Dissecting the function of γTuRC subunits in microtubule nucleation and organization

Abstract

[eng] The depletion of MZT1 in human cells causes severe mitotic spindle defects. Depleted cells lack centrosomal γ-tubulin and arrest in mitosis with a monopolar spindle configuration. Similarly, double deletion mutants of the plant MZT1 orthologs GIP1a and GIP1b are embryonic lethal due to abnormal spindle microtubule distribution and chromosome mis-segregation. Moreover GIP1a and GIP1b were shown to localize to active nucleation sites in the interphase cortical microtubule array. MZT1 function is conserved in fission yeast, where it interacts with GCP3, and is an essential component for the recruitment of the γ-tubulin complex to the spindle pole body, the centrosome equivalent, but not for assembly of the γ-tubulin complex. However, the molecular mechanisms underlying these effects remain unknown. The main goal of this project is to study how MZT1 regulates γTuRC to control MT nucleation and organization. In this work I confirm that in human cells MZT1 is a subunit of the γTuRC and is required for the targeting of the γTuRC to centrosomes and for proper spindle formation. By sucrose gradient fractionation I found that in mammalian cells, MZT1 is not required to assemble the γTuRC. Interestingly, I found that MZT1 is necessary for the interaction of the γTuRC with the targeting factor NEDD1/GCPWD. While in plants and in fission yeast MZT1 interacts with the N-terminal region of GCP3, I found that in mammalian cells MZT1 interacts with a conserve motif at the N-terminal extension of GCP2, GCP3, GCP5 and GCP6. Furthermore, by immunoprecipitation of FLAG-tagged GCPs MZT1 binding motif mutants, I found that the mutants can be integrated into the γTuRC but lost the interaction with GCP-WD and fail to be targeted to the centrosomes To study the role of MZT1 in MT nucleation I performed a MT regrowth experiment with U2OS cells over expressing the CDK5RAP2 nucleation-activating fragment (CDK5RAP2 CM1) and depleted of MZT1. The MT nucleation induced by CDK5RAP2 was lost upon the depletion of MZT1, suggesting that MZT1 in required for the MT nucleation activation mediated by CDK5RAP2. In summary MZT1 is required for all γTuRC-dependent functions including centriole duplication. MZT1 binds to a conserved motif present in the extended N-termini of GCP2, GCP3, GCP5 and GCP6, allowing specific recognition of fully assembled γTuRC. Binding of MZT1 primes γTuRC for interaction with the adapter NEDD1/GCP-WD for targeting γTuRC to centrosomes. In addition, MZT1-dependent priming is required for the CDK5RAP2 CM1 domain to activate γTuRC nucleation activity. Thus, by enabling specific recognition of γTuRC by targeting and activation factors, MZT1 spatially controls microtubule nucleation.

[spa] En las células humanas la depleción de MZT1 provoca graves defectos del huso mitótico. Las células deplecionadas carecen de γ-tubulina centrosomal y presentan una detención de la mitosis con una configuración monopolar del huso mitótico. Del mismo modo, mutantes de deleción dobles de planta MZT1 con sus ortólogos GIP1a y GIP1b son letales para los embriones debido a la anormal distribución de los microtúbulos del huso mitótico y la mala segregación del cromosoma. Además, GIP1a y GIP1b localizan en sitios de nucleación activos de los microtúbulos corticales. La función de MZT1 se conserva en la levadura de fisión, donde interactúa con GCP3, y es un componente esencial para el reclutamiento del complejo de γ-tubulina en el huso polar del cuerpo apical, el equivalente al centrosoma, pero no para el montaje de la γ-tubulina compleja. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a estos efectos siguen siendo desconocidos. El objetivo principal de este proyecto es estudiar cómo MZT1 regula la actividad del γTuRC en la nucleación y organización de los microtúbulos. En este trabajo encontré que MZT1 es necesaria para todas las funciones γTuRC-dependientes, como la duplicación de centríolos. MZT1 se une a un motivo conservado presente en la N-terminales extendida de GCP2, GCP3, GCP5 y GCP6, lo que permite el reconocimiento específico de γTuRC totalmente ensamblado. La unión de MZT1 al γTuRC “prepara” al complejo para la interacción con el adaptador NEDD1/GCP-WD para la orientación γTuRC a los centrosomas. Además, se requieren esta “preparación” para activar la actividad nucleadora del γTuRC mediada por CDK5RAP2 CM1. Por lo tanto, al permitir el reconocimiento específico de γTuRC por los factores de reclutamiento y los factores de activación, se observa que la MZT1 controla espacialmente la nucleación de microtúbulos.