Análisis genómico y proteómico de los mecanismos de captación de hierro en "Aeromonas" mesófilas

Abstract

[spa] El objetivo central de la presente tesis doctoral fue la caracterización de los mecanismos de captación de hierro de Aeromonas mesófilas, así como de la contribución de dichos sistemas a la virulencia. Los bioensayos con las cepas indicadoras A. hydrophila SB22 (mutante amoA) y E. coli AN346 (mutante entA), nos permitieron identificar de forma presuntiva el sideróforo secretado por las diferentes cepas de Aeromonas spp.; generalmente amonabactina o enterobactina.El siguiente paso fue la obtención de un banco de mutantes por la inserción del elemento de transposición mini::Tn5-Km en un derivado rifampicina resistente de la cepa A. hydrophila AH-3. Los mutantes AH-768 y AH-777 mostraron un aumento notable de los niveles de producción de sideróforos, una disrupción de la capacidad de crecimiento en presencia de agente quelante