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Title: Análisis de los efectos de los glucocorticoides sobre la proliferación celular y la síntesis de colágeno. Estudio experimental en cultivo de osteoblastos humanos.
Author: Hernández Miguel, María Victoria
Director: Guañabens Gay, Núria
Muñoz Gómez, José
Keywords: Antiinflamatoris
Malaltes reumàtiques
Osteoporosi secundària
Massa òssia
Glucocorticoïdes
Issue Date: 23-Oct-2003
Publisher: Universitat de Barcelona
Abstract: [spa] Los glucocorticoides son fármacos ampliamente utilizados como antiinflamatorios o inmunosupresores en el tratamiento de múltiples patologías como enfermedades reumáticas y autoinmunes, respiratorias, y en el transplante de órganos. Uno de los principales efectos secundarios de su administración de forma prolongada o a dosis elevadas es la disminución de masa ósea asociada a un mayor riesgo de fracturas. En la actualidad, y dada la amplia utilización de estos medicamentos, la osteoporosis inducida por glucocorticoides constituye la principal causa de osteoporosis secundaria. En los diversos estudios realizados se ha demostrado que estos fármacos producen una inhibición de la formación ósea, sin embargo, los mecanismos celulares de la osteoporosis inducida por glucocorticoides no están aún bien establecidos.El objetivo de nuestro estudio fue analizar "in vitro" el efecto de los glucocorticoides sobre la proliferación y la función celular de osteoblastos humanos, para estudiar los mecanismos celulares de la osteoporosis inducida por los glucocorticoides. En la primera parte de nuestro estudio se estableció el cultivo de osteoblastos a partir de hueso trabecular humano obtenido de pacientes que precisaban colocación de una prótesis articular, excluyendo previamente aquellos con sospecha de osteoporosis. Una vez establecida la línea celular, se estudió el efecto de dosis suprafisiológicas de glucocorticoides (dexametasona 10-6 M y 10-7 M) sobre la proliferación celular de osteoblastos humanos, valorada a través de la síntesis de DNA por la incorporación de timidina tritiada; sobre la síntesis de procolágeno tipo I intracelular, por técnica de inmunocitoquímica utilizando un anticuerpo monoclonal antiprocolágeno I; y sobre la secreción de los propéptidos amino (PINP) y carboxi (PICP) terminal del procolágeno tipo I en el medio de cultivo por técnica de radioimmunoanálisis. Se valoraron los resultados a las 24 y 48 horas de incubación y se compararon con los del grupo control, cultivo de osteoblastos humanos sin adición de glucocorticoides. Cuando analizamos los resultados, observamos una disminución de la síntesis de procolágeno I intracelular en los cultivos de osteoblastos tratados con dexametasona (DEX), que ya era evidente a las 24 y fue máxima a las 48 horas de incubación (32 ± 5% y 35 ± 6%, respectivamente) (p<0.05). Asimismo, se observó una disminución en la secreción de ambos propéptidos derivados del procolágeno I (PINP y PICP) en el sobrenadante de los cultivos tratados con DEX a las 24 h (PINP: 20 ± 8%; PICP: 22 ± 10%), que persistía a las 48 h (PINP: 19 ± 5%; PICP: 14 ± 3%) (p<0.05). No se hallaron diferencias significativas entre ambas concentraciones de glucocorticoides. Los niveles de PINP y de PICP se correlacionaron de forma significativa entre sí en el medio de cultivo (r = 0.827) y con la síntesis de procolágeno I intracelular (PINP r = 0.515; PICP r = 0.486) (p<0.001). No se observó una disminución de la proliferación celular sino que se produjo un discreto incremento de incorporación de timidina tritiada en relación con el tiempo de exposición en las células tratadas con y sin adición de glucocorticoides, aunque este incremento sólo fue significativo en el grupo control y en el tratado con DEX 10-6 M (p<0.05).De los resultados de nuestro estudio podemos concluir que los glucocorticoides a dosis suprafisiológicas producen una inhibición precoz de la síntesis de procolágeno I en osteoblastos humanos, no asociada a una disminución de la proliferación celular; que la actividad osteoblástica en sobrenadante valorada mediante PINP y PICP se correlaciona directamente con la síntesis intracelular de procolágeno I, y, por último, que tanto la determinación de la inmunorreactividad intracelular para procolágeno I mediante inmunocitoquímica como de los propéptidos del procolágeno I en el medio de cultivo son métodos útiles para analizar la función osteoblástica "in vitro".
[eng] Glucocorticoids are drugs frequently employed as anti-inflammatory or immunosuppressive agents in a variety of disorders such a bronchial asthma and rheumatic diseases, as well as after organ transplantation. Among their side effects, bone loss is often observed in long-lasting or in high-dose treatment. Currently, glucocorticoid-induced osteoporosis is the main cause of secondary osteoporosis. It is well-known that glucocorticoids induce an inhibition of bone formation, however, the cellular mechanisms of glucocorticoid-induced osteoporosis are not well established.The effects of glucocorticoids on DNA synthesis and cellular function were assessed in cultures of human osteoblastic cells by using indirect immunoperoxidase staining with a type I antiprocollagen antibody and by measuring procollagen type I N and C propeptides (PINP, PICP) in the culture medium by radiometric methods. Likewise, we analyzed the correlation between intracellular immunostaining and procollagen propeptides released into the culture medium, as well as the correlation between PINP and PICP. Human osteoblasts were cultured with and without addition of dexamethasone (DEX) at two supraphysiological concentrations, 10-6 M and 10-7 M, for 24 and 48 h. Treatment with DEX at 10-6 M was associated with a significant decrease in the percentage of cells showing intracellular type I procollagen immunoreactivity at 24 and 48 h (p<0.05). Similar effects were observed with 10-7 M DEX. Dexamethasone 10-6 M and 10-7 M also induced significant decreases in PINP and PICP values after 24 and 48 h of treatment (p<0.05). The decrease in intracellular procollagen immunoreactivity and propeptide secretion was not associated with a reduction in DNA synthesis. A highly significant correlation was observed between the values of PINP and PICP in the culture medium as well as between the values of intracellular immunostaining and PINP and PICP (p<0.001). In conclusion, our results suggest that supraphysiological doses of glucocorticoids produce a direct inhibition on osteoblastic function through their effect on type I procollagen synthesis, that was not associated with a reduction in DNA synthesis. Immunoperoxidase detection of type I intracellular procollagen as well as the quantification of PINP and PICP in the culture medium are reliable methods of assessing osteoblast function.
URI: http://hdl.handle.net/2445/42157
ISBN: 846891343X
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