Identificación y caracterización funcional de la molécula de membrana CD38 en células hepáticas estrelladas

Abstract

[spa] Las células hepáticas estrelladas (CHE) representan entre 5-8% del total de las células hepáticas y un 13% del total de las células sinusoidales. Se encuentran situadas en el espacio de Disse (espacio virtual entre las células endoteliales y el parénquima). En el hígado normal, presentan un fenotipo quiescente, morfológicamente se caracterizan por la presencia de vacuolas intracitoplasmaticas que contienen vitamina A. En el hígado normal funcionalmente están implicadas en: la regulación del recambio de la matriz extracelular, secreción de una variedad de citoquinas y factores de crecimiento, control del diámetro de los sinusoides y almacenamiento de vitamina A. En situaciones de lesión celular las CHE sufren un proceso de activación y se transforman en un fenotipo tipo miofibroblasto, adquiriendo características propias de este linaje: una elevada capacidad proliferativa, sintética y contráctil. En este estado de activación las CHE están implicadas en procesos de fibrogenesis, al ser las principales productoras de matriz extracelular, en procesos inflamatorios, debido a su capacidad de secretar al medio mediadores solubles de la inflamación (ej. quimioquinas, factores de crecimiento hematopoyetico, etc.) y en procesos de contracción, las CHE son capaces de contraerse o relajarse en respuesta a diferentes sustancias vasoactivas. Nuestro objetivo fue identificar nuevas moléculas expresadas en la superficie CHE y posteriormente estudiar su posible papel funcional en procesos fisopatologicos como la inflamación, fibrogenesis y contracción. Para alcanzar tal objetivo la estrategia que seguimos fue la producción de anticuerpos monoclonales que reconociesen proteínas de la membrana expresadas principalmente en CHE. Los resultados obtenidos fueron los siguientes: 1.1. Producción de anticuerpos monoclonales: Obtuvimos una panel de 13 anticuerpos monoclonales contra la CHE. El estudio lo centramos en los anticuerpos 5.520, 8.9 y 14.27, ya que por datos preliminares de citometría de flujo e inmunohistoquimica, fueron los mas específicos. 1.2. Identificación de proteínas; Purificamos la proteína reconocida por el anticuerpo 14.27 y por espectrometría de masas (MALDI-TOF), pudimos identificar que proteína estaba reconociendo, se trato del CD38. 1.3. Clonaje del CD38 de rata y transfección en células COS: Para acabar de confirmar que el anticuerpo 14.27 estaba reconociendo la molécula CD38. El CD38 de rata fue clonado a partir del mRNA procedente de un cultivo primario de CHEs. Posteriormente se subclono en un vector de expresión y se transfectaron células COS. Los experimentos demostraron que el anticuerpo reconocía el CD38 expresado en células COS. 1.4. Caracterización bioquímica del anticuerpo anti-CD38 (14.27): A partir de lisados de cultivos primarios de CHE, el anticuerpo 14.27 inmunoprecipitó la molécula CD38. El anticuerpo también pudo detectar el CD38 mediante Western-Blott. 1.5. Estudio de la expresión del CD38: mediante un esudio inmunohistoquimico realizados con secciones de hígado procedente de ratas sanas, pre-tratadas con LPS y cirróticas, se determinó la distribución del CD38 en el hígado. Su localización fue mayoritariamente sinusoidal. Estudios "in Vitro" y "in vivo" demostraron que la expresión del CD38 en CHE aumentaba tras su activación. 1.6. Estudios funcionales demostraron que el anticuerpo anti-CD38 (14.27): 1.6.1. Funciona como un anticuerpo agonista al inducir la movilización de calcio en CHE. 1.6.2. Induce la secreción de IL-6 tanto en CHEs activadas como en CHEs quiescentes (independiente estado de activación) 1.6.3. Induce la expresión de las moléculas de adhesión I-CAM, V-CAM y N-CAM en CHE activadas pero no en CHE quiescente (dependiente estado de activación) 1.6.4. Produce un aumento de la presión portal en ratas. 1.6.5. Induce la contracción de CHE en cultivo, la fosforilación de la cadena ligera de la miosina y la reorganización de citoesqueleto. (datos pre-liminares). 1.6.6. Media la regulación del colageno I, metaloproteinasa II (MMP-2) y del inhibidor de metaloproteinasas I (TIMP-I) (datos pre-liminares). Estos resultados indican el posible papel del CD38 en la inflamación, contracción y fibrogenesis.