Factor 4 Plaquetar indueix activitat proinflamadora en les cèl·lules "Natural Killer" Humanes, El

Abstract

[cat] L'activació de les plaquetes en resposta a la lesió vascular o la inflamació porta a la secreció de gran nombre de mediadors els quals són capaços de modular les funcions de les cèl·lules implicades en la Inflamació. El F4P (Factor 4 Plaquetar) és una proteïna específica de les plaquetes i membre de la superfamilia de proteïnes anomenades quemoquines. Encara que estan força establertes l'activitat del F4P com a efector antiangiogènic i procoagulant, es coneix poc sobre la seva implicació en la regulació de la Inflamació. En aquest estudi es demostra la capacitat del F4P per estimular les anomenades cèl·lules "Natural Killer" a sintetitzar citoquines proinflamatòries com són la IL-8, IL-1beta, IL-6, INF-gamma, TNF-alfa i GM-CSF. Assaigs de cinètica i de dosi resposta (10-200 ng/ml) es demostren que el F4P incrementa els nivells de mRNA i proteïna de totes les citoquines estudiades. Es va determinar la capacitat del F4P per induir aquest efecte unit a heparansulfats, ja que en condicions fisiològiques el F4P es troba unit als glicosaminoglicans de la paret vascular. Els resultats obtinguts posen de manifest que el F4P, en aquestes condicions, manté la capacitat d'activar les cèl·lules NK. L'estimulació d'aquestes cèl·lules a través del receptor Fc-gamma-RIIIA (CD16) provoca un efecte d'increment sinèrgic amb el F4P en el lliurament de citoquines. En canvi no vàrem observar cap efecte del F4P sobre cèl·lules NK primàries en repòs en aquelles activitats regulades per la IL-2 com son les activitats citotòxiques "Natural Killer" NK, "Lymphokine-Activated Killer" LAK ó l'expressió del receptor IL-2R (CD25). En canvi el F4P es capaç d'induir un increment dosi-resposta en la "antibody-dependent cellular cytotoxicity" ADCC, activitat citotóxica no regulada, en aquestes condicions, per la IL-2. A més a més, el F4P incrementa l'expressió de CD69, demostrant la inducció d'un estat d'activació. Les cèl·lules NK estimulades amb F4P lliuren citoquines amb capacitat per desencadenar el quimiotactisme dels neutròfils. El 70% d'aquest potencial quimiotàctic induït pels factors lliurats per les cèl·lules NK estimulades amb F4P, es deu a la IL-8 lliurada per aquestes cèl·lules. Es va iniciar l'estudi del possible mecanisme de transducció de senyal desencadenat pel F4P en les cèl·lules NK. Per això es va tenir en compte que el F4P pertany a la família de proteïnes anomenada quemoquines. La major part de les proteïnes d'aquesta família interaccionen amb receptors de 7 segments de domini transmembrana acoblats a proteïnes G i amb el Ca2+ com a missatger secundari. Per poder valorar la possible implicació d'un receptor d'aquestes característiques pel F4P, es va determinar per un costat l'augment transitori de Ca2+ així com la implicació de les proteïnes G. Els resultats que vàrem obtenir ens demostren que l'activitat del F4P sobre aquestes cèl·lules no s'associa a un increment transitori de Ca2+ i cap dels inhibidors de proteïnes G testats va revertir l'efecte del F4P. En canvi, vàrem poder associar l'estímul del F4P a l'activació d'enzims fosfo-tirosinquinasa i més concretament a la fosforilació en residus tyr de l'enzim PI3-K. Per altre banda, els resultats obtinguts amb inhibidors de la transcripció, per una banda, i de la traducció per l'altre apunten que el F4P indueix la síntesi de citoquines estimulant la seva transcripció génica. Finalment, els resultats suggereixen l'existència en les cèl·lules NK de dues vies complementàries i contraposades que semblen bloquejar-se mútuament dirigint l'activitat d'aquestes cèl·lules vers un comportament citolític ó pro-inflamatori. Amb aquests resultats evidenciem, per tant, una nova capacitat pel F4P en potenciar la resposta pro-inflamatòria a través de les cèl·lules Natural Killer. Una de les funcions menys conegudes d'aquestes cèl·lules.

[eng] The activation of platelets in response to vascular injury or inflammation leads to the secretion of a variety of mediators, which modulate the functions of inflammatory cells. Platelet Factor 4 (PF4) is a platelet-specific protein member of the chemokine superfamily. Although the capacity of PF4 as an antiangiogenic factor or its procoagulant activity are well established, little is known about its proinflammatory functions. In the present study, we demonstrate the ability of PF4 to activate resting Natural Killer cells, to synthesize proinflammatory cytokines, such as IL-8, IL-1-beta, IL-6, IFN-gamma, TNF-alpha and granulocyte/macrophage colony-stimulatory factor (GM-CSF). Dose-response curves (10-200 ng/ml) and time-course assays show that PF4 increases mRNA levels and protein release for all cytokines studied. This ability was retained even while PF4 was bound to heparin, the physiological conditions must to greate affinity to glycosaminoglycans of the endotelial cells surface. Stimulation of Natural Killer cells through the Fc receptor for immunoglobulin gamma-IIIAwas found to synergistically increase the effect of PF4 on cytokines production. Conversely, PF4 does not have any effect in resting primary NK cells on the biological activities regulated by IL-2, such as Natural Killer (NK) and Lymphokine-Activated Killer (LAK) cytotoxic activities or high affinity IL-2 receptor (CD25) expression. However, PF4 was able to induce a dose-response increase in antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), an activity not regulated by IL-2 under these conditions. PF4 also increases CD69 expression, demonstrating the induction of a cellular activation state. The biological effects of PF4 are not Ca2+ mobilization dependent. Pertussis toxin did not block the PF4-derived cytokines production, which demonstrates that response to PF4 is not coupled to a pertussis toxin-sensitive Gi and G0 class of G proteins. Different evidences implicating a role of phosphatidilinositol 3-kinase in the intracellular signalling pathway triggered by platelet factor 4. Finally these results characterize a new capacity for PF4 and provide further evidence for the pivotal role of Natural Killer cells in the environment of inflammation.