Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2445/41910
Title: Mecanismes de regulació transcripcional del gen que codifica per la "Kidney-Androgen Regulated Protein" (KAP) en relació a la seva especificitat de teixit i control hormonal.
Author: Teixidó Travesa, Neus
Director: Meseguer Navarro, Anna
Balcells Comas, Susana
Keywords: Regulació gènica
Issue Date: 27-Jul-2007
Publisher: Universitat de Barcelona
Abstract: [cat] Entre els gens sotmesos a regulació androgènica al ronyó de ratolí i amb una expressió pràcticament exclsuiva al túbul proximal es troba el de la Kidney Androgen-regulated Protein (KAP). L'mRNA del gen de la KAP és el més abundant del ronyó de ratolí mascle i la hibridació in situ sols es detecta en les cèl·lules epitelials dels túbuls corticals (Meseguer et al., 1987). L'especificitat tan restringida de l'expressió del gen de la KAP així com el dimorfisme sexual que manifesta ha permès distingir dos patrons diferents dins les cèl·lules S1/S2 i S3 que integren el túbul proximal. En les cèl·lules S3 l'expressió de KAP és dependent de l'hormona tiroïdal i en les cèl·lules S1/S2 l'expressió sols present en mascles respon a andrògens i és dependent de la presència puntual de l'hormona tiroïdal durant la maduració gonadal. La mutació de dues putatives seqüències d'unió per a factors C/EBP situades a -429 i -457 del promotor del gen suposa en assajos de transfeccio transitòria en la línia cel·lular PCT3 derivada dels segments S1/S2 amb constructes de 638 pb del promotor, una caiguda de la inducció per andrògens de -40 cops. En aquesta Tesi s'ha comprovat mitjançant assajos EMSA que el receptor d'andrògens (RA) és capaç d'unir l'element de reposta a andrògens (ARE) situat a -39bp de l'inici de transcripció. Assajos de transfecció transitòria han mostrat que la mutació A<G de la primera adenina de la caixa TATA situada a -28 pb solapada parcialment amb l'ARE suposa una caiguda dramàtica en l'activitat del promotor del gen. Mitjançant assajos EMSA hem vist que la unió de RA a l'ARE mutat que incorpora el canvi de nucleòtid en la caixa TATA no es veu afectada per aquest. Hem pogut concloure que el gen de la KAP presenta una caixa TATA funcional necessària per a què es produeixi la inducció per andrògens que té lloc per unió de RA a l'ARE solapat i que el gen no es comporta com un gen TATA-less en els contextos d'inducció androgènica. Hem comprovat que la seqüència GC situada a -100 pb del promotor és un lloc d'unió pel factor Sp1 que és capaç d'induir l'activitat del constructe que incorpora els primers 638 pb del promotor. La caixa GC també és unida pel factor Sp3 que al seu torn no és capaç d'induir l'activitat del promotor i competeix amb Sp1 fent disminuir el seu efecte inductor. Mitjançant assajos de transfecció transitòria s'ha vist que Sp1 sinergitza amb RA en la resposta a andrògens del promotor. S'ha comprovat per assajos EMSA la possible unió dels factors C/EBP a les caixes -429 i -457. Així s'ha vist que que la caixa -457 és unida per C/EBP en cèl·lules PCT3 i pels factors C/EBP i  al ronyó de ratolí. La caixa -429 no és unida per cap dels factors C/EBP testats. S'han realitzat cromatografies d'afinitat per la caixa -429 i se n'ha aïllat l' ATP-dependant RNA helicase DDX20, helicasa que s'uneix al factor Steroidogenic Factor 1, possible candidat a regular la KAP. La predicció in silico per a la caixa -429 apunta la possible unió per Receptor de Glucocorticoides (GR) fet que ha permès constatar la col·laboració que en el promotor del gen ocorre entre andrògens, glucocorticoides i Sp1. L'escenari final descrit en aquesta Tesi per a la regulació del gen de la KAP apunta a una resposta androgènica del promotor dependent de la presència simultània de l'ARE, la caixa GC i la caixa -429 suggerint la col·laboracio entre AR, Sp1 i el factor que uneix la caixa -429. La caixa -457 (C/EBP sembla no tenir implicació en aquesta la resposta androgènica.
[eng] The Kidney Androgen-regulated Protein (KAP) gene is exclusively expressed in proximal tubules of mouse kidney. It displays a differential regulation of expression by steroid and thyroid hormones (THs) in different proximal tubule segments. Whereas the pars recta (PR cells) responds to thyroid and sexual hormones, the pars convoluta (PCT cells) represents a truly androgen-dependent compartment because expression occurs only in the presence of androgens and functional androgen receptors. Using several genetically deficient mouse models it was determined that thyroid and GH modulate CCAAT/enhancer binding protein  and  levels that, in turn, control KAP expression in PCT cells in a developmentally dependent manner. In this thesis we demonstrated that C/EBP  actually binds to CAAT box located at -457 bp of the KAP promoter meanwhile the putative CAAT situated at -429 bp is not bound by a C/EBP protein. We have proved that AR binds to an Androgen Response Element located at -39 bp that is overlapping with the TATA box of the gene. We saw that the androgenic response of KAP promoter is mediated and increased by Sp1 factor. The GC box, Sp target sequence, is found at -110 bp and we have seen Sp3 is also able to bound it eventhough this factor competes with Sp1 for the binding decreasing the androgen promoted transcription. With the aim of determining which factor is bound to box -429 promoting KAP transcription we performed DNA affinity chromatograpy. With these assays we could isolate ATP-dependant RNA helicase DDX20, an helicase that interacts with Steroidogenic Factor 1 (SF-1) a new candidate for KAP gene regulation. The in silico predictions for box -429 indicated the possible binding of Glucocorticoid Receptor (GR). Eventhough GR is not bound to -429 sequence, we could see a strong collaboration of glucorticoids in the AR-Sp1 response in KAP promoter. The final scenario for KAP regulation we could describe in this Thesis is an androgenic response of the promoter depending on the simultaneous presence of ARE, GC box and box -429 suggesting a collaboration between AR, Sp1 and the transcription factor that is bound to -429 box.
URI: http://hdl.handle.net/2445/41910
ISBN: 9788469135327
Appears in Collections:Tesis Doctorals - Departament - Genètica

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
NTT_TESI.pdf4.6 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.