Distribución intracelular de la anexina A6: implicaciones funcionales

Abstract

[spa] Las proteínas de la familia de las anexinas se caracterizan su unión a los fosfolípidos de la bicapa lipídica de forma dependiente de calcio, a través de los motivos "repetición anexina" presentes en su secuencia. Esta capacidad ha sido descrita mediante ensayos in-vitro, aunque poco se conoce de la funcionalidad de este comportamiento en los sistemas biológicos. Además del calcio, otros componentes celulares, como el citoesqueleto de actina, podrían modular in-vivo la unión de anexinas a las membranas biológicas. En trabajos previos nuestro grupo determinó in-vivo como la anexina A6 era capaz de reclutarse hacia el compartimento endocítico en paralelo a la internalización de las lipoproteínas de baja densidad (LDL), uno de cuyos componentes mayoritarios es el colesterol. En el presente trabajo describimos como el colesterol por si sólo es capaz de inducir este reclutamiento, de forma independiente de calcio. En primer lugar, se determinó que existía una población de anexina A6, asociada a membranas (totales o endosomales) aisladas en ausencia de calcio, y que ésta era liberada al solubilizar el colesterol presente en la bicapa (con digitonina). Además, la acumulación de colesterol en el compartimento endocítico tardío (mediante el tratamiento de las células con la droga U18666A) inducía el reclutamiento in-vivo de anexina A6 hacia éstas membranas, proceso observado mediante fraccionamiento celular (aislamiento de endosomas e immunodetección por western blot) e immunocitoquímica (co-localizando, en estos endosomas a la anexina con el lípido no esterificado -marcado con filipina-). El incremento de la asociación colesterol-dependiente se observó asimismo para la anexina A6 añadida de forma exógena (a membranas aisladas carentes de anexina endógena) descartando la afectación del tráfico intracelular como causa del efecto observado. A continuación se determinó la funcionalidad derivada de la interacción de otro tipo de lipoproteínas involucradas en el metabolismo de colesterol, las HDL (de alta densidad), con la superficie de células CHO. Describimos la activación de Ras de forma subsiguiente a la unión de la partícula a la membrana. involucrando a uno de sus receptores más importantes, el Scavenger Receptor Type B-I (SR-BI). Al estudiar el efecto de la sobreexpresión de anexina A6 sobre esta señalización a partir de las HDL y su receptor SR-BI, en células CHO, se observó una disminución de la activación de Ras y Raf (pero no del resto de MAPKs). Por otro lado, la observación in-vivo (videomicroscopía) de la distribución celular de anexina A6-GFP sobreexpresada en células CHO, muestra como incrementos del calcio intracelular ejercen un reclutamiento masivo y muy rápido de la anexina A6 hacia la membrana plasmática (o dominios subyacentes a ésta), siguiendo un patrón similar al observado para algunas GAPs (GTPase activating proteins). Esta observación, así como la interacción ya descrita in-vitro entre la anexina A6 y p120GAP, sugiere la hipótesis que la translocación calcio-dependiente de la anexina hacia la membrana modularía la concentración de p120GAP, colaborando así en la desactivación de Ras. En este sentido, observamos como la sobreexpresión de anexina A6 induce, en células CHO, un incremento de la asociación de p120 GAP a fracciones de membrana enriquecidas en Ras. La caracterización de estos dominios de concentración de anexina A6 en la membrana indica que se trata de lipid rafts (dominios enriquecidos en colesterol) con presencia de citoesqueleto de actina. Postulamos que, en la célula viva, el calcio, el colesterol y el citoesqueleto de actina colaboran determinando la localización de la anexina en la membrana, desde donde actuaría como un modulador de la señalización a través de Ras.

[eng] The annexin family of proteins is characterized by the presence of a tandemly repeated calcium dependant - phospholipid binding domain, called "annexin repeat". However, other cell constituents, like actin cytoskeleton or cholesterol, have been proposed to play a role in annexin binding to biological membranes. In this sense, here we demonstrate in-vivo that cholesterol itself is able to modulate the intracellular distribution of membrane-associated annexin A6, in a calcium - independent manner. Concretely, cholesterol accumulation in the late endocytic compartment, upon treatment of the cells with "U18666A", is accompanied by annexin VI recruitment to this structures. Also, treatment of crude membrane extracts from early or late endosomes with digitonin, a cholesterol-sequestering agent, is able to displace a significant membrane-bound population of annexin VI, associated in a calcium independent manner. Finally, we demonstrate that this redistribution correlates with an increased binding of recombinant GST-annexin VI to cholesterol-enriched endocytic membranes in-vitro. After determining the role of cholesterol in mediating annexin VI recruitment to membranes, we aimed to characterize the signalling pathway activated upon HDL (one of the key lipoproteins in cholesterol metabolism) binding to the cell surface of CHO cells. Here we describe that HDL activates MAP kinases through the small GTPase Ras. We involve in this activation one of the most physiologically important receptors for HDL, the "Scavenger Receptor Type B-I" (SR-BI). We then analyzed this activation pathway in an annexin VI-overexpressing derived cell line, finding that annexin VI partially inhibits the signalling through the small GTPase Ras and blocks the subsequent activation of Raf. This diminished Ras activation is completely dependant on the presence of the enzyme PKC, and does not ultimately lead to a deficient MAPK activation. We also observed that annexin VI overexpression promoted the association of p120 GAP (one of the Ras inactivators and also an annexin VI-interacting protein) with Ras - enriched membrane fractions, suggesting an increased Ras - p120 GAP complex formation in these cells. In summary, we suggest that annexin VI is able to modulate signalling activation from the membranes and that, in this process, both calcium- and cholesterol-mediated membrane recruitment of annexin VI are involved.