Contractile response of alveolar epithelial cells to biochemical or mechanical stimulation probed by traction microscopy

Abstract

[eng] THESIS SUMMARY: GENERAL AIM The general aim of this thesis was to study the generation of contractile force by human alveolar epithelial cells in culture in response to biochemical or mechanical stimuli using traction microscopy. SPECIFIC AIMS 1. To implement a traction microscopy setup to measure the contractile force generated by human alveolar epithelial cells in culture. 1.1. To implement and validate a software to determine the deformation field induced by adhered cells on the elastic substrate, following previously described algorithms. 1.2. To implement and validate a software to determine the traction field induced by adhered cells and other contractility parameters, following previously described algorithms. 1.3. To implement a software to determine the contour of an adhered cell from a brightfield or phase contrast image of the cell. 2. To study the contractile response of human alveolar epithelial cells in response to thrombin. 2.1. To determine the gel substrate conditions and gel fabrication procedure which enable suitable cell culture and optimal detection of traction forces exerted by human alveolar epithelial cells. These gel conditions include: concentration of polyacrilamide gel components to provide optimal gels stiffness; concentration of fluorescent beads to optimally compute gel deformation; and suitable gel coating to enable cell attachment. 2.2. To determine the gel elastic properties (Young's modulus) by atomic force microscopy. 2.3. To measure the time-course of the contractile response to thrombin challenge. 2.4. To study the distribution of contractile forces exerted by adhered cells before and after thrombin stimulation. 2.5. To measure actin polymerization and reorganization induced by thrombin challenge. 2.6. To study the role of the actin cytoskeleton in the contractile response to thrombin by pre-treatments with cytochalasin D. 2.7. To study the role of pathways signalling MLC phosphorilation in the contractile response to thrombin by pre-treatments with ML7 and Y-27632. 3. To study the contractile response of human alveolar epithelial cells subjected to stretch. 3.1. To determine a suitable gel substrate that firmly attaches to a flexible membrane, allowing biaxial stretch application (max ~15%) and cell culture. 3.2. To determine the gel elastic properties (Young's modulus) of the gel at different strain levels by atomic force microscopy. 3.3. To implement and validate a stretching device to apply controlled biaxial and uniform strains to cultured cells and simultaneously measure contractile forces by deforming the gel substrate to which they are adhered. 3.4. To adapt the existing traction microscopy algorithms and software to allow computation of large bead displacements (~20 μm) and corresponding stretch fields. 3.5. To measure contractile forces exerted by human alveolar epithelial cells before, during and after being subjected to a stepwise deformation of up to 11.5% linear strain. 3.6. To assess the role of actin polymerization in the contractile response to stretch. 3.7. To assess the role of actomyosin crossbridges attachment or detachment in the contractile response to stretch. 3.8. To assess temporal changes in cell contractility after stretch release.

[cat] "Estudi de la contracció de cèl·lules epitelials alveolars en resposta a estímuls inflamatoris i de deformació mitjançant microscopia de tracció" TEXT: L'epiteli alveolar forma una barrera cel·lular semipermeable entre l'espai alveolar i l'interstici del pulmó, permetent l'intercanvi gasós a la vegada que restringeix el pas de líquid, macromolècules i cèl·lules cap a l'alvèol. El trencament de la monocapa, degut a la formació de forats entre cèl·lules adjacents, pot donar lloc a l'augment de la permeabilitat i l'entrada de líquid a l'alvèol, característics del dany pulmonar agut. La integritat de la monocapa epitelial es regeix per un equilibri dinàmic de forces als punts d'unió cèl·lula-cèl·lula, i cèl·lula-matriu. Les forces en joc es divideixen en una component de tensió centrípeta i una component d'adhesió centrífuga. La component centrípeta es deguda a les forces de contracció generades activament per la maquinària contràctil cel·lular i el retrocés passiu degut a la deformació cíclica a la que es troben sotmeses les cèl·lules alveolars durant la respiració. Per tal de garantir la integritat de la monocapa, les forces d'adhesió han de ser capaces de contrarestar la tensió centrípeta. L'equilibri de forces als punts d'unió pot veure's compromès degut a estímuls inflamatoris o bé mecànics. El projecte de tesi es centra en el paper de les forces actives de contracció sobre la integritat de la monocapa alveolar en resposta a estímuls característics del dany pulmonar agut. Per tal d'estudiar aquesta component contràctil, el present projecte ha utilitzat la microscopia de tracció. Aquesta tècnica permet mesurar la força que cèl·lules adherents aïllades realitzen sobre el seu substrat, així com la seva distribució espaial i evolución temporal. La tècnica consisteix en cultivar cèl·lules adherents sobre substrats elàstics que contenen microesferes fluorescents. Comparant la posició de les microesferes quan la cèl·lula es troba adherida al substrat i un cop aquesta ha estat desenganxada amb tripsina, podem calcular la força que la cèl·lulaadherent realitzava sobre el substrat. El projecte de tesi inclou dos estudis concrets, dedicats a dos estímuls característics de dany pulmonar agut als qual poden trobar-se sotmeses les cèl·lules epitelials alveolars. El primer estudi (secció 3) es centra en l'efecte que el mediador inflamatori trombina provoca sobre la realització de forces contràctils per part de cèl·lules alveolars epitelials. El segon estudi (secció 4) es centra en la resposta contràctil de cèl·lules alveolars epitelials a l'aplicar deformacions externes, simulant les condicions de respiració mecànica que requereixen molts pacients amb dany pulmonar agut.