Entendiendo la síntesis de ADN en patógenos bacterianos: nuevas estrategias para el tratamiento de enfermedades infecciosas

Abstract

[spa] Las ribonucleótido reductasas (RNR) son enzimas esenciales que convierten los ribonucleótidos en desoxirribonucleótidos, los monómeros utilizados en la síntesis y reparación del ADN. Existen tres clases de RNR (clase I, II y III), que se clasifican en función de su estructura, mecanismo para formar el radical, cofactores que utilizan y requisitos específicos de oxígeno. El genoma de los organismos eucariotas codifica únicamente para la ribonucleótido reductasa de clase Ia, pero hay microorganismos cuyo genoma codifica para más de una RNR. Por ejemplo, el genoma de Pseudomonas aeruginosa contiene información para producir las tres clases de RNR, lo que le aporta una gran ventaja para adaptarse a distintos ambientes. P. aeruginosa es una bacteria Gram-negativa que puede crecer formando una biopelícula (biofilm) donde hay un gradiente de la concentración de oxígeno. P. aeruginosa forma biofilms en tejidos del organismo y dispositivos quirúrgicos, y también se ha encontrado en biofilms polimicrobianos en heridas. Las infecciones por biofilms se consideran infecciones crónicas y son difíciles de tratar, lo que conlleva un mal pronóstico. Esto, sumado a que las terapias actuales son ineficaces, pone de manifiesto la necesidad de encontrar nuevos enfoques terapéuticos para tratar eficazmente las infecciones por biofilms. En nuestro estudio nos centramos en el desarrollo de nuevas terapias para tratar las infecciones por biofilm. En la búsqueda de nuevas dianas moleculares, estudiamos los factores de transcripción AlgR y NrdR. En esta tesis investigamos la relación entre AlgR, clave en la formación del biofilm, y las RNR de P. aeruginosa. Hemos demostrado que AlgR en su estado no fosforilado activa la transcripción de las RNR bajo condiciones de estrés oxidativo cuando P. aeruginosa crece en forma planctónica y formando un biofilm. También determinamos que la RNR de clase II, NrdJ, es esencial durante la infección en el modelo in vivo Galleria mellonella. Asimismo, estudiamos el mecanismo de activación del factor de transcripción NrdR en P. aeruginosa y Escherichia coli. En esta tesis determinamos que NrdR regula los promotores de todas las RNR en P. aeruginosa y E. coli. Según nuestros estudios, NrdR se encontraría formando poblaciones oligoméricas dinámicas en función del cofactor nucleotídico que se le una. NrdR forma grandes estructuras oligoméricas que son inactivas cuando se une ATP y estructuras entre tetrámeros y octámeros que son activas y reprimen la transcripción de las RNR cuando se une dATP. También hemos desarrollado una nueva técnica de biología molecular, llamada ReViTA, que se basa en la transcripción in vitro para medir la expresión de genes cuando están regulados por factores de transcripción, y que permite estudiar la función biológica del factor de transcripción de interés. Finalmente, estudiamos la formación de biofilms polimicrobianos de P. aeruginosa y Staphylococcus aureus en un modelo de herida in vitro para identificar nuevos tratamientos. Analizamos varias terapias que combinan antibióticos y enzimas disgregadoras de la matriz del biofilm solubles o inmovilizadas en nanopartículas. Los resultados apuntan a que, dentro del biofilm, las bacterias de S. aureus están protegidas y que las terapias que combinan enzimas y antibióticos mejoran el tratamiento del biofilm. En conclusión, las RNR y los factores de transcripción que las regulan son posibles dianas moleculares para desarrollar nuevos enfoques terapéuticos contra las infecciones por biofilm. La técnica ReViTA puede ser útil en la identificación de nuevos factores de transcripción y en la evaluación de su papel en la regulación génica. El estudio de biofilms polimicrobianos es fundamental para entender la interacción entre diferentes especies bacterianas y desarrollar tratamientos efectivos contra las infecciones crónicas.

[eng] Ribonucleotide reductases (RNR) are enzymes that convert ribonucleotides into deoxyribonucleotides, which are essential for DNA synthesis and repair. RNR are classified in three classes (I, II, and III) based on their structure, mechanism of radical formation, cofactor, and oxygen requirement. Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative bacterium that synthesizes all three classes of RNR, providing a significant adaptive advantage in different environmental conditions. Moreover, P. aeruginosa can form a biofilm. Biofilm infections are chronic and challenging to treat, resulting in severe damage to the host and poor prognosis. Since current therapies are ineffective, new therapeutic approaches are necessary to effectively treat biofilm infections. In this thesis, we focused on the development of new therapies for infectious diseases, particularly biofilm infections. We investigated the relationship between AlgR, a key transcription factor in biofilm formation, and RNR in P. aeruginosa. We demonstrated that AlgR in its non-phosphorylated state activates RNR transcription under oxidative conditions, and that the class II RNR, NrdJ, is essential during Galleria mellonella infection. Additionally, we studied the role of the transcription factor NrdR in P. aeruginosa and Escherichia coli. We have also developed a novel molecular biology technique, called ReViTA, which utilizes in vitro transcription to measure gene expression when the genes are regulated by transcription factors, enabling the study of the biological function of the transcription factor of interest. Finally, we investigated the formation of polymicrobial biofilms by P. aeruginosa and Staphylococcus aureus in an in vitro wound model to identify new treatments. We analyzed several therapies combining antibiotics and biofilm matrix-disintegrating enzymes, either soluble or immobilized in nanoparticles. The results suggest that biofilm disaggregation is best achieved with combination therapies that include enzymes and antibiotics. In conclusion, RNR and the transcription factors that regulate they expression are critical targets for developing new therapeutic approaches against biofilm infections. The ReViTA technique may be useful in identifying novel transcription factors and assessing their role in gene regulation. The study of polymicrobial biofilms is essential for understanding the interaction between different bacterial species and developing effective treatments against chronic infections.