5 10 %w/v M tris 8,5 20 %w/v Polyvinylpyrrolidine K15 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol MME 2000 polyethylene glycol MME 5000 polyethylene glycol 3350 M HEPES 7,5 22 %w/v M bis-tris 6,5 45 %v/v polyethylene glycol 400 polyacrylic acid 5100 sodium salt M bis-tris 6,5 30 %v/v pentaerythritol ethoxylate (15/4 EO/OH) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 M M M M M M M M bis-tris bis-tris HEPES tris bis-tris bis-tris HEPES tris M tris M HEPES M bis-tris M bis-tris M tris 8,5 5,5 6,5 7,5 8,5 5,5 6,5 7,5 8,5 5,5 6,5 7,5 8,5 M HEPES 7,5 M bis-tris 6,5 M bis-tris 5,5 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 M tris 8,5 25 M HEPES 7,5 25 M bis-tris 6,5 25 M bis-tris 5,5 25 M bis-tris 5,5 17 %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v polyethylene glycol 10,000 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 E9 0,05 M ammonium sulfate E10 E11 0,02 M magnesium chloride hexahydrate E12 0,01 M Cobaltous chloride hexahydrate F1 0,2 M proline F2 0,2 M trimethylamine n-oxide F3 5 %v/v tacsimate pH 7.0 F4 0,005 M magnesium chloride hexahydrate 0,005 M Nickel chloride hexahydrate 0,005 M Cadmium chloride dihydrate 0,005 M Cobaltous chloride hexahydrate F5 0,1 M ammonium acetate F6 0,2 M ammonium sulfate F7 0,2 M ammonium sulfate F8 0,2 M ammonium sulfate F9 0,2 M ammonium sulfate F10 0,2 M sodium chloride F11 0,2 M sodium chloride F12 0,2 M sodium chloride G1 0,2 M sodium chloride G2 0,2 M lithium sulfate monohydrate G3 0,2 M lithium sulfate monohydrate G4 0,2 M lithium sulfate monohydrate G5 0,2 M lithium sulfate monohydrate G6 0,2 M ammonium acetate G7 0,2 M ammonium acetate G8 0,2 M ammonium acetate G9 0,2 M ammonium acetate G10 0,2 M magnesium chloride hexahydrate G11 0,2 M magnesium chloride hexahydrate G12 0,2 M magnesium chloride hexahydrate H1 0,2 M magnesium chloride hexahydrate H2 20 20 15 20 20 15 20 20 30 30 %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v %w/v polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol 3350 polyethylene glycol MME 2000 polyethylene glycol MME 2000 %w/v polyethylene glycol 3350 %w/v polyethylene glycol 3350 0,2 M potassium sodium tartrate tetrahydrate 20 %w/v polyethylene glycol 3350 H3 0,2 M Malonic Acid pH 7.0 H4 0,2 M tri-ammonium citrate pH 7.0 H5 0,1 M succinic acid pH 7.0 H6 0,2 M sodium formate H7 0,15 M DL-malic acid pH 7.0 H8 0,1 M magnesium formate H9 0,05 M zinc acetate dihydrate H10 0,2 M tri-sodium citrate dihydrate H11 0,1 M potassium thiocyanate H12 0,15 M potassium bromide 213 214 SaltRx Salt Sodium Acetate trihydrate pH 7.0 Sodium Acetate trihydrate pH 7.0 Ammonium Chloride Ammonium Chloride Ammonium Chloride Ammonium Chloride Ammonium Chloride Ammonium Chloride Sodium Chloride Sodium Chloride Sodium Chloride Sodium Chloride Sodium Chloride Sodium Chloride di-Ammonium hydrogen Citrate di-Ammonium hydrogen Citrate tri-Ammonium Citrate pH 7.0 tri-Ammonium Citrate pH 7.0 tri-Sodium Citrate dihydrate tri-Sodium Citrate dihydrate tri-Sodium Citrate dihydrate tri-Sodium Citrate dihydrate Magnesium Formate Magnesium Formate Magnesium Formate Magnesium Formate Sodium Formate Sodium Formate Sodium Formate 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 M M M M M M M M M M M M M M 0,1 M 0,1 M 0,1 M Tris Sodium Acetate trihydrate Sodium Acetate trihydrate Bis-Tris Propane Bis-Tris Propane Bis-Tris Propane Tris Bis-Tris Propane Tris Sodium Acetate trihydrate Bis-Tris Propane Tris Bis-Tris Propane Sodium Acetate trihydrate Bis-Tris Propane Tris 0,1 M 0,1 M Tris Sodium Acetate trihydrate Bis-Tris Propane 0,1 M 0,1 M Bis-Tris Propane 0,1 M Tris Sodium Acetate trihydrate 0,1 M Bis-Tris Propane 0,1 M Sodium Acetate trihydrate 0,1 M Tris 0,1 M Bis-Tris Propane 0,1 M Sodium Acetate trihydrate 4,6 7 8,5 4,6 7 8,5 4,6 7 8,5 4,6 7 8,5 4,6 4,6 7 7 7 8,5 7 8,5 4,6 7 8,5 7 4,6 7 8,5 0,1 M Bis-Tris Propane 7 0,1 M Bis-Tris Propane 7 [Buffer] [Buffer] units Buffer pH Nº [Salt] [Salt] units A1 0,8 M A2 2,8 M A3 0,5 M A4 1,5 M A5 1,5 M A6 3,5 M A7 3,5 M A8 3,5 M A9 2,2 M A10 2,2 M A11 2,2 M A12 3,2 M B1 3,2 M B2 3,2 M B3 1 M B4 1,8 M B5 1 M B6 2 M B7 0,7 M B8 0,7 M B9 1,2 M B10 1,2 M B11 0,4 M B12 0,4 M C1 0,4 M C2 0,7 M C3 2 M C4 2 M C5 2 M C6 Sodium Formate Sodium Formate DL-Malic Acid pH 7.0 DL-Malic Acid pH 7.0 Malonic Acid pH 7.0 Malonic Acid pH 7.0 Ammonium Nitrate Ammonium Nitrate Ammonium Nitrate Ammonium Nitrate Ammonium Nitrate Ammonium Nitrate Sodium Nitrate Sodium Nitrate Sodium Nitrate Sodium Nitrate Sodium Nitrate Sodium Nitrate Ammonium dihydrogen phosphate Ammonium dihydrogen phosphate di-Ammonium hydrogen phosphate di-Ammonium hydrogen phosphate Na/K Phosphate pH 5.0 Na/K Phosphate pH 6.9 Na/K Phosphate pH 8.2 Na/K Phosphate pH 5.0 Na/K Phosphate pH 6.9 Na/K Phosphate pH 8.2 Succinic acid pH 7.0 Succinic acid pH 7.0 Ammonium Sulfate 0,1 0,1 0,1 M M M Bis-Tris Propane Bis-Tris Propane Sodium Acetate trihydrate 7 7 4,6 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 M M M M M 0,1 M 0,1 M 0,1 M Tris Sodium Acetate trihydrate Bis-Tris Propane Tris Sodium Acetate trihydrate Sodium Acetate trihydrate Tris Tris 0,1 M 0,1 M 0,1 M Tris Sodium Acetate trihydrate Bis-Tris Propane 0,1 M Bis-Tris Propane 0,1 M 0,1 M Tris Sodium Acetate trihydrate 0,1 M Bis-Tris Propane 0,1 M Sodium Acetate trihydrate 0,1 M Bis-Tris Propane 0,1 M Bis-Tris Propane 7 7 4,6 7 8,5 4,6 7 8,5 4,6 7 8,5 4,6 7 8,5 4,6 4,6 8,5 8,5 0,1 M Bis-Tris Propane 7 0,1 M Bis-Tris Propane 7 0,1 M Tris 8,5 0,1 M Bis-Tris Propane 7 3,5 M Sodium Formate 0,1 M Sodium Acetate trihydrate 4,6 C7 3,5 M C8 3,5 M C9 1,2 M C10 1,2 M C11 1,4 M C12 2,4 M D1 2,5 M D2 2,5 M D3 2,5 M D4 6 M D5 6 M D6 6 M D7 1,5 M D8 1,5 M D9 1,5 M D10 4 M D11 4 M D12 4 M E1 1 M E2 1,8 M E3 1,5 M E4 2,4 M E5 1 M E6 1 M E7 1 M E8 1,8 M E9 1,8 M E10 1,8 M E11 0,5 M E12 1 M F1 1,5 M 215 216 Ammonium Sulfate Ammonium Sulfate Ammonium Sulfate Ammonium Sulfate Ammonium Sulfate Lithium Sulfate monohydrate Lithium Sulfate monohydrate Lithium Sulfate monohydrate Lithium Sulfate monohydrate Lithium Sulfate monohydrate Lithium Sulfate monohydrate Magnesium Sulfate monohydrate Magnesium Sulfate monohydrate Magnesium Sulfate monohydrate Magnesium Sulfate monohydrate Magnesium Sulfate monohydrate Magnesium Sulfate monohydrate di-Ammonium Tartrate di-Ammonium Tartrate di-Ammonium Tartrate di-Ammonium Tartrate di-Ammonium Tartrate di-Ammonium Tartrate Potassium Sodium Tartrate tetrahydrate Potassium Sodium Tartrate tetrahydrate Potassium Sodium Tartrate tetrahydrate Potassium Sodium Tartrate tetrahydrate Potassium Thiocyanate Potassium Thiocyanate Potassium Thiocyanate Ammonium Acetate Ammonium Acetate 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 M M M M M M M M M M M M M M 0,1 M 0,1 M 0,1 M Tris Sodium Acetate trihydrate Bis-Tris Propane Tris Sodium Acetate trihydrate Bis-Tris Propane Tris Bis-Tris Propane Bis-Tris Propane Tris Tris Sodium Acetate trihydrate Bis-Tris Propane Tris Sodium Acetate trihydrate Bis-Tris Propane 0,1 M 0,1 M Tris Sodium Acetate trihydrate Bis-Tris Propane 0,1 M 0,1 M Bis-Tris Propane 0,1 M Tris Sodium Acetate trihydrate 0,1 M Bis-Tris Propane 0,1 M Sodium Acetate trihydrate 0,1 M Tris 0,1 M Bis-Tris Propane 0,1 M Sodium Acetate trihydrate 4,6 7 8,5 4,6 7 8,5 4,6 7 8,5 4,6 7 8,5 4,6 7 8,5 4,6 7 8,5 7 7 8,5 8,5 4,6 7 8,5 4,6 7 0,1 M Tris 8,5 0,1 M Bis-Tris Propane 7 0,1 M Sodium Acetate trihydrate 4,6 0,1 M Tris 8,5 0,1 M Bis-Tris Propane 7 F2 1,5 M F3 1,5 M F4 2,5 M F5 2,5 M F6 2,5 M F7 0,8 M F8 0,8 M F9 0,8 M F10 1,5 M F11 1,5 M F12 0,5 M G1 1 M G2 1 M G3 1 M G4 1,8 M G5 1,8 M G6 1,8 M G7 0,7 M G8 0,7 M G9 0,7 M G10 1,2 M G11 1,3 M G12 1,4 M H1 0,6 M H2 1,2 M H3 0,6 M H4 1,2 M H5 0,5 M H6 0,5 M H7 0,5 M H8 4 M H9 4 M H10 Tacsimate Tacsimate 0,1 M Bis-Tris Propane 7 0,1 M Bis-Tris Propane 7 4 M Ammonium Acetate 0,1 M Tris 8,5 H11 35 %v/v H12 60 %v/v 217 8.2. Annex 2: Taula de valors d’intensitat per a cada spot i altres paràmetres estadístics Aquesta taula inclou els principals resultats de l’anàlisi estadístic realitzat sobre els microarrays hibridats amb les dues sondes. L’experiment s’ha realitzat per triplicat (tres microarrys iguals però independents identificats com a 15, 16 i 20). A continuació es mostra la llegenda per entendre el significat de cada columna: Block, Column i Row: localització de l’spot en el microarray., Name: nom del clon corresponent a l’spot., ID: identificador únic per a cada spot., Status: descripció del bloc on es localitza l’spot., X_BoOK: l’spot supera els filtres de qualitat dels dos canals (1 supera, 0 no supera)., X_ROK: l’spot supera els filtres de qualitat del canal vermell (1 supera, 0 no supera)., X_GOK: l’spot supera els filtres de qualitat del canal verd (1 supera, 0 no supera)., X NormRed: intensitat normalitzada per al canal vermell., R_Mean: mitjana de la intensitat normalitzada per a tots els spots en el canal vermell., R_SD: desviació estàndard de la mitjana de la intensitat normalitzada per a tots els spots en el canal vermell., X NormGreen: intensitat normalitzada per al canal verd., G_Mean: mitjana de la intensitat normalitzada per a tots els spots en el canal verd., G_SD: desviació estàndard de la mitjana de la intensitat normalitzada per a tots els spots en el canal verd., log2R/G: log2(R_Mean/G_Mean)., sdlog2R/G: desviació estàndard de log2(R_Mean/G_Mean). Taula de valors d’intensitat normalitzats per a cada spot i altres paràmetres estadístics Block Column Row Name ID Status 15_BoOK 16_BoOK 20_BoOK 15_ROK 16_ROK 20_ROK 15_GOK 16_GOK 20_GOK 15 NormRed 16 NormRed 20 NormRed R_Mean R_SD 15 NormGreen 16 NormGreen 20 NormGreen G_Mean G_SD log2R/G 9554,1322 10070,6731 9461,7843 3492,8385 4009,8919 3359,3878 3210,3206 3090,1665 2955,8312 2628,1747 2196,4509 2694,2039 2431,3204 2184,8248 2489,8850 2628,1747 1989,1555 2215,0486 2277,3667 1977,7986 2018,7049 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 693,5639 694,5639 864,5639 865,5639 1 1 0 1 1 1 1 1 0 560,5639 561,5639 0 1 0 514,5639 515,5639 1 0 0 1700,5639 1701,5639 0 1 0 2947,5639 2948,5639 420,2328 891,3098 529,2328 552,9765 522,2328 544,3098 1 0 0 2828,5639 2829,5639 1 1 1 1 1 1 1 1 85_A1 1 posctrl 1 1 1 1 1 8684,5639 8685,5639 10058,2328 9503,9765 724,2047 8760,5476 659,9267 0,0059 0,0233 9716,7940 10306,5012 9313,7280 1244,2724 -0,0062 0,0237 1827,4593 1921,3567 8321,2865 11166,4199 -2,5000 0,3529 1979,1422 2254,7139 4780,8859 4616,1671 -1,4252 0,3107 1 1 5 85_A1 97 posctrl 1 1 1 1 1 7986,5639 7987,5639 10319,2328 9267,9765 1183,2434 7917,8889 396,2328 1197,3098 1412,7824 21215,0436 912,2328 1575,3098 1188,6304 10108,8016 703,9778 8002,1548 54,3264 2575,4329 19,8179 2567,0063 224,9753 3257,9861 186,2636 2853,5100 665,2328 678,6432 843,2328 876,3098 14,2258 2027,8155 40,2564 1800,9494 1 16 8 89_G7 184 block1 0 0 0 1 0 1 20 7 71_E3 164 block1 0 1 0 0 1 3 20 4 71_H3 476 block3 1 0 0 1 0 1411,8654 1126,8613 3513,6272 3889,7901 -1,6698 0,4902 726,4812 -2,5835 0,3066 342,0494 -2,4350 0,2079 533,8391 -0,5107 0,1633 338,1676 -0,4231 0,1151 358,2995 -1,6949 0,2272 240,8285 -1,1982 0,1266 3 19 8 71_H1 571 block3 0 0 0 0 1 3 19 4 71_H1 475 block3 0 0 0 1 1 3 21 7 71_F5 549 block3 1 1 1 1 1 2009,5639 2010,5639 1616,2328 1875,9765 1960,5639 1961,5639 1637,2328 1852,3098 3 21 3 71_F5 453 block3 1 1 0 1 1 1 15 5 89_A5 111 block1 0 1 0 0 1 1 20 3 71_E3 68 block1 1 0 0 1 0 sdlog2R/G 221 222 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 611,5639 612,5639 511,5639 512,5639 456,5639 457,5639 0 0 0 650,5639 651,5639 0 0 0 808,5639 809,5639 0 0 0 602,5639 603,5639 0 0 0 761,5639 762,5639 0 0 0 631,5639 632,5639 0 0 0 627,5639 628,5639 636,2328 750,3098 778,2328 729,9765 706,2328 693,9765 762,2328 656,3098 515,2328 646,9765 664,2328 634,3098 637,2328 633,3098 685,2328 619,6432 503,2328 551,3098 0 0 0 863,5639 864,5639 758,2328 760,9765 0 0 0 672,5639 673,5639 637,2328 766,9765 0 0 0 904,5639 905,5639 672,2328 786,9765 116,1917 194,9272 205,1405 74,4758 148,9254 40,5703 94,3093 125,8702 0 0 0 738,5639 739,5639 904,2328 813,6432 83,9165 0 0 0 897,5639 898,5639 806,2328 814,3098 0 0 0 746,5639 747,5639 982,2328 863,9765 117,8367 0 0 0 748,5639 749,5639 984,2328 889,3098 124,3373 755,2174 660,5038 680,6931 852,1583 882,5406 101,2434 1039,9499 801,6724 85,2331 1247,1628 656,7492 91,7353 1438,8764 925,0735 640,9173 20,0741 1045,9636 646,0080 721,1676 0 0 0 729,5639 730,5639 1069,2328 911,3098 171,0830 746,2354 0 0 0 871,5639 872,5639 1086,2328 937,9765 128,6253 856,3575 0 0 0 818,5639 819,5639 1044,2328 949,6432 117,1761 662,4152 765,4487 0 0 0 801,5639 802,5639 1081,2328 950,3098 140,6838 794,5553 839,3523 0 0 0 856,5639 857,5639 1163,2328 977,9765 162,9983 656,7492 0 0 0 805,5639 806,5639 1524,2328 1059,9765 402,6748 767,7094 755,7471 1017,6837 959,3517 914,4852 0 0 0 1393,5639 1394,5639 1046,2328 1190,6432 180,9069 1033,9847 1074,7586 0 0 0 1145,5639 1146,5639 1358,2328 1234,3098 110,6123 703,4820 931,4492 923,4085 0 0 0 1182,5639 1183,5639 1457,2328 1264,9765 167,0628 749,1933 849,2250 955,8619 0 0 0 452,5639 453,5639 554,2328 1944,6432 2496,8268 583,2688 40922,1829 851,4267 852,7799 0 0 0 1631,5639 1632,5639 2327,2328 1966,9765 348,4992 930,0456 1091,2081 1255,1389 1092,1308 0 0 0 1833,5639 1834,5639 2527,2328 2126,9765 358,9649 971,6169 1191,7214 1440,0087 1201,1157 1 0 0 651,5639 652,5639 407,2328 554,3098 129,5615 1834,4770 1510,7490 1093,9855 1479,7372 1 0 0 778,5639 779,5639 734,2328 774,9765 39,0737 1775,8349 1613,6236 1466,9949 1618,8178 0 1 0 779,5639 780,5639 814,2328 893,6432 168,4612 1306,6493 2311,5636 1476,1291 1698,1140 1 0 0 1084,5639 1085,5639 809,2328 931,6432 140,1783 2465,8881 1565,7127 1610,8105 1880,8038 0 1 0 603,5639 604,5639 748,2328 688,9765 75,7983 1360,2484 2166,3308 2477,4456 2001,3416 576,5835 -1,4995 0,2906 507,1994 -0,9917 0,1940 537,9788 -0,8973 0,1749 154,4855 -1,0596 0,1127 371,2186 -1,4138 0,0861 234,3371 0,8297 0,0790 162,5486 0,8445 0,0414 103,3519 0,5702 0,1123 129,3583 0,5415 0,1700 50,7966 0,2030 0,1976 810,0600 864,4198 780,7830 878,7209 998,3495 808,5532 952,7231 829,7778 981,2976 949,0204 942,3592 952,7231 1058,6523 988,8897 767,9378 1080,1984 778,1573 981,2976 832,5304 799,5291 840,1526 1154,8448 1121,2102 1613,6236 911,6215 806,0258 966,4727 1034,0256 817,6100 1479,8501 1551,5953 1294,5346 964,6386 1069,3621 1049,1278 1052,8133 923,9533 1263,1377 1314,9034 1275,0679 752,4058 1397,0728 2011,9312 1615,9601 934,9337 753,0758 1102,3911 1299,5025 1149,2857 974,0210 830,6832 1055,1581 186,4962 0,2835 0,0955 85,2100 0,1304 0,1033 126,7327 0,2874 0,0884 159,4425 -0,1031 0,1238 131,5029 0,0457 0,0679 135,7180 -0,0343 0,0527 144,2749 0,1069 0,0645 129,0959 -0,3420 0,0715 131,2567 0,0007 0,1014 384,7849 -0,6790 0,6783 88,6584 -0,3558 0,3959 15,0485 -0,4768 0,2129 105,9663 -0,3270 0,3121 35,4111 -0,8112 0,1508 88,9139 -0,1154 0,2881 343,5574 -1,2885 0,0995 140,5942 -0,5453 0,3162 101,9583 -0,2404 0,2292 133,1159 -0,8540 0,1509 284,5650 -0,6165 0,2467 486,7352 -0,8665 0,3052 772,2476 14092,5664 23235,3216 -1,3094 1,5376 973,7863 1027,5098 1064,0091 6486,0866 2772,6017 3219,3828 -0,7812 1,1498 998,3495 1174,6275 1009,7782 880,7086 1009,2187 79,5238 1182,8812 2 6 1 85_A12 198 block2 0 1 0 1 1 3 16 6 89_D7 520 block3 1 0 0 1 1 3 16 2 89_D7 424 block3 0 1 0 1 1 3 20 6 71_D3 524 block3 1 0 0 1 0 3 20 8 71_H3 572 block3 0 0 0 1 0 1 10 8 06_G7 178 block1 0 0 0 1 1 1 