Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2445/36307
Title: Control transcripcional i caracterització molecular de l’alanina aminotransferasa mitocondrial en l’orada (Sparus aurata)
Author: Salgado Martín, María del Carmen
Director: Vázquez Baanante, Ma. Isabel
Metón Teijeiro, Isidoro
Keywords: Alanina aminotransferasa mitocondrial
Control transcripcional
Expressió gènica
Expresión génica
Gene expression
Sparus aurata
Issue Date: 25-Nov-2011
Publisher: Universitat de Barcelona
Abstract: [cat] Els peixos carnívors presenten baixa capacitat per metabolitzar carbohidrats i per mantenir la glucèmia. En aquests organismes, la baixa capacitat per metabolitzar carbohidrats condueix a estats d’hiperglicèmia més marcats i sostinguts que els descrits per a mamífers, després de l’administració de glucosa o la ingesta de dietes amb elevat contingut de carbohidrats. L’alanina aminotransferasa (ALT) catalitza la transaminació reversible entre L-alanina i α-cetoglutarat per formar L-glutamat i piruvat. Mitjançant la interconversió d’aquests quatre metabòlits, l’ALT esdevé un nexe d’unió entre el metabolisme d’aminoàcids i el de carbohidrats. En estudis previs del nostre grup es va descriure la presència de tres isoformes ALT en S. aurata, els isoenzims citosòlics, cALT1 i cALT2, i la isoforma mitocondrial mALT. L’expressió hepàtica de cALT2 incrementa en situacions gluconeogèniques, mentre que la de cALT1 és predominant durant el període postprandial per a l’utilització dels nutrients de la dieta. L’objectiu d’aquest treball és incrementar el coneixement del metabolisme intermediari en peixos i així permetre realitzar futures intervencions biotecnològiques amb la intenció de millorar la utilització metabòlica dels nutrients de la dieta. Per comprendre millor la funció d’mALT vam estudiar la distribució tissular, la caracterització cinètica i la regulació nutricional i hormonal de l’expressió d’mALT en S. aurata. Addicionalment, vam analitzar l’expressió tissular i la regulació hormonal dels enzims aspartat aminotransferasa mitocondrial (AST2), glutamat deshidrogenasa (GDH) i glutamina sintetasa (GlnS), relacionats tots ells amb el metabolisme d’aminoàcids. En orades alimentades, mALT, GDH i GlnS s’expressen majoritàriment a fetge, intestí i ronyó. Els nostres estudis indiquen que l’expressió de mALT, GDH, AST2 i GlnS és elevada en animals alimentats, mentre que disminueix en condicions associades amb la gluconegènesi, com ara el dejú i el tractament amb estreptozotocina (STZ). Estudis cinètics de l’activitat enzimàtica mALT indiquen que l’enzim catalitza de manera més eficient la conversió d’L-alanina a piruvat, que no pas la reacció inversa. Per conèixer el mecanisme molecular implicat en la regulació transcripcional de l’expressió d’mALT, vam aïllar el promotor mALT d’orada, i vam mostrar que HNF4α incrementa la transcipció d’mALT per unió a una caixa HRE. El dejú i l’administració d’STZ disminuïren els nivells d’HNF4α en ronyó d’S. aurata, portant a un descens en la transcripció d’mALT. Els nostres resultats suggereixen que HNF4α té un paper important en la regulació transcripcional del gen mALT en ronyó d’S. aurata. En conclusió, els nostres resultats suggereixen que mALT i cALT1, que presenten una distribució tissular i un patró d’expressió en dejú i tractament amb STZ similars, podrien cooperar per direccionar els aminoàcids de la dieta al mitocondri per destinar-los a l’obtenció d’energia. Per tant, ALT es podria utilitzar com a diana per realitzar una intervenció biotecnològica a fi de reduir la utilització de proteïnes amb finalitats energètiques i optimitzar així l’ús dels nutrients de la dieta en el cultiu de peixos.
[eng] Carnivorous fish have poor ability to use dietary carbohydrates and to control the blood glucose levels. Compared with mammals, these animals show prolonged hyperglycemia after a glucose load or when feeding on high carbohydrate diets. Alanine aminotransferase (ALT) links carbohydrate and amino acid metabolism through catalyzing the reversible transamination between L-alanine and 2-oxoglutarate to form pyruvate and L-glutamate. Our group, in previous studies showed the presence of three ALT isoforms in Sparus aurata: the cytosolic isoenzymes cALT1 and cALT2 and a mitochondrial isoform, mALT. In fish liver, increased expression of cALT2 is associated to enhanced gluconeogenesis while cALT1 is predominant during the postprandial utilization of dietary nutrients. The aim of the present study was to increase the current knowledge of fish intermediary metabolism to allow future biotechnological actions in order to improve metabolic utilization of dietary nutrients. To better understand the functional role of mALT we analysed the tissue distribution, kinetic characterization and nutritional and hormonal regulation of mALT expression in S. aurata. Furthermore, cloning and characterization of the mALT promoter was also addressed. Additionally, tissue expression and nutritional regulation of glutamate dehydrogenase (GDH), mitochondrial aspartate aminotransferase (AST2) and glutamine synthetase (GlnS), also involved in amino acid metabolism, was followed. In S. aurata under feeding conditions, mALT, GDH and GlnS are mainly expressed in liver, intestine and kidney. Our studies indicate that the expression of mALT, GDH, AST2 and GlnS is increased in fed animals, while decreased in conditions associated with gluconeogenesis, such as fasting or treatment with streptozotocin (STZ). Kinetic analysis of mALT enzyme activity indicated that this enzyme catalyses more efficiently the conversion of L-alanine to pyruvate than the reverse reaction. To understand the molecular mechanism underlying the transcriptional regulation of mALT expression, we isolated the S. aurata mALT promoter, and showed that HNF4α enhances mALT transcription through binding to an HRE box. Starvation and administration of STZ decreased HNF4α levels in the kidney of S. aurata, leading to downregulation of mALT transcription. Our results suggest that HNF4α may play an important role in the transcriptional regulation of mALT gene in kidney of S. aurata. In conclusion, our findings suggest that mALT and cALT1, which present a similar tissue distribution and pattern expression under starvation and STZ-treatment, can cooperate to redirect dietary amino acids to the mitochondria for energetic pourposes. This points to ALT as a target for a biotechnological action to spare protein and optimize the use of dietary nutrients for fish culture.
URI: http://hdl.handle.net/2445/36307
Appears in Collections:Tesis Doctorals - Departament - Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
MCSM_TESI.pdf9.68 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.