Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2445/121346
Title: Comunicación microbiota- huésped: Internalización y señalización intracelular de vesículas de membrana externa de cepas probióticas y comensales de E. coli en células de epitelio intestinal
Author: Cañas Pacheco, María Alexandra
Director/Tutor: Baldomà Llavinés, Laura
Badia Palacín, Josefa
Keywords: Probiòtics
Membranes (Biologia)
Microbiota
Probiotics
Membranes (Biology)
Issue Date: 21-Jul-2017
Publisher: Universitat de Barcelona
Abstract: [spa] Las interacciones entre la microbiota y el huésped son complejas y dependen principalmente de factores secretados que pueden atravesar la capa de mucus y alcanzar el epitelio. Dentro de los factores secretados, las bacterias liberan vesículas extracelulares como mecanismo de comunicación con el entorno. Estas vesículas representan un mecanismo de secreción de proteínas y otros compuestos activos en un ambiente protegido que permiten la interacción a distancia con otras células. Puesto que Escherichia coli se encuentra formando parte de la microbiota normal del intestino humano, en este trabajo, se han utilizado como modelo de estudio las vesículas de membrana externa (OMVs) secretadas por la cepa probiótica E. coli Nissle 1917 (EcN) y la cepa comensal ECOR12. Como primer objetivo nos planteamos establecer la vía de internalización de las OMVs de EcN y ECOR12 en varias líneas celulares de epitelio intestinal. El análisis mediante espetrofluorimetría y microscopía confocal de fluorescencia de células incubadas con OMVs marcadas con rodamina B-R18 en presencia de inhibidores específicos de las vías de endocitosis ha permitido establecer que las OMVs de estas cepas son internalizadas en las células epiteliales mediante endocitosis mediada por clatrina. La colocalización de las OMVs con clatrina y marcadores específicos de endosomas (proteína EEA-1) y lisosomas (Lysotracker) demuestra el tráfico intracelular típico de esta vía, siendo por tanto dirigidas hacia compartimentos lisosómicos. También hemos demostrado que las OMVs de estas cepas no son citotóxicas puesto que no alteran la viabilidad celular si bien reducen la proliferación de células HT-29. El marcaje específico de aductos de 8-oxo-dG, reveló que, a diferencia de otras cepas de E. coli, las OMVs de EcN y ECOR12 no promueven este tipo de daño oxidativo. Sin embargo, el análisis por citometría de flujo y microscopía confocal de fluorescencia de la histona H2AX fosforilada (γH2AX) evidenció que OMVs de la cepa probiótica EcN producen una mayor cantidad de roturas de doble cadena en el DNA que las vesículas de la cepa comensal ECOR12. Las OMVs contienen múltiples componentes que actúan como ligandos de los receptores de reconocimiento de patrones microbianos presentes en la célula huésped. Uno de estos componentes es el peptidoglicano (PGN) reconocido específicamente por los receptores citoplasmáticos tipo NOD. Puesto que la entrada de las OMVs por endocitosis y su acceso a endosomas constituyen una de las vías de entrada del PGN al interior celular, nos planteamos analizar la implicación de los receptores NOD-1/NOD-2 en la señalización mediada por las OMVs de EcN y ECOR12. Para ello seguimos dos aproximaciones. Por una parte se analizó la respuesta inflamatoria inducida por las OMVs en células Caco-2 silenciadas con siRNA específicos para estos receptores. El análisis por RT-qPCR y ELISA de las citoquinas IL-6 e IL-8 confirmó la implicación de NOD-1, pero no de NOD-2 en la señalización mediada por OMVs. Por otra parte, demostramos mediante microscopía de fluorescencia la interacción de NOD- 1 con las OMVs, así como el reclutamiento de NOD-1 hacia los compartimentos endosomales en células epiteliales incubadas con OMVs. Se ha descrito que este paso es esencial para la activación de NOD-1 por su ligando específico. Uno de los mayores inconvenientes para los estudios con OMVs, es el bajo rendimiento el cual requiere una gran cantidad de cultivo inicial que dificulta el proceso. Para aumentar el rendimiento se ha descrito el uso de mutantes en proteínas de la envoltura celular que presentan un fenotipo de hipervesiculación. En este trabajo hemos obtenido OMVs a partir del mutante tolR derivado de la cepa EcN. Sin embargo, la aplicación de técnicas de TEM de alta resolución mostró una considerable heterogeneidad estructural en las muestras del mutante EcN tolR, que, además de las vesículas comunes, incluían otras estructuras atípicas. Los ensayos de internalización en células Caco-2 utilizando vesículas marcadas con rodamina B-R18 o DIO evidenciaron una menor tasa de internalización para las vesículas derivadas de EcN tolR, la cual correlacionaba con una menor capacidad de unión de las OMVs a la célula epitelial. Estos hallazgos que indican la heterogeneidad de OMVs del mutante tolR puede tener un impacto importante sobre la funcionalidad de las vesículas.