10 4 06_G7 82 block1 0 0 0 1 1 1 5 1 85_A9 5 block1 0 0 0 1 0 1 8 8 06_G3 176 block1 0 0 0 1 1 1 8 4 06_G3 80 block1 0 0 0 1 1 2 10 2 06_C8 226 block2 0 0 0 0 0 1 7 6 06_C1 127 block1 0 0 0 1 0 2 8 8 06_G4 368 block2 0 0 0 0 0 3 8 5 06_B3 488 block3 0 0 0 1 0 2 8 4 06_G4 272 block2 0 0 0 0 1 1 6 8 85_G11 174 block1 0 0 0 1 1 3 8 1 06_B3 392 block3 0 0 0 1 1 1 7 2 06_C1 31 block1 0 0 0 1 1 1 4 8 85_G7 172 block1 0 0 0 1 1 3 1 7 85_F1 529 block3 0 0 0 1 0 1 4 4 85_G7 76 block1 0 0 0 0 1 3 20 2 71_D3 428 block3 0 0 0 1 1 4 20 7 71_F4 740 block4 0 0 0 0 1 3 1 3 85_F1 433 block3 0 0 0 1 0 4 20 3 71_F4 644 block4 0 0 0 1 1 4 4 4 85_H8 652 block4 0 0 0 0 1 1 2 7 85_E3 146 block1 0 0 0 1 0 2 6 5 85_A12 294 block2 0 0 0 1 1 1 4 7 85_E7 148 block1 0 0 0 0 0 1 2 3 85_E3 50 block1 0 0 0 0 1 1 22 2 71_C7 46 block1 0 0 0 0 1 1 8 2 06_C3 32 block1 0 0 0 0 1 3 2 2 85_D3 410 block3 0 0 0 0 1 4 13 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 718,5639 719,5639 1063,5639 1064,5639 748,5639 749,5639 0 0 0 1148,5639 1149,5639 0 0 0 813,5639 814,5639 0 0 0 1632,5639 1633,5639 0 0 0 1742,5639 1743,5639 0 0 0 816,5639 817,5639 0 0 0 900,5639 901,5639 929,2328 931,3098 898,2328 859,9765 389,2328 837,3098 408,2328 787,3098 849,2328 776,9765 578,2328 772,6432 714,2328 733,6432 568,2328 726,6432 677,2328 722,3098 0 0 0 947,5639 948,5639 945,2328 970,9765 0 0 0 2511,5639 2512,5639 0 0 0 1680,5639 1681,5639 822,2328 1042,6432 0 0 0 89,8153 90,8153 0 0 0 184,0966 185,0966 148,3027 1146,5107 1698,0429 0 0 0 1421,5639 1422,5639 1086,2328 1193,6432 0 0 0 97,6165 98,6165 4142,2328 1444,1458 2336,6132 891,6507 197,4938 1218,2236 0 0 0 210,6699 211,6699 72,4111 1447,7380 2263,4562 0 0 0 141,0776 142,0776 0 0 0 4519,5639 4520,5639 212,2328 1665,6432 2471,7094 13176,0793 0 0 0 4952,5639 4953,5639 115,5986 1724,3976 2795,6790 19496,0198 1027,7503 0 0 0 5393,5639 5394,5639 181,2340 1923,9773 3004,7606 39660,8430 0 0 0 170,6621 171,6621 6215,2328 2173,2364 3500,5201 672,3241 0 0 0 192,8851 193,8851 101,1709 2367,7296 3846,6414 0 0 0 330,5639 331,5639 209,2328 2538,6432 3930,0496 1952,0833 0 0 0 101,4520 102,4520 89,1508 2596,9119 4332,9208 0 0 0 110,7991 111,7991 120,1827 3221,0382 5378,9678 0 0 0 87,0258 88,0258 76,8005 6452,9864 11035,0237 694,0327 117313,3174 0 0 0 1493,5639 1494,5639 104,3748 6709,0239 10260,0533 7909,4623 0 0 0 145,3001 146,3001 128,6967 2816,7099 4641,4039 718,5478 55655,9207 0 0 0 527,5639 528,5639 361,2328 408,6432 103,6909 1039,9499 1185,4712 1262,3412 1162,5874 0 0 0 260,5663 261,5663 183,2337 244,9776 55,6131 920,1511 1091,2081 1115,6286 1042,3293 0 0 0 439,5639 440,5639 456,2328 407,9765 69,6471 900,9548 1332,0731 977,5169 1070,1816 0 0 0 89_F2 733 block4 0 0 0 0 1 520,5639 521,5639 354,2328 451,6432 86,7482 1045,9636 709,0115 846,1245 867,0332 169,4463 -0,9417 0,3514 230,0126 -1,3854 0,5517 106,5116 -2,1108 0,4311 112,9479 -1,5328 0,4795 3 2 5 85_B3 482 block3 0 0 0 1 0 2 23 7 71_E10 359 block2 0 0 0 1 0 3 3 7 85_F5 531 block3 0 0 0 1 0 4 23 1 71_B10 599 block4 0 0 0 0 1 903,1259 19092,5315 31664,9584 -2,6280 0,2797 981,2976 39662,8826 67247,4026 -3,0942 0,5388 3 14 3 89_F3 446 block3 0 0 0 0 0 823,5567 1284,4080 3339,1423 3964,7149 -0,5114 4,3754 4 21 3 71_F6 645 block4 0 0 0 0 0 1 24 7 71_E11 168 block1 0 0 0 0 0 755,2174 71605,3417 1405,0216 24588,5269 40719,0523 -3,0802 0,4119 791,0589 60946,7109 1073,4084 20937,0594 34649,6622 -3,1854 0,3508 1173,0951 1144,2359 1423,1381 458,3071 -0,8069 2,9446 935,0674 46914,9874 1735,0649 16528,3732 26318,6196 -3,0540 0,9408 814,4618 67494,8062 22993,8640 38539,0119 -2,6748 0,7339 975,0156 1338,5770 13991,4786 22231,0649 -2,6898 0,3322 832,5304 7118,7668 10719,4599 -2,7053 0,6684 1125,2752 1044,4576 5115,2707 6980,9820 -1,9761 0,3894 1 7 4 06_G1 79 block1 0 0 0 0 0 3 14 2 89_D3 422 block3 0 0 0 0 0 3 12 8 06_H11 564 block3 0 0 0 0 0 4 10 3 06_F8 634 block4 0 0 0 0 0 4 6 3 85_F12 630 block4 0 0 0 0 0 2 4 5 85_A8 292 block2 0 0 0 0 0 2 20 7 71_E4 356 block2 0 0 0 0 0 3 1 8 85_H1 553 block3 0 0 0 0 0 126,7807 1479,6637 2330,8916 1675,7489 29801,2501 1724,4463 11067,1484 16224,2262 -3,3909 0,4897 852,1583 11643,0526 1422,3711 4639,1940 6072,2164 -2,6106 1,4804 1332,0731 41718,7990 14647,5076 23445,4603 -3,4567 0,3450 935,6237 1083,5660 1079,1378 141,3520 0,1414 0,1200 2 11 5 06_A10 299 block2 0 0 0 0 0 1 16 3 89_E7 64 block1 0 0 0 0 0 2 10 6 06_C8 322 block2 0 0 0 0 0 3 9 6 06_D5 513 block3 0 0 0 0 0 637,6221 30537,5089 1262,3412 10812,4907 17085,2224 -2,7262 0,8155 1711,2598 1440,0087 3335,8025 3051,7160 -1,4299 0,6103 1389,7221 1338,5770 6638,4780 9135,4406 -2,7537 0,1747 1022,7431 887,1709 1012,7783 120,9333 -0,0547 0,1773 3 18 5 89_B11 498 block3 0 0 0 0 0 75,9957 1123,3146 1802,0547 1070,4979 28559,8834 1291,9169 10307,4328 15807,4737 -3,6062 0,4665 561,1766 6856,1389 42,5866 1128,4209 31,8353 41,0779 878,0578 878,0578 783,9862 10327,8928 733,3058 5870,2282 95,9337 873,6230 325,6208 1684,0610 29,9473 1314,2236 291,9549 999,2224 39,2143 2128,8664 177,2349 974,3106 1331,6044 17187,1349 1 19 7 71_E1 163 block1 0 0 0 0 0 4 14 1 89_B4 590 block4 0 0 0 0 0 3 6 2 85_D11 414 block3 0 0 0 0 0 3 6 6 85_D11 510 block3 0 0 0 0 0 797,0967 1449,3592 684,3057 670,1607 664,2666 1204,3452 653,1462 945,6676 873,6074 985,1290 1104,1820 74,3853 0,0952 0,1583 303,6882 -0,3275 0,3614 842,1183 3951,4390 5522,7348 -1,5096 0,9255 825,2761 2455,2217 2958,4992 -1,3077 0,4670 1204,3452 1248,0130 1108,6604 793,8181 1047,3819 966,4727 1161,6805 787,0395 813,1360 1502,9877 1641,1876 1757,6805 204,7160 -0,5027 0,3764 555,1721 -0,3925 0,1999 177,7580 -0,6521 0,2174 174,5077 -0,2109 0,2823 328,7993 -1,2683 0,2440 1 6 4 85_G11 78 block1 0 0 0 0 0 4 3 7 85_F6 723 block4 0 0 0 0 0 3 4 8 85_H7 556 block3 0 0 0 0 0 1 4 3 85_E7 52 block1 0 0 0 0 0 3 4 7 85_F7 532 block3 0 0 0 0 0 4 4 8 85_H8 748 block4 0 0 0 0 0 3 4 3 85_F7 436 block3 0 0 0 0 0 3 20 5 71_B3 500 block3 0 0 0 0 0 223 224 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 444,5639 445,5639 482,5639 483,5639 656,5639 657,5639 0 0 0 666,5639 667,5639 0 0 0 462,5639 463,5639 0 0 0 684,5639 685,5639 0 0 0 418,5639 419,5639 0 0 0 504,5639 505,5639 0 0 0 483,5639 484,5639 593,2328 531,3098 337,2328 518,9765 512,2328 516,6432 465,2328 514,3098 548,2328 513,9765 394,2328 510,9765 382,2328 509,6432 498,2328 508,9765 382,2328 508,6432 0 0 0 558,5639 559,5639 585,2328 542,6432 0 0 0 709,5639 710,5639 453,2328 543,9765 0 0 0 542,5639 543,5639 557,2328 546,3098 0 0 0 622,5639 623,5639 487,2328 551,6432 0 0 0 606,5639 607,5639 354,2328 557,6432 0 0 0 417,5639 418,5639 533,2328 564,9765 0 0 0 521,5639 522,5639 426,2328 570,3098 173,6593 945,2603 165,5825 1052,0255 183,8968 1162,1469 67,9000 1478,9319 9,6138 1415,0640 143,6231 1519,3885 52,3966 56,1921 100,3572 636,0032 696,3521 189,3618 1016,3820 873,6230 151,7874 1329,4575 45,3381 1135,0806 140,2593 1391,4363 169,5892 945,2603 33,1183 1141,7836 138,4247 1064,2929 0 0 0 554,5639 555,5639 401,2328 572,9765 181,6513 1182,8812 0 0 0 533,5639 534,5639 422,2328 573,9765 175,4756 801,6724 0 0 0 615,5639 616,5639 567,2328 576,3098 35,5944 1817,7078 1148,8458 1022,7431 1058,6994 0 0 0 531,5639 532,5639 550,2328 579,3098 67,1823 1211,0792 0 0 0 512,5639 513,5639 465,2328 582,9765 164,6577 1121,8048 0 0 0 543,5639 544,5639 656,2328 600,6432 56,3492 755,2174 0 0 0 593,5639 594,5639 610,2328 606,6432 11,7049 1016,3820 1472,1879 0 0 0 486,5639 487,5639 713,2328 608,9765 114,4200 654,9053 1142,8891 1138,3736 0 0 0 579,5639 580,5639 573,2328 622,6432 80,1609 1775,8349 0 0 0 515,5639 516,5639 731,2328 624,9765 107,8691 808,9578 1411,8654 1440,0087 1220,2773 2166,3308 1703,3434 1881,8364 978,7227 914,4852 1134,3517 0 0 0 447,5639 448,5639 882,2328 625,3098 227,8947 1196,9032 1777,4145 1989,1555 1654,4911 0 0 0 472,5639 473,5639 731,2328 628,6432 137,3800 634,4033 832,9367 840,1526 769,1642 0 0 0 635,5639 636,5639 664,2328 631,3098 35,2431 1284,1047 1148,8458 1269,6201 1234,1902 0 0 0 491,5639 492,5639 773,2328 648,9765 143,7319 587,4284 694,4674 818,3684 700,0881 0 0 0 1035,5639 1036,5639 385,2328 659,6432 336,8396 1070,4979 832,9367 798,0764 900,5037 0 0 0 810,5639 811,5639 613,2328 673,6432 118,8497 2137,2896 1148,8458 1330,6097 1538,9150 0 0 0 767,5639 768,5639 593,2328 714,3098 105,1085 2027,8155 2516,8994 1821,4858 2122,0669 357,1589 -1,5687 0,1487 526,1166 -1,1535 0,2295 148,2476 -0,5588 0,5017 115,5725 -0,1216 0,1206 74,2644 -0,9669 0,0422 116,7621 -0,3045 0,1132 410,1811 -1,4315 0,2650 356,4910 -0,9320 0,2623 249,0313 -1,5952 0,0224 280,4432 -0,6563 0,2192 296,9776 -0,8721 0,3467 497,2230 -1,0276 0,5286 286,9996 -1,2781 0,2512 261,6973 -1,3571 0,1532 202,8630 -1,6918 0,2115 949,0204 952,4183 966,5129 973,4739 1894,6335 1600,7955 1515,8182 840,1526 1020,3330 814,4618 1590,8375 1294,7438 1852,5958 1777,9626 1681,8741 1877,7984 1187,2960 1528,1610 664,2666 832,9367 1179,2624 768,8454 820,0640 689,7051 783,1176 856,5936 1017,4127 1198,0128 1110,1159 1060,5839 1979,1422 1561,3155 1623,3051 1911,4931 1532,3410 1526,3049 1064,0091 1017,6837 1157,7097 1256,4484 848,1656 1016,6248 1179,2624 1200,2615 1173,7691 1953,7378 1262,3412 1426,7906 174,2464 -0,7801 0,3363 273,9951 -1,3020 0,3131 42,8182 -0,8134 0,3708 427,6832 -1,4224 0,1418 164,3900 -0,9187 0,3374 419,6829 -1,1782 0,5672 234,0582 -1,6126 0,2059 345,3348 -1,4963 0,4606 69,9793 -0,3458 0,1408 75,4163 -0,5603 0,1142 161,3368 -1,0256 0,3119 167,7714 -1,0432 0,0833 329,2485 -1,6787 0,6896 388,2414 -1,5418 0,2809 203,7342 -1,2007 0,1552 213,2917 -1,0259 0,1643 29,6234 -1,2072 0,0847 466,9698 -1,4748 0,6881 1735,9821 1387,9641 1293,0545 1694,8414 1379,5460 1398,7307 1727,7292 1541,9368 1493,5817 2089,6051 1692,8613 1866,7247 1694,8414 1269,6201 1382,4476 3 13 7 89_F1 541 block3 0 0 0 0 0 3 20 1 71_B3 404 block3 0 0 0 0 0 1 11 4 06_G9 83 block1 0 0 0 0 0 2 5 6 85_C10 317 block2 0 0 0 0 0 1 22 6 71_C7 142 block1 0 0 0 0 0 2 5 2 85_C10 221 block2 0 0 0 0 0 1 19 8 71_G1 187 block1 0 0 0 0 0 1 19 3 71_E1 67 block1 0 0 0 0 0 1 15 1 89_A5 15 block1 0 0 0 0 0 1 8 6 06_C3 128 block1 0 0 0 0 0 1 6 5 85_A11 102 block1 0 0 0 0 0 1 6 1 85_A11 6 block1 0 0 0 0 0 2 22 4 71_G8 286 block2 0 0 0 0 0 2 14 6 89_C4 326 block2 0 0 0 0 0 1 13 7 89_E1 157 block1 0 0 0 0 0 4 22 5 71_B8 694 block4 0 0 0 0 0 2 22 8 71_G8 382 block2 0 0 0 0 0 4 22 1 71_B8 598 block4 0 0 0 0 0 2 19 3 71_E2 259 block2 0 0 0 0 0 4 13 3 89_F2 637 block4 0 0 0 0 0 3 13 3 89_F1 445 block3 0 0 0 0 0 1 13 3 89_E1 61 block1 0 0 0 0 0 3 3 1 85_B5 387 block3 0 0 0 0 0 1 5 5 85_A9 101 block1 0 0 0 0 0 3 2 6 85_D3 506 block3 0 0 0 0 0 4 19 3 71_F2 643 block4 0 0 0 0 0 2 22 3 71_E8 262 block2 0 0 0 0 0 3 3 5 85_B5 483 block3 0 0 0 0 0 1 19 4 71_G1 91 block1 0 0 0 0 0 2 22 6 71_C8 334 block2 0 0 0 0 0 4 19 7 71_F2 739 block4 0 0 0 0 0 2 14 2 89_C4 230 block2 0 0 0 0 0 3 6 7 85_F11 534 block3 0 0 0 0 0 2 19 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 397,5639 398,5639 488,5639 489,5639 547,5639 548,5639 0 0 0 244,5730 245,5730 0 0 0 405,5639 406,5639 0 0 0 398,5639 399,5639 0 0 0 920,5639 921,5639 0 0 0 505,5639 506,5639 0 0 0 411,5639 412,5639 425,2328 462,6432 387,2328 461,9765 195,2329 460,9766 587,2328 459,3098 535,2328 456,3098 338,2328 453,3129 480,2328 452,9765 444,2328 452,6432 375,2328 450,6432 0 0 0 501,5639 502,5639 336,2328 463,3098 0 0 0 465,5639 466,5639 334,2328 463,6432 0 0 0 494,5639 495,5639 403,2328 465,9765 128,4608 0 0 0 505,5639 506,5639 498,2328 467,6432 0 0 0 462,5639 463,5639 400,2328 467,6432 0 0 0 488,5639 489,5639 386,2328 469,3098 75,3190 0 0 0 441,5639 442,5639 529,2328 472,9765 48,8300 1089,3942 945,2603 70,0882 1568,3775 59,4448 1391,4363 54,4090 1269,2299 993,6017 112,9192 1994,1486 76,9385 1759,1092 65,0277 1016,3820 399,6346 1709,0322 110,8312 1438,8764 69,2745 47,9908 88,1562 955,6530 284,3195 1108,7053 993,6017 32,5411 1519,3885 647,7455 0 0 0 478,5639 479,5639 526,2328 473,9765 54,6944 1634,2885 0 0 0 743,5639 744,5639 272,2328 474,3098 242,7402 1352,5118 0 0 0 482,5639 483,5639 348,2328 474,6432 122,6420 1901,6415 0 0 0 409,5639 410,5639 536,2328 476,3098 63,6095 910,4545 0 0 0 409,5639 410,5639 542,2328 476,9765 66,3607 848,0054 0 0 0 435,5639 436,5639 440,2328 486,6432 84,4608 746,2354 0 0 0 665,5639 666,5639 279,2328 486,6432 194,7349 1022,2006 836,1281 1083,5660 0 0 0 241,5755 242,5755 231,2328 486,9804 434,0416 1128,4209 0 0 0 448,5639 449,5639 424,2328 487,6432 89,5885 960,9243 923,2191 867,7514 0 0 0 512,5639 513,5639 471,2328 487,9765 21,7533 2297,3629 2277,3667 3149,1219 2574,6172 917,2983 980,6315 762,9854 1703,3434 1198,2499 1198,0128 1362,9331 1102,3938 1502,9877 1168,4038 1173,1323 1449,3592 1661,7055 1340,5064 2234,6388 1832,4565 1989,5790 1479,8501 1126,8613 1319,7411 1860,9896 2395,2108 1963,4963 1191,7214 1144,2359 1141,7839 948,3876 877,2091 923,6190 2636,7350 1405,0216 1870,0447 1835,8303 1788,7874 1672,0180 1096,7779 1243,1856 945,6676 1103,8918 935,8733 1057,5535 2294,4637 1093,9855 1794,1993 2499,7820 2818,9979 2359,2964 1464,5518 779,3967 1086,7768 965,9748 1138,3736 1271,1269 1185,4712 1162,2531 1101,1258 788,8109 712,8365 903,1259 828,8586 895,1795 1495,2504 1522,8088 1512,4826 729,8135 0 0 0 716,5639 717,5639 314,2328 489,9765 205,9281 1454,8462 1827,4593 867,7514 1383,3523 0 0 0 444,5639 445,5639 273,2328 492,6432 246,9851 1291,5893 1919,9315 2046,2377 1752,5862 0 0 0 462,5639 463,5639 433,2328 498,6432 89,1078 882,5406 1058,6994 1049,1278 996,7893 0 0 0 498,5639 499,5639 519,2328 502,3098 15,3956 1568,3775 2191,9367 1810,5501 1856,9548 0 0 0 535,5639 536,5639 536,2328 503,6432 55,8686 848,0054 859,4035 939,0946 882,1679 0 0 0 477,5639 478,5639 542,2328 504,9765 33,4393 1784,2031 1979,1422 2000,5333 1921,2929 0 0 0 71_E2 355 block2 0 0 0 0 0 405,5639 406,5639 451,2328 506,3098 136,8650 1052,0255 1479,8501 1307,1647 1279,6801 215,2325 -1,3566 0,1878 119,2040 -1,9280 0,0622 49,6283 -0,8134 0,1529 314,3590 -1,8731 0,2626 99,0579 -1,0090 0,2380 404,1991 -1,9267 0,8530 483,8319 -1,5148 0,5195 497,6361 -2,3835 0,3118 46,8678 -0,9257 0,2448 474,0521 -1,5772 1,7207 128,8502 -1,0914 0,7501 319,2746 -1,1478 0,4376 327,5167 -1,2690 0,3307 387,2741 -1,4564 0,2642 215,0288 -2,0959 0,2616 178,7616 -1,5915 0,6377 390,6807 -2,0386 0,2314 51,2076 -1,2754 0,1512 40,2225 -0,9889 0,1791 668,9782 -1,9535 0,2902 244,1266 -1,8354 0,3705 161,8984 -1,2408 0,1138 163,3328 -1,2172 0,2326 624,7174 -1,9161 0,1881 543,7308 -2,3353 0,3435 347,9597 -1,1957 0,3245 388,9102 -1,7636 0,8293 3 16 1 89_B7 400 block3 0 0 0 0 0 3 4 4 85_H7 460 block3 0 0 0 0 0 1 16 5 89_A7 112 block1 0 0 0 0 0 2 22 7 71_E8 358 block2 0 0 0 0 0 3 3 2 85_D5 411 block3 0 0 0 0 0 3 2 1 85_B3 386 block3 0 0 0 0 0 2 13 1 89_A2 205 block2 0 0 0 0 0 2 19 8 71_G2 379 block2 0 0 0 0 0 3 15 2 89_D5 423 block3 0 0 0 0 0 4 5 2 85_D10 605 block4 0 0 0 0 0 4 5 1 85_B10 581 block4 0 0 0 0 0 1 19 6 71_C1 139 block1 0 0 0 0 0 1 19 2 71_C1 43 block1 0 0 0 0 0 4 18 4 89_H12 666 block4 0 0 0 0 0 3 3 3 85_F5 435 block3 0 0 0 0 0 1 14 2 89_C3 38 block1 0 0 0 0 0 1 20 8 71_G3 188 block1 0 0 0 0 0 2 19 4 71_G2 283 block2 0 0 0 0 0 1 14 6 89_C3 134 block1 0 0 0 0 0 1 15 6 89_C5 135 block1 0 0 0 0 0 2 24 7 71_E12 360 block2 0 0 0 0 0 2 24 3 71_E12 264 block2 0 0 0 0 0 3 16 5 89_B7 496 block3 0 0 0 0 0 2 13 5 89_A2 301 block2 0 0 0 0 0 1 5 4 85_G9 77 block1 0 0 0 0 0 2 22 5 71_A8 310 block2 0 0 0 0 0 1 17 8 89_G9 185 block1 0 0 0 0 0 1777,4145 3585,4014 2267,2308 1154,0504 -2,2142 0,3802 126,5169 -1,2749 0,1784 4725,6440 2138,4242 2657,5912 1863,5214 -2,4818 0,2624 102,6264 -0,9820 0,3102 15,0211 -1,7429 0,0937 91,7424 -0,7060 0,4510 1 20 4 71_G3 92 block1 0 0 0 0 0 1 20 6 71_C3 140 block1 0 0 0 0 0 2 5 1 85_A10 197 block2 0 0 0 0 0 1 16 1 89_A7 16 block1 0 0 0 0 0 1 11 8 06_G9 179 block1 0 0 0 0 0 225 226 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 493,5639 494,5639 378,5639 379,5639 545,5639 546,5639 0 0 0 381,5639 382,5639 0 0 0 438,5639 439,5639 0 0 0 424,5639 425,5639 0 0 0 540,5639 541,5639 0 0 0 473,5639 474,5639 0 0 0 649,5639 650,5639 279,2328 400,9765 350,2328 399,6432 360,2328 398,9765 348,2328 396,9765 307,2328 395,9765 343,2328 394,9765 350,2328 394,6432 366,2328 393,3098 319,2328 386,3098 0 0 0 411,5639 412,5639 399,2328 402,6432 0 0 0 377,5639 378,5639 295,2328 403,6432 0 0 0 304,5639 305,5639 495,2328 405,6432 95,8523 123,5322 7,7966 215,2981 0 0 0 553,5639 554,5639 382,2328 407,9765 0 0 0 373,5639 374,5639 451,2328 409,6432 39,1266 0 0 0 324,5639 325,5639 403,2328 411,3098 91,0536 0 0 0 280,5643 281,5643 528,2328 412,9766 124,7224 694,0327 801,6724 988,0307 574,5264 864,8959 971,6169 774,1835 65,2166 1083,0489 126,7377 1064,2929 42,3356 76,8750 59,5930 637,6221 731,9714 887,0715 85,8166 1115,2328 36,7408 1422,9817 138,4879 831,8514 0 0 0 458,5639 459,5639 377,2328 413,9765 41,2290 672,3241 0 0 0 435,5639 436,5639 396,2328 414,6432 19,7854 1299,1043 0 0 0 344,5639 345,5639 476,2328 414,9765 66,3103 617,9765 633,3030 677,8627 829,7778 1069,3621 0 0 0 497,5639 498,5639 331,2328 417,9765 83,3962 848,0054 965,9748 0 0 0 1060,5639 1061,5639 129,6590 418,9784 556,5200 3022,0417 564,2770 0 0 0 404,5639 405,5639 453,2328 419,6432 29,1400 1045,9636 0 0 0 347,5639 348,5639 323,2328 419,6432 146,4226 831,8514 1064,0091 838,2114 0 0 0 428,5639 429,5639 333,2328 424,6432 89,5145 831,8514 1085,6815 894,9913 0 0 0 735,5639 736,5639 206,2328 427,3099 275,2230 1593,0239 786,1058 0 0 0 553,5639 554,5639 306,2328 429,9765 123,6656 955,6530 1744,2466 1448,9340 1382,9446 781,8873 1053,6723 937,5081 911,3573 0 0 0 474,5639 475,5639 465,2328 432,3098 65,2721 715,9598 1012,8576 1144,2359 957,6844 0 0 0 523,5639 524,5639 448,2328 433,6432 98,0332 791,0589 1048,2101 1121,2102 986,8264 0 0 0 594,5639 595,5639 338,2328 434,9765 139,2422 1360,2484 1217,1318 1093,9855 1223,7885 0 0 0 464,5639 465,5639 339,2328 440,3098 91,3964 1593,0239 1597,5780 1314,9034 1501,8351 0 0 0 468,5639 469,5639 400,2328 441,3098 36,2021 824,0445 1860,9896 799,5291 1161,5211 0 0 0 504,5639 505,5639 485,2328 442,6432 91,0232 1430,9194 1198,0128 1379,5460 1336,1594 0 0 0 513,5639 514,5639 289,2328 449,6432 139,8707 1750,7520 2149,2678 1887,7975 1929,2724 202,4693 -2,1508 0,4922 122,3649 -1,6121 0,1844 605,8815 -1,2815 0,6562 161,9036 -1,7866 0,1638 133,2562 -1,5324 0,2932 173,4242 -1,1964 0,5489 219,4041 -1,1318 0,4776 398,4168 -1,6833 0,7835 467,0969 -1,4154 0,4418 132,1484 -1,1554 0,2423 132,2386 -1,1630 0,2727 98,0639 -1,4372 0,0605 915,5583 798,0764 872,4191 889,7436 977,5169 683,1186 740,8686 804,5180 949,5172 1249,7976 1115,6286 1117,8190 1711,2598 2046,2377 1597,1607 644,0941 948,3876 903,3268 1472,1879 791,0600 985,1290 977,5169 669,8935 932,8042 961,5165 1354,7390 1095,9575 885,0091 952,4183 1169,2184 1827,4593 1810,5501 1567,4341 760,5475 1058,6523 772,9944 1063,5077 832,9367 1104,6715 818,9406 856,1579 941,5599 975,0156 1338,5770 1142,9418 1534,1727 1788,7874 1581,9806 832,9367 1035,2980 900,0287 60,8230 -1,1489 0,3635 99,8508 -0,7220 0,1337 124,3199 -1,7186 0,1492 113,9597 -0,8335 0,3388 100,2708 -1,0023 0,2812 136,0236 -1,2204 0,1231 130,8972 -1,4460 0,1656 515,6820 -1,9640 0,9233 110,5482 -0,7394 0,1546 61,6127 -1,2506 0,4629 224,1683 -1,4259 0,2923 102,8969 -1,2604 0,8734 270,3868 -1,5364 0,3978 435,8151 -1,9774 0,8787 216,5039 -1,0180 0,5261 180,7380 -1,1121 0,5892 143,8287 -1,2532 0,4163 183,3577 -1,5432 0,3797 187,5304 -2,0055 0,2491 117,1479 -1,2692 0,5804 1125,2752 1240,9636 1137,4008 932,6946 827,0564 1471,1250 1349,5444 -2,4214 0,8146 1510,7490 1291,9169 1367,2568 134,5751 1033,9847 4 18 8 89_H12 762 block4 0 0 0 0 0 1 3 8 85_G5 171 block1 0 0 0 0 0 1 5 8 85_G9 173 block1 0 0 0 0 0 4 24 4 71_H12 672 block4 0 0 0 0 0 3 5 1 85_B9 389 block3 0 0 0 0 0 1 4 1 85_A7 4 block1 0 0 0 0 0 1 4 5 85_A7 100 block1 0 0 0 0 0 3 6 3 85_F11 438 block3 0 0 0 0 0 2 7 3 06_E2 247 block2 0 0 0 0 0 4 24 2 71_D12 624 block4 0 0 0 0 0 4 24 6 71_D12 720 block4 0 0 0 0 0 1 23 7 71_E9 167 block1 0 0 0 0 0 3 7 8 06_H1 559 block3 0 0 0 0 0 3 10 6 06_D7 514 block3 0 0 0 0 0 3 5 8 85_H9 557 block3 0 0 0 0 0 1 15 2 89_C5 39 block1 0 0 0 0 0 4 3 3 85_F6 627 block4 0 0 0 0 0 2 5 5 85_A10 293 block2 0 0 0 0 0 2 22 2 71_C8 238 block2 0 0 0 0 0 1 23 3 71_E9 71 block1 0 0 0 0 0 1 3 6 85_C5 123 block1 0 0 0 0 0 3 5 4 85_H9 461 block3 0 0 0 0 0 4 19 2 71_D2 619 block4 0 0 0 0 0 3 19 7 71_F1 547 block3 0 0 0 0 0 3 9 3 06_F5 441 block3 0 0 0 0 0 1 3 4 85_G5 75 block1 0 0 0 0 0 1 3 2 85_C5 27 block1 0 0 0 0 0 4 12 1 06_B12 588 block4 0 0 0 0 0 4 5 6 85_D10 701 block4 0 0 0 0 0 4 19 6 71_D2 715 block4 0 0 0 0 0 3 5 5 85_B9 485 block3 0 0 0 0 0 4 13 6 89_D2 709 block4 0 0 0 0 0 3 10 2 06_D7 418 block3 0 0 0 0 0 4 12 5 06_B12 684 block4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 360,5639 361,5639 431,5639 432,5639 245,5723 246,5723 0 0 0 328,5639 329,5639 0 0 0 285,5641 286,5641 0 0 0 289,5641 290,5641 0 0 0 421,5639 422,5639 0 0 0 377,5639 378,5639 0 0 0 247,5711 248,5711 413,2328 348,6456 272,2328 344,6432 337,2328 343,3098 332,2328 342,3099 360,2328 340,6433 285,2328 338,9765 294,2328 337,6432 285,2328 337,6432 394,2328 336,6460 0 0 0 425,5639 426,5639 315,2328 348,9765 0 0 0 431,5639 432,5639 277,2328 350,3098 0 0 0 366,5639 367,5639 341,2328 350,6432 77,4898 66,4825 88,6535 75,3994 58,4397 0 0 0 323,5639 324,5639 394,2328 353,9765 36,3483 0 0 0 584,5639 585,5639 156,2619 354,6529 215,8837 0 0 0 389,5639 390,5639 363,2328 354,9765 0 0 0 365,5639 366,5639 383,2328 355,6432 33,6648 971,6169 784,1885 977,0382 749,1933 694,0327 864,8959 62,7952 1399,2907 682,8494 900,9548 48,3579 1446,8522 59,6358 1211,0792 37,6141 1232,6220 81,5201 79,7873 824,0445 644,2910 39,3702 1792,5747 0 0 0 415,5639 416,5639 270,2328 358,3098 77,4133 1759,1092 0 0 0 528,5639 529,5639 264,2328 360,3098 146,2015 749,1933 0 0 0 378,5639 379,5639 309,2328 361,9765 46,7136 1284,1047 939,8381 0 0 0 285,5641 286,5641 353,2328 362,9766 82,7159 925,0735 0 0 0 254,5680 255,5680 420,2328 363,3112 94,2089 856,3575 0 0 0 113,8708 114,8708 165,2428 363,4155 388,5845 882,5406 0 0 0 427,5639 428,5639 273,2328 366,9765 82,3349 755,2174 832,9367 810,1905 0 0 0 356,5639 357,5639 373,2328 367,6432 9,5951 1004,8928 0 0 0 364,5639 365,5639 249,2328 368,6432 121,5014 1527,5223 0 0 0 344,5639 345,5639 333,2328 369,3098 52,9781 1399,2907 1605,5918 1620,8815 1541,9213 1886,2128 1682,4270 1698,7207 1256,4484 1580,9376 1280,7596 799,4482 0 0 0 340,5639 341,5639 366,2328 369,6432 30,9258 1083,0489 1223,5856 1338,5770 1215,0705 0 0 0 318,5639 319,5639 421,2328 370,3098 51,3394 805,2939 1017,7789 1255,1389 1026,0706 0 0 0 348,5639 349,5639 344,2328 370,6432 42,0491 1352,5118 1573,6497 1541,9368 1489,3661 0 0 0 334,5639 335,5639 367,2328 375,3098 45,3275 1004,8928 1389,7221 1641,1876 1345,2675 0 0 0 387,5639 388,5639 399,2328 377,3098 28,4703 1478,9319 1844,2092 2150,0077 1824,3830 0 0 0 361,5639 362,5639 257,2328 378,3098 130,2599 1910,0451 1670,3160 1200,2615 1593,5409 0 0 0 0 0 0 0 404,5639 405,5639 317,2328 381,3098 56,1834 615,2066 826,6513 1099,2949 847,0509 242,6880 -1,1224 0,6087 361,0665 -2,1059 0,3676 335,9769 -2,2596 0,2837 320,4683 -1,8196 0,3014 119,5753 -2,0094 0,1354 225,0371 -1,4562 0,1186 127,9767 -1,7148 0,1380 123,7581 -2,0681 0,1951 179,8995 -2,2534 0,4391 288,7909 -1,7763 0,2947 39,9577 -1,1489 0,3819 164,6560 -1,5195 0,2279 166,5990 -1,6343 0,1622 295,0714 -2,1389 0,4207 4 24 8 71_H12 768 block4 0 0 0 0 0 1 13 4 89_G1 85 block1 0 0 0 0 0 2 13 8 89_G2 373 block2 0 0 0 0 0 1 17 4 89_G9 89 block1 0 0 0 0 0 2 6 3 85_E12 246 block2 0 0 0 0 0 2 20 2 71_C4 236 block2 0 0 0 0 0 4 13 2 89_D2 613 block4 0 0 0 0 0 3 15 1 89_B5 399 block3 0 0 0 0 0 2 16 6 89_C8 328 block2 0 0 0 0 0 2 7 7 06_E2 343 block2 0 0 0 0 0 4 14 2 89_D4 614 block4 0 0 0 0 0 2765,1444 1213,5265 1620,4038 1005,0926 -2,5334 0,6628 1185,4712 1030,8073 1024,2120 1230,0793 1193,7414 1116,2981 1662,1698 1865,5675 1603,9473 897,6672 862,2329 2174,8647 1777,9626 1903,9788 1027,7503 1121,2102 1040,1925 2226,0961 1943,8615 1987,5108 998,3495 757,2656 846,6012 1080,1984 1641,1876 1232,8081 2209,0140 2173,2085 2016,5552 627,6875 621,2802 818,3684 827,0564 731,7498 714,1231 1069,3621 1255,1389 1063,1323 1597,5780 1735,0649 1577,3112 1003,1430 1078,4548 921,4824 1113,7469 1115,6286 1043,4435 1332,0731 2184,8248 1654,5834 1263,1377 1255,1389 1243,1186 1136,9751 1150,1697 1173,2556 1053,4331 1039,8479 783,4288 1269,6201 972,4418 899,1133 2 6 7 85_E12 342 block2 0 0 0 0 0 2 20 6 71_C4 332 block2 0 0 0 0 0 4 3 6 85_D6 699 block4 0 0 0 0 0 3 9 7 06_F5 537 block3 0 0 0 0 0 100,1402 -1,3244 0,7118 234,7834 -2,4274 0,3217 75,5688 -1,5503 0,1408 220,0322 -2,4854 0,3211 132,1056 -1,4427 0,9402 357,4085 -1,7674 0,2529 302,8695 -2,5130 0,2836 96,5298 -1,0776 0,4211 104,3488 -1,0394 0,3433 195,1960 -1,6269 0,1670 168,8021 -2,2061 0,4121 210,0648 -1,4201 0,6360 123,4024 -1,6147 0,1457 462,7748 -2,2553 0,3951 28,0337 -1,8891 0,2451 51,8344 -1,8023 0,1522 128,6952 -1,5434 0,5288 328,3235 -1,3869 0,3028 4 1 6 85_D2 697 block4 0 0 0 0 0 1 21 8 71_G5 189 block1 0 0 0 0 0 1 13 8 89_G1 181 block1 0 0 0 0 0 3 10 7 06_F7 538 block3 0 0 0 0 0 2 13 4 89_G2 277 block2 0 0 0 0 0 3 15 5 89_B5 495 block3 0 0 0 0 0 13,8638 1667,4431 4 1 5 85_B2 673 block4 0 0 0 0 0 4 1 1 85_B2 577 block4 0 0 0 0 0 2 23 1 71_A10 215 block2 0 0 0 0 0 4 3 2 85_D6 603 block4 0 0 0 0 0 2 8 7 06_E4 344 block2 0 0 0 0 0 2 23 5 71_A10 311 block2 0 0 0 0 0 3 19 5 71_B1 499 block3 0 0 0 0 0 2 14 8 89_G4 374 block2 0 0 0 0 0 3 21 1 71_B5 405 block3 0 0 0 0 0 3 11 5 06_B9 491 block3 0 0 0 0 0 3 19 3 71_F1 451 block3 0 0 0 0 0 227 228 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 137,7826 138,7826 313,5639 314,5639 274,5646 275,5646 0 0 0 304,5639 305,5639 0 0 0 322,5639 323,5639 0 0 0 312,5639 313,5639 0 0 0 129,8960 130,8960 0 0 0 375,5639 376,5639 0 0 0 329,5639 330,5639 282,2328 308,9765 283,2328 307,9765 147,3104 306,7798 320,2328 306,6432 277,2328 306,6432 304,2328 303,9765 156,2619 302,3925 204,2328 302,3099 294,2328 301,6434 0 0 0 243,5738 244,5738 282,2328 310,9798 0 0 0 430,5639 431,5639 248,2328 311,6432 0 0 0 226,5994 227,5994 325,2328 311,9883 79,5975 103,0641 0 0 0 328,5639 329,5639 260,2328 313,3098 0 0 0 254,5680 255,5680 331,2328 313,3112 0 0 0 388,5639 389,5639 216,2328 313,6432 88,3394 0 0 0 258,5668 259,5668 307,2328 316,9775 63,8433 764,5299 752,1872 0 0 0 357,5639 358,5639 301,2328 320,6432 31,9884 873,6230 0 0 0 258,5668 259,5668 381,2328 322,3108 61,4750 864,8959 0 0 0 224,6048 225,6048 366,2328 322,3235 84,7715 662,4152 935,6237 0 0 0 317,5639 318,5639 231,2328 324,6432 97,1437 2036,2339 0 0 0 357,5639 358,5639 243,2328 325,3098 71,6216 1004,8928 0 0 0 303,5639 304,5639 356,2328 325,3099 27,5075 1182,8812 0 0 0 280,5643 281,5643 332,2328 325,9766 42,6300 1064,2929 0 0 0 462,5639 463,5639 260,2328 326,3098 118,0173 812,6644 1032,8005 1115,6286 0 0 0 307,5639 308,5639 240,2328 326,6432 97,3623 770,9271 1048,2101 844,1088 0 0 0 592,5639 593,5639 155,2654 327,3207 233,0675 774,1835 817,4622 879,6512 823,7656 887,7487 987,0312 0 0 0 266,5653 267,5653 359,2328 327,9770 53,1869 812,6644 829,7778 1000,9747 881,1390 0 0 0 275,5645 276,5645 269,2328 329,9767 99,7784 698,6998 873,4639 811,7871 794,6503 0 0 0 356,5639 357,5639 292,2328 330,6432 33,9355 1717,3667 2166,3308 1541,9368 1808,5448 0 0 0 356,5639 357,5639 208,2328 330,9765 112,1608 2010,9807 2098,1221 1921,3567 2010,1531 0 0 0 365,5639 366,5639 245,2328 334,9765 79,0221 1360,2484 1210,7182 1200,2615 1257,0760 0 0 0 294,5640 295,5640 408,2328 335,6432 63,0462 1115,2328 1694,8414 1661,7055 1490,5932 0 0 0 444,5639 445,5639 279,2328 335,9765 94,0713 1052,0255 891,8499 977,5169 973,7974 80,1525 -1,5669 0,2916 325,4936 -2,1414 0,2965 89,5027 -1,9353 0,3378 88,3856 -2,6648 0,4794 322,0280 -2,4420 0,1987 88,6333 -1,3023 0,3118 104,1329 -1,4329 0,2018 53,0156 -1,5639 1,0784 143,7003 -1,4724 0,2959 156,5821 -1,6415 0,7189 280,8875 -2,0053 0,2506 227,0140 -1,9983 0,1284 141,1417 -1,7773 0,3003 347,5795 -2,8057 0,2676 929,5579 842,5323 156,0155 -1,4063 0,1342 383,4135 -1,9345 0,1794 131,0400 -1,6655 0,3299 998,3495 1058,6994 1670,3160 674,3785 910,4545 85,4850 1135,0806 24,2587 1634,2885 59,2279 1155,3172 291,4204 812,6644 17,3261 1189,8726 25,4991 2112,0208 0,7492 1218,2236 269,2677 92,9623 905,6801 805,2939 31,4460 1344,8008 770,4530 989,0117 905,9097 917,2971 905,5988 1785,7322 1703,3434 1513,7004 830,6832 1223,3390 1678,4770 1180,9248 1177,9268 914,4852 865,1309 1353,4442 1088,7427 1192,4225 1637,8231 1600,7955 1624,3024 1397,0728 955,8619 1169,4173 1136,9751 1440,0087 1255,6188 2166,3308 2150,0077 2142,7864 1404,4540 1362,9331 1328,5369 1495,2504 1220,2720 1207,0675 707,1281 846,1245 786,1822 1375,1146 1269,6201 1329,8452 132,3826 -1,5416 0,1574 153,2563 -1,5583 0,5632 401,9387 -2,2479 0,1745 422,4440 -1,9185 0,2976 502,0559 -1,8538 0,2771 82,0182 -1,5168 0,4053 141,3605 -1,9670 0,2442 20,4341 -2,3972 0,0984 220,9431 -1,9245 0,4151 5461,9028 1144,2359 2472,9344 2593,8262 -2,8963 0,2267 161,8619 -2,0276 0,1256 27,8658 -2,8082 0,1295 97,7638 -2,1251 0,1111 295,0069 -2,3226 0,9062 71,4419 -1,4244 0,5970 54,3141 -2,1447 0,1334 1276,6305 1620,8815 1320,6016 1173,0951 1571,0966 1309,0243 1263,1377 1035,2980 1101,1095 2619,6145 2000,5333 2218,7939 1276,6305 1631,0075 1257,5113 1058,6994 1126,8613 1019,7279 52,1458 1052,0255 47,3310 1169,0178 3 10 1 06_B7 394 block3 0 0 0 0 0 1 16 4 89_G7 88 block1 0 0 0 0 0 3 21 5 71_B5 501 block3 0 0 0 0 0 3 14 1 89_B3 398 block3 0 0 0 0 0 2 1 4 85_G2 265 block2 0 0 0 0 0 4 5 5 85_B10 677 block4 0 0 0 0 0 2 1 3 85_E2 241 block2 0 0 0 0 0 3 10 3 06_F7 442 block3 0 0 0 0 0 4 20 4 71_H4 668 block4 0 0 0 0 0 3 11 1 06_B9 395 block3 0 0 0 0 0 2 14 4 89_G4 278 block2 0 0 0 0 0 2 18 1 89_A12 210 block2 0 0 0 0 0 2 16 2 89_C8 232 block2 0 0 0 0 0 3 13 2 89_D1 421 block3 0 0 0 0 0 2 1 7 85_E2 337 block2 0 0 0 0 0 2 9 5 06_A6 297 block2 0 0 0 0 0 2 9 1 06_A6 201 block2 0 0 0 0 0 4 23 2 71_D10 623 block4 0 0 0 0 0 3 10 5 06_B7 490 block3 0 0 0 0 0 3 19 1 71_B1 403 block3 0 0 0 0 0 2 4 8 85_G8 364 block2 0 0 0 0 0 2 1 8 85_G2 361 block2 0 0 0 0 0 4 6 6 85_D12 702 block4 0 0 0 0 0 4 24 1 71_B12 600 block4 0 0 0 0 0 3 23 1 71_B9 407 block3 0 0 0 0 0 1 2 1 85_A3 2 block1 0 0 0 0 0 1 22 7 71_E7 166 block1 0 0 0 0 0 2 18 5 89_A12 306 block2 0 0 0 0 0 3 14 6 89_D3 518 block3 0 0 0 0 0 1 24 8 71_G11 192 block1 0 0 0 0 0 4 17 1 89_B10 593 block4 0 0 0 0 0 4 20 8 71_H4 764 block4 0 0 0 0 0 3 23 6 71_D9 527 block3 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 271,5648 272,5648 284,5642 285,5642 308,5639 309,5639 0 0 0 301,5639 302,5639 0 0 0 276,5645 277,5645 0 0 0 251,5691 252,5691 0 0 0 319,5639 320,5639 0 0 0 288,5641 289,5641 0 0 0 276,5645 277,5645 354,2328 278,6435 211,2328 276,9766 220,2328 276,9765 251,2328 274,6449 247,2328 274,6434 225,2328 274,6432 178,2346 274,3108 263,2328 274,3099 294,2328 