Integrative analysis of endocrine disruption in zebrafish (Danio rerio)

Abstract

[eng] Understanding the mode of action of different pollutants and xenobiotics in human and wildlife is a key step in environmental risk assessment. Omic technologies allow the study of the global status at different biological levels (transcriptome, metabolome, lipidome...) from a holistic and integrative point of view. The omic data fusion and integration of the effects at these different levels is an extremely useful method to elucidate the mode of action (MoA) of the pollutants and to propose adverse outcome pathways (AOPs). In this way, the aim of this thesis is to determine molecular and phenotypical signatures of exposure of several endocrine disrupting chemicals (EDCs) on zebrafish (Danio rerio) eleutheroembryos, which constitutes an excellent model for endocrine disruption. Morphometric and transcriptomic (RNA-Sequencing) studies were carried out in individuals exposed to bisphenol A (BPA), perfluorooctanesulfonate (PFOS) and tributyltin (TBT). Further metabolic, epigenetic (DNA methylation and miRNAs) and lipidomic (thin layer chromatography and high performance liquid chromatography – mass spectrometry) studies were performed only in BPA-exposed individuals. Main effects of BPA included lipid metabolism disruption, yolk sac malabsorption syndrome and lipid retention (obesogenicity), visual system alteration, and estrogenicity. Some of its effects were long-term persistent and could be mediated by epigenetic mechanisms. PFOS had immunosuppressive and anorexic-like properties, it disrupted the transcription of genes related to cell adhesion molecules (CAMs), and the exposed eleutheroembryos presented muscle-skeletal alterations (scoliosis and kyphosis). Finally, TBT disrupted the transcription of genes related to steroid and cell cycle metabolism, and elicited a general developmental delay (diapause-arrest effect) in the exposed individuals. Phenotypic observations were related to their transcriptomic alterations and their proposed molecular initiation event (MIE), allowing the design of an AOP for each of the studied EDCs. Overall, this thesis shows the usefulness of transcriptomics and of data integration at different biological levels to discern AOPs and MIE, therefore contributing to a deeper comprehension of the toxicity and the mode of action of BPA, PFOS and TBT. We consider that these results can be extrapolated to understand the toxic effects of these compounds in other animals, including humans.

[spa] Comprender el modo de acción de los diferentes contaminantes y xenobióticos en humanos y en la vida silvestre constituye un paso clave en la evaluación del riesgo ambiental. Las tecnologías “ómicas” permiten el estudio global de los diferentes niveles biológicos (transcriptoma, metaboloma, lipidoma...) desde un punto de vista holístico e integrado. La fusión de datos ómicos y la integración de los efectos observados a estos diferentes niveles es un método extremadamente útil para dilucidar el modo de acción (MoA) de los contaminantes y proponer “mecanismos explicativos de efectos adversos” (AOP). De este modo, el objetivo de esta tesis es determinar las firmas moleculares y fenotípicas de exposición a varios disruptores endocrinos (EDC) en eleuteroembriones de pez cebra (Danio rerio), el cual constituye un excelente modelo para estudiar la disrupción endocrina. Se realizaron estudios morfométricos y transcriptómicos (RNA- Seq) en individuos expuestos a bisfenol A (BPA), perfluorooctanosulfonato (PFOS) y tributilestaño (TBT). Adicionalmente, otros estudios metabólicos, epigenéticos (metilación de ADN y miRNAs) y lipidómicos (mediante cromatografía de capa fina y cromatografía líquida de alta eficacia – espectrometría de masas) se realizaron específicamente en individuos expuestos a BPA. Los principales efectos causados por el BPA incluyeron la alteración del metabolismo de lípidos, síndrome de malabsorción del saco vitelino y retención de lípidos (obesogenicidad), alteración del sistema visual y estrogenicidad. Algunos de sus efectos fueron persistentes a largo plazo y podrían estar regulados por mecanismos epigenéticos. El PFOS presentó propiedades inmunosupresoras y pseudo-anoréxicas, alteró la transcripción de genes relacionados con las moléculas de adhesión celular (MAC) y los eleuteroembriones expuestos a él presentaron alteraciones músculo-esqueléticas (escoliosis y cifosis). Finalmente, el TBT alteró la transcripción de genes relacionados con el metabolismo de esteroides y del ciclo celular, y provocó un retraso general del desarrollo (efecto “pseudo-diapáusico”) en los individuos expuestos. Las observaciones fenotípicas se pudieron relacionar con las alteraciones transcriptómicas y el evento molecular de iniciación (MIE) propuesto para cada EDC estudiado, permitiendo así el diseño de un AOP específico para cada uno de ellos. En conclusión, esta tesis muestra la utilidad de la transcriptómica y de la integración de datos a diferentes niveles biológicos para la propuesta de AOPs y MIEs, contribuyendo a una comprensión más profunda de la toxicidad y el modo de acción del BPA, PFOS y TBT. Consideramos que estos resultados pueden extrapolarse para comprender los efectos tóxicos de estos compuestos en otros animales, incluidos los humanos.