[eng] The microbiota and host interactions are complex and depend mainly on factors secreted that can pass through the mucus layer and reaching the epithelium. Factors secreted, the bacteria release extracellular vesicles as a mechanism for communication with the environment. These vesicles represent a mechanism of secretion of proteins and other active compounds in a protected environment that allow the distance interaction with other cells. Since Escherichia coli is forming part of the normal microbiota of the human intestine, in this work, have been used as study model (OMVs) secreted outer membrane vesicles by the probiotic strain e. coli Nissle 1917 (EcN) and the strain diner ECOR12. First objective we set ourselves to establish the internalization of the OMVs of NEC and ECOR12 road in several cell lines of intestinal epithelium. Analysis by spectro-fluorimetry and confocal microscopy fluorescence of cells incubated with OMVs marked with rhodamine B-R18 in the presence of specific inhibitors of Endocytosis pathways has helped establish that the OMVs of these strains are internalized in the epithelial cells through clathrin-mediated Endocytosis. The co-localization of the OMVs with clathrin and specific markers (EEA-1 protein) endosomes and lysosomes (Lysotracker) shows the typical intracellular trafficking of this pathway, being therefore directed towards lysosomic compartments. We have also shown that the OMVs of these strains are not cytotoxic since that does not alter cell viability while reducing the proliferation of HT-29 cells. The specific marking of 8-oxo-dG adducts, revealed that, unlike other strains of E. coli, the OMVs of EcN and ECOR12 do not promote this type of oxidative damage. However, the analysis by flow cytometry and microscopy, confocal fluorescence of histone H2AX phosphorylated (γH2AX) showed OMVs of the probiotic strain NEC to produce a greater amount of double-strand breaks in the DNA that the vesicles of the strain diner ECOR12. The OMVs contain multiple components that act as ligands of microbial pattern present in the host cell recognition. One of these components is the Peptidoglycan (PGN) specifically recognized by the cytoplasmic receptors type NOD. Since the entry of the OMVs by Endocytosis and their access to endosomes constitute one of the routes of entry of the PGN to the cell interior, we analyze the involvement of recipients NOD-NOD-1⁄2 in signaling mediated by the OMVs of NEC and ECOR12. For this purpose, we follow two approaches. On the one hand analyzed the inflammatory response induced by the OMVs in silenced Caco-2 cells with siRNA specific for these receptors. Analysis by RT- qPCR and cytokines IL-6 and IL-8 ELISA confirmed the involvement of NOD-1, but not NOD-2 signaling mediated by OMVs. On the other hand, we demonstrate using fluorescence microscopy NOD-1 with the OMVs interaction, as well as the recruitment of NOD-1 towards endosomals compartments in epithelial cells incubated with OMVS. He has been described that this step is essential for NOD-1 activation by its ligand specific. One of the biggest drawbacks for studies with OMVs, is the low performance which requires a large amount of initial culture which hinders the process. To increase performance, the use of mutants in the cell envelope proteins that exhibit a phenotype of hypervesiculation has been described. In this work we have obtained OMVs from the mutant tolR derived strain EcN. However, the application of high resolution TEM techniques showed considerable structural heterogeneity in the samples of the mutant EcN tolR, which, besides the common vesicles, included other atypical structures. Trials of internalization in Caco-2 cells using vesicles marked with rhodamine B-R18 or gave showed a lower rate of internalization vesicles derived from NEC for tolR, which correlated with a lower binding capacity of the OMVs to epithelial cell. These findings indicating the heterogeneity of the mutant tolR OMVS can have a significant impact on the functionality of the vesicles.
URI: http://hdl.handle.net/2445/121346
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