Antigens and mechanisms of immune-mediated encephalitis

Abstract

[eng] BACKGROUND: The autoimmune encephalitis represents a new category of immune- mediated diseases of the brain that are mediated by antibodies against neurotransmitter receptors, ion channels or neuronal cell-surface proteins. Among the many encephalitis considered idiopathic, there are subtypes that are probably immune-mediated and are pending to be discovered. In the last 11 years, 16 subtypes of idiopathic encephalitis have been found to be immune mediated. The recognition of these disorders is important because despite being potentially lethal, they are curable if promptly recognized and treated. On a more basic level, the study of these diseases has uncovered novel antibody-mediated mechanisms of synaptic dysfunction that lead to changes in memory and behavior, epilepsy, abnormal movements, or decreased level of consciousness. OBJECTIVES: 1) Identify patients with encephalitis of unclear etiology but whose clinical features and initial investigations strongly suggest an antibody-mediated cause; 2) characterize the new autoantibodies associated with these disorders along with the neuronal target antigens, and develop unambiguous diagnostic tests, and 3) determine in animal models how autoantibodies alter the level and function of neuronal synaptic antigens (NMDAR and LGI1) potentially resulting in an impairment of memory and behavior. METHODS: Rat brain sections and primary cultures of dissociated rat hippocampal neurons served to identify patients whose serum and CSF samples contained novel neuronal antibodies. Techniques of tissue immunohistochemistry, neuronal immunocytochemistry and cell-based assays were used to identify the antibodies. Cell- surface neuronal protein immunoprecipitation with patients’ antibodies was used to isolate the target antigen, which was subsequently characterized by mass spectrometry. Cerebroventricular transfer of patients’ antibodies to mice through subcutaneously implanted mini-osmotic pumps was used to determine the pathogenic effect of patients’ antibodies on the corresponding synaptic targets and how these changes altered memory and behavior. An extensive combination of techniques was used for these studies, including quantitative confocal microscopy analysis of the levels of synaptic targets, immunoprecipitation of brain-bound antibodies, immunoblot of precipitated proteins, electrophysiology on acute sections of mice hippocampus, and a comprehensive panel of standard behavioral tests. All studies were conducted with sets of mice at different time points during the antibody infusion (disease phase) and after the infusion was stopped (recovery phase). RESULTS: (1) Two novel autoimmune encephalitis were identified: anti-GABAaR encephalitis and anti-neurexin-3α encephalitis. Anti-GABAaR encephalitis can affect children and adults, associates with prominent seizures and highly suggestive MRI abnormalities, and is treatable with immunotherapy. In some patients the immune response is triggered by the presence of a tumor. Anti-neurexin-3α encephalitis manifests with a less distinctive syndrome, often associates with seizures and is also treatable with immunotherapy. No tumor association has been identified. (2) Immunoprecipitation of the target antigen of anti-GABAaR encephalitis demonstrated that the epitopes are mainly located in the alpha1 and beta3 subunits, and less frequently in the γ2 subunit. Whereas the antibodies against alpha1 and beta3 subunits are disease relevant, the presence of additional antibodies to γ2 does not modify the disease phenotype. Patients’ GABAaR antibodies cause a decrease in the total and synaptic levels of GABAaR clusters, supporting their pathogenicity. (3) Immunoprecipitation of the target antigen of patients with anti-neurexin-3α encephalitis demonstrated that the epitopes are specifically located in neurexin-3α, but not in its postsynaptic ligand LRRTM2. Patients’ antibodies cause a reduction of the total number of synapses as well as the levels of the presynaptic protein Bassoon and the post-synaptic protein Homer1, supporting the pathogenicity of the antibodies. (4) Recombinant expression of the indicated subunits of the GABAaR and neurexin-3α in HEK293 cells can be used as a test to diagnose patients with these autoimmune encephalitis. (5) The infusion of patients’ NMDAR antibodies into the cerebroventricular system