Control de proteïnes reguladores de l'apoptosi en cèl·lules leucèmiques

Abstract

[cat] La Tesi Doctoral porta per títol "CONTROL DE PROTEÏNES REGULADORES DE L'APOPTOSI EN CÈL·LULES LEUCÈMIQUES", i ha estat realitzada a la Unitat de Bioquímica del Departament de Ciències Fisiològiques II de la Universitat de Barcelona. Hem estudiat el control de la regulació de diferents proteïnes encarregades de regular el procés d'apoptosi. S'ha estudiat la regulació de dos gens de la família de Bcl-2, un d'antiapoptòtic com mcl-1, i un de proapoptòtic, com bim. S'ha estudiat la regulació a nivell transcripcional i a nivell traduccional d'mcl-1 a la línia limfocitaria Jurkat, derivada d'una leucèmia aguda de cèl·lules T, durant l'apoptosi induïda per les drogues estaurosporina i aspirina. Ambdues drogues redueixen els nivells de la proteïna Mcl-1, tant per vies dependents com per vies independents de l'activació de caspases, ja que l'inhibidor general de caspases Z-VAD.fmk només protegeix parcialment el descens de la proteïna induït per les dues drogues d'estudi. El tractament amb estaurosporina també redueix els nivells de missatger d'mcl-1, de manera paral·lela a la reducció dels nivells de proteïna, i dependent de l'activació de les caspases, suggerint que aquesta droga inhibeix la transcripció del gen, a més de tenir altres efectes a nivell post-transcripcional caspasa-independents. El tractament amb aspirina en canvi no te cap efecte a nivell de regulació transcripcional, però sembla afectar la taxa de síntesi proteica de la cèl·lula. Hem determinat que aquesta droga afectaria la síntesi proteica de la cèl·lula per vies dependents i independents de l'activació de les caspases, on sembla tenir importància la fosforilació del factor eIF2-alfa, determinant que es dóna un pic transitori de fosforilació d'aquests factor al poc d'iniciar-se el tractament. També hem determinat que durant l'apoptosi induïda per aspirina es produeix una aturada de la síntesi proteica que afectaria de forma general a tots els gens cel·lulars amb una traducció CAP-dependent, mentre que alguns gens regulats a nivell traduccional per elements IRES, com XIAP, podrien escapar d'aquesta inhibició. Els resultats obtinguts amb els tractaments amb ciclohexinida, que redueix els nivells de la proteïna Mcl-1 sense afectar la viabilitat de les cèl·lules, ens permeten afirmar que la caiguda d'Mcl-1 pot ser necessària, però no suficient per induir l'apoptosi a les cèl·lules Jurkat. Aquest estudi ha estat publicat amb el títol: "Transcriptional and translational control of Mcl-1 during apoptosis. Iglesias-Serret D, Pique M, Gil J, Pons G, Lopez JM. Arch Biochem Biophys. 2003 Sep 15;417(2):141-52". També hem estudiat les insercions descrites al promotor d'mcl-1 a les cèl·lules B de pacients amb leucèmia limfàtica crònica de cèl·lules B (LLC-B). S'ha descrit que aquestes insercions són exclusives de pacients amb LLC-B (es troben en un 30%), que indueixen a augments de missatger i proteïna, correlacionant amb un mal pronòstic, una progressió més ràpida de la malaltia i una supervivència més baixa dels malalts. Els resultats obtinguts en aquests estudi demostren que la presència de les insercions no es exclusiva ni de les cèl·lules B ni dels malalts de LLC-B, tractant-se d'un polimorfisme present a la població general. Aquests resultats han estat acceptats per a ser publicats a la revista "Journal of the Nacional Cancer Institute". També hem estudiat la regulació del gen proapoptòtic bim de la família de Bcl-2, durant l'apoptosi induïda per diferents drogues en les cèl·lules de LLC-B i durant la supervivència induïda per diferents factors. Hem estudiat les isoformes majoritàries d'aquest gen i la regulació d'aquestes a nivell transcripcional i traduccional, així com les vies implicades en la seva fosforilació, important pel control dels seus nivells. Una part de la Tesi també s'ha dedicat a estudiar la regió 5'-no traduida (5'-UTR) i el promotor del gen antiapoptòtic XIAP, de la família de les IAPs, on hem intentat mapar l'inici de transcripció del gen i caracteritzar la regió promotora. Aquests estudis no han tingut un resultat satisfactori, i els resultats no són concloents.

[eng] The name of the thesis is "Control of apoptotic regulatory proteins in leukaemic cells". In this study we analyzed the regulation of two Bcl-2 family genes, an antiapoptotic member, mcl-1, an proapoptotic member, bim. We have studied the transcriptional and translational regulation of the mcl-1 gene during apoptosis induced by staurosporine and aspirin in Jurkat T cells. Both drugs reduced the levels of Mcl-1 protein in Jurkat cells. The caspase inhibitor Z-VAD.fmk and the proteasome inhibitor MG132 reduced Mcl-1 decay, indicating that both caspase and proteasome-dependent pathways are involved in the regulation of Mcl-1. Treatment with cycloheximide, at doses that inhibit protein synthesis without affecting cell viability, also induced Mcl-1 protein decay, suggesting that the Mcl-1 disappearance might be necessary but not sufficient for the induction of apoptosis by staurosporine and aspirin. Different patterns of transcriptional and translational control during apoptosis emerge depending on the stimulus although translational shutdown seems to be a common point during apoptosis. We analyzed the short sequence insertions in the Mcl-1 promoter of B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) samples and confirmed their presence in samples from patients of our hospital. Surprisingly, when we analyzed genomic DNA from normal lymphocytes (10 control subjects) and from mouth epithelial cells (10 additional healthy individuals) we also found the presence of the same insertions. Moreover, different allelic combinations for this polymorphism were present in all kind of samples. As the frequency of the 3 alleles was almost equal in all B-CLL and normal cells we concluded that these Mcl-1 insertions represent hereditary polymorphisms that likely do not predispose to chronic lymphocytic leukaemia and their significance in the pathogenesis of B-CLL should be re-evaluated. We investigated the effect of several drugs used in the therapy of B-CLL and different survival factors on BIM isoforms levels, and the signal transduction pathways involved in the control of BIM. Only the glucocorticoid dexametasone, a potent proapoptotic drug for B-CLL cells, induced an increase of BIM levels. The survival factors TPA and SDF-1 induced the phosphorilation of the two major isoforms of BIM, and the subsequent degradation of BIMEL isoform by the proteasome pathway, suggesting that this could be one of the survival mechanisms induced by these factors in B-CLL cells. We also studied the 5'-UTR of the antiapoptotic gene XIAP, but the results have not been conclusive.