273,3099 0 0 0 321,5639 322,5639 217,2328 278,9765 0 0 0 369,5639 370,5639 181,2340 280,9769 0 0 0 336,5639 337,5639 225,2328 281,3098 0 0 0 274,5646 275,5646 292,2328 281,3101 9,5461 0 0 0 228,5946 229,5946 294,2328 283,3201 0 0 0 341,5639 342,5639 206,2328 283,9765 0 0 0 321,5639 322,5639 300,2328 284,3098 47,2715 780,8138 69,8809 1935,2643 50,1673 1016,3820 721,1676 55,6701 1952,0833 94,6593 1383,6043 54,7400 1052,0255 74,5715 1454,8462 60,7841 1329,4575 51,1563 1609,5035 40,2601 4092,2183 26,5023 97,4781 49,1755 966,2456 42,8480 2010,9807 827,9257 10,6895 1028,0682 749,1933 0 0 0 312,5639 313,5639 272,2328 285,3099 23,6091 1175,9294 0 0 0 178,2970 179,2970 266,2328 285,8876 118,6453 640,9173 0 0 0 333,5639 334,5639 320,2328 287,9766 67,7432 731,9714 0 0 0 337,5639 338,5639 195,2329 288,3099 80,6527 1247,1628 1534,1727 0 0 0 268,5651 269,5651 288,2328 289,3103 21,3043 1135,0806 0 0 0 308,5639 309,5639 282,2328 290,3099 15,8433 1232,6220 1819,0964 0 0 0 129,8960 130,8960 113,8015 290,6101 292,4140 1039,9499 0 0 0 313,5639 314,5639 235,2328 290,6432 48,2247 1430,9194 0 0 0 391,5639 392,5639 248,2328 293,6432 84,8761 1058,1353 794,3061 832,5304 0 0 0 292,5640 293,5640 216,2328 293,6432 77,9556 808,9578 1108,0474 917,4203 944,8085 894,9906 0 0 0 430,5639 431,5639 245,2328 295,3099 118,4408 1291,5893 1694,8414 2011,9312 1666,1206 0 0 0 315,5639 316,5639 185,2335 295,9767 102,3650 891,6507 1191,7214 903,1259 995,4993 0 0 0 282,5642 283,5642 244,2328 296,6433 60,6875 960,9243 1108,0474 970,1051 1013,0256 0 0 0 166,8955 167,8955 110,2785 297,1023 276,0121 1383,6043 3133,2703 0 0 0 354,5639 355,5639 267,2328 298,6432 48,5515 900,9548 760,5475 932,6946 864,7323 0 0 0 365,5639 366,5639 289,2328 300,6432 60,0344 749,1933 852,5835 1156,1752 919,3173 0 0 0 4 4 85_G8 268 block2 0 0 0 0 0 314,5639 315,5639 225,2328 301,3098 70,3922 1478,9319 1565,7127 945,6676 1330,1041 335,7473 -2,1358 0,0860 211,5387 -1,6069 0,5064 91,6117 -1,5403 0,2364 82,4192 -1,7884 0,1912 170,0301 -1,8021 0,4233 361,0288 -2,5443 0,8310 151,4141 -1,7088 0,3301 142,5743 -1,6333 0,1729 62,3887 -2,3091 0,1953 278,4337 -2,2158 1,7832 499,5934 -2,0817 0,5801 47,4039 -1,9900 0,1369 317,3665 -2,0995 0,1854 288,3283 -1,8706 0,7308 2 8 3 06_E4 248 block2 0 0 0 0 0 4 6 2 85_D12 606 block4 0 0 0 0 0 2 3 8 85_G6 363 block2 0 0 0 0 0 800,9989 1772,6245 1213,8266 -2,7544 0,3621 2 20 8 71_G4 380 block2 0 0 0 0 0 4 24 7 71_F12 744 block4 0 0 0 0 0 3 3 6 85_D5 507 block3 0 0 0 0 0 4 24 3 71_F12 648 block4 0 0 0 0 0 1 2 5 85_A3 98 block1 0 0 0 0 0 3 23 5 71_B9 503 block3 0 0 0 0 0 1487,5378 1362,9331 1427,1301 709,0115 1262,3412 1003,7675 825,2761 1292,3315 900,3786 1227,2380 797,5226 966,4727 1010,2399 1565,7127 1379,5460 1626,8410 1375,1146 1641,1876 1344,2281 935,6237 1276,9757 977,9223 2456,9918 2092,2157 2167,0969 1263,1377 1126,8613 1257,8678 694,4674 935,8733 894,1220 823,5567 1068,4262 1115,6097 797,0967 1000,9747 1042,5096 2388,5407 2092,2157 2030,0866 1325,0179 1541,9368 1277,7335 2439,8772 2795,4226 2415,4268 1108,0474 894,9913 943,6548 952,7231 1138,3736 1039,7216 1160,8862 1240,9636 1050,3477 1108,0474 1200,2615 1147,7965 1269,8651 1180,9248 1060,9204 673,1959 1078,4548 1283,4333 1332,0731 1354,7390 1287,5805 3 14 4 89_H3 470 block3 0 0 0 0 0 1 6 3 85_E11 54 block1 0 0 0 0 0 2 19 2 71_C2 235 block2 0 0 0 0 0 3 23 2 71_D9 431 block3 0 0 0 0 0 1 5 3 85_E9 53 block1 0 0 0 0 0 4 2 5 85_B4 674 block4 0 0 0 0 0 243,8291 -1,5228 0,7140 97,3546 -2,1744 0,2278 254,1520 -1,8132 0,6067 282,8572 -2,5361 0,1912 313,5458 -2,2346 0,2161 280,3080 -1,7587 0,3672 260,6502 -2,9580 0,3684 128,4526 -2,2177 0,3771 182,3988 -1,6790 0,4444 318,2787 -1,9977 0,4013 268,5998 -1,9052 0,5528 393,2172 -2,8722 0,4793 3 22 2 71_D7 430 block3 0 0 0 0 0 1 5 7 85_E9 149 block1 0 0 0 0 0 3 20 3 71_F3 452 block3 0 0 0 0 0 2 15 7 89_E6 351 block2 0 0 0 0 0 1 21 4 71_G5 93 block1 0 0 0 0 0 3 13 6 89_D1 517 block3 0 0 0 0 0 3 22 6 71_D7 526 block3 0 0 0 0 0 4 2 2 85_D4 602 block4 0 0 0 0 0 2 1 6 85_C2 313 block2 0 0 0 0 0 4 5 8 85_H10 749 block4 0 0 0 0 0 4 1 2 85_D2 601 block4 0 0 0 0 0 2 20 4 71_G4 284 block2 0 0 0 0 0 1179,2624 1314,9034 2195,4613 1644,0392 -2,7628 1,1216 290,7438 -2,1960 0,4206 392,7921 -3,1362 0,4562 146,2639 -1,8355 0,4270 93,3723 -1,9192 0,1702 263,8628 -1,9249 0,5843 2 15 3 89_E6 255 block2 0 0 0 0 0 3 14 5 89_B3 494 block3 0 0 0 0 0 4 20 2 71_D4 620 block4 0 0 0 0 0 2 24 8 71_G12 384 block2 0 0 0 0 0 1 4 6 85_C7 124 block1 0 0 0 0 0 229 230 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 90,1834 0 0 0 301,5639 302,5639 91,1834 270,5649 271,5649 0 0 0 293,5640 294,5640 0 0 0 329,5639 330,5639 0 0 0 338,5639 339,5639 0 0 0 245,5723 246,5723 0 0 0 224,6048 225,6048 0 0 0 310,5639 311,5639 255,2328 252,3107 273,2328 250,6568 161,2491 249,9848 252,2328 249,0107 204,2328 246,6433 220,2328 246,6432 207,2328 246,3099 528,2328 246,1334 186,2334 245,3104 0 0 0 281,5643 282,5643 213,2328 256,9766 0 0 0 334,5639 335,5639 196,2329 257,3099 0 0 0 273,5647 274,5647 181,2340 258,6438 70,5701 59,7679 24,4996 91,0221 91,2070 71,8176 40,7415 244,7592 0 0 0 323,5639 324,5639 122,9877 258,8948 117,7448 0 0 0 239,5774 240,5774 247,2328 259,3143 0 0 0 233,5852 234,5852 233,2328 259,3169 44,8743 0 0 0 291,5640 292,5640 197,2329 259,6433 54,0537 1076,7500 856,3575 672,3241 966,2456 37,9805 1291,5893 710,8773 988,0307 891,6507 708,3821 752,1872 701,0764 49,2023 1108,7053 808,9578 51,3412 1239,8749 27,8202 1314,2236 71,1329 1083,0489 0 0 0 439,5639 440,5639 191,2331 259,7128 157,2252 887,0715 0 0 0 360,5639 361,5639 174,2359 259,9776 94,0468 715,9598 0 0 0 596,5639 597,5639 96,6222 260,9378 290,6817 4286,0298 877,0681 0 0 0 252,5687 253,5687 317,2328 260,9782 52,5569 646,0080 0 0 0 266,5653 267,5653 216,2328 261,6437 43,1610 835,8219 0 0 0 225,6020 226,6020 299,2328 263,6559 36,8778 1070,4979 1053,4331 1058,6523 0 0 0 210,6699 211,6699 192,2330 263,6786 108,1741 835,8219 1142,8891 970,1051 0 0 0 302,5639 303,5639 266,2328 264,3099 39,2509 3460,2242 0 0 0 225,6020 226,6020 271,2328 264,3225 35,7696 685,0321 903,3268 973,7863 0 0 0 260,5663 261,5663 136,4616 264,3869 129,8778 1045,9636 1154,8448 818,3684 1006,3923 854,0484 982,9387 982,6358 0 0 0 305,5639 306,5639 229,2328 265,3099 38,3366 1617,7568 823,5567 989,0117 1143,4417 0 0 0 291,5640 292,5640 188,2332 266,6434 69,3913 1352,5118 1526,3420 1541,9368 1473,5969 0 0 0 289,5641 290,5641 186,2334 266,6434 71,7501 713,4031 657,2157 807,0539 725,8909 0 0 0 269,5650 270,5650 255,2328 266,9769 10,6877 1368,0097 2098,1221 1600,7955 1688,9757 0 0 0 368,5639 369,5639 212,2328 268,6432 86,7739 882,5406 1269,8651 1138,3736 1096,9265 0 0 0 301,5639 302,5639 206,2328 270,9765 56,0981 1095,7857 1317,9976 1291,9169 1235,2334 0 0 0 233,5852 234,5852 281,2328 271,3169 33,8802 1148,5293 1621,6731 1431,1542 1400,4522 238,0614 -2,3612 0,0715 121,4673 -2,2065 0,4015 196,9606 -2,0596 0,6937 372,9582 -2,6393 0,2913 75,6957 -1,4787 0,5691 105,1522 -2,5004 0,4627 419,0166 -2,0569 0,3764 171,6931 -2,0443 0,5214 150,5524 -1,6852 0,1377 317,4400 -3,8505 0,2998 153,9354 -1,9605 0,3894 349,9261 -2,4541 0,2326 127,1713 -1,9140 0,3358 349,2569 -1,9595 0,5778 800,9989 798,0089 80,5958 -1,6765 0,6217 186,5799 -2,1358 0,9724 1142,8891 1193,7414 1137,7935 1154,8448 823,5567 966,4727 750,5609 992,5583 1526,3420 1590,8375 1477,1344 748,8139 1339,1629 1200,2615 1207,4911 1472,1879 1330,6097 1256,3477 1970,6697 1322,7184 1528,3258 839,3523 1068,4262 1204,3452 872,8853 1419,3066 1580,9376 1329,4249 970,1051 1022,0336 826,6513 1132,5822 1027,7503 1200,2615 899,4635 1053,8592 889,2052 993,3997 884,7997 1472,1879 1590,8375 1390,5769 1510,7490 1631,0075 1460,5438 58,6619 -2,1534 0,3874 150,9438 -1,9391 0,0973 144,7234 -2,5106 0,1552 75,6314 -1,6611 0,8318 128,2100 -2,2576 0,4086 261,0183 -2,3005 0,6715 383,3971 -2,5553 0,3258 181,1178 -1,7983 0,5239 306,5023 -2,3838 0,2151 162,6865 -2,0869 0,4354 218,9091 -1,8785 0,7143 226,0036 -2,0211 0,7290 176,8480 -1,8355 0,5193 251,2133 -2,4987 0,5531 1058,6994 3054,7938 1640,8170 1230,8901 -2,9461 0,3590 200,3412 -2,5877 0,4853 3826,7233 4092,4317 3793,1264 1735,9821 1590,8375 1465,7725 1210,7182 1284,4080 1047,0447 1375,1146 2150,0077 2603,7174 1507,5630 -3,7534 0,8312 961,5165 1240,9636 1029,8505 2 24 1 71_A12 216 block2 0 0 0 0 0 3 23 7 71_F9 551 block3 0 0 0 0 0 1 11 2 06_C9 35 block1 0 0 0 0 0 2 1 2 85_C2 217 block2 0 0 0 0 0 4 2 1 85_B4 578 block4 0 0 0 0 0 3 20 7 71_F3 548 block3 0 0 0 0 0 4 5 4 85_H10 653 block4 0 0 0 0 0 4 24 5 71_B12 696 block4 0 0 0 0 0 4 10 8 06_H8 754 block4 0 0 0 0 0 1 13 1 89_A1 13 block1 0 0 0 0 0 4 20 6 71_D4 716 block4 0 0 0 0 0 1 16 6 89_C7 136 block1 0 0 0 0 0 2 20 3 71_E4 260 block2 0 0 0 0 0 1 4 2 85_C7 28 block1 0 0 0 0 0 1 17 1 89_A9 17 block1 0 0 0 0 0 3 10 4 06_H7 466 block3 0 0 0 0 0 1 18 4 89_G11 90 block1 0 0 0 0 0 3 24 3 71_F11 456 block3 0 0 0 0 0 2 19 6 71_C2 331 block2 0 0 0 0 0 2 24 5 71_A12 312 block2 0 0 0 0 0 3 10 8 06_H7 562 block3 0 0 0 0 0 3 24 7 71_F11 552 block3 0 0 0 0 0 4 11 2 06_D10 611 block4 0 0 0 0 0 1 14 8 89_G3 182 block1 0 0 0 0 0 1 1 3 85_E1 49 block1 0 0 0 0 0 1 16 2 89_C7 40 block1 0 0 0 0 0 4 22 4 71_H8 670 block4 0 0 0 0 0 2 8 2 06_C4 224 block2 0 0 0 0 0 2 8 6 06_C4 320 block2 0 0 0 0 0 1 1 7 85_E1 145 block1 0 0 0 0 0 3 4 5 85_B7 484 block3 0 0 0 0 0 4 15 3 89_F6 639 block4 0 0 0 0 0 2 16 7 89_E8 352 block2 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 359,5639 360,5639 187,0156 188,0156 263,5658 264,5658 0 0 0 206,7011 207,7011 0 0 0 278,5644 279,5644 0 0 0 277,5644 278,5644 0 0 0 249,5700 250,5700 0 0 0 253,5683 254,5683 0 0 0 202,7402 203,7402 210,2328 229,0353 234,2328 228,6450 200,2329 227,9786 208,2328 226,9772 227,2328 225,9837 239,2328 225,0222 133,5334 224,7460 174,2359 224,1281 174,2359 223,3115 0 0 0 265,5655 266,5655 173,2364 229,3116 0 0 0 158,5737 159,5737 196,2329 229,6465 0 0 0 248,5705 249,5705 152,2783 230,6606 92,4262 49,2527 39,2349 28,1365 25,2378 53,2162 0 0 0 279,5643 280,5643 198,2329 230,9767 0 0 0 203,7296 204,7296 267,2328 232,3651 32,2070 0 0 0 275,5645 276,5645 210,2328 232,9768 0 0 0 317,5639 318,5639 171,2375 232,9781 75,7910 1291,5893 36,9106 3064,1746 960,9243 42,9182 1399,2907 71,1388 1247,1628 626,6772 977,0382 680,6931 843,8986 999,2224 44,2967 1058,1353 945,2603 16,6509 1162,1469 119,1575 1102,2228 75,6188 1089,3942 45,3135 1141,7836 0 0 0 201,7515 202,7515 186,2334 233,0392 68,0747 864,8959 0 0 0 203,7296 204,7296 218,2328 233,6984 40,0100 698,6998 0 0 0 328,5639 329,5639 136,4616 235,0528 96,1518 1076,7500 895,6379 1074,7586 0 0 0 303,5639 304,5639 174,2359 235,3109 64,9621 1446,8522 0 0 0 355,5639 356,5639 150,2893 235,9955 106,7445 852,1583 0 0 0 87,3598 88,3598 75,2215 238,2381 271,9086 1102,2228 0 0 0 237,5796 238,5796 273,2328 238,6486 34,0623 691,7413 0 0 0 181,1899 182,1899 247,2328 238,8519 53,9618 896,2784 0 0 0 253,5683 254,5683 248,2328 239,6447 19,6774 1314,2236 0 0 0 284,5642 285,5642 265,2328 240,3177 60,6705 780,8138 1148,8458 1126,8613 1018,8403 1760,8093 2011,9312 1695,6547 1096,7779 1338,5770 1110,5444 1353,4442 1150,1697 1065,1184 692,7309 1307,1647 1034,0395 1589,5828 1213,5265 1218,4225 1479,8501 1126,8613 1351,1879 1154,8448 1009,2187 1080,2712 844,1088 973,7863 812,8155 971,1469 1694,8414 1440,0087 1475,4798 3929,4571 4328,2598 3773,9638 1510,7490 1799,6503 1423,7745 1464,5518 1346,6202 1403,4876 1404,4540 1138,3736 1263,3301 735,3371 889,7436 1204,3452 1073,4084 750,5860 1043,0303 1187,2960 1069,1215 986,1489 1249,7976 1494,6014 1196,0992 1236,6128 1144,2359 1126,6904 1979,1422 1503,9382 1513,7386 2089,6051 1269,6201 1434,8285 1449,3592 1213,5265 1275,0109 2004,5838 1610,8105 1572,5390 1464,5518 996,9339 1183,6266 1003,1430 1255,1389 1133,3551 0 0 0 425,5639 426,5639 126,7807 240,8345 161,4439 891,6507 1091,2081 1035,2980 1006,0522 0 0 0 312,5639 313,5639 207,2328 242,3100 60,8417 1203,9722 1230,0793 1233,9904 1222,6806 0 0 0 293,5640 294,5640 193,2330 242,6433 50,1826 1135,0806 2089,6051 1494,6014 1573,0957 0 0 0 352,5639 353,5639 167,2406 243,3125 97,0146 1203,9722 899,4635 1200,2615 1101,2324 0 0 0 215,6400 216,6400 199,2329 243,3353 62,7174 820,2075 1311,0126 1291,9169 1141,0457 0 0 0 220,6180 221,6180 255,2328 243,9946 20,2497 1560,1831 2021,5634 2000,5333 1860,7599 0 0 0 5 7 85_E10 341 block2 0 0 0 0 0 228,5946 229,5946 211,2328 244,3201 43,1552 1115,2328 1397,0728 914,4852 1142,2636 242,4267 -2,2178 0,0913 260,5195 -2,9244 0,0887 278,0180 -2,2270 0,4121 174,7468 -2,2377 0,5493 482,0791 -2,6726 0,6302 16,3196 -2,3632 0,3617 102,9431 -2,2592 1,0470 206,4298 -2,0967 0,6453 353,3876 -2,8041 0,3726 221,4705 -2,2239 0,2640 338,9513 -2,1125 0,5910 312,8401 -2,7012 2,0688 368,7366 -2,4166 1,0009 194,9719 -2,5478 0,2555 72,8769 -2,2883 0,5874 102,1304 -1,8038 0,1366 104,9562 -2,0916 0,2991 203,9527 -2,7026 0,5884 646,2286 -4,0144 0,4739 426,0736 -2,5764 0,2934 59,0777 -2,6182 0,2553 133,7749 -2,4998 0,3496 132,1945 -1,7671 0,5538 107,5297 -2,2407 0,4736 272,5134 -2,0783 0,3064 328,6581 -2,3552 0,5374 119,6638 -2,3057 0,2696 460,5816 -2,7085 0,7168 589,7894 -2,6154 0,9266 153,1600 -2,4984 0,1593 452,3962 -2,8922 1,1069 247,6417 -2,4312 0,1705 126,2092 -2,3584 0,4246 1 14 7 89_E3 158 block1 0 0 0 0 0 2 16 8 89_G8 376 block2 0 0 0 0 0 3 5 3 85_F9 437 block3 0 0 0 0 0 3 4 1 85_B7 388 block3 0 0 0 0 0 2 3 7 85_E6 339 block2 0 0 0 0 0 2 5 8 85_G10 365 block2 0 0 0 0 0 1 10 3 06_E7 58 block1 0 0 0 0 0 1 14 3 89_E3 62 block1 0 0 0 0 0 2 22 1 71_A8 214 block2 0 0 0 0 0 1 10 7 06_E7 154 block1 0 0 0 0 0 3 15 3 89_F5 447 block3 0 0 0 0 0 1 11 6 06_C9 131 block1 0 0 0 0 0 3 22 4 71_H7 478 block3 0 0 0 0 0 3 5 7 85_F9 533 block3 0 0 0 0 0 4 23 6 71_D10 719 block4 0 0 0 0 0 4 22 2 71_D8 622 block4 0 0 0 0 0 3 7 1 06_B1 391 block3 0 0 0 0 0 1 13 5 89_A1 109 block1 0 0 0 0 0 1 20 2 71_C3 44 block1 0 0 0 0 0 3 21 4 71_H5 477 block3 0 0 0 0 0 3 21 8 71_H5 573 block3 0 0 0 0 0 4 9 4 06_H6 657 block4 0 0 0 0 0 4 1 4 85_H2 649 block4 0 0 0 0 0 4 9 7 06_F6 729 block4 0 0 0 0 0 4 2 3 85_F4 626 block4 0 0 0 0 0 3 24 1 71_B11 408 block3 0 0 0 0 0 1 1 8 85_G1 169 block1 0 0 0 0 0 3 2 3 85_F3 434 block3 0 0 0 0 0 1 24 4 71_G11 96 block1 0 0 0 0 0 1 12 2 06_C11 36 block1 0 0 0 0 0 3 23 3 71_F9 455 block3 0 0 0 0 0 4 7 2 06_D2 607 block4 0 0 0 0 0 231 232 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 219,6219 220,6219 194,8497 195,8497 274,5646 275,5646 0 0 0 220,6180 221,6180 0 0 0 178,2970 179,2970 0 0 0 232,5868 233,5868 0 0 0 198,7891 199,7891 0 0 0 201,7515 202,7515 0 0 0 199,7759 200,7759 101,1709 210,3599 144,3383 210,0742 221,2328 209,7183 195,2329 209,3178 184,2336 209,2212 183,2337 208,3282 276,2328 207,6995 190,2331 207,4052 163,2456 206,6500 0 0 0 315,5639 316,5639 109,4137 210,3703 0 0 0 193,8670 194,8670 150,2893 210,7630 0 0 0 263,5658 264,5658 173,2364 210,9788 46,9587 103,1404 114,8473 0 0 0 243,5738 244,5738 170,2381 211,3149 37,4546 0 0 0 164,0966 165,0966 177,2349 211,4881 71,0109 0 0 0 255,5676 256,5676 132,5613 212,4206 69,2350 0 0 0 260,5663 261,5663 152,2783 212,6592 55,2111 1203,9722 887,0715 982,5095 703,4820 848,0054 900,9548 743,3130 70,2679 1568,3775 11,2333 1010,6127 20,3000 824,0445 48,5118 1052,0255 21,7340 1028,0682 75,2067 59,5696 945,2603 25,8482 1089,3942 827,9257 0 0 0 203,7296 204,7296 193,2330 214,0318 27,4409 820,2075 0 0 0 285,5641 286,5641 168,2397 214,3132 62,5834 878,0578 0 0 0 299,5640 300,5640 155,2654 214,3219 