of mice, cause memory deficits, anhedonia, and depressive-like behavior. The infused antibodies specifically bind to brain NMDAR resulting in a highly specific reduction of the density of these receptors at synaptic and extrasynaptic levels. The behavioral and molecular effects caused by patients’ antibodies are reversible upon stopping the infusion of antibodies. (6) The administration of ephrin-B2 antagonizes the pathogenic effects of patients’ NMDAR antibodies in all the investigated paradigms, including memory, depressive-like behavior, density of cell-surface and synaptic NMDAR and EphB2, and long-term synaptic plasticity. These findings reveal a strategy beyond immunotherapy to antagonize patients’ antibody effects. (7) The antibodies of patients with anti-LGI1 encephalitis abrogate the binding of the neuronal secreted LGI1 with the presynaptic ADAM23 and with the postsynaptic ADAM22. (8) The infusion of patients’ LGI1 antibodies into the cerebroventricular system of mice cause protracted memory deficits, together with a decrease of presynaptic Kv1.1 potassium channels and post- synaptic AMPAR. These structural effects associate with impairment of synaptic plasticity and increase of neuronal excitability, which are in line with the models of genetic depletion of LGI1. CONCLUSIONS: (1) Anti-GABAaR and anti-neurexin-3α encephalitis are two new forms of antibody-mediated encephalitis for which there is evidence of antibody-mediated pathogenicity. These findings support the concept that among the many types of encephalitis of unclear etiology, there are some that are immune mediated but are still pending to characterize. (2) Direct neuronal antigen precipitation using patients’ antibodies is an excellent strategy to isolate and characterize disease-relevant antigens, and subsequently develop diagnostic screening tests. (3) My studies have contributed to develop two animal models of antibody-mediated symptoms (NMDAR, LGI1) and uncover the underlying antibody-mediated changes in synaptic function and plasticity. Both models fulfill the Witebsky’s criteria for antibody-mediated disease, and provide the basis for modeling other antibody-mediated neurological disorders.

[spa] INTRODUCCIÓN: La encefalitis autoimmune representa una nueva categoria de enfermedades immunomediadas del cerebro que estan mediadas por anticuerpos dirigidos contra receptores sinápticos, canales iónicos o proteinas neuronales de superfície. De entre todas las encefalitis consideradas idiopaticas, hay un subgrupo, probablemente immunomedidos, pendientes de ser identificadas. En los ultimos 11 años, 16 subtipos de encefalitis idiopaticas han sido identificadas como immunomediadas. La identificación de estas enfermedades es importante porque, aunque son potencialmente letales, son curables si se identifican rapid de nuevas en amente y se tratan. El estudio de estas enfermedades ha permitido el descubrimiento de nuevos mecanismos de alteración de la sinapsi medidados por anticuerpos que dan lugar a alteraciones de comportamiento y de memoria, epilepsia, movimientos anormales, o bajo nivel de consciencia. OBJETIVOS: 1) Identificar pacientes con encefalitis de etiologia desconocida, pero con caracteristicas clinicas y paraclinicas que sugieren una causa immunomedidada; 2) Caracterizar nuevos autoanticuerpos asociados a estos trastornos asi como las dianas antigenicas, y desarrollar pruebas diagnosticas inequivocas, y 3) determinar en modelos animales como los autoanticuerpos alteran el nivel y funcion de de los antigenos neuronales sinápticos (NMDAR y LGI1). MÉTODOS: Se usaron secciones de cerebro de rata y cultivos primarios de neuronas hipocampales de rata para la identificación de nuevos anticuerpos contra proteinas neuronales en muestras de suero y liquido cefaloraquideo (LCR) de pacientes. Para la detección de los anticuerpos se usó immunohistoquimica, immunocitoquimica de neuronas y en células HEK293 transfectadas. El aislamiento de nuevos antigeno diana se hizo mediante la immunoprecipitacion de proteinas de superficie neuronal con anticuerpos de los pacientes, y posterior caracterización por espectometria de masas. Para determinar el efecto patogenico de los anticuerpos de los pacientes, durante 14 dias los ratones fueron expuestos de manera cerebroventricular a los anticuerpos mediante la implantación subcutanea de bombas osmoticas, y posteriormente se analizó el efecto sobre las