Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2445/36309
Title: Producció de proteïnes recombinants mitjançant la tecnologia Zera® en diferents sistemes eucariotes: desenvolupament d’estratègies de processament.
Author: Pallissé Bergwerf, Roser
Director: Llompart i Royo, Blanca
Serra i Cucurull, Dolors
Keywords: Producció de proteïnes de fusió recombinants
Sistemes de processament
Proteases exògenes
Inteïnes
Tecnologia Zera®
Issue Date: 18-Jan-2012
Publisher: Universitat de Barcelona
Abstract: [cat] ERA Biotech S.A. és una empresa que desenvolupa la seva pròpia tecnologia per a la producció de proteïnes i pèptids d’alt valor afegit. El mètode de producció i acumulació de proteïna recombinant es basa en el mecanisme natural d’acumulació de proteïnes de reserva de blat de moro (zeïnes) en orgànuls densos derivats de reticle endoplasmàtic anomenats cossos proteics. La tecnologia Zera® empra el domini ric en prolina de l’extrem N-terminal de la γ-zeïna per induir la formació de novo de cossos proteics heteròlegs en teixits i cèl•lules eucariotes. L’elevada densitat que presenten aquests orgànuls permet una recuperació i enriquiment de la proteïna de fusió d’interès, mitjançant tècniques d’homogeneïtzació i fraccionament cel•lular. Originàriament dissenyats per permetre la purificació per afinitat del proteïna d’interès, els elements de fusió també poden ajudar a mantenir l’estabilitat, el plegament i la solubilitat del producte. Malgrat tot, per a algunes aplicacions posteriors es requereix la producció de la proteïna nativa, amb el qual són necessàries etapes de proteòlisi mitjançant endoproteases específiques. En un context industrial l’addició d’una proteasa exògena suposa l’etapa més costosa en el procés de producció. A més, les condicions de processament poden arribar a interferir amb l’activitat biològica del component purificat. Un dels objectius principals de moltes empreses dedicades a la producció de proteïnes recombinants, tracta de cercar alternatives al processament convencional per addició de proteases exògenes. L’objectiu general d’aquest treball s’ha centrat en el desenvolupament i aplicació de dues estratègies de processament aplicades a proteïnes recombinants de fusió produïdes mitjançant la tecnologia Zera®, en diferents sistemes d’expressió. La primera aproximació ha consistit en la producció d’enteroquinasa bovina (EK), endoproteasa específica, mitjançant la tecnologia Zera®. La producció d’enteroquinasa pròpia evitaria l’adquisició comercial de la mateixa, amb el qual es reduirien els costos globals de producció. S’han dissenyat diferents construccions amb el domini catalític de l’enteroquinasa fusionat al domini Zera® per tal de permetre la seva acumulació en cossos proteics heteròlegs. Degut a la conformació catalítica que adopta, observàrem que el seu extrem N-terminal havia de romandre lliure per tal de mantenir la seva activitat proteolítica. La fusió del domini Zera® al extrem C-terminal d’EK va resultar incompatible amb la viabilitat de les cèl•lules de mamífer o del teixit foliar de tabac, indicant cert grau de citotoxicitat promogut per la proteasa activa. D’altra banda, el bloqueig de l’extrem N-terminal d’EK mitjançant la fusió del domini Zera®, requeria d’una etapa prèvia de processament per tal d’activar la proteasa in vitro. Els baixos nivells d’expressió assolits en cèl•lules de mamífer, juntament amb la baixa idoneïtat de l’estratègia, varen motivar l’exploració d’altres alternatives de processament. La segona aproximació descrita en aquest treball es basa en l’estudi de l’autoprocessament de proteïnes de fusió mitjançant inteïnes. Les inteïnes són elements proteics naturals capaços de promoure l’splicing de proteïnes a través d’una sèrie de reaccions que permeten la seva auto-excissió i la unió dels fragments que les flanquegen o exteïnes. Certes modificacions genètiques en residus clau de la seqüència de les inteïnes, han permès modular la seva activitat per permetre l’autoprocessament in vitro de forma controlable. S’ha estudiat l’aplicació de dos tipus diferents d’inteïnes induïbles per al processament de proteïnes de fusió Zera®, en cèl•lules de mamífer, en cèl•lules d’insecte, i en planta de tabac. El rendiment global del procés de producció de rhGH (com a proteïna model), fou analitzat i comparat emprant dos sistemes de processament diferents sobre la proteïna de fusió Zera® expressada en planta de tabac: el mediat per la inteïna MxeGyrA, i el de la proteasa comercial enteroquinasa. Tot i que els costos globals de producció de rhGH resultaren similars per ambdós processos, el rendiment de producció fou notòriament major en el procés emprant la inteïna. L’èxit de l’aplicació de les inteïnes a la tecnologia Zera®, ha comportat un avenç en el procés de downstream, facilitant de manera significativa la recuperació de la proteïna nativa d’interès.
[eng] ERA Biotech S.A. is a biotechnology company whose technology permits high-level production of recombinant proteins and peptides through application of the Zera® assembler peptide. The Zera® domain originates from a maize storage protein (gamma-zein), which naturally accumulates in maize grains in the form of dense protein bodies to elevated levels. The Zera® assembler peptide when fused to a protein of interest triggers the formation in vivo of protein bodies in eukaryotic cells, effectively converting the cells into dense storage organelles. Due to its physicochemical properties, the downstream steps and recovery of the recombinant proteins are extremely efficient. For some applications in the biopharmaceutical industry, fusion or affinity tags need to be cleaved off by site-specific endoproteases in order to recover the native target protein. At a manufacturing scale, the removal of the fusion tag is the most costly step in protein production (cost and specificity/efficiency issues), and can interfere with the biological activity of the purified component. Therefore novel cleavage options which permit specific, efficient and scalable protein production processes are required. In the present study we describe two different cleavage strategies that have been adopted for Zera® fusion proteins expressed in different host expression systems. The first approach was to produce a conventional site-specific endoprotease in house through Zera® technology. Different constructs were designed for the easy and active production of bovine enterokinase (EK) catalytic subunit in mammalian cells and transgenic tobacco plants. Active conformation of this protease was adopted when the N-terminus of the protein was free of any fusion tag, however, proteolytic activity of this protease resulted in cytotoxicity in both host cell systems tested. The fusion of the Zera® domain in the N-terminus of EK and its expression in mammalian cells resulted in the formation de novo of protein bodies accumulating the target fusion protein. Isolation of protein bodies and subsequent downstream steps for protein recovery were designed and set up for this new host system. For the EK activation, a cleavage step by another endoprotease was included, but the low expression levels achieved for this fusion protein, resulted in non-conlcusive data from the activity test. Considering the biochemical properties of this protease its recombinant production for large scale manufacturing results technically cost-unfriendly, so alternative cleavage methods were explored. The second approach described in the present work, consisted in the use and application of self-cleavable elements for the specific cleavage of Zera® fusion proteins. Inteins are naturally occurring protein elements capable of post-translational self-excission from a precursor protein through a process known as protein splicing. MxeGyrA and SspDnaB mini-inteins have been engineered to yield a controllable N-terminal and C-terminal autocleavage induced under certain controlled conditions. Both inteins have shown activity when fused to Zera® and to a protein of interest in mammalian cells (CHO), insect cells (Sf9) and transgenic tobacco plants. The success of the intein application to the Zera® technology has evolved into a faster and more user friendly downstream step leading to the recovery of a native protein of interest.
URI: http://hdl.handle.net/2445/36309
Appears in Collections:Tesis Doctorals - Departament - Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
RPB_TESI.pdf4.48 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.