Péptidos de fusión del virus de la hepatitis G: definición, síntesis y caracterización biofísica

Abstract

[spa] Un primer paso para conocer la entrada del virus de la hepatitis G en la célula es conocer dónde se encuentra el péptido de fusión. Por esta razón, éste fue el principal objetivo de la presente tesis. Dentro de la familia "Flaviviridae", los péptidos de fusión descritos hasta el momento, se encuentran en la zona interna de la proteína estructural. El virus de la hepatitis G se asemeja estructuralmente al virus de la hepatitis C, por ello,la búsqueda del péptido de fusión se centró en la proteína estructural E2 también presente en el virus de la hepatitis C. Las regiones escogidas dentro de la proteína estructural pertenecen a la región amino terminal, E2(7-26), y la zona interna (E2(279-298). Estas secuencias fueron sintetizadas mediante metodología en fase sólida y se estudió la interacción entre los péptidos y modelos de membrana de distinta complejidad (monocapas lipídicas, bicapas lipídicas). Las técnicas utilizadas para conocer la interacción entre ambos fueron las isotermas de Langmuir, la calorimetría diferencial de barrido, la espectroscopia de fluorescencia, la espectroscopia de UV y la microscopía. Además se estudió la conformación adoptada por los péptidos por las técnicas de dicroísmo circular y espectroscopia de infrarrojos por transformada de Fourier. De todos los resultados obtenidos el péptido que interaccionó en mayor medida con los modelos de membrana, además de desestabilizar y producir fusión fue E2(279-298). Este péptido producía un cambio en su conformación al interaccionar con membranas fosfolipídicas(sobre todo en presencia de cargas negativas) hacia una estructura de tipo alfa-hélice. Este cambio hacia una estructura más ordenada podría proporcionar la conformación activa del péptido responsable de la desestabilización de las membranas.

[eng] The hepatitis G virus (GBV-C/HGV) is a enveloped RNA virus belonging to the "Flaviviridae" family. The natural history of the GBV-C/HGV infection is at present not fully understood and its potential to cause hepatitis in humans is questionable. Elucidation of the mechanism of the fusion of enveloped viruses to target membranes has attracted considerable attention because of its relative simplicity and potential clinical importance. Apart from the functions of viral binding to target membranes and the activation of viral fusion proteins, usually only one viral protein is responsible for the membrane fusion step. However, the nature of the interaction of viral fusion proteins with membranes and the mechanism by which these proteins accelerate the formation of membrane fusion intermediates are poorly understood. In this sense, specialized hydrophobic conserved domains ("fusion peptides") have been postulated to be absolutely required for the fusogenic activity. The main objective of the present work was the knowlegment of the fusion peptide of the hepatitis G virus. For this purpose we have performed studies with different synthetic peptides belonging the envelope protein E2 of hepatitis G virus. The selected peptides were from the amino terminal part of the protein (E2(7-26)) and from the internal part (E2(279-298)). We have analysed lipid-peptide interactions depending on the degree of complexity of model membranes: monolayer studies (surface activity, insertion of peptides into monolayers) and liposomes studies (differential scanning calorimetry, fluorescence measurements). The peptides were compared for their ability to interact and perturb membranes. In addition, they were also tested for their ability to induce both leakage of vesicular contents and vesicle fusion as well as to lyse erythrocytes. Furthermore, we have studied the conformational behaviour of the peptides in water and in different membrane environments by Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR) and circular dichroism (CD). The results obtained showed that the E2(279-298) sequence was able to interact, penetrate and permeabilize vesicles bilayers in a higher extent than E2(7-26) sequence. Furthermore, the interaction with membranes induced a change in the internal peptide to an alpha-helical conformation while the amino terminal sequence did not. This indicate that this internal segment peptide could be involved in the fusion of hepatitis G virus into cell membrane.