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Title: Analysis of CK2-dependent regulation of Myo5-induced actin polymerization during the endocytic uptake in S. Cerevisiae
Other Titles: Análisis de la regulación mediada por CK2 de la polimerización de actina inducida por Myo5 durante la internalización endocítica en “S. Cerevisiae”
Author: Fernández Golbano, Isabel M.
Director: Geli Fernández-Peñaflor, María Isabel
Martínez García, Albert
Keywords: Endocitosis
Endocitosi
Endocytosis
Polimerització
Polimerización
Polymerization
Actina
Miosines-I
Miosinas-I
Myosines-I
Saccharomyces cerevisiae
Issue Date: 14-Dec-2012
Publisher: Universitat de Barcelona
Abstract: [eng] S. cerevisiae (budding yeast) is particularly powerful to study the relation between the molecular mechanisms of actin regulation and its biological significance due to its powerful molecular and genetic methods, well-established biochemical techniques, and development of live cell imaging and immuno-electron microscopy. Further, budding yeast has a simple cytoskeleton but the molecular mechanisms controlling its remodeling are conserved from yeast to mammals. Interestingly, a dynamic actin cytoskeleton is mandatory for endocytosis in S. cerevisiae. In this organism the formation of the primary endocytic profiles in yeast occurs concomitant with the assembly of a complex actin structure (the endocytic actin module), which includes the actin nucleator Arp2/3 complex. Consistent with observations indicating that the myosin-I Myo5 in complex with the WIP homolog Vrp1 is a major Arp2/3-dependent actin nucleating promoting factor (NPF) driving productive membrane invagination, our laboratory has demonstrated that the C-terminal domain of Myo5 immobilized on the surface of Sepharose beads induces assembly of the endocytic actin module in the presence of yeast extracts. Analysis of the in vitro actin assembly assay demonstrated that Myo5 is phosphorylated by the casein kinase CK2 at the serine 1205 during the assay. In this study, we have characterized the CK2 activity that phosphorylates Myo5 at the C-terminus and investigated the functional significance of this phosphorylation in vivo and in vitro. Our results indicate that a non-tetrameric and particulate-associated CK2 activity that includes the catalytic subunit Cka2 but not Cka1 or the regulatory subunits Ckb1 and Ckb2 phosphorylates Myo5 S1205. Our results also indicate that this phosphorylation event down-regulates the assembly of complex actin structures in vitro and slows down the internalization process and the dissociation of the myosin from the plasma membrane in vivo. The Cka2-mediated phosphorylation at Myo5 S1205 does not seem to regulate the affinity of the NPF for the Arp2/3 complex but rather down-regulates the interaction of Myo5 with its co-activator Vrp1. This phosphorylation also increases directly or indirectly the binding of the myosin to the endocytic coat components Sla1 and Pan1 and to the syndapin Bzz1, suggesting that the phosphorylation event occurs late during the maturation of the endocytic invagination. Finally, our data suggest that Cka2 have endocytic targets other than Myo5 and that its activity might also regulate early steps during the assembly of the endocytic coat.
[spa] La conexión GABAérgica septohipocámpica es un elemento crucial para el correcto funcionamiento del hipocampo y, en concreto, para determinados procesos de aprendizaje y memoria. La exquisita especificidad de contacto de este componente es la piedra angular que determina su función, pero los datos existentes sobre los mecanismos que rigen la selección de diana y sinaptogénesis de estos axones son escasos. Aunque esta conexión desempeña un papel elemental en procesos cognitivos que están afectados durante el envejecimiento y en la enfermedad de Alzheimer, en el momento en que iniciamos este proyecto había un sorprendente vacío en la literatura sobre el estado de la vía GABAérgica septohipocámpica en estas situaciones. Hemos establecido el modelo in vitro del desarrollo de la conexión septohipocámpica, mediante cultivos organotípicos que constan de septum, hipocampo y corteza entorrinal obtenidos de animales neonatales. La conexión septohipocámpica se forma en nuestro modelo in vitro manteniendo la exquisita especificidad de contacto de su componente GABAérgico. Hemos comprobado, mediante el uso de tejido proveniente de ratones knock-out para Semaforina 3C y mediante la aplicación de ectodominios bloqueantes de los receptores de Semaforina 3C, que esta molécula es prescindible para el proceso de sinaptogénesis específica de los axones GABAérgicos septohipocámpicos in vitro. Utilizando el cultivo puesto a punto también hemos demostrado que las aferencias de corteza entorrinal a hipocampo no son necesarias para que la conexión se forme de manera específica. Se ha llevado a cabo un análisis exhaustivo de la inervación y complejidad de las sinapsis de la conexión GABAérgica septohipocámpica sobre diferentes tipos de interneuronas del hipocampo de ratones wild-type a diferentes edades (2, 8 y 18 meses), así como de ratones de la cepa transgénica J20 (modelo murino de enfermedad de Alzheimer) a 2 y 8 meses de edad. Los resultados de estos experimentos muestran que durante el envejecimiento normal, en ratones wild-type de 18 meses, se produce una disminución tanto en el número de fibras GABAérgicas septohipocámpicas como en la complejidad de sus contactos sinápticos. Estos déficits de la conexión GABAérgica septohipocámpica se producen de manera acelerada en ratones J20, modelo de enfermedad de Alzheimer. En esta cepa transgénica, los déficits histológicos observados van acompañados de alteraciones funcionales: disminución en la potencia de los ritmos theta y gamma hipocámpicos. El análisis del estado funcional del hipocampo de ratones J20 demuestra que la sinapsis CA3-CA1 funciona normalmente en los animales transgénicos J20, aunque con alteraciones sutiles en la facilitación sináptica a corto plazo. Los procesos de potenciación a largo plazo (LTP) de esta sinapsis están aumentados en el modelo de EA. En un paradigma de condicionamiento operante de autoestimulación, en que los animales pueden autoadministrarse estímulos eléctricos reforzantes en el septum medial, los animales J20 presentan peor aprendizaje y ejecución de la tarea. Hemos demostrado que, en animales WT, este refuerzo operante se correlaciona con una disminución de la respuesta obtenida en la sinapsis CA3-CA1. Los transgénicos J20 no presentan tal disminución, especialmente durante los primeros días del test, y por tanto muestran peor aprendizaje y ejecución del paradigma de refuerzo operante, como se observa en nuestros resultados. En estos mismos animales, además, la inducción de LTP afecta negativamente la ejecución de la tarea reforzante ya adquirida, seguramente porque la excesiva respuesta de la sinapsis una vez potenciada cancela esa disminución de la respuesta en CA3-CA1 que es necesaria para que tenga lugar el refuerzo operante.
URI: http://hdl.handle.net/2445/35983
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