dianas antigenicas asi como alteraciones de comportamiento y memoria. Para ello, se usaron tecnicas de microscopia confocal cuantitativa de los niveles de antigenos sinápticos, immunoprecipitación de los anticuerpos unidos al tejido cerebral, immunoblot de las proteinas precipitadas, electrofisiologia en secciones de cerebro de raton, y una bateria de pruebas de comportamiento estandarizadas. Todos los estudios se realizaron en dias determinados de exposición a los anticuerpos (fase de la enfermedad), asi como después de la infusión (fase de recuperación). RESULTADOS: (1) Se identificaron dos nuevas encefalitis autoimmunes: encefalitis anti-GABAaR y encefalitis anti-neurexin-3α. La encefalitis anti-GABAaR puede afectar niños y adultos, esta asociada con crisis epilepticas y anormalidades en la resonancia magnetica del cerebro, y es tratable con immunoterapia. En algunos pacientes la respuesta immune se desencadena por la presencia de un tumor. La encefalitis anti-neurexin-3α manifiesta con un sindrome menos distintivo, a menudo se asocia con crisis epilepticas y tambien es tratable con immunoterapia. No se ha identificado asociacion tumoral. (2) La diana antigenica de los anticuerpos de la encefalitis anti-GABAaR se encuentra principalmente en las subunidades alfa1 y β3, y menos frecuentemente en la subunidad γ2. Mientras que las subunidades alfa1 y β3 son relevantes para la enfermedad, la presencia de anticuerpos adicionales contra γ2 no modifica el fenotipo de la enfermedad. Los anticuerpos anti-GABAaR producen una disminución de los niveles de GABAaR totales y sinapticos, apoyando su patogenicidad. (3) La immunoprecipitación de la diana antigenica de pacientes con encefalitis anti-neurexin-3α demostró que los epitopos estan localizados en la subunidad 3alfa, y no en su ligando postsinaptico LRRTM2. Estos autoanticuerpos causan una reducción del numero total de sinapsis asi como de la proteina presinaptica Bassoon, y de la postsinaptica Homer1, apoyando su patogenicidad. (4) La expresion recombinante de las subunidades antigenicas en celulas HEK293, pueden ser usadas como prueba diagnostica para identificar pacientes con estas encefalitis autoimmunes. (5) La infusión de anticuerpos NMDAR en el sistema cerebroventricular de ratones causa problemas de memoria, anhedonia, y comportamientos depresivos. Los anticuerpos infusionados se unen especificamente a los receptores NMDA del cerebro y provocan la disminución de la densidad de dichos receptores a nivel sinaptico y extrasinaptico. Estos efectos son reversibles despues de la suspension de la infusion de anticuerpos. (6) La administracion de ephrin-B2 antagoniza el efecto patogenico de los anticuerpos contra NMDAR de los pacientes, incluyendo los efectos de memoria, depresion, densidad de receptores NMDA y EphB2, y plasticidad sinaptica a largo plazo, pudiendo ser usado como estrategia terapeutica. (7) Los anticuerpos de los pacientes con encefalitis anti-LGI1 impiden la unión entre la proteina neuronal secretada LGI1 y la proteina presinaptica ADAM23 y la postsinaptica ADAM22. (8) La infusión de anticuerpos de los pacientes contra LGI1 en el sistema cerebroventricular de los ratones causa problemas de memoria, asi como disminución de los niveles de canales de potasio Kv1.1 presinapticos y de receptores AMPA postsinapticos. Estos efectos se asocian a una alteración de la plasticidad sinaptica e incremento de excitabilidad neuronal, de manera similar a los modelos de depleción genetica de LGI1. CONCLUSIONES: (1) Las encefalitis Anti-GABAaR y anti-neurexin-3α encephalitis son dos nuevas formas de encefalitis mediadas por anticuerpos. Hay evidencia que sostiene que estos anticuerpos son patogenicos, apoyando el concepto de que hay encefalitis sin caracterizar dentro de las muchas formas de encefalitis de causa desconocida. (2) La precipitación del antigeno neuronal es una estrategia excelente para aislar y caracterizar antigenos relevantes para la enfermedad, y poder desarrollar pruebas de detección. (3) Estos estudios han contribuido a desarrollar dos modelos animales de infusión de anticuerpos de encefalitis autoimmunes (NMDAR, LGI1) y a descubrir los cambios subyacentes mediados por anticuerpos en la función sináptica y la plasticidad. Los dos modelos cumplen con los criterios de Witebsky para enfermedades immunomediadas, y proporcionan la base para modelar otros trastornos neurológicos mediados por anticuerpos.