Regulació postraduccional per SUMO i la seva funció en respostes a estrés a "Arabidopsis thaliana".

Abstract

[cat] L'activació de SUMO està catalitzada per l'heterodímer SAE2/SAE1 en una reacció depenent d'ATP. La subunitat SAE2 està organitzada en tres dominis funcionals: el domini d'adenilació, on SUMO és adenilat, el domini Cys que conté la cisteïna catalítica involucrada en la formació del tioéster amb l'extrem C-terminal de SUMO, i el domini UBL que s'ha descrit el seu paper en el reclutament de E2 per E1. La subunitat petita SAE1 presenta una contribució menor a la formació del domini d'adenilació i aparentment no estableix contacte amb SUMO. Arabidopsis expressa dues isoformes de SAE1, SAE1a i SAE1b i en aquesta tesi s'ha estudiat la rellevància biològica d'aquestes. Els nostres resultats indiquen que AtSAE1a és més estable que AtSAE1b tan in vitro com in vivo, i la taxa de conjugació de SUMO és depenent de la isoforma AtSAE1 present en la barreja de reacció, suggerint que l'activació de SUMO pot ser regulada pels nivells relatius de les isoformes de AtSAE1 presents in vivo. Per altra banda, s'ha descrit la capacitat de SUMO per interaccionar de manera no covalent amb el seu corresponent E2. Els determinants estructurals responsables d'aquesta interacció estan conservats a humans i llevat, suggerint que és un mecanisme conservat. A Arabidopsis s'ha detectat expressió de 5 isoformes de SUMO (AtSUMO1, 2, 3 i 5), de les quals només AtSUMO1 i 2 són capaços d'establir aquestes interaccions no covalents amb E2. Posteriorment, s'ha avaluat si aquestes diferències comporten una conseqüència a l'hora de ser conjugades a un substrat in vitro. Com a molècula acceptora de SUMO s'ha utilitzat el domini C-terminal de la catalasa 3 d'Arabidopsis. S'ha observat que AtSUMO1, 2 i 3 són capaços de ser conjugats al substrat, tot i que AtSUMO3 es conjugat d'una manera més ineficient, amb una taxa fins a quatre vegades inferior que AtSUMO1 i 2. En canvi, AtSUMO5 no es conjugat en nivells que es puguin detectar en cap de les situacions estudiades. Paral·lelament, durant aquesta tesi s'ha descrit que el domini AtE1 UBL disminueix l'eficiència de la conjugació de SUMO in vitro. S'han generat plantes transgèniques que expressen el domini AtE1 UBL i s'ha observat que l'expressió d'aquest domini in vivo provoca un fenotip de nanisme i floració primerenca. A més, en situacions d'estrès, aquestes plantes són incapaces d'acumular el mateix nivell de conjugats de SUMO que plantes silvestres. Amb tots aquests anàlisis es dedueix que la maquinària de sumoilació a Arabidopsis presenta una gran complexitat en quant a nombre de components, entre els quals podria existir una especificitat de funció. A més, la sumoilació es un procés essencial i està regulant processos tan importants com la floració, el creixement i el desenvolupament de les plantes.

[eng] SUMO activation is catalyzed by the heterodimer SAE2/SAE1 in an ATP-dependent reaction. The SAE2 subunit is organized into three functional domains: the adenylation domain, where SUMO is adenylated, the Cys domain containing the catalytic cysteine involved in the thioester formation with SUMO Ct, and the UBL domain which has been involved in E2 recruitment. To E1. The small subunit SAE1 has a minor contribution to the adenylation domain formation and apparently it does not establish direct contacts with SUMO. Surprisingly, Arabidopsis expresses two SAE1 isoforms, AtSAE1a and AtSAE1b and we have investigated the biological relevance of this. Our results indicate that AtSAE1a is more stable than AtSAE1b both in vivo and in vitro, and that SUMO conjugation rate is dependent on the AtSAE1 isoform present in the reaction mixture, suggesting that SUMO activation could be regulated by the relative levels of AtSAE1 isoforms present in vivo. Together, our results suggest that SUMO activation could be a rate limiting step in the conjugation cascade in vivo.