Cerca i identificació del gen de retinitis pigmentària autosòmica recessiva del locus RP26

Abstract

[spa] La retinitis pigmentària (RP) és la degeneració retinal hereditària més prevalent i una de les causes principals de ceguesa en humans. Des d'un punt de vista clínic es manifesta com a ceguesa nocturna, progressa amb la reducció del camp visual i en estadis avançats condueix a la ceguesa completa. Es caracteritza per la mort apoptòtica de les cèl·lules fotoreceptores de la retina com a conseqüència de l'alteració d'algun dels 32 gens que, fins a dia d'avui, han estat identificats com a gens causals de la malaltia. L'objectiu principal d'aquest treball de tesi doctoral ha estat la cerca d'un nou gen de retinitis pigmentària autosòmica recessiva en el locus RP26. Aquest locus havia estat definit prèviament, pel nostre grup, en el braç llarg del cromosoma 2, mitjançant una anàlisi de lligament. En aquest treball de tesi, es presenta la caracterització funcional d'un nou gen del locus RP26, el gen ORMDL1, identificat com a pressumpte candidat, i la descripció de la família gènica a què pertany: una nova família de gens que codifiquen proteïnes transmembrana del reticle endoplasmàtic, molt conservades i presents exclusivament en els eucariotes. A partir de l'anàlisi funcional realitzada amb la generació de soques knockout dels gens ORM1 i ORM2 del llevat, es proposa una implicació d'aquestes proteïnes en la resposta del reticle endoplasmàtic a proteïnes malplegades. En la segona part del treball, s'exposen els resultats de la cerca del gen responsable d'RP del locus RP26. Gràcies a una aproximació que va incloure el refinament dels marges del locus, l'anàlisi de gens candidats i un extens mapatge d'homozigositat, realitzat al llarg d'un interval de cosegregació de 12 Mb, vam definir una regió candidata que contenia 9 gens descrits. Tot ells van ser descartats per seqüenciació com a responsables de la malatia. La cerca in silico de nous gens ens va conduir a la identificació d'un nou gen, que vam anomenar CERKL (ceramide kinase-like) perquè codifica una proteïna similar a ceramida quinasa. La seqüenciació de la regió codificant de CERKL en la família RP26, ens va permetre identificar una mutació puntual (R257X) en l'exó 5 del gen, en homozigosi en els individus afectes. Aquesta mutació produeix el truncament prematur de la proteïna CERKL, al bell mig del pressumpte domini quinàsic. El gen CERKL s'expressa en diversos teixits adults, inclosa la retina, i fetals. L'ortòleg del ratolí s'expressa en la capa de cèl·lules ganglionars i en els fotoreceptors de la retina. La descoberta de CERKL com a gen RP26 vincula per primer cop l'apoptosi característica de la degeneració retinal amb una alteració del metabolisme dels esfingolípids, que ha estat implicat en nombrosos processos de supervivènica i mort cel·lular.

[eng] Retinitis Pigmentosa (RP), the main cause of adult blindness, is a genetically heterogeneous disorder characterized by progressive loss of photoreceptor cells through apoptosis. Up to now, 32 genes have been implicated in RP. The main goal of this PhD thesis has been the search of a novel autosomal recessive RP gene within the RP26 locus. This locus was identified by linkage analysis on 2q31.2-q32.3. As no obvious positional candidates were found among known genes, an expressed sequence tag (EST) database search was undertaken to identify sequences expressed in the retina. Following this approach, we characterized a novel gene within the RP26 locus, ORMDL1. This gene belonged to a eukaryotic gene family that encoded highly conserved endoplasmic reticulum transmembrane proteins. In the second part of the thesis, we refined the RP26 locus down to 2.5 Mb by homozygosity mapping. After unsuccessful mutational analysis of the nine genes initially reported in this region, a detailed gene search based on expressed-sequence-tag data was undertaken. We finally identified a novel gene encoding a ceramide kinase (CERKL), which encompassed 13 exons. All of the patients from the RP26 family bear a homozygous mutation in exon 5, which generates a premature termination codon. The same mutation was also characterized in another, unrelated, Spanish pedigree with arRP. Human CERKL is expressed in the retina, among other adult and fetal tissues. A more detailed analysis by in situ hybridization on adult murine retina sections shows expression of Cerkl in the ganglion cell layer. Ceramide kinases convert the sphingolipid metabolite ceramide into ceramide-1-phosphate, both key mediators of cellular apoptosis and survival. Ceramide metabolism plays an essential role in the viability of neuronal cells, the membranes of which are particularly rich in sphingolipids. Therefore, CERKL deficiency could shift the relative levels of the signaling sphingolipid metabolites and increase sensitivity of photoreceptor and other retinal cells to apoptotic stimuli. This is the first genetic report suggesting a direct link between retinal neurodegeneration in RP and sphingolipid-mediated apoptosis.