75,6292 740,4258 961,5165 0 0 0 170,6621 171,6621 228,2328 214,3426 38,6548 1717,3667 0 0 0 101,4520 102,4520 264,2328 215,2725 98,8916 755,2174 0 0 0 186,0413 187,0413 182,2338 215,4693 54,3016 824,0445 911,1679 962,8884 998,3495 1200,2615 932,6946 0 0 0 183,1263 184,1263 250,2328 216,4973 33,5547 940,1389 0 0 0 227,5969 228,5969 205,2328 216,6542 11,1897 1383,6043 0 0 0 263,5658 264,5658 163,2456 218,6481 50,9753 755,2174 944,0927 1162,2531 0 0 0 301,5639 302,5639 165,2428 218,9808 72,5941 696,3521 1204,3452 1220,2720 1040,3231 953,8544 1727,7292 1541,9368 1551,0901 1472,1879 1110,1159 1174,1476 899,3669 984,6095 878,2123 0 0 0 230,5904 231,5904 201,2328 218,9854 15,6144 698,6998 820,4938 945,6676 821,6204 0 0 0 234,5836 235,5836 236,2328 220,6506 25,5743 999,2224 1760,8093 1876,6676 1545,5664 0 0 0 283,5642 284,5642 133,5334 220,7435 77,9323 1010,6127 1256,4484 959,3517 1075,4709 0 0 0 198,7891 199,7891 228,2328 221,0516 19,6803 1626,0186 1919,9315 1898,9563 1814,9688 0 0 0 187,9910 188,9910 223,2328 222,1189 33,5848 1576,5827 1263,1377 1854,4984 1564,7396 0 0 0 223,6078 224,6078 258,2328 222,6593 36,0571 640,9173 701,5917 874,7986 739,1025 0 0 0 276,5645 277,5645 169,2389 222,9787 53,6630 1010,6127 1621,6731 1503,9382 1378,7413 324,1981 -2,6276 0,6723 121,3689 -1,7312 0,1991 295,8582 -2,8101 0,4351 163,9714 -3,0373 0,0172 158,8130 -2,3454 0,5058 476,6809 -2,7614 0,5906 123,4877 -1,8992 0,3179 297,9941 -2,2517 0,9112 203,6934 -2,1311 0,6610 172,2449 -2,8352 0,2045 271,7427 -2,4258 0,3145 70,1702 -2,0869 0,3487 222,8400 -2,3043 0,5415 120,1936 -2,0819 0,6824 665,4057 -2,8782 1,0951 200,1637 -2,2477 0,3575 1557,7960 1307,1647 1356,3110 1032,8005 1230,0793 948,3876 919,1631 1108,0474 920,3945 701,5917 1150,1697 977,5169 946,7555 863,2023 1025,2637 851,7478 924,6366 981,2976 1089,4901 1243,1856 1104,6715 1082,9373 816,6933 889,3512 2217,5545 1354,7390 1713,5570 2115,1627 1843,4610 1656,4121 895,6379 1213,5265 977,7363 1419,3066 1620,8815 1364,0712 1694,8414 1431,1542 1384,6879 1346,2867 1821,4858 1371,0110 884,3855 887,1709 953,6502 1719,4883 1291,9169 1279,7770 181,9597 -2,7001 0,4536 76,3572 -2,2142 0,5196 187,1380 -2,3117 0,2575 258,4426 -1,9862 0,6706 67,9440 -2,1520 0,4187 243,1975 -2,3998 0,6314 172,1475 -2,4806 0,9162 192,9175 -2,2185 0,6921 449,3556 -3,0511 0,1553 575,5416 -2,9143 0,5117 207,3141 -2,2076 0,4074 288,4224 -2,7061 0,3798 335,8064 -2,7080 0,4225 438,6357 -2,7434 0,6491 117,5660 -2,2012 0,2926 445,9052 -2,6052 0,8863 712,8365 5707,8540 2712,6857 2642,0721 -3,1738 1,5552 1987,6188 2069,1953 1644,9573 1032,8005 1220,2720 1024,4267 70,4579 1368,0097 1 1 4 85_G1 73 block1 0 0 0 0 0 1 6 7 85_E11 150 block1 0 0 0 0 0 4 3 8 85_H6 747 block4 0 0 0 0 0 3 17 2 89_D9 425 block3 0 0 0 0 0 2 16 4 89_G8 280 block2 0 0 0 0 0 2 5 3 85_E10 245 block2 0 0 0 0 0 4 10 2 06_D8 610 block4 0 0 0 0 0 4 4 3 85_F8 628 block4 0 0 0 0 0 4 4 7 85_F8 724 block4 0 0 0 0 0 3 15 6 89_D5 519 block3 0 0 0 0 0 1 23 1 71_A9 23 block1 0 0 0 0 0 4 20 1 71_B4 596 block4 0 0 0 0 0 4 18 6 89_D12 714 block4 0 0 0 0 0 3 13 4 89_H1 469 block3 0 0 0 0 0 4 11 5 06_B10 683 block4 0 0 0 0 0 1 12 6 06_C11 132 block1 0 0 0 0 0 2 23 3 71_E10 263 block2 0 0 0 0 0 3 7 5 06_B1 487 block3 0 0 0 0 0 2 20 1 71_A4 212 block2 0 0 0 0 0 4 1 8 85_H2 745 block4 0 0 0 0 0 4 11 7 06_F10 731 block4 0 0 0 0 0 4 8 2 06_D4 608 block4 0 0 0 0 0 4 1 3 85_F2 625 block4 0 0 0 0 0 4 11 6 06_D10 707 block4 0 0 0 0 0 4 20 5 71_B4 692 block4 0 0 0 0 0 3 17 6 89_D9 521 block3 0 0 0 0 0 1 6 6 85_C11 126 block1 0 0 0 0 0 4 8 6 06_D4 704 block4 0 0 0 0 0 2 17 7 89_E10 353 block2 0 0 0 0 0 1 14 4 89_G3 86 block1 0 0 0 0 0 1 6 2 85_C11 30 block1 0 0 0 0 0 4 11 3 06_F10 635 block4 0 0 0 0 0 3 9 1 06_B5 393 block3 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 189,9455 190,9455 236,5809 237,5809 286,5641 287,5641 0 0 0 185,0683 186,0683 0 0 0 235,5822 236,5822 0 0 0 158,5737 159,5737 0 0 0 277,5644 278,5644 0 0 0 269,5650 270,5650 0 0 0 268,5651 269,5651 105,1960 196,2980 197,2329 196,1892 155,2654 195,6952 199,2329 194,6465 129,6590 194,4581 144,3383 194,1798 214,2328 194,1074 136,4616 194,0585 169,2389 194,0411 0 0 0 212,6569 213,6569 142,3617 196,3838 0 0 0 286,5641 287,5641 124,8772 196,5284 0 0 0 177,3361 178,3361 176,2352 196,5680 34,2686 82,3963 48,0010 73,9032 70,9026 34,0123 56,7918 0 0 0 151,3896 152,3896 255,2328 196,5872 53,2117 0 0 0 225,6020 226,6020 132,5613 196,7654 0 0 0 264,5656 265,5656 157,2588 196,9953 58,8194 0 0 0 294,5640 295,5640 166,2416 197,2609 86,0919 896,2784 864,8959 999,2224 777,4789 784,1885 816,4142 83,2973 1064,2929 749,1933 794,5553 824,0445 820,2075 54,9666 1196,9032 18,4009 1634,2885 51,7339 1503,1619 82,9511 1337,1158 0 0 0 96,2660 97,2660 238,2328 197,5439 88,2718 529,8487 0 0 0 233,5852 234,5852 132,5613 197,7598 56,5556 896,2784 0 0 0 212,6569 213,6569 124,8772 199,5557 69,0661 971,6169 1404,4540 722,7489 1173,0951 1589,5828 862,8656 0 0 0 255,5676 256,5676 100,3908 199,6971 86,2262 1383,6043 1339,1629 0 0 0 217,6304 218,6304 165,2428 200,3354 30,3921 662,4152 767,9378 0 0 0 158,5737 159,5737 282,2328 200,3366 70,9289 935,0674 840,1526 0 0 0 211,6632 212,6632 141,3750 200,7237 54,7055 820,2075 984,2231 1174,6275 0 0 0 209,6770 210,6770 157,2588 201,0229 40,1429 982,5095 0 0 0 300,5639 301,5639 113,8015 201,1671 93,9607 784,1885 0 0 0 234,5836 235,5836 219,2328 201,7034 44,3257 1128,4209 1263,1377 1561,3155 1317,6247 1382,4026 1053,8592 1073,4834 1441,8038 1387,9641 1270,7591 993,0194 756,8352 935,8733 1219,5468 894,9913 1090,3541 900,3786 717,6587 1654,0386 1522,8088 1357,7086 970,1051 1002,6987 892,3502 1291,1231 1375,1146 1233,9904 1202,7758 929,5579 907,2282 1000,9747 1043,0303 805,5132 1148,8458 1053,8592 856,6342 1179,2624 1387,9641 1117,1383 908,2057 970,9455 983,9661 1290,2733 1150,1697 1078,3327 931,4492 1255,1389 1003,5442 1191,7214 1284,4080 1098,7790 1802,3962 1044,4576 1347,9190 1987,6188 1943,8615 1855,2563 2414,2075 2278,0730 2065,1475 895,6379 917,4203 1050,0580 1154,8448 2208,0864 1432,6662 0 0 0 245,5723 246,5723 194,2330 202,9890 38,9506 920,1511 1204,3452 1651,4206 1258,6389 0 0 0 166,8955 167,8955 139,4053 204,1446 89,3875 607,2635 762,9854 828,8586 733,0358 0 0 0 225,6020 226,6020 174,2359 204,3236 26,7922 1609,5035 2379,9858 2231,3840 2073,6244 0 0 0 252,5687 253,5687 158,2559 205,3193 47,1567 878,0578 1518,5339 1338,5770 1245,0563 0 0 0 203,7296 204,7296 154,2693 205,7106 52,4599 864,8959 826,6513 830,6832 840,7435 0 0 0 198,7891 199,7891 152,2783 206,0668 57,7721 905,6801 1012,8576 889,7436 936,0938 0 0 0 2 7 85_F3 530 block3 0 0 0 0 0 256,5673 257,5673 177,2349 206,3133 43,7003 835,8219 1353,4442 1132,5822 1107,2828 259,7369 -2,4166 0,6248 66,9552 -2,2191 0,3131 21,0136 -2,0628 0,3782 330,3211 -2,5887 0,6918 408,7503 -3,3316 0,4415 113,7930 -1,9176 0,6289 368,6457 -2,6084 0,6219 221,5312 -2,7200 0,4094 299,5895 -2,4881 0,9717 251,0788 -2,6601 0,4588 177,3737 -2,3303 0,6274 680,4652 -2,7925 0,2099 89,3874 -1,9226 0,3815 246,6714 -2,7063 0,4457 274,7034 -2,4868 0,3288 190,4607 -2,4805 0,5355 185,3174 -1,9547 0,4886 404,9613 -2,8198 1,0769 156,6635 -2,3759 0,5838 359,2776 -2,7171 0,0809 189,8802 -2,6348 0,3265 76,2308 -2,1336 0,2648 306,6444 -2,5512 1,0224 92,2841 -2,2362 0,5002 143,6624 -2,4003 0,4869 208,7925 -2,3768 0,8823 255,5474 -2,4902 0,8471 224,4078 -2,3584 0,3070 245,6609 -2,5193 0,7567 400,9016 -2,7935 0,0876 192,6103 -3,2555 0,1981 491,4305 -3,4193 0,7033 248,8378 -2,4955 0,3058 4 19 8 71_H2 763 block4 0 0 0 0 0 4 1 7 85_F2 721 block4 0 0 0 0 0 1 10 1 06_A7 10 block1 0 0 0 0 0 4 12 2 06_D12 612 block4 0 0 0 0 0 4 9 8 06_H6 753 block4 0 0 0 0 0 2 4 6 85_C8 316 block2 0 0 0 0 0 2 3 3 85_E6 243 block2 0 0 0 0 0 2 11 2 06_C10 227 block2 0 0 0 0 0 4 14 3 89_F4 638 block4 0 0 0 0 0 4 7 6 06_D2 703 block4 0 0 0 0 0 3 4 6 85_D7 508 block3 0 0 0 0 0 4 10 4 06_H8 658 block4 0 0 0 0 0 3 22 8 71_H7 574 block3 0 0 0 0 0 3 24 5 71_B11 504 block3 0 0 0 0 0 2 16 3 89_E8 256 block2 0 0 0 0 0 1276,6305 1068,4262 1080,4450 4 2 6 85_D4 698 block4 0 0 0 0 0 1 12 1 06_A11 12 block1 0 0 0 0 0 3 8 8 06_H3 560 block3 0 0 0 0 0 2 6 4 85_G12 270 block2 0 0 0 0 0 55,6982 1391,4363 1 23 5 71_A9 119 block1 0 0 0 0 0 4 18 2 89_D12 618 block4 0 0 0 0 0 1 12 7 06_E11 156 block1 0 0 0 0 0 2 23 8 71_G10 383 block2 0 0 0 0 0 4 22 8 71_H8 766 block4 0 0 0 0 0 1 9 7 06_E5 153 block1 0 0 0 0 0 2 9 7 06_E6 345 block2 0 0 0 0 0 2 20 5 71_A4 308 block2 0 0 0 0 0 2 12 1 06_A12 204 block2 0 0 0 0 0 2 6 8 85_G12 366 block2 0 0 0 0 0 2 3 1 85_A6 195 block2 0 0 0 0 0 4 12 6 06_D12 708 block4 0 0 0 0 0 3 2 8 85_H3 554 block3 0 0 0 0 0 233 234 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 206,7011 207,7011 186,0413 187,0413 270,5649 271,5649 0 0 0 334,5639 335,5639 0 0 0 190,9244 191,9244 0 0 0 198,7891 199,7891 0 0 0 185,0683 186,0683 0 0 0 172,5589 173,5589 0 0 0 152,2753 153,2753 171,2375 179,2152 201,2328 178,9924 178,2346 177,4882 139,4053 176,4432 165,2428 176,4396 74,4770 175,4623 124,8772 174,9043 143,3495 174,1752 135,4837 173,8883 0 0 0 268,5651 269,5651 139,4053 179,3362 0 0 0 247,5711 248,5711 92,4037 180,0361 0 0 0 241,5755 242,5755 156,2619 180,1042 79,5120 77,4163 31,6911 0 0 0 166,8955 167,8955 147,3104 180,4463 0 0 0 181,1899 182,1899 180,2342 181,5211 1,4805 0 0 0 196,8178 197,8178 195,2329 181,7728 0 0 0 154,9540 155,9540 203,2328 183,4406 25,2865 831,8514 668,2888 24,6990 1422,9817 41,6008 1155,3172 53,6801 1709,0322 835,8219 670,2943 839,8376 19,8228 1329,4575 7,9796 1344,8008 32,3033 1519,3885 13,1527 1016,3820 139,4433 1232,6220 43,8525 1121,8048 26,9304 1918,4501 84,3116 1859,6488 0 0 0 134,5660 135,5660 205,2328 184,3106 43,2608 1952,0833 0 0 0 137,7826 138,7826 140,3895 184,4350 78,5575 977,0382 0 0 0 261,5661 262,5661 124,8772 184,5372 69,9802 915,2781 0 0 0 205,7101 206,7101 201,2328 184,7676 32,4733 955,6530 0 0 0 205,7101 206,7101 199,2329 185,7410 29,1584 1070,4979 0 0 0 171,6094 172,6094 156,2619 186,0014 38,9818 603,4881 758,1348 870,0702 0 0 0 227,5969 228,5969 129,6590 186,7964 50,9718 1064,2929 1210,7182 0 0 0 258,5668 259,5668 157,2588 187,0755 62,1965 977,0382 0 0 0 166,8955 167,8955 174,2359 187,0881 28,8520 935,0674 0 0 0 186,0413 187,0413 163,2456 187,4733 24,9745 910,4545 957,0993 1174,6275 1014,0604 1727,7292 1269,6201 1310,8056 1404,4540 1110,1159 1163,8694 973,7863 1082,9325 743,8977 0 0 0 179,2597 180,2597 184,2336 188,8756 12,5956 654,9053 735,3371 977,5169 789,2531 0 0 0 194,8497 195,8497 175,2356 189,0731 12,0380 674,3785 948,3876 1144,2359 922,3340 0 0 0 170,6621 171,6621 190,2331 189,3428 18,2518 764,5299 1022,7431 1121,2102 969,4944 0 0 0 189,9455 190,9455 159,2534 189,4439 29,9429 971,6169 1113,7469 1063,5077 1049,6239 0 0 0 286,5641 287,5641 145,3282 189,5237 84,1507 1809,3272 2534,0174 3597,1928 2646,8458 0 0 0 92,0917 93,0917 68,6951 191,9732 193,6156 808,9578 0 0 0 189,9455 190,9455 140,3895 192,8226 53,9293 746,2354 1223,5856 929,5579 966,4596 240,8051 -2,3344 0,3776 899,2572 -3,8335 1,0387 72,0750 -2,4799 0,2248 184,2058 -2,3422 0,2007 236,0097 -2,2548 0,4580 167,9279 -2,0443 0,3147 140,9974 -2,4350 0,3622 397,9326 -2,7746 0,2555 218,7193 -2,6698 0,6893 119,5607 -2,5699 0,3418 133,8601 -2,0038 0,4127 359,4904 -2,9347 0,4829 296,8775 -2,7993 0,5646 972,6984 50,3370 -2,4644 0,6109 123,9388 -2,5986 0,4059 205,6012 -3,5956 0,2298 1003,1430 1115,6286 983,5410 1179,2624 1887,7975 1496,6805 1479,8501 1854,4984 1334,2124 1360,6350 1494,6014 1336,8512 911,1679 1064,0091 979,5985 854,4463 1158,2155 1419,3066 1049,1278 1101,4188 959,3517 966,4727 897,8850 928,6362 1064,0091 1532,3410 1308,6025 1449,3592 1854,4984 1549,5528 1526,3420 1620,8815 1555,5373 1317,9976 1162,2531 1165,5443 984,2231 1110,1159 1108,9870 1589,5828 1269,6201 1327,0026 2200,4747 1200,2615 1773,0621 1217,1318 1240,9636 1439,2480 142,9005 -2,4218 0,0362 359,9710 -3,0237 0,2209 606,3671 -2,7535 0,7738 170,8880 -2,9056 0,3928 477,8636 -2,6502 0,1872 295,2361 -2,6955 0,8822 203,9276 -2,3783 0,9254 77,1814 -2,3846 0,1662 234,8615 -2,8598 0,1344 269,2155 -3,1131 0,2592 56,6964 -3,1570 0,3327 150,8347 -2,7183 0,2710 124,2033 -2,9491 1,0135 239,1101 -2,9423 0,4608 515,7130 -3,3140 0,2268 364,2727 -3,1241 0,3137 3253,1264 1233,9904 1765,3582 1305,8537 -3,4240 0,6487 1456,9420 1788,7874 1438,7424 1495,2504 1440,0087 1296,9707 993,5985 1009,2187 1204,3452 1005,0694 1062,1509 2303,0133 2313,1599 2189,4188 4 9 3 06_F6 633 block4 0 0 0 0 0 1 18 3 89_E11 66 block1 0 0 0 0 0 2 2 1 85_A4 194 block2 0 0 0 0 0 2 24 6 71_C12 336 block2 0 0 0 0 0 2 23 6 71_C10 335 block2 0 0 0 0 0 4 11 1 06_B10 587 block4 0 0 0 0 0 4 10 6 06_D8 706 block4 0 0 0 0 0 2 21 2 71_C6 237 block2 0 0 0 0 0 3 1 2 85_D1 409 block3 0 0 0 0 0 3 2 4 85_H3 458 block3 0 0 0 0 0 3 8 4 06_H3 464 block3 0 0 0 0 0 4 11 8 06_H10 755 block4 0 0 0 0 0 4 3 1 85_B6 579 block4 0 0 0 0 0 1 10 5 06_A7 106 block1 0 0 0 0 0 3 12 7 06_F11 540 block3 0 0 0 0 0 4 19 4 71_H2 667 block4 0 0 0 0 0 3 13 8 89_H1 565 block3 0 0 0 0 0 2 23 2 71_C10 239 block2 0 0 0 0 0 4 3 5 85_B6 675 block4 0 0 0 0 0 2 4 2 85_C8 220 block2 0 0 0 0 0 4 14 7 89_F4 734 block4 0 0 0 0 0 2 10 4 06_G8 274 block2 0 0 0 0 0 3 9 5 06_B5 489 block3 0 0 0 0 0 1 12 8 06_G11 180 block1 0 0 0 0 0 2 21 7 71_E6 357 block2 0 0 0 0 0 3 21 2 71_D5 429 block3 0 0 0 0 0 2 17 1 89_A10 209 block2 0 0 0 0 0 4 3 4 85_H6 651 block4 0 0 0 0 0 3 4 2 85_D7 412 block3 0 0 0 0 0 4 7 5 06_B2 679 block4 0 0 0 0 0 3 16 4 89_H7 472 block3 0 0 0 0 0 3 3 4 85_H5 459 block3 0 0 0 0 0 1 21 2 71_C5 45 block1 0 0 0 0 0 1 12 5 06_A11 108 block1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 98,0771 99,0771 189,9455 190,9455 226,5994 227,5994 0 0 0 154,0575 155,0575 0 0 0 162,2440 163,2440 0 0 0 176,3769 177,3769 0 0 0 140,2467 141,2467 0 0 0 169,7169 170,7169 0 0 0 107,3087 108,3087 270,2328 164,9625 133,5334 164,1288 159,2534 162,8787 137,4413 162,3233 141,3750 161,5866 138,4226 161,5384 84,4474 160,8858 168,2397 160,5870 149,2957 160,5652 0 0 0 126,1534 127,1534 145,3282 165,2048 0 0 0 151,3896 152,3896 183,2337 165,2734 0 0 0 231,5886 232,5886 138,4226 165,7516 57,2898 16,3087 51,9260 91,3048 24,6454 21,6087 19,8910 27,6266 0 0 0 126,1534 127,1534 122,9877 166,0913 71,9335 0 0 0 100,9535 101,9535 296,2328 166,4052 112,4352 0 0 0 150,5078 151,5078 210,2328 166,4474 38,3837 0 0 0 129,1365 130,1365 153,2735 167,1810 46,5822 900,9548 839,8376 715,9598 761,3884 664,3495 703,4820 740,4258 873,6230 28,2193 1115,2328 631,2588 869,2357 715,9598 930,0456 120,7839 1028,0682 33,8401 1108,7053 61,1829 658,6153 0 0 0 148,7557 149,7557 153,2735 167,7209 29,0242 812,6644 0 0 0 219,6219 220,6219 124,8772 167,9032 47,9668 1893,2395 0 0 0 187,0156 188,0156 180,2342 167,9761 27,3157 798,0930 0 0 0 151,3896 152,3896 117,4175 167,9800 60,5860 873,6230 0 0 0 172,5589 173,5589 148,3027 168,9996 19,1668 647,7455 829,7778 0 0 0 137,7826 138,7826 150,2893 169,0683 43,8059 955,6530 1198,0128 942,3592 0 0 0 208,6846 209,6846 147,3104 169,4250 34,0905 816,4142 993,5985 914,4852 0 0 0 156,7572 157,7572 161,2491 169,7138 18,6869 999,2224 0 0 0 155,8539 156,8539 144,3383 170,7751 36,2769 816,4142 1058,6994 1009,2187 0 0 0 330,5639 331,5639 100,3908 170,8378 138,6469 729,2210 944,0927 970,1051 881,1396 961,4441 908,1660 806,6275 0 0 0 135,3626 136,3626 111,1498 171,2151 83,9448 920,1511 1346,2867 1078,4548 1114,9642 0 0 0 182,1574 183,1574 149,2957 171,5307 19,2624 672,3241 1243,1856 1682,4270 