Metaloproteínas y metalómica: Mecanismos de respuesta a metales en diversos organismos modelo, sus interacciones moleculares y su integración en redes metabólicas

Abstract

[spa] Las líneas de investigación de la presente tesis se encuentran enmarcadas en dos aspectos de la respuesta de los sistemas biológicos ante la presencia de metales. Los sujetos de investigación son tanto (1) elementos individuales (las proteínas denominadas Metalotioneínas), como (2) redes de respuesta global (Metalómica), y su relación e imbricación con el metabolismo celular (Metabolómica).

Las metalotioneínas (MT), aunque ubicuas, son probablemente de origen polifilético, de modo que habrían aparecido numerosas “familias de homología” a lo largo de la evolución.

El análisis computacional de los miembros de la familia de metalotioneínas en los genomas de Drosophila (5 formas parálogas), en doce especies (12 conjuntos de ortólogos) condujo a la identificación de 60 secuencias de isogenes/proteínas con secuencias de DNA/proteína altamente conservadas. La conservación en el número de isogenes del sistema MT en Drosophila sugiere que la multiplicidad de estos genes es debida a un evento evolutivo anterior a la especiación de este género. A pesar de exhibir una gran plasticidad, la región cromosómica donde se localizan los componentes del sistema de MT en Drosophila, preserva su localización en el elemento Müller E en las doce especies. La arquitectura de los genes, formados por dos exones y un intrón, también se conserva en el conjunto de ortólogos/parálogos. La reorganización identificada en la región cromosómica donde se localizan las isoformas de MT en Drosophila es debida principalmente a eventos de inversión de DNA que implican orientaciones diferentes de los cinco genes. El análisis de las propiedades de coordinación de metales de la isoforma MtnE la clasifican como una Cu-tioneína de carácter intermedio o no extremo, ya que a pesar de formar complejos homometálicos con el Cu, la capacidad de unión de cobre es menor que la observada para el resto de las isoformas. MtnE muestra la capacidad coordinante menos específica, en comparación con el resto de isoformas, lo que sugiere una función fisiológica relacionada con condiciones en las que se necesite un péptido con amplio espectro de coordinación de metales, por ejemplo condiciones de toxicidad mixta por varios metales, o elevado nivel de toxicidad de Cu en los que apoyaría la acción del resto de isoformas.

Además se identificaron dos secuencias (BfMT1 y BfMT2) como potenciales MT en el genoma de Branchiostoma floridae, organismo procordado ubicado en la base evolutiva de los vertebrados. Las secuencias de ORFs, sus regiones reguladoras, y correspondientes productos proteicos, mostraron características que los reafirman como potenciales MT. Los genes BfMT1 y BfMT2 fueron identificados in vivo mediante RT-PCR sobre RNA total de organismos de Branchiostoma lanceolatum. Ambos genes se inducen in vivo en B. lanceolatum en condiciones de exceso de metales (Cd o Cu), mostrando BfMT1 un patrón correspondiente a un gen de expresión basal o constitutiva, mientras que la expresión de BfMT2 se corresponde con la de un gen inducible. El tratamiento de organismos vivos con distintas concentraciones de Cd demostró que en condiciones de exceso de este metal, se produce además una disrupción en la homoestasis del zinc.

En cuanto a los elementos de respuesta global, desarrollamos el estudio genómico y transcriptómico de las redes de respuesta de S. cerevisiae como organismo modelo ante dosis excesivas de Zn que alteran sus equilibrios homeostáticos. Resultados previos de nuestro grupo mostraron una interrelación entre las vías metabólicas de respuesta a estrés de Zn y aquellas de distintos metales. Análisis de varios mutantes tolerantes a zinc nos permitió identificar una imbricación relevante entre procesos metabólicos vitales como la respiración, la respuesta a estrés oxidativo, la estabilidad del DNA mitocondrial y la tolerancia a zinc mediante redes de respuesta y señalización global que implican interconexiones de proceso

[eng] This thesis is framed in two aspects of the of biological systems responses to metals. The subjects of research are: (1) individual elements (proteins called Metalothioneins), and (2) networks of global response (Metallomics), and their relationship and overlap with cellular metabolism (metabolomics).

Computational analysis of the members of the family of MTs in the genomes of Drosophila (5 forms parálogas), twelve species (12 sets of orthologous) led to the identification of 60 isogenes/proteins with highly conserved sequences and architecture of DNA/protein sequences. All the components of the MT system are located in the Müller E element in the twelve species. The MtnE isoform is classified as a not extreme Cu-thionein, despite forming homometallic complexes with the Cu. MtnE shows the less specific coordinating capacity compared with the rest of isoforms, suggesting a physiological function related to the need for a peptide with a broad spectrum of coordination of metals.

We also identified two sequences (BfMT1 and BfMT2) as potential MTs in the genome of Branchiostoma floridae. ORFs sequences, their regulatory regions, and corresponding protein products, showed characteristics which confirm them as potential MT. The BfMT1 and BfMT2 genes were identified in vivo using RT-PCR on total RNA from Branchiostoma lanceolatum. Both genes are induced in vivo in B. lanceolatum in excess of metals (Cd or Cu) conditions, showing BfMT1 a pattern corresponding to a basal or constitutive expression gene, while the expression of BfMT2 corresponds with an inducible gene. The treatment of living organisms with different concentrations of Cd showed that under conditions of excess of this metal, there is also a disruption in zinc homoestasis.

With respect to the elements of global response, we studied the metabolic responses of S. cerevisiae to high zinc. Previous results of our group showed an interconnection of zinc related metabolic pathways and those related to other metals. Analysis of several mutants tolerant to high zinc allowed us to identify a significant overlap between metabolic life processes such as respiration, oxidative stress response, stability of mitochondrial DNA and tolerance to high zinc through networks of response and global signalling involving interconnected processes.