[cat] Comprendre el mode d'acció dels diferents contaminants i xenobiòtics en humans i en la vida silvestre constitueix un pas clau en l'avaluació del risc ambiental. Les tecnologies "òmiques" permeten l'estudi global dels diferents nivells biològics (transcriptoma, metaboloma, lipidoma...) des d'un punt de vista holístic i integrat. La fusió de dades òmiques i la integració dels efectes observats a aquests diferents nivells és un mètode extremadament útil per dilucidar el mode d'acció (MoA) dels contaminants i proposar "mecanismes explicatius d'efectes adversos" (AOP). D'aquesta manera, l'objectiu d'aquesta tesi és determinar les signatures moleculars i fenotípiques d'exposició a diversos disruptors endocrins (EDC) a eleuteroembrions de peix zebra (Danio rerio), el qual constitueix un excel·lent model per estudiar la disrupció endocrina. Es van realitzar estudis morfomètrics i transcriptòmics (RNA-Seq) en individus exposats a bisfenol A (BPA), perfluorooctanosulfonat (PFOS) i tributilestany (TBT). Addicionalment, altres estudis metabòlics, epigenètics (metilació d'ADN i miRNAs) i lipidòmics (mitjançant cromatografia de capa fina i cromatografia líquida d'alta eficàcia - espectrometria de masses) es van realitzar específicament en individus exposats a BPA. Els principals efectes causats pel BPA van incloure l'alteració del metabolisme de lípids, síndrome de malabsorció del sac vitel·lí i retenció de lípids (obesogenicitat), alteració del sistema visual i estrogenicitat. Alguns dels seus efectes van ser persistents a llarg termini i podrien estar regulats per mecanismes epigenètics. El PFOS va presentar propietats immunosupressores i pseudo-anorèxiques, va alterar la transcripció de gens relacionats amb les molècules d'adhesió cel·lular (MAC) i els eleuteroembrions exposats a ell van presentar alteracions músculo-esquelètiques (escoliosi i cifosi). Finalment, el TBT va alterar la transcripció de gens relacionats amb el metabolisme d'esteroides i del cicle cel·lular, i va provocar un retard general de desenvolupament (efecte “pseudo- diapàusic”) en els individus exposats. Les observacions fenotípiques es van poder relacionar amb les alteracions transcriptòmiques i l'esdeveniment molecular d'iniciació (MIE) proposat per a cada EDC estudiat, permetent així el disseny d'un AOP específic per a cada un d'ells. En conclusió, aquesta tesi mostra la utilitat de la transcriptòmica i de la integració de dades a diferents nivells biològics per a la proposta d'AOPs i MIEs, contribuint a una comprensió més profunda de la toxicitat i el mode d'acció de l'BPA, PFOS i TBT. Considerem que aquests resultats poden extrapolar-se per comprendre els efectes tòxics d'aquests compostos en altres animals, inclosos els humans.