1199,3122 0 0 0 187,0156 188,0156 156,2619 172,1431 15,4016 1189,8726 1263,1377 892,3502 1115,1202 0 0 0 126,1534 127,1534 165,2428 172,1764 49,8527 805,2939 1058,6994 1053,8592 972,6175 0 0 0 202,7402 203,7402 186,2334 173,0039 38,1138 662,4152 970,4745 1138,3736 923,7544 0 0 0 133,7745 134,7745 190,2331 173,0473 34,0994 640,9173 961,5165 856,5936 819,6758 0 0 0 0 0 0 0 268,5651 269,5651 139,4053 173,6798 83,2215 787,6034 1487,5378 1457,9297 1244,3569 395,8371 -2,8855 1,1665 163,4569 -2,2440 0,0665 241,3943 -2,4065 0,6218 144,9267 -2,5269 0,2542 196,3715 -2,6834 0,1770 506,4786 -2,7138 0,8063 215,4010 -2,7923 0,4731 132,2067 -2,6490 1,3121 128,0130 -2,5047 0,2630 352,7957 -2,8196 0,4631 88,7610 -2,4360 0,4069 163,3252 -2,6021 0,1752 148,6649 -2,2441 0,3872 121,8260 -2,6473 0,5099 331,6514 -2,6924 0,5193 533,0448 -3,8905 0,7333 2 10 8 06_G8 370 block2 0 0 0 0 0 1 10 6 06_C7 130 block1 0 0 0 0 0 2 21 3 71_E6 261 block2 0 0 0 0 0 2 6 6 85_C12 318 block2 0 0 0 0 0 2 12 5 06_A12 300 block2 0 0 0 0 0 2 17 3 89_E10 257 block2 0 0 0 0 0 1 23 6 71_C9 143 block1 0 0 0 0 0 2 21 6 71_C6 333 block2 0 0 0 0 0 2 16 1 89_A8 208 block2 0 0 0 0 0 1043,0303 1631,0075 1224,4201 887,1709 1013,6122 2 3 6 85_C6 315 block2 0 0 0 0 0 2 24 4 71_G12 288 block2 0 0 0 0 0 4 11 4 06_H10 659 block4 0 0 0 0 0 4 17 3 89_F10 641 block4 0 0 0 0 0 1085,6815 1083,5660 1014,2902 1069,3621 1457,9297 1108,4616 2551,1360 2948,6790 2464,3515 866,3629 1039,8479 1012,8576 1132,5822 1032,8005 1085,6815 746,4404 931,4492 2089,6051 1043,0303 957,0993 952,4183 860,9712 840,1526 917,4203 906,2917 1230,0793 1099,2949 1076,7763 995,0924 900,3929 902,6804 750,3142 1007,9789 1422,3711 1044,6107 863,0984 1694,8414 2453,9354 1674,1332 977,5169 1394,1182 992,9465 1037,8938 1063,5077 894,9913 889,0786 990,2124 856,0168 1166,9697 1193,7414 1096,9189 1510,7490 1448,9340 1329,2504 862,8656 862,8656 985,1290 825,2761 985,5667 782,2524 1 12 3 06_E11 60 block1 0 0 0 0 0 2 2 5 85_A4 290 block2 0 0 0 0 0 2 23 4 71_G10 287 block2 0 0 0 0 0 118,7384 -2,4396 0,3278 165,7138 -2,7113 0,1936 147,1787 -2,5931 0,2407 164,7028 -2,6169 0,8469 166,1212 -2,5082 0,3498 87,9655 -2,2248 0,6105 360,8418 -2,6058 0,3717 106,4689 -2,4222 0,3222 790,3597 -3,3535 0,4391 606,2325 -3,0179 0,3956 224,6783 -2,4246 0,2374 105,5488 -2,6122 0,3264 125,2051 -2,4019 0,2603 145,1351 -2,7682 0,2946 262,6563 -3,2741 0,8903 122,9204 -2,6329 0,1480 108,7099 -2,3446 0,7517 4 17 7 89_F10 737 block4 0 0 0 0 0 1 18 8 89_G11 186 block1 0 0 0 0 0 1 22 3 71_E7 70 block1 0 0 0 0 0 4 22 6 71_D8 718 block4 0 0 0 0 0 4 10 7 06_F8 730 block4 0 0 0 0 0 2 7 2 06_C2 223 block2 0 0 0 0 0 4 19 1 71_B2 595 block4 0 0 0 0 0 1 24 1 71_A11 24 block1 0 0 0 0 0 2 3 5 85_A6 291 block2 0 0 0 0 0 1 9 3 06_E5 57 block1 0 0 0 0 0 2 24 2 71_C12 240 block2 0 0 0 0 0 3 7 7 06_F1 535 block3 0 0 0 0 0 4 17 5 89_B10 689 block4 0 0 0 0 0 1 16 7 89_E7 160 block1 0 0 0 0 0 2 4 1 85_A8 196 block2 0 0 0 0 0 2 7 4 06_G2 271 block2 0 0 0 0 0 235 236 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 186,0413 187,0413 165,9600 166,9600 184,0966 185,0966 0 0 0 182,1574 183,1574 0 0 0 151,3896 152,3896 0 0 0 194,8497 195,8497 0 0 0 183,1263 184,1263 0 0 0 122,5517 123,5517 0 0 0 197,8031 198,8031 107,7049 151,6107 123,9306 151,5385 120,1827 151,5342 91,7338 150,9185 150,2893 150,0068 101,1709 149,5014 96,6222 149,2799 116,5054 149,2138 122,9877 148,8837 0 0 0 139,4205 140,4205 155,2654 151,6297 0 0 0 174,4640 175,4640 171,2375 151,8225 0 0 0 199,7759 200,7759 121,1135 151,8852 42,0326 36,4576 10,8579 45,0926 31,4725 53,2233 42,7080 28,3290 31,6019 0 0 0 144,4467 145,4467 172,2369 152,0835 17,6231 0 0 0 130,6610 131,6610 126,7807 152,5251 41,2758 0 0 0 240,5764 241,5764 91,7338 152,5704 78,0523 0 0 0 156,7572 157,7572 117,4175 153,1042 34,0076 1135,0806 798,0930 839,8376 647,7455 816,4142 764,5299 852,1583 710,8773 49,0172 1211,0792 666,3073 812,6644 1,5437 1717,3667 636,0032 46,7810 1511,2682 971,6169 843,8986 0 0 0 185,0683 186,0683 148,3027 154,4697 28,0286 1261,8409 0 0 0 192,8851 193,8851 173,2364 154,6328 50,2092 664,3495 0 0 0 187,9910 188,9910 126,7807 155,0267 30,8768 664,3495 888,0992 0 0 0 81,3961 82,3961 78,9525 155,1605 129,8856 770,9271 0 0 0 87,0258 88,0258 185,2335 155,4646 59,4366 556,9931 0 0 0 218,6260 219,6260 95,8957 155,6006 61,4325 713,4031 772,9944 1039,8479 0 0 0 183,1263 184,1263 152,2783 156,7236 24,4846 723,8195 0 0 0 107,3087 108,3087 257,2328 156,7806 86,9974 694,0327 993,5985 989,0117 0 0 0 147,8856 148,8856 129,6590 156,8931 32,6824 1446,8522 0 0 0 204,7196 205,7196 130,6240 157,3408 41,1428 801,6724 1526,3420 1233,9904 1187,3349 1886,2128 1932,5965 1755,2205 892,2143 842,0818 1217,1318 1532,3410 1157,7641 1210,7182 1476,1291 1081,2801 1526,3420 1322,7184 1206,6625 1085,6815 1104,6715 932,6946 951,5675 828,3811 0 0 0 176,3769 177,3769 165,2428 157,8464 23,1332 701,0764 755,7471 914,4852 790,4362 0 0 0 153,1646 154,1646 173,2364 158,2474 13,2029 1470,8866 1744,2466 2289,7625 1834,9653 0 0 0 116,4353 117,4353 140,3895 158,3192 53,1668 940,1389 1353,4442 1457,9297 1250,5043 0 0 0 217,6304 218,6304 98,8566 158,5658 59,3895 1314,2236 1032,8005 887,1709 1078,0650 0 0 0 182,1574 183,1574 112,9115 158,7365 39,6889 1115,2328 1835,8303 1299,5025 1416,8552 0 0 0 144,4467 145,4467 155,2654 159,6183 17,7528 848,0054 1131,1037 1276,9757 1085,3616 0 0 0 246,5717 247,5717 76,8005 160,1995 84,9246 950,4317 755,7471 962,8884 889,6891 116,1642 -2,6199 0,9046 218,1127 -2,7507 0,2559 374,3580 -3,1600 0,4816 217,0948 -2,8192 0,3046 273,8143 -3,0077 0,3716 416,9075 -3,5145 0,2332 110,8528 -2,3258 0,2911 364,5806 -2,8968 0,8122 268,0599 -3,4920 0,3514 171,6456 -2,6225 0,6471 407,5171 -2,8296 0,7375 173,8429 -2,4962 0,8763 473,0417 -2,7711 0,1943 390,8512 -3,2108 0,8724 248,9192 -2,5990 0,6870 143,7948 -2,4653 0,7002 422,6005 -3,4245 0,6265 1472,1879 1104,6715 1237,3134 808,5532 1037,8938 1032,8005 1311,0126 952,7231 1249,7976 797,0967 897,6672 939,0946 962,8884 834,7712 938,9420 881,1448 1375,1146 1330,6097 1174,0462 932,6946 1002,7457 989,0117 900,3786 985,1290 931,2977 953,6845 1785,7322 1314,9034 1437,2383 816,1777 1332,0731 1132,5822 1092,4399 2337,2180 2254,7139 2103,0995 770,4530 1367,8586 1125,2752 842,6097 959,3517 788,6026 903,1259 1260,7509 929,5579 1008,8167 877,2091 854,5725 203,9748 -3,0271 0,1914 54,7201 -2,5698 0,7871 99,0282 -2,6493 0,2589 205,1301 -2,5118 0,3622 310,5167 -2,9465 0,7947 279,8950 -2,7184 0,7609 70,8978 -2,6184 0,0499 273,3860 -2,6581 0,7037 306,2366 -3,2710 0,1560 160,2650 -2,4319 0,5866 262,0208 -2,8964 0,7883 336,5919 -3,7963 0,2557 162,4365 -2,4236 0,7416 317,9045 -3,0988 0,1097 103,0251 -2,7713 0,2233 19,6145 -2,5416 0,3221 2106,6413 1661,7055 1676,7292 4 12 7 06_F12 732 block4 0 0 0 0 0 2 13 3 89_E2 253 block2 0 0 0 0 0 3 14 7 89_F3 542 block3 0 0 0 0 0 3 6 8 85_H11 558 block3 0 0 0 0 0 4 14 5 89_B4 686 block4 0 0 0 0 0 3 17 1 89_B9 401 block3 0 0 0 0 0 2 9 8 06_G6 369 block2 0 0 0 0 0 1 7 7 06_E1 151 block1 0 0 0 0 0 4 13 1 89_B2 589 block4 0 0 0 0 0 2 11 3 06_E10 251 block2 0 0 0 0 0 2 9 3 06_E6 249 block2 0 0 0 0 0 3 9 8 06_H5 561 block3 0 0 0 0 0 4 2 7 85_F4 722 block4 0 0 0 0 0 1 18 7 89_E11 162 block1 0 0 0 0 0 3 9 2 06_D5 417 block3 0 0 0 0 0 1 9 6 06_C5 129 block1 0 0 0 0 0 1 7 1 06_A1 7 block1 0 0 0 0 0 3 24 8 71_H11 576 block3 0 0 0 0 0 3 7 2 06_D1 415 block3 0 0 0 0 0 4 21 2 71_D6 621 block4 0 0 0 0 0 1 9 2 06_C5 33 block1 0 0 0 0 0 3 12 3 06_F11 444 block3 0 0 0 0 0 2 7 8 06_G2 367 block2 0 0 0 0 0 4 6 7 85_F12 726 block4 0 0 0 0 0 3 11 8 06_H9 563 block3 0 0 0 0 0 3 16 3 89_F7 448 block3 0 0 0 0 0 4 7 7 06_F2 727 block4 0 0 0 0 0 2 11 6 06_C10 323 block2 0 0 0 0 0 1 14 1 89_A3 14 block1 0 0 0 0 0 4 7 3 06_F2 631 block4 0 0 0 0 0 3 3 8 85_H5 555 block3 0 0 0 0 0 3 19 2 71_D1 427 block3 0 0 0 0 0 3 7 3 06_F1 439 block3 0 0 0 0 0 2 11 8 06_G10 371 block2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 152,2753 153,2753 177,3361 178,3361 147,8856 148,8856 0 0 0 136,9709 137,9709 0 0 0 177,3361 178,3361 0 0 0 113,8708 114,8708 0 0 0 151,3896 152,3896 0 0 0 132,9882 133,9882 0 0 0 112,6243 113,6243 127,7372 141,5000 167,2406 140,9664 116,5054 140,7170 93,0831 140,3623 98,8566 139,8805 146,3189 139,3520 163,2456 138,9402 130,6240 138,7058 114,6973 137,9588 0 0 0 122,5517 123,5517 93,0831 141,9226 0 0 0 160,4028 161,4028 109,4137 142,0173 0 0 0 133,7745 134,7745 118,3345 142,4190 0 0 0 132,9882 133,9882 128,6967 142,9510 0 0 0 206,7011 207,7011 108,5558 143,0562 55,1831 0 0 0 183,1263 184,1263 103,5616 143,7040 39,7872 0 0 0 193,8670 194,8670 122,0486 144,1313 43,1624 660,5038 882,5406 905,6801 0 0 0 139,4205 140,4205 100,3908 144,3154 46,5653 915,2781 0 0 0 198,7891 199,7891 90,4230 144,5454 54,1832 698,6998 0 0 0 173,5104 174,5104 112,9115 144,5939 30,3940 999,2224 993,5985 1869,3906 0 0 0 134,5660 135,5660 159,2534 144,7845 12,8808 915,2781 0 0 0 154,0575 155,0575 128,6967 145,0114 14,1569 1052,0255 1526,3420 0 0 0 132,9882 133,9882 128,6967 145,6110 25,6697 1121,8048 0 0 0 174,4640 175,4640 131,5915 145,6775 24,9317 839,8376 823,5567 1022,0008 0 0 0 123,9752 124,9752 120,1827 145,7642 41,0679 774,1835 877,0681 1053,8592 0 0 0 187,9910 188,9910 101,9595 145,7701 43,0378 2027,8155 2602,4944 0 0 0 141,0776 142,0776 130,6240 145,9578 18,2696 662,4152 739,7095 952,4183 784,8477 901,7036 895,1317 865,4622 1831,9240 0 0 0 157,6639 158,6639 95,8957 146,2324 45,7061 910,4545 1154,8448 818,3684 961,2226 0 0 0 181,1899 182,1899 126,7807 146,3159 30,2746 1503,1619 2337,2180 1821,4858 1887,2886 0 0 0 193,8670 194,8670 81,3156 146,4544 58,3319 805,2939 1346,2867 932,6946 1028,0917 0 0 0 141,9131 142,9131 147,3104 146,5106 4,2544 827,9257 1048,2101 1240,9636 1039,0331 0 0 0 187,0156 188,0156 78,0671 146,7436 59,7708 1269,2299 1662,1698 870,0702 1267,1566 0 0 0 155,8539 156,8539 158,2559 146,8100 17,7853 705,9171 1325,0179 1083,5660 1038,1670 0 0 0 0 0 0 0 182,1574 183,1574 80,8255 148,7073 58,7894 731,9714 1249,7976 1193,7414 1058,5035 284,1707 -2,8873 0,9444 312,0373 -2,7819 0,6058 396,0539 -3,1625 0,3651 206,6718 -2,8070 0,2651 282,8317 -2,8700 0,7466 420,9037 -3,6848 0,5696 173,8883 -2,7547 0,2984 150,1784 -2,4172 0,3907 884,9295 -3,5530 0,5389 141,4560 -2,6527 0,4747 110,1730 -2,6257 0,3458 509,8898 -3,3779 0,5731 324,3615 -2,9708 0,3078 254,7866 -3,0254 0,2248 252,5109 -3,1034 0,5020 1 7 3 06_E1 55 block1 0 0 0 0 0 3 21 6 71_D5 525 block3 0 0 0 0 0 1 24 6 71_C11 144 block1 0 0 0 0 0 4 9 2 06_D6 609 block4 0 0 0 0 0 3 1 1 85_B1 385 block3 0 0 0 0 0 2 6 2 85_C12 222 block2 0 0 0 0 0 4 8 8 06_H4 752 block4 0 0 0 0 0 2 3 4 85_G6 267 block2 0 0 0 0 0 4 19 5 71_B2 691 block4 0 0 0 0 0 3 1 6 85_D1 505 block3 0 0 0 0 0 2 14 1 89_A4 206 block2 0 0 0 0 0 1419,3066 2115,2937 1552,1350 905,9097 1161,4257 1256,4484 1413,6601 1195,1289 1502,9877 1220,2720 1240,8274 942,3592 878,2192 996,9339 1260,5342 895,6379 1049,1278 868,4232 1353,4442 1110,1159 1115,3669 1204,3452 1168,4038 1092,8097 1819,0964 1854,4984 1665,1404 2013,0719 1854,4984 1729,7989 1549,9002 1058,6523 1287,6791 3 6 4 85_H11 462 block3 0 0 0 0 0 2 16 5 89_A8 304 block2 0 0 0 0 0 3 15 8 89_H5 567 block3 0 0 0 0 0 3 11 4 06_H9 467 block3 0 0 0 0 0 157,5651 -2,6591 0,7913 528,8634 -3,1005 0,3346 195,7361 -2,6050 0,7289 235,4957 -2,9731 0,6176 163,0523 -2,9872 0,7413 297,8450 -3,5353 0,2794 362,1015 -3,5992 0,3392 247,3005 -3,1840 0,1885 3 15 4 89_H5 471 block3 0 0 0 0 0 2 7 6 06_C2 319 block2 0 0 0 0 0 3 24 2 71_D11 432 block3 0 0 0 0 0 2 11 1 06_A10 203 block2 0 0 0 0 0 3 17 7 89_F9 545 block3 0 0 0 0 0 21,0821 1321,8266 29,3767 1321,8266 28,3123 1254,4850 60,8818 23,3316 64,7273 39,3612 33,0559 20,2171 999,2224 37,6912 1306,6493 694,0327 21,0167 1128,4209 950,4317 710,8773 6,1334 1284,1047 654,9053 35,2904 1247,1628 882,5406 4 13 5 89_B2 685 block4 0 0 0 0 0 3 24 4 71_H11 480 block3 0 0 0 0 0 3 22 7 71_F7 550 block3 0 0 0 0 0 1185,4712 1053,8592 1079,5176 1276,6305 1206,8564 1263,3787 952,7231 1115,6286 685,9571 1063,5077 1085,6815 1039,8479 1064,0091 1039,8479 920,7948 1487,5378 1138,3736 1251,4441 899,9655 945,4689 1325,0179 1788,7874 1465,9700 919,5874 2089,6051 1767,1769 1701,3149 1269,8651 1405,0216 1185,8091 95,7388 -3,0082 0,5027 51,1993 -3,1899 0,3739 212,6037 -2,6929 0,2894 204,5237 -3,1520 0,2202 193,7686 -2,7517 0,9556 204,4507 -2,7727 0,7075 280,3155 -3,3794 0,2042 229,5396 -2,7229 0,6457 425,0654 -3,6147 0,7395 271,1930 -3,0870 0,5190 3 22 1 71_B7 406 block3 0 0 0 0 0 2 9 2 06_C6 225 block2 0 0 0 0 0 3 22 5 71_B7 502 block3 0 0 0 0 0 4 13 8 89_H2 757 block4 0 0 0 0 0 2 18 3 89_E12 258 block2 0 0 0 0 0 2 17 5 89_A10 305 block2 0 0 0 0 0 1 12 4 06_G11 84 block1 0 0 0 0 0 1 7 5 06_A1 103 block1 0 0 0 0 0 2 13 7 89_E2 349 block2 0 0 0 0 0 237 238 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 138,5992 139,5992 172,5589 173,5589 126,8908 127,8908 0 0 0 146,1577 147,1577 0 0 0 137,7826 138,7826 0 0 0 119,0948 120,0948 0 0 0 155,8539 156,8539 0 0 0 123,2606 124,2606 0 0 0 139,4205 140,4205 148,3027 131,1746 96,6222 131,0115 111,1498 130,8016 139,4053 130,7715 106,8612 130,6678 111,1498 130,3739 109,4137 129,1932 125,8273 129,1491 159,2534 128,6698 0 0 0 149,6298 150,6298 114,6973 131,4551 0 0 0 156,7572 157,7572 103,5616 131,6950 0 0 0 184,0966 185,0966 109,4137 132,0926 45,1592 26,7305 17,5093 22,4189 22,8361 0 0 0 173,5104 174,5104 79,4078 132,1223 0 0 0 166,8955 167,8955 100,3908 132,1297 0 0 0 143,5977 144,5977 95,1784 132,3314 32,9954 0 0 0 147,8856 148,8856 114,6973 132,4497 16,7150 993,6017 761,3884 0 0 0 125,4217 126,4217 107,7049 133,0995 29,9802 685,0321 0 0 0 172,5589 173,5589 91,0736 133,4370 40,8392 1767,4702 0 0 0 199,7759 200,7759 83,3666 133,4961 59,8615 794,5553 907,2282 820,4938 0 0 0 157,6639 158,6639 95,1784 134,3835 34,1512 960,9243 0 0 0 128,3824 129,3824 172,2369 134,4623 35,1315 689,4777 0 0 0 125,4217 126,4217 145,3282 134,5384 10,0582 689,4777 927,3144 908,7305 0 0 0 140,2467 141,2467 116,5054 135,0312 16,5464 812,6644 1022,7431 1110,1159 0 0 0 132,2072 133,2072 125,8273 135,1314 11,0601 770,9271 760,5475 908,7305 0 0 0 97,6165 98,6165 122,0486 135,2674 45,7169 701,0764 869,8955 879,6512 0 0 0 180,2240 181,2240 101,1709 135,5986 40,5012 925,0735 1346,2867 1276,9757 1182,7787 816,8743 813,4017 981,8412 841,8409 0 0 0 129,8960 130,8960 172,2369 136,2371 33,2854 905,6801 1142,8891 1387,9641 1145,5111 0 0 0 149,6298 150,6298 106,8612 136,2570 25,4920 900,9548 1464,5518 1440,0087 1268,5051 0 0 0 157,6639 158,6639 105,1960 136,4132 27,6174 1095,7857 1613,6236 1387,9641 1365,7911 0 0 0 174,4640 175,4640 89,7821 136,8752 43,1336 743,3130 952,7231 981,2976 892,4446 0 0 0 158,5737 159,5737 123,9306 136,8919 18,8963 743,3130 979,5985 1110,1159 944,3425 0 0 0 121,1514 122,1514 122,9877 137,7669 27,2041 1734,0503 1346,2867 911,5888 1330,6419 0 0 0 152,2753 153,2753 112,9115 137,8427 21,6805 1095,7857 1108,0474 1049,1278 1084,3203 31,0881 -2,9881 0,1992 411,4539 -3,2405 0,5210 185,9256 -2,7753 0,4870 129,9395 -2,7479 0,6807 259,6301 -3,3271 0,4770 318,5443 -3,2027 0,5837 241,1527 -3,0783 0,3160 225,8538 -3,1473 0,6920 100,4026 -2,6394 0,3594 82,7201 -2,5880 0,2454 152,8858 -2,8575 0,3642 132,2771 -2,6354 0,1724 718,6496 -3,3477 0,8253 189,1193 -3,1193 0,4947 985,1290 989,0117 899,4635 1026,3751 895,6375 831,5125 1662,1698 1371,2022 1342,3245 895,7423 3295,9321 2150,0077 2738,3946 1534,1727 1513,3409 1479,6500 999,2224 743,3130 930,0456 915,2781 38,8491 1269,2299 