Control transcripcional i al·lostèric del gen carnitina palmitoïl-transferasa 1B(CPT1B)

Abstract

[cat] L'enzim carnitina palmitoïltransferasa1 (CPT1), localitzat a la membrana mitocondrial externa, constitueix el principal punt de control de l'entrada d'àcids grassos de cadena llarga (LCFA) al mitocondri i és clau en el manteniment d'àcids grassos circulants. Existeixen tres isotips descrits (CPT1A, CPT1B i CPT1C) que codifiquen per enzims amb diferents característiques cinètiques i patrons d'expressió. 1.- Mecanismes de control transcripcional del gen CPT1B humà. El promotor humà de la CPT1B inclou un element de resposta a PPAR i un lloc d'unió a MEF-2. Hem investigat el paper d'aquests elements de resposta i la possible interacció entre PPARα i MEF2C en la regulació transcripcional d'aquest promotor. Dels resultats obtinguts podem concloure que la resposta del promotor a PPARα depèn: del context cel·lular, de l'element de resposta a MEF-2 i de la disposició espacial d'aquest respecte al PPRE. La combinació d'aquests elements cis en el promotor de la CPT1B indueix l'expressió màxima del gen en resposta a diferents senyals. La concurrència de senyals metabòlics i miogènics en aquest promotor genera una conformació transcripcional permissiva d'aquest promotor que porta a una activació sinèrgica del promotor en aquells teixits on es troben els corresponents factors de transcripció (MEF2C, PPARα/RXRα) i el substrat metabòlic de l'enzim, els àcids grassos que activen PPARα. En la mateixa una regió promotor una zona rica en GC capaç d'unir Sp1 ha resultat fonamental per l'expressió basal del gen i per la transactivació per PPARα però no per la de PPARδ. 2.- Relació estructura/funció de l'enzim CPT1 de porc. A nivell cinètic, les CPT1A mostren una alta afinitat per la carnitina i una baixa sensibilitat al malonil-CoA mentre que les CPT1B presenten característiques contràries. Una excepció a aquesta relació és la CPT1A de porc (PLCPT1) que es comporta com una quimera natural entre els isotips A i B, presentant afinitats pels substrats similars a les CPT1A i una IC50 pel malonil-CoA típica de les CPT1B. Utilitzant quimeres entre la CPT1A de rata i la CPT1A de porc hem demostrat que l'extrem C-terminal de les CPT1A es comporta com un únic domini que dicta la sensibilitat total a malonil-CoA de l'enzim. El grau de sensibilitat a l'inhibidor ve determinat per l'estructura adoptada per aquest domini. Utilitzant mutants delecionats hem mostrat que la sensibilitat a malonil-CoA també depèn de la interacció d'aquest únic domini carboxil amb els primers 18 aminoàcids de la proteïna. D'aquests resultats podem concloure que les CPt1A de rata i porc presenten diferent sensibilitats a malonil-CoA perquè els primers 18 aminoàcids dels enzims interaccionen diferent amb el domini C-terminal. Hem aïllat l'isotip muscular de la CPT1 de porc (PMCPT1), una proteïna de 772 aminoàcids molt similar a les CPT1B. Expressada en Pichia pastoris la CPt1B de porc ha resultat ser un enzim amb característiques cinètiques pròximes a les CPT1A. 3.- Efecte de C75 sobre el sistema CPT. Els enzims CPT1 i CPT2 són components del sistema llançadora CPT. Aquest sistema es troba finament regulat pels nivells de malonil-CoA, un inhibidor reversible de la CPT1. Per la seva capacitat d'inhibir la sintasa d'àcids grassos (FAS), el C75 és capaç d'incrementar els nivells intracel·lular de malonil-CoA intracel·lular. Paradoxalment també activa l'oxidació d'àcids grassos de cadena llarga. Per tal d'identificar la diana exacta del C75 en el sistema CPT vam analitzar l'activitat enzimàtica de CPT1A, CPT1B i CPT2 davant el tractament amb C75. Els resultats d'aquests experiments indiquen que el C75 actua sobre el sistema CPT activant CPT1A, CPT1B i CPT2 de manera independent de malonil-CoA.

[eng] The outer mitochondrial membrane enzyme carnitine palmitoyltransferase1 (CPTI) catalyzes the initial and regulatory step in the β-oxidation of long-chain fatty acids. There are three characterized isotypes: CPT1A, CPT1B and CPT1C. The human CPT1B promoter includes a functional PPAR responsive element and a myocite-specific site that binds MEF2C. We investigated the roles of these sites and the potential interaction between PPARα and MEF2C regulating this promoter. The combination of cis elements in the promoter of the CPT1B maximally induces the expression of this gene in response to a combination of signals. The concurrence of myogenic and metabolic signals generates a transcriptionally permissive conformation of the promoter that gives rise to a synergistic transcription of the gene in tissues containing the corresponding transcription factors and fatty acids that activate PPARα. Kinetic hallmarks of the CPT1A are high affinity for carnitine and low sensitivity to malonyl-CoA inhibition, while the opposite characteristics are intrinsic to the CPT1B isotype. Pig and rat CPT1A share common Km values for their substrates but differ in their sensitivity to malonyl-CoA inhibition. Using chimeras between rat CPT1A and pig CPT1A, we show that the C-terminal region behaves as a single domain, which dictates the overall malonyl-CoA sensitivity of this enzyme. Using deletion mutation analysis, we show that malonyl-CoA sensitivity also depends on the interaction of this single domain with the first 18 N-terminal amino acid residues. Pig and rat CPT1A have different malonyl-CoA sensitivity, because the first 18 N-terminal amino acids interact differently with the C-terminal domain. Pig CPT1B is a protein of 772 amino acids that shares extensive sequence identity with CPT1B. Expressed in Pichia pastoris, pig CPT1B shows kinetic characteristics similar to those of the CPT1A isotype. CPT1 and CPT2 enzymes are components of the CPT shuttle system. This system is tightly regulated by malonyl-CoA. Because of its ability to inhibit fatty acid synthase, C75 is able to increase malonyl-CoA intracellular levels. Paradoxically it also activates β-oxidation. To identify the exact target of C75 within the CPT system, we expressed CPT1 and CPT2 in Pichia pastoris. We show that C75 acts on recombinant CPT1A, CPT1B and CPT2.