La proteína asP1a/4 y el ciclo biológico de astrovirus: aplicación en epidemiología molecular.

Abstract

[cat] Los astrovirus son unos virus icosaédricos de pequeño tamaño con un genoma ARN monocatenario de polaridad positiva y 3 pautas abiertas de lectura (ORF1a y ORF1b para las proteínas no estructurales, y ORF2 para las proteínas estructurales). Se consideran la tercera causa de gastroenteritis no bacteriana tanto en niños como en adultos.En esta tesis, se caracteriza una de las proteínas no estructurales del virus codificadas por el ORF1a, la proteína nsP1a/4. La utilización de un anticuerpo policlonal de ratón, producido en el laboratorio contra un péptido sintético correspondiente a la región más hidrofílica de la proteína, permitió determinar que la proteína nsP1a/4 tiene un peso molecular que oscila entre los 24 y 26 kDa, que se acumula en la región perinuclear colocalizando con el ARN vírico y con las membranas del retículo endoplasmático, y que puede sufrir múltiples modificaciones post-traduccionales por glicosilación y/o fosforilación. Además, se caracterizó también la variabilidad genética de una región hipervariable contenida en la proteína nsP1a/4 y se asoció dicha variabilidad a diferentes capacidades replicativas del virus, así como también a diferentes títulos de partículas víricas en heces de niños infectados. Por todo ello, se estableció una relación indirecta entre la variabilidad de nsP1a/4 y propiedades víricas potencialmente patogénicas. Las principales características de esta variabilidad genética fueron la presencia de numerosas inserciones y delecciones que conservan la pauta de lectura y una gran tolerancia a las substituciones de aminoácidos.Dada la importancia de esta relación entre la variabilidad de la proteína nsP1a/4 y las propiedades potencialmente virulentas del virus, se desarrolló un sistema de diagnóstico y tipado por RT-PCR y análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) para astrovirus y se aplicó dicho método en un estudio epidemiológico a gran escala durante 3 años sobre la población pediátrica de la región de Barcelona. La incidencia de astrovirus observada fue del 4.9% y del 3.6% para los genogrupos A y B respectivamente y la tasa de detección máxima se encontró en niños de entre los 2 y los 4 años. Se observó una distribución bianual y una mayor incidencia de las infecciones durante los meses de invierno. También se observó como las incidencias relativas de cada serotipo y de cada subgenotipo varían cada año, sugiriendo que no existe inmunidad cruzada entre diferentes serotipos.Finalmente, se estudiaron algunas de las relaciones que se producen entre el virus y la célula hospedadora utilizando la línea celular intestinal humana CaCo-2 y se observó como las células desarrollan una respuesta apoptótica tras la infección por astrovirus. La caracterización de esta respuesta apoptótica permitió afirmar que el porcentaje de células apoptóticas es directamente proporcional a la multiplicidad de infección utilizada y que existe una relación directa entre la expresión de las proteínas no estructurales del virus codificadas por el ORF1a y la apoptosis. Además, se identifica un potencial dominio <I>death domain</i> (DD) en la proteína nsP1a/4 del virus. Por último, se identifica la activación de la caspasa 8 en la inducción de la apoptosis y se presenta un modelo para explicar el significado biológico de esta inducción de apoptosis por el virus, sugiriendo que la apoptosis sería necesaria para una correcta maduración de las proteínas de la cápside.