718,5478 10,4916 1576,5827 21,1660 1182,8812 17,7557 17,1364 41,8479 29,7340 694,0327 761,3884 816,4142 668,2888 1589,5828 2103,7478 1564,1843 1360,6350 959,3517 1021,0999 895,6379 1039,8479 955,1771 923,2191 1240,9636 1026,4869 1069,3621 1099,2949 1145,9623 952,7231 966,4727 879,2479 2328,6660 2324,8671 2076,7052 1662,1698 1354,7390 1399,9300 731,0541 1083,5660 836,2176 1549,9002 1457,9297 1256,4061 1125,2752 1138,3736 1026,6877 1022,7431 1269,6201 986,8840 95,8141 -2,8351 0,7919 308,3641 -3,6863 0,2868 152,2891 -2,6507 0,4803 335,2182 -3,3174 0,4935 132,5325 -2,7815 0,5645 573,5847 -4,3824 0,3126 77,1020 -3,5582 0,6360 552,7006 -3,5522 0,9756 313,2590 -2,9309 0,5969 75,3181 -2,8668 0,2816 185,7846 -2,9683 0,2216 107,7969 -3,1663 0,4729 139,3400 -2,7502 0,4822 433,1230 -3,9692 0,2123 242,8190 -3,4206 0,2886 215,0083 -2,6608 0,5501 431,1572 -3,2223 0,6751 182,2199 -3,0263 0,7205 302,2652 -2,9161 0,4846 1662,1698 2092,2157 1481,2877 1339,1629 1150,1697 1150,0856 1936,8246 1338,5770 1680,9573 33,3555 2769,2441 48,0629 1391,4363 3 19 6 71_D1 523 block3 0 0 0 0 0 2 5 4 85_G10 269 block2 0 0 0 0 0 4 6 8 85_H12 750 block4 0 0 0 0 0 2 21 8 71_G6 381 block2 0 0 0 0 0 3 16 8 89_H7 568 block3 0 0 0 0 0 4 12 3 06_F12 636 block4 0 0 0 0 0 1 21 6 71_C5 141 block1 0 0 0 0 0 3 11 2 06_D9 419 block3 0 0 0 0 0 4 23 5 71_B10 695 block4 0 0 0 0 0 4 8 4 06_H4 656 block4 0 0 0 0 0 2 21 1 71_A6 213 block2 0 0 0 0 0 4 10 5 06_B8 682 block4 0 0 0 0 0 1 1 2 85_C1 25 block1 0 0 0 0 0 4 15 1 89_B6 591 block4 0 0 0 0 0 2 11 7 06_E10 347 block2 0 0 0 0 0 3 5 2 85_D9 413 block3 0 0 0 0 0 4 23 3 71_F10 647 block4 0 0 0 0 0 1 15 8 89_G5 183 block1 0 0 0 0 0 2 21 4 71_G6 285 block2 0 0 0 0 0 3 6 1 85_B11 390 block3 0 0 0 0 0 3 5 6 85_D9 509 block3 0 0 0 0 0 1 2 4 85_G3 74 block1 0 0 0 0 0 2 7 5 06_A2 295 block2 0 0 0 0 0 4 6 4 85_H12 654 block4 0 0 0 0 0 2 3 2 85_C6 219 block2 0 0 0 0 0 4 5 7 85_F10 725 block4 0 0 0 0 0 2 10 3 06_E8 250 block2 0 0 0 0 0 1 14 5 89_A3 110 block1 0 0 0 0 0 3 16 7 89_F7 544 block3 0 0 0 0 0 4 8 5 06_B4 680 block4 0 0 0 0 0 2 7 1 06_A2 199 block2 0 0 0 0 0 2 10 1 06_A8 202 block2 0 0 0 0 0 1 10 2 06_C7 34 block1 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 96,7110 0 0 0 0 0 0 153,1646 154,1646 113,2446 114,2446 97,7110 0 0 0 162,2440 163,2440 0 0 0 115,7852 116,7852 0 0 0 108,4486 109,4486 0 0 0 119,0948 120,0948 0 0 0 104,5607 105,5607 0 0 0 114,5030 115,5030 125,8273 122,5247 128,6967 122,3572 128,6967 122,2968 142,3617 122,1422 98,8566 121,9785 85,5659 121,7186 91,0736 121,7041 148,3027 121,4382 166,2416 121,4174 0 0 0 147,0196 148,0196 87,9173 122,6007 0 0 0 118,4211 119,4211 129,6590 122,6880 0 0 0 170,6621 171,6621 81,8147 122,9850 44,7796 6,0875 30,8592 6,9830 15,6232 5,5425 17,8736 38,5256 31,0538 38,8866 0 0 0 103,5019 104,5019 135,4837 123,0079 17,1107 0 0 0 94,5371 95,5371 134,5076 123,1930 0 0 0 142,7531 143,7531 123,9306 123,9047 18,8614 0 0 0 123,9752 124,9752 91,0736 124,0917 33,0765 1784,2031 878,0578 613,8450 993,6017 935,0674 852,1583 971,6169 616,5836 723,8195 950,4317 26,7615 1337,1158 731,9714 696,3521 23,8478 1039,9499 780,8138 24,9990 1717,3667 0 0 0 108,4486 109,4486 124,8772 124,2976 15,5672 678,5627 0 0 0 154,9540 155,9540 107,7049 124,4134 26,4880 605,9909 0 0 0 179,2597 180,2597 76,8005 124,4687 51,5996 1155,3172 0 0 0 112,0100 113,0100 105,1960 125,1413 28,8471 882,5406 0 0 0 97,6165 98,6165 97,3579 125,3717 48,2975 878,0578 895,6379 0 0 0 166,8955 167,8955 91,7338 125,6163 38,1229 1225,4047 981,2976 0 0 0 132,2072 133,2072 118,3345 125,6206 6,9628 694,0327 931,4492 1269,6201 0 0 0 110,2026 111,2026 120,1827 126,2422 19,7782 848,0054 0 0 0 119,7745 120,7745 148,3027 126,4936 19,3454 1329,4575 0 0 0 112,6243 113,6243 89,7821 126,5172 45,3082 955,6530 1404,4540 1269,6201 1209,9091 2132,2115 1756,4313 1739,3668 1230,0793 1150,1697 1076,0848 965,0340 918,3311 1479,8501 1099,2949 1268,1832 1119,4895 1073,4084 1025,1462 2140,7388 1187,2960 1494,4507 993,5985 1049,1278 2516,8994 882,9058 926,4628 1742,5218 1017,7789 1030,8073 836,1281 1187,2960 975,5480 1243,1856 1187,2960 1382,6161 879,0897 2191,9367 1631,0075 1605,5153 1096,7779 1193,7414 1075,1956 1629,7397 1049,1278 1177,0086 1542,0256 1735,0649 1416,2358 1136,9751 932,6946 788,8109 1099,2949 895,4178 870,6417 1080,1984 1299,5025 1110,0442 1810,7419 1522,8088 1556,8888 915,1461 1144,2359 930,4511 1290,2733 1213,5265 1066,7173 1353,4442 1777,9626 1390,4522 1113,7469 1200,2615 1031,6074 1434,2762 1405,0216 1172,6202 0 0 0 162,2440 163,2440 89,1508 126,5221 36,5745 915,2781 1744,2466 1322,7184 1327,4144 0 0 0 115,7852 116,7852 141,3750 126,6102 13,2420 1028,0682 1360,6350 914,4852 1101,0628 0 0 0 140,2467 141,2467 105,1960 127,0546 19,0649 1511,2682 2098,1221 1466,9949 1692,1284 0 0 0 131,4314 132,4314 109,4137 127,1265 16,0007 644,2910 714,7785 1121,2102 826,7599 0 0 0 163,1689 164,1689 115,5986 127,4271 31,5376 966,2456 1191,7214 1485,3315 1214,4328 0 0 0 165,9600 166,9600 112,0275 127,6726 33,3419 761,3884 1096,7779 1193,7414 1017,3026 0 0 0 7 1 06_B2 583 block4 0 0 0 0 0 156,7572 157,7572 112,0275 128,4210 24,6406 920,1511 939,8381 1099,2949 986,4280 98,2400 -2,9534 0,3742 226,8690 -2,9986 0,6937 260,2871 -3,2583 0,6047 257,4255 -2,6657 0,5994 352,2970 -3,7273 0,2682 231,8589 -3,1051 0,3910 414,5042 -3,3845 0,7720 230,2817 -3,2979 0,4563 401,6490 -3,7657 0,4294 201,5231 -3,0847 0,1599 289,2597 -2,8993 0,5158 193,8506 -3,3684 0,4274 55,2345 -2,9361 0,5520 125,6309 -3,0506 0,2715 559,9303 -3,6093 0,8066 241,4172 -2,8063 0,7288 428,1163 -3,1663 0,4557 796,0372 -3,7315 0,3420 84,6799 -2,9845 0,3337 291,2462 -3,4900 0,6003 289,1293 -2,7948 0,2973 599,5741 -3,6976 1,0021 130,6806 -3,1254 0,1250 404,2565 -3,2429 0,6133 396,9641 -3,4899 0,3628 262,1907 -2,8348 0,2642 200,6680 -2,8085 0,2553 176,4389 -3,1819 0,0467 238,6452 -3,6853 0,2266 206,5580 -2,9594 0,7838 323,0330 -3,1123 0,8191 370,3956 -3,5006 0,2698 221,4594 -3,1080 0,3143 3 11 3 06_F9 443 block3 0 0 0 0 0 2 2 6 85_C4 314 block2 0 0 0 0 0 4 12 8 06_H12 756 block4 0 0 0 0 0 3 12 5 06_B11 492 block3 0 0 0 0 0 2 1 5 85_A2 289 block2 0 0 0 0 0 3 12 6 06_D11 516 block3 0 0 0 0 0 4 15 5 89_B6 687 block4 0 0 0 0 0 3 12 1 06_B11 396 block3 0 0 0 0 0 3 24 6 71_D11 528 block3 0 0 0 0 0 4 10 1 06_B8 586 block4 0 0 0 0 0 3 14 8 89_H3 566 block3 0 0 0 0 0 4 13 4 89_H2 661 block4 0 0 0 0 0 4 17 4 89_H10 665 block4 0 0 0 0 0 3 12 4 06_H11 468 block3 0 0 0 0 0 1 8 3 06_E3 56 block1 0 0 0 0 0 1 7 8 06_G1 175 block1 0 0 0 0 0 3 1 4 85_H1 457 block3 0 0 0 0 0 3 18 4 89_H11 474 block3 0 0 0 0 0 4 5 3 85_F10 629 block4 0 0 0 0 0 2 9 6 06_C6 321 block2 0 0 0 0 0 3 12 2 06_D11 420 block3 0 0 0 0 0 1 21 7 71_E5 165 block1 0 0 0 0 0 3 11 6 06_D9 515 block3 0 0 0 0 0 1 15 4 89_G5 87 block1 0 0 0 0 0 2 9 4 06_G6 273 block2 0 0 0 0 0 4 8 1 06_B4 584 block4 0 0 0 0 0 1 21 3 71_E5 69 block1 0 0 0 0 0 3 17 3 89_F9 449 block3 0 0 0 0 0 3 8 3 06_F3 440 block3 0 0 0 0 0 3 11 7 06_F9 539 block3 0 0 0 0 0 1 18 5 89_A11 114 block1 0 0 0 0 0 1 24 2 71_C11 48 block1 0 0 0 0 0 239 240 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 121,1514 122,1514 147,0196 148,0196 102,9809 103,9809 0 0 0 115,1411 116,1411 0 0 0 89,8153 90,8153 0 0 0 99,9730 100,9730 0 0 0 135,3626 136,3626 0 0 0 115,7852 116,7852 0 0 0 154,9540 155,9540 75,6049 113,4417 105,1960 113,3600 101,1709 113,1003 89,1508 112,8160 93,0831 112,3848 80,3442 112,3297 81,8147 112,2601 79,8716 111,9498 97,3579 111,7017 0 0 0 130,6610 131,6610 103,5616 114,1267 0 0 0 141,9131 142,9131 106,0248 114,5680 0 0 0 157,6639 158,6639 75,9957 115,0211 0 0 0 141,9131 142,9131 107,7049 115,3485 23,6865 0 0 0 113,2446 114,2446 79,8716 115,4612 36,7481 0 0 0 130,6610 131,6610 107,7049 115,7747 12,9072 0 0 0 89,4516 90,4516 111,1498 116,3143 29,7826 639,2600 824,0445 691,7413 764,5299 0 0 0 120,4600 121,4600 109,4137 116,6192 6,2447 1503,1619 0 0 0 145,3001 146,3001 87,9173 118,0305 28,7969 1642,5662 0 0 0 133,7745 134,7745 95,1784 118,4244 20,4737 1182,8812 2038,5564 0 0 0 117,0913 118,0913 75,9957 118,4260 43,1131 882,5406 1191,7214 0 0 0 126,8908 127,8908 84,4474 118,5874 30,8384 664,3495 0 0 0 113,8708 114,8708 129,6590 118,8663 9,3554 1306,6493 0 0 0 112,0100 113,0100 120,1827 118,8929 6,3373 1470,8866 0 0 0 147,0196 148,0196 104,3748 119,0650 24,2199 713,4031 993,5985 996,9339 0 0 0 166,8955 167,8955 89,7821 119,0853 41,7553 780,8138 0 0 0 105,6425 106,6425 117,4175 119,2754 14,6505 805,2939 799,9165 1058,6523 887,9542 901,3118 1456,9420 1078,4548 1105,4035 2106,6413 1532,3410 1703,2897 1686,6522 2289,7625 1761,0214 1210,7182 1126,8613 1000,6430 908,7305 994,3308 981,2976 1400,9117 0 0 0 184,0966 185,0966 88,5293 119,3197 56,1212 1247,1628 1703,0440 945,6676 1298,6248 0 0 0 128,3824 129,3824 82,8401 119,5274 33,1588 1269,2299 1518,5339 1307,1647 1364,9762 0 0 0 121,1514 122,1514 120,1827 119,5600 1,9777 743,3130 1243,1856 1000,9747 995,8244 0 0 0 126,8908 127,8908 126,7807 120,0833 11,6957 642,5942 965,9748 846,1245 818,2312 0 0 0 154,9540 155,9540 91,7338 120,4829 31,9961 737,5734 845,9005 1121,2102 901,5614 0 0 0 95,8262 96,8262 127,7372 120,7217 22,2340 755,2174 762,9854 955,8619 824,6882 0 0 0 103,5019 104,5019 116,5054 121,1520 20,3748 831,8514 1074,7586 1068,4262 991,6787 138,4507 -3,0364 0,1481 113,6661 -2,7809 0,2798 197,7825 -2,9148 0,6809 163,4848 -2,7530 0,4201 249,9761 -3,0268 0,3950 134,3307 -3,5502 0,3734 381,3017 -3,4987 0,7826 147,8533 -2,8907 0,3035 338,8687 -3,2230 0,8739 162,7423 -2,9219 0,5572 350,6616 -3,8228 0,2245 495,7579 -3,8539 0,3134 294,2414 -3,0646 0,6749 171,4461 -3,1237 0,3955 561,3395 -3,5076 0,4510 312,6253 -4,0917 0,5404 366,2818 -3,6262 0,3040 772,9944 1073,4084 895,6379 939,0946 828,5543 1703,0440 1551,5953 1359,5613 842,1580 1304,0633 1058,6523 1042,4152 2696,6583 1168,4038 2048,5244 1936,8246 2115,2937 1804,1222 14,5024 7,2619 32,0767 36,2983 30,6766 27,1160 33,6738 20,1713 843,8986 39,8020 1454,8462 746,2354 19,2962 1291,5893 887,0715 831,8514 605,9909 988,0307 820,2075 705,9171 1131,1037 1138,3736 1037,7920 1744,2466 1009,2187 1402,7705 880,7086 879,6512 835,5317 2021,5634 2034,7841 1782,6456 1069,3621 1121,2102 1025,8813 1472,1879 1248,0130 1184,0175 1091,2081 1573,6497 945,6676 880,9555 1389,7221 1193,7414 1190,4981 874,7986 1089,5519 939,8381 1240,9636 962,2396 222,3429 -2,8301 0,4451 469,9126 -3,4906 0,7244 132,0643 -2,9044 0,5648 270,1329 -3,1614 0,6743 790,0974 -4,1314 0,4059 394,6274 -3,9724 0,6164 167,9559 -3,1787 0,4237 370,2708 -3,6532 0,3867 77,3347 -2,8795 0,1879 425,3186 -3,9608 0,6121 122,9763 -3,2141 0,4101 324,9297 -3,4036 0,2964 248,9973 -2,9667 0,5808 200,8654 -3,4237 0,4216 420,1286 -3,2618 0,7059 268,2257 -3,0837 0,5097 2251,7273 2069,1953 1987,8296 1819,0964 1088,7427 1470,3337 40,9541 2280,5113 24,2307 1360,2484 2 21 5 71_A6 309 block2 0 0 0 0 0 4 23 7 71_F10 743 block4 0 0 0 0 0 4 9 5 06_B6 681 block4 0 0 0 0 0 3 9 4 06_H5 465 block3 0 0 0 0 0 1 9 8 06_G5 177 block1 0 0 0 0 0 4 4 2 85_D8 604 block4 0 0 0 0 0 1 2 8 85_G3 170 block1 0 0 0 0 0 4 21 6 71_D6 717 block4 0 0 0 0 0 1 9 4 06_G5 81 block1 0 0 0 0 0 3 8 7 06_F3 536 block3 0 0 0 0 0 1 20 5 71_A3 116 block1 0 0 0 0 0 2 14 5 89_A4 302 block2 0 0 0 0 0 2 11 4 06_G10 275 block2 0 0 0 0 0 4 14 6 89_D4 710 block4 0 0 0 0 0 4 6 5 85_B12 678 block4 0 0 0 0 0 3 17 5 89_B9 497 block3 0 0 0 0 0 4 2 8 85_H4 746 block4 0 0 0 0 0 4 22 3 71_F8 646 block4 0 0 0 0 0 2 12 7 06_E12 348 block2 0 0 0 0 0 4 9 6 06_D6 705 block4 0 0 0 0 0 1 3 5 85_A5 99 block1 0 0 0 0 0 3 6 5 85_B11 486 block3 0 0 0 0 0 1 17 5 89_A9 113 block1 0 0 0 0 0 4 16 6 89_D8 712 block4 0 0 0 0 0 3 1 5 85_B1 481 block3 0 0 0 0 0 3 7 6 06_D1 511 block3 0 0 0 0 0 1 13 2 89_C1 37 block1 0 0 0 0 0 4 16 2 89_D8 616 block4 0 0 0 0 0 4 15 6 89_D6 711 block4 0 0 0 0 0 1 8 7 06_E3 152 block1 0 0 0 0 0 4 16 5 89_B8 688 block4 0 0 0 0 0 1 2 6 85_C3 122 block1 0 0 0 0 0 4 9 1 06_B6 585 block4 0 0 0 0 0 4 16 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 101,9560 102,9560 113,2446 114,2446 119,7745 120,7745 0 0 0 89,8153 90,8153 0 0 0 116,4353 117,4353 0 0 0 171,6094 172,6094 0 0 0 107,8757 108,8757 0 0 0 109,6120 110,6120 0 0 0 102,9809 103,9809 91,0736 107,4086 94,4705 107,1428 85,0019 107,0163 73,7610 106,7046 107,7049 106,6354 121,1135 106,0977 81,8147 105,8617 107,7049 105,5718 106,8612 105,0463 0 0 0 105,6425 106,6425 76,3942 107,5237 0 0 0 103,5019 104,5019 93,7721 107,5583 0 0 0 97,6165 98,6165 112,0275 107,5710 8,6366 32,1114 18,9411 11,6359 21,5975 56,2113 15,6875 26,2188 8,9324 15,7144 0 0 0 117,7532 118,7532 82,3229 107,5821 0 0 0 94,1174 95,1174 66,6275 107,6453 49,1970 0 0 0 99,4909 100,4909 121,1135 107,7907 11,6537 0 0 0 109,0274 110,0274 90,4230 107,9788 17,0558 777,4789 682,8494 784,1885 971,6169 721,1676 670,2943 920,1511 891,6507 791,0589 10,3760 1033,9847 791,0589 752,1872 910,4545 761,3884 0 0 0 97,6165 98,6165 105,1960 108,1941 12,3526 835,8219 0 0 0 121,1514 122,1514 112,0275 108,5890 14,5888 1391,4363 0 0 0 170,6621 171,6621 74,4770 108,6103 53,8282 601,0403 0 0 0 115,1411 116,1411 76,3942 109,0855 30,1234 945,2603 0 0 0 132,2072 133,2072 106,8612 109,1906 21,9448 993,6017 0 0 0 110,2026 111,2026 108,5558 109,2389 0,8585 674,3785 957,0993 985,1290 0 0 0 104,5607 105,5607 114,6973 109,4054 5,0830 820,2075 0 0 0 121,1514 122,1514 84,4474 109,4231 21,6429 966,2456 0 0 0 112,0100 113,0100 121,1135 109,6298 12,8403 1016,3820 0 0 0 106,1921 107,1921 127,7372 109,6808 16,5895 905,6801 1263,1377 1396,4561 1188,4246 1794,0595 1620,8815 1477,1077 919,1631 1138,3736 1007,9275 1565,7127 1156,1752 1180,6985 872,2023 1844,2092 2080,6980 1639,5030 1243,1856 1104,6715 1097,7058 1154,8448 1346,6202 1034,1684 1526,3420 1121,2102 1346,3295 1346,2867 1206,8564 1129,6550 1032,8005 1441,8038 981,2976 760,5475 1088,7427 930,5257 844,0465 825,2761 1017,0895 2636,7350 2348,2969 2273,1696 1434,2762 1240,9636 1215,6189 1339,1629 1017,6837 1140,3798 1526,3420 1121,2102 1122,9066 748,7310 897,6672 772,2308 1179,2624 1248,0130 1115,8088 1325,0179 1330,6097 1182,4261 1012,8576 1291,9169 1031,9445 1102,3911 1457,9297 1198,1018 1037,8938 1240,9636 1023,3054 1069,3621 1068,4262 979,5985 1049,1278 965,9748 1049,1278 963,3252 979,7269 925,4970 0 0 0 115,7852 116,7852 90,4230 109,9280 17,3352 694,0327 1339,1629 1068,4262 1033,8739 0 0 0 121,1514 122,1514 86,1394 109,9871 20,6666 808,9578 1297,1501 1099,2949 1068,4676 0 0 0 92,0917 93,0917 115,5986 111,0304 17,1181 887,0715 1819,0964 1200,2615 1302,1431 0 0 0 125,4217 126,4217 99,6193 111,0661 13,1448 856,3575 1108,0474 1058,6523 1007,6857 0 0 0 74,2279 75,2279 125,8273 111,2898 32,3441 530,8664 758,1348 1174,6275 821,2096 0 0 0 94,5371 95,5371 95,8957 111,2939 27,8553 878,0578 1022,7431 977,5169 959,4393 0 0 0 89_F8 640 block4 0 0 0 0 0 160,4028 161,4028 71,1641 111,4448 45,2478 896,2784 1404,4540 1330,6097 1210,4474 274,5721 -3,4932 0,9042 74,0173 -3,1329 0,2676 326,4826 -2,8544 0,3605 133,3610 -3,1793 0,3542 474,2916 -3,5009 0,3145 245,5518 -3,2718 0,4808 323,9500 -3,1947 0,5329 253,7751 -3,4247 0,3202 408,2876 -3,7172 0,5234 115,3965 -3,2180 0,4653 373,3571 -3,3834 0,4388 171,8927 -2,9767 0,3155 571,7282 -3,8581 0,8226 149,0847 -3,3622 0,4332 387,1621 -3,2773 1,2764 206,2981 -3,6293 0,3719 263,8439 -3,3616 0,2299 135,0208 -3,1088 0,3068 215,4447 -2,9449 0,2009 368,3867 -3,2805 0,3069 406,3712 -4,4072 0,4366 232,3686 -3,4833 0,1753 173,7214 -3,4063 0,0399 402,5899 -3,3626 0,5563 115,4937 -2,8500 0,3984 172,8963 -3,3740 0,3294 251,8344 -3,4618 0,4675 250,9740 -3,3652 1,0219 227,6022 -3,4781 0,3068 225,3068 -3,2563 0,1101 182,8515 -3,1962 0,4461 69,3368 -3,2153 0,1837 148,0788 -3,1373 0,4133 4 21 5 71_B6 693 block4 0 0 0 0 0 4 12 4 06_H12 660 block4 0 0 0 0 0 3 18 8 89_H11 570 block3 0 0 0 0 0 2 12 3 06_E12 252 block2 0 0 0 0 0 4 15 4 89_H6 663 block4 0 0 0 0 0 3 8 2 06_D3 416 block3 0 0 0 0 0 1 22 1 71_A7 22 block1 0 0 0 0 0 1 20 1 71_A3 20 block1 0 0 0 0 0 3 22 3 71_F7 454 block3 0 0 0 0 0 1 24 5 71_A11 120 block1 0 0 0 0 0 2 10 7 06_E8 346 block2 0 0 0 0 0 1 5 6 85_C9 125 block1 0 0 0 0 0 4 15 8 89_H6 759 block4 0 0 0 0 0 2 17 4 89_G10 281 block2 0 0 0 0 0 1 2 2 85_C3 26 block1 0 0 0 0 0 4 15 2 89_D6 615 block4 0 0 0 0 0 4 14 4 89_H4 662 block4 0 0 0 0 0 4 8 3 06_F4 632 block4 0 0 0 0 0 4 17 8 89_H10 761 block4 0 0 0 0 0 3 13 1 89_B1 397 block3 0 0 0 0 0 22,0129 1834,4770 16,1999 1064,2929 1 18 1 89_A11 18 block1 0 0 0 0 0 4 2 4 85_H4 650 block4 0 0 0 0 0 2 12 8 06_G12 372 block2 0 0 0 0 0 4 22 7 71_F8 742 block4 0 0 0 0 0 3 17 8 89_H9 569 block3 0 0 0 0 0 4 16 1 89_B8 592 block4 0 0 0 0 0 2 4 3 85_E8 244 block2 0 0 0 0 0 4 17 2 89_D10 617 block4 0 0 0 0 0 4 18 5 89_B12 690 block4 0 0 0 0 0 4 21 1 71_B6 597 block4 0 0 0 0 0 1 3 1 85_A5 3 block1 0 0 0 0 0 1 23 2 71_C9 47 block1 0 0 0 0 0 241 242 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 83,9003 0 0 0 103,5019 104,5019 84,9003 110,7991 111,7991 0 0 0 107,3087 108,3087 0 0 0 129,1365 130,1365 0 0 0 106,1921 107,1921 110,2785 82,8401 106,0248 96,6222 120,1827 70,8675 0 0 0 102,4657 103,4657 109,4137 0 0 0 102,4657 103,4657 91,7338 0 0 0 123,2606 124,2606 86,7224 98,2723 98,2593 97,6670 97,1795 97,1409 96,7045 96,5838 96,4721 95,5656 0 0 0 100,4605 101,4605 106,0248 98,3295 0 0 0 128,3824 129,3824 82,8401 98,6854 0 0 0 113,2446 114,2446 68,9482 98,9846 25,7376 8,9530 21,6611 5,7294 14,7438 19,2578 27,7609 0 0 0 90,1834 91,1834 92,4037 99,4012 0 0 0 96,2660 97,2660 88,5293 99,5690 13,0096 0 0 0 117,0913 118,0913 92,4037 99,7075 15,1187 0 0 0 97,6165 98,6165 101,1709 100,0290 2,0903 1162,1469 784,1885 662,4152 0 0 0 99,0143 100,0143 93,0831 100,0849 7,5940 649,5036 0 0 0 104,0284 105,0284 105,1960 100,6042 6,9666 691,7413 0 0 0 87,3598 88,3598 88,5293 100,7364 22,1639 2246,8088 1911,4931 783,4288 0 0 0 106,7475 107,7475 72,4111 100,9115 26,0768 1033,9847 0 0 0 99,9730 100,9730 106,8612 101,7662 4,4764 761,3884 0 0 0 120,4600 121,4600 82,8401 101,7765 18,8112 1089,3942 820,4938 1063,5077 0 0 0 102,4657 103,4657 80,3442 101,8267 21,1703 824,0445 1022,7431 846,1245 0 0 0 109,6120 110,6120 110,2785 102,2571 13,3204 1284,1047 0 0 0 90,9330 91,9330 122,0486 102,4835 17,0359 843,8986 0 0 0 109,0274 110,0274 101,9595 102,9213 5,6865 794,5553 1411,8654 1532,3410 1246,2539 1204,3452 1121,2102 1056,4847 2030,0583 2196,4509 1836,8713 897,6374 881,7966 955,8619 1704,7213 964,9654 889,7436 774,2253 1703,0440 2571,5719 1812,2543 1760,8093 1168,4038 1237,8005 1502,9877 1187,2960 1117,5663 1735,9821 1724,4463 1559,5506 2243,1826 2184,8248 1960,9512 993,6017 746,2354 703,4820 687,2414 982,5095 839,8376 824,0445 17,2669 1064,2929 6,9373 1028,0682 20,5465 856,3575 21,5828 1010,6127 1605,5918 1551,5953 1383,5962 888,0992 1049,1278 998,3495 1227,0932 1204,3452 1078,4548 894,4875 976,3083 990,0138 1311,0126 1078,4548 1123,9923 1411,8654 1354,7390 1202,1473 1367,8586 1088,7427 1093,5486 1382,4026 1503,9382 1316,8779 1464,5518 1551,5953 1348,0717 1007,9789 1000,9747 955,1037 1449,3592 1590,8375 1350,2698 1332,0731 1448,9340 1290,1338 1970,6697 2324,8671 1776,5072 1185,4712 1017,6837 0 0 0 99,0143 100,0143 84,4474 102,9542 20,7591 900,9548 2021,5634 1977,7986 1633,4389 0 0 0 122,5517 123,5517 107,7049 103,2342 21,8979 848,0054 1243,1856 1448,9340 1180,0417 0 0 0 109,0274 110,0274 90,4230 103,3439 11,2168 1314,2236 1269,8651 1187,2960 1257,1283 0 0 0 81,9290 82,9290 108,5558 103,7864 19,9058 798,0930 1249,7976 1168,4038 1072,0981 0 0 0 105,0988 106,0988 95,8957 103,8586 7,4210 761,3884 1012,8576 1044,4576 939,5679 0 0 0 87,6980 88,6980 125,8273 104,4635 19,4761 734,7554 998,3495 1240,9636 991,3562 0 0 0 93,7026 94,7026 123,9306 104,9104 16,5593 1022,2006 1311,0126 1955,1507 1429,4546 477,6195 -3,7274 0,2672 253,1765 -3,2300 0,1418 155,1147 -3,1658 0,2952 240,7599 -3,3608 0,0724 64,4153 -3,6093 0,0979 305,4000 -3,5028 0,6263 634,7272 -3,9154 0,6870 395,7933 -3,5424 0,5869 188,7392 -3,3620 0,2688 485,8856 -4,1375 0,5214 108,9058 -3,1546 0,2112 183,4023 -3,6707 0,4768 160,1173 -3,1010 0,1964 666,9847 -4,0920 0,8685 669,8522 -4,0123 0,6312 251,0512 -3,2286 0,4743 120,3841 -2,9424 0,2815 711,0309 -4,1042 0,5479 491,9949 -3,5667 0,7805 424,6024 -3,4166 0,5492 295,6542 -3,9620 0,2377 439,2699 -4,3194 0,6518 338,8226 -3,8073 0,7405 151,5472 -3,1755 0,2449 262,5006 -3,2974 0,6924 269,6580 -3,2943 0,4753 168,9196 -3,5256 0,4238 315,0669 -3,6118 0,6249 271,9389 -3,4986 0,7404 227,0289 -3,7689 0,4330 280,5278 -3,7826 0,4076 85,5884 -3,3239 0,2532 302,5380 -3,8214 0,6504 14,0867 1218,2236 26,0233 1454,8462 1 21 1 71_A5 21 block1 0 0 0 0 0 1 22 4 71_G7 94 block1 0 0 0 0 0 4 14 8 89_H4 758 block4 0 0 0 0 0 4 15 7 89_F6 735 block4 0 0 0 0 0 3 18 1 89_B11 402 block3 0 0 0 0 0 1 8 1 06_A3 8 block1 0 0 0 0 0 4 6 1 85_B12 582 block4 0 0 0 0 0 1 8 5 06_A3 104 block1 0 0 0 0 0 1 23 8 71_G9 191 block1 0 0 0 0 0 1 13 6 89_C1 133 block1 0 0 0 0 0 2 18 7 89_E12 354 block2 0 0 0 0 0 2 13 2 89_C2 229 block2 0 0 0 0 0 2 2 2 85_C4 218 block2 0 0 0 0 0 2 12 6 06_C12 324 block2 0 0 0 0 0 3 7 4 06_H1 463 block3 0 0 0 0 0 2 10 5 06_A8 298 block2 0 0 0 0 0 4 8 7 06_F4 728 block4 0 0 0 0 0 1 5 2 85_C9 29 block1 0 0 0 0 0 1 9 5 06_A5 105 block1 0 0 0 0 0 1 1 6 85_C1 121 block1 0 0 0 0 0 3 18 6 89_D11 522 block3 0 0 0 0 0 2 12 2 06_C12 228 block2 0 0 0 0 0 1 15 7 89_E5 159 block1 0 0 0 0 0 4 16 4 89_H8 664 block4 0 0 0 0 0 2 8 1 06_A4 200 block2 0 0 0 0 0 3 8 6 06_D3 512 block3 0 0 0 0 0 1 23 4 71_G9 95 block1 0 0 0 0 0 1 11 1 06_A9 11 block1 0 0 0 0 0 1 9 1 06_A5 9 block1 0 0 0 0 0 1 17 3 89_E9 65 block1 0 0 0 0 0 2 15 1 89_A6 207 block2 0 0 0 0 0 1 22 8 71_G7 190 block1 0 0 0 0 0 2 14 7 89_E4 350 block2 0 0 0 0 0 1 11 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 86,3698 0 0 0 0 0 0 87,6980 88,6980 87,3698 117,0913 118,0913 0 0 0 77,1390 78,1390 0 0 0 89,4516 90,4516 0 0 0 94,1174 95,1174 82,3229 83,9024 85,0019 76,3942 66,8397 72,0900 0 0 0 98,5430 99,5430 75,2215 0 0 0 81,1344 82,1344 80,3442 0 0 0 92,0917 93,0917 89,1508 88,6921 88,3308 88,1834 87,9512 87,8521 87,5731 87,0634 86,7855 86,5865 0 0 0 94,5371 95,5371 72,4111 88,7029 0 0 0 91,7008 92,7008 75,9957 88,9524 0 0 0 102,4657 103,4657 79,8716 89,3927 11,8245 14,2972 3,6506 13,1547 5,9156 3,4411 11,9293 10,3665 26,6796 0 0 0 96,2660 97,2660 74,8456 89,8587 13,0481 0 0 0 92,8875 93,8875 94,4705 89,9380 6,5279 0 0 0 94,1174 95,1174 94,4705 90,0489 7,3547 0 0 0 86,0478 87,0478 105,1960 90,0962 13,5374 791,0589 852,1583 873,6230 910,4545 993,6017 787,6034 878,0578 743,3130 11,8766 1089,3942 856,3575 723,8195 649,5036 761,3884 749,1933 14,6060 1344,8008 0 0 0 99,4909 100,4909 74,8456 90,4782 13,5910 1169,0178 0 0 0 101,9560 102,9560 93,0831 90,7268 12,5741 791,0589 0 0 0 89,0924 90,0924 72,0900 91,9811 21,4816 860,6032 0 0 0 85,1049 86,1049 84,4474 92,5699 13,5032 731,9714 775,5625 0 0 0 93,7026 94,7026 96,6222 92,7596 4,4103 920,1511 0 0 0 87,6980 88,6980 85,0019 93,8860 13,1222 1742,3990 0 0 0 96,7110 97,7110 105,1960 93,9204 12,8993 656,7492 944,0927 949,0204 0 0 0 92,4872 93,4872 103,5616 93,9633 8,9521 824,0445 0 0 0 94,1174 95,1174 71,4666 94,0207 22,5059 1045,9636 0 0 0 84,1960 85,1960 81,3156 94,2858 20,0225 3687,7421 4991,0396 4068,8489 4249,2102 1191,7214 1362,9331 1200,2060 1173,0951 1269,6201 1088,9199 849,9541 2405,6516 2011,9312 2053,3273 1304,0633 1193,7414 1139,3186 970,1051 825,8796 949,6839 966,4727 962,8784 1173,0951 1661,7055 1228,9863 1198,0128 1138,3736 1070,0031 1662,1698 1448,9340 1340,5194 1860,9896 1767,1769 1713,1449 1518,5339 1590,8375 1367,6577 1058,6994 1466,9949 1104,4326 1236,6128 2115,2937 1409,9881 915,1461 992,9465 944,0927 1126,8613 1053,4331 1093,9855 849,2250 1058,6994 905,9097 973,7863 883,8019 1573,6497 1932,5965 1531,8801 975,7705 957,0793 801,5461 1091,2081 1672,0413 1174,8793 927,2263 1654,0386 1887,7975 1628,8789 1411,8654 1422,3711 1231,6133 877,0681 1180,9248 1131,1037 1495,2504 1713,8721 1459,3801 0 0 0 98,0771 99,0771 102,7565 94,4298 10,6304 685,0321 975,0156 860,9712 840,3396 0 0 0 118,4211 119,4211 80,3442 94,6995 20,6944 856,3575 1198,0128 1099,2949 1051,2217 0 0 0 86,0478 87,0478 109,4137 94,8409 12,7101 705,9171 888,0992 1049,1278 881,0481 0 0 0 85,7296 86,7296 105,1960 94,9196 9,7785 1039,9499 1557,7960 1276,9757 1291,5739 0 0 0 117,7532 118,7532 77,6368 95,0058 20,5919 767,7094 944,0927 1174,6275 962,1432 0 0 0 104,5607 105,5607 92,4037 95,3418 8,1568 780,8138 1502,9877 1413,6601 1232,4872 0 0 0 06_A9 107 block1 0 0 0 0 0 109,0274 110,0274 98,1028 95,3917 15,1740 764,5299 1581,6065 1162,2531 1169,4632 408,5860 -3,5663 0,7563 393,7023 -3,6376 0,6422 204,0587 -3,3403 0,6092 259,2315 -3,7518 0,2611 171,7140 -3,2052 0,1489 175,8277 -3,4800 0,5422 146,0885 -3,1449 0,3858 670,1073 -5,5028 0,1249 158,6550 -3,6941 0,4879 234,4110 -3,5146 0,3208 167,3385 -3,1668 0,4000 333,5584 -4,4473 0,1272 197,6576 -3,6043 0,2979 126,7903 -3,1562 0,3429 321,3470 -3,7317 0,5241 204,8259 -3,3761 0,3724 274,1926 -4,0055 0,4842 170,0509 -3,4130 0,3688 407,6574 -3,7205 0,4913 172,6647 -3,5618 0,3147 387,4071 -3,8646 0,5486 181,0134 -4,2628 0,3296 325,9531 -3,9207 0,4752 341,9968 -3,6051 0,6615 636,5786 -3,8958 0,6582 127,7343 -3,3224 0,2654 423,1501 -4,0885 0,6088 138,0061 -3,4645 0,2959 203,0240 -3,4223 0,3604 134,6884 -3,1885 0,1951 461,0562 -3,6868 0,6883 159,9199 -3,4449 0,6654 272,3713 -4,2336 0,4147 4 4 5 85_B8 676 block4 0 0 0 0 0 1 11 7 06_E9 155 block1 0 0 0 0 0 1 15 3 89_E5 63 block1 0 0 0 0 0 4 18 1 89_B12 594 block4 0 0 0 0 0 2 17 8 89_G10 377 block2 0 0 0 0 0 4 23 8 71_H10 767 block4 0 0 0 0 0 1 19 1 71_A1 19 block1 0 0 0 0 0 3 23 8 71_H9 575 block3 0 0 0 0 0 1 24 3 71_E11 72 block1 0 0 0 0 0 2 2 8 85_G4 362 block2 0 0 0 0 0 3 13 5 89_B1 493 block3 0 0 0 0 0 1 22 5 71_A7 118 block1 0 0 0 0 0 4 7 4 06_H2 655 block4 0 0 0 0 0 4 16 7 89_F8 736 block4 0 0 0 0 0 2 8 5 06_A4 296 block2 0 0 0 0 0 2 13 6 89_C2 325 block2 0 0 0 0 0 2 2 4 85_G4 266 block2 0 0 0 0 0 2 15 2 89_C6 231 block2 0 0 0 0 0 3 17 4 89_H9 473 block3 0 0 0 0 0 4 4 6 85_D8 700 block4 0 0 0 0 0 1 17 6 89_C9 137 block1 0 0 0 0 0 11,7083 1511,2682 2 15 6 89_C6 327 block2 0 0 0 0 0 2 14 3 89_E4 254 block2 0 0 0 0 0 2 4 7 85_E8 340 block2 0 0 0 0 0 4 23 4 71_H10 671 block4 0 0 0 0 0 2 15 5 89_A6 303 block2 0 0 0 0 0 2 18 2 89_C12 234 block2 0 0 0 0 0 1 11 3 06_E9 59 block1 0 0 0 0 0 4 21 7 71_F6 741 block4 0 0 0 0 0 4 17 6 89_D10 713 block4 0 0 0 0 0 2 18 4 89_G12 282 block2 0 0 0 0 0 1 17 2 89_C9 41 block1 0 0 0 0 0 243 244 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 63,2822 64,2822 0 0 0 64,1601 65,1601 0 0 0 64,2320 65,2320 0 0 0 65,1474 66,1474 67,9651 58,6508 57,9333 56,3972 0 0 0 64,3044 65,3044 68,9482 0 0 0 63,9484 64,9484 74,4770 0 0 0 76,9284 77,9284 69,7383 71,8525 66,7137 64,9238 64,6327 61,2228 60,8204 59,6503 0 0 0 80,3683 81,3683 58,8670 72,2480 0 0 0 75,9124 76,9124 71,7753 76,5637 0 0 0 84,1960 85,1960 78,9525 79,0867 5,0435 11,6761 4,4163 6,8152 3,7533 3,6173 2,8161 3,1380 3,4581 0 0 0 77,3520 78,3520 70,8675 79,2823 9,5277 0 0 0 83,9003 84,9003 78,0671 79,8254 3,5401 0 0 0 87,6980 88,6980 71,7753 81,9433 0 0 0 76,5148 77,5148 80,3442 82,1621 6,7427 955,6530 891,6507 905,6801 882,5406 774,1835 856,3575 516,0338 511,8852 515,6422 513,7283 498,7575 498,7575 8,8313 1076,7500 0 0 0 88,3867 89,3867 79,4078 82,2798 5,2919 691,7413 0 0 0 74,2279 75,2279 75,6049 83,2326 14,4207 812,6644 0 0 0 94,1174 95,1174 65,4367 83,2521 15,5523 971,6169 0 0 0 87,3598 88,3598 93,0831 83,2588 12,3945 612,4989 0 0 0 80,1191 81,1191 75,2215 83,2698 10,0030 1560,1831 0 0 0 81,1344 82,1344 78,5056 83,6726 6,8012 651,2828 811,4923 1104,6715 888,0992 1115,6286 823,5567 1162,2531 979,5985 952,4183 0 0 0 79,3893 80,3893 82,3229 84,1660 5,9176 758,2843 0 0 0 81,3961 82,3961 79,4078 84,2608 6,7574 856,3575 0 0 0 87,0258 88,0258 69,7383 85,0762 14,4620 1725,7061 0 0 0 83,9003 84,9003 89,1508 85,1690 3,5232 887,0715 1464,5518 1448,9340 1266,8524 1678,4770 1600,7955 1668,3262 1346,2867 1466,9949 1223,2130 1096,7779 1291,9169 1048,9931 855,8155 872,0756 985,8089 874,5860 1526,3420 1571,0966 1351,0305 1744,2466 1631,0075 1484,0014 1487,5378 1354,7390 1244,6425 1339,1629 1338,5770 1194,4733 1353,4442 1503,9382 1246,6410 4605,7879 3998,1005 4139,3431 2311,5636 735,3375 1273,6949 1645,9229 1672,0413 1391,4406 557,7929 1058,6523 544,2335 1682,4270 554,7569 1485,3315 536,3164 522,3064 522,0212 706,2591 678,0473 678,6624 710,8263 912,8486 851,9102 585,4346 566,3704 566,4804 1043,0303 1494,6014 1365,9383 0 0 0 95,8262 96,8262 70,8675 85,6320 13,0920 710,8773 1613,6236 820,0640 1048,1883 0 0 0 90,9330 91,9330 76,3942 85,6515 8,0436 1052,0255 1339,1629 1682,4270 1357,8718 0 0 0 89,0924 90,0924 71,4666 85,6622 12,8292 701,0764 869,8955 952,4183 841,1301 0 0 0 88,3867 89,3867 75,2215 85,8138 9,5689 628,1867 1210,7182 1017,6837 952,1962 0 0 0 83,3198 84,3198 89,7821 85,8148 3,4736 864,8959 979,5985 1000,9747 948,4897 0 0 0 95,3914 96,3914 73,0727 85,8418 11,5024 1169,0178 1389,7221 1485,3315 1348,0238 0 0 0 86,6958 87,6958 83,9024 86,5531 2,5823 1196,9032 1629,7397 1284,4080 1370,3503 228,8590 -3,9724 0,2056 162,2272 -3,9748 0,3651 73,1790 -3,4642 0,0820 296,7359 -3,4256 0,5176 128,1163 -3,2953 0,3944 315,6169 -3,9648 0,4676 492,7152 -3,5282 0,6350 328,9926 -3,8585 0,4003 63,0710 -4,3072 0,2147 323,3881 -3,8247 0,4081 270,0064 -3,6075 0,3583 229,9212 -3,3234 0,4316 281,5624 -4,0202 0,4812 251,9473 -3,3573 0,4767 169,7937 -3,5697 0,5109 239,0264 -3,6964 0,3039 158,9303 -3,3947 0,3700 343,1374 -4,0074 0,3312 357,2059 -4,1534 0,4714 312,8279 -3,9298 0,4562 250,1024 -3,8967 0,3450 324,1742 -3,9441 0,4810 414,2926 -5,7541 0,0896 899,0305 -3,9364 0,8539 463,5795 -4,2129 0,6376 301,9489 -3,3393 0,4322 666,6707 -3,5823 0,8923 548,9075 -3,5415 0,7933 105,2448 -3,2436 0,3082 97,4291 -3,2069 0,3061 97,8463 -3,2354 0,3165 1210,7182 1240,9636 1088,1154 5,1452 3814,1409 3 15 7 89_F5 543 block3 0 0 0 0 0 3 18 2 89_D11 426 block3 0 0 0 0 0 2 18 6 89_C12 330 block2 0 0 0 0 0 2 12 4 06_G12 276 block2 0 0 0 0 0 4 16 8 89_H8 760 block4 0 0 0 0 0 4 4 1 85_B8 580 block4 0 0 0 0 0 2 1 1 85_A2 193 block2 0 0 0 0 0 1 21 5 71_A5 117 block1 0 0 0 0 0 3 18 3 89_F11 450 block3 0 0 0 0 0 2 15 8 89_G6 375 block2 0 0 0 0 0 2 17 2 89_C10 233 block2 0 0 0 0 0 4 18 3 89_F12 642 block4 0 0 0 0 0 3 18 7 89_F11 546 block3 0 0 0 0 0 4 7 8 06_H2 751 block4 0 0 0 0 0 2 18 8 89_G12 378 block2 0 0 0 0 0 2 17 6 89_C10 329 block2 0 0 0 0 0 4 18 7 89_F12 738 block4 0 0 0 0 0 1 18 6 89_C11 138 block1 0 0 0 0 0 1 17 7 89_E9 161 block1 0 0 0 0 0 2 15 4 89_G6 279 block2 0 0 0 0 0 3 23 4 71_H9 479 block3 0 0 0 0 0 1 18 2 89_C11 42 block1 0 0 0 0 0 1 19 5 71_A1 115 block1 0 0 0 0 0 1 3 7 85_E5 147 block1 0 0 0 0 0 1 3 3 85_E5 51 block1 0 0 0 0 0 2 19 1 71_A2 211 block2 0 0 0 0 0 2 2 3 85_E4 242 block2 0 0 0 0 0 2 19 5 71_A2 307 block2 0 0 0 0 0 2 2 7 85_E4 338 block2 0 0 0 0 0 4 21 8 71_H6 765 block4 0 0 0 0 0 4 21 4 71_H6 669 block4 0 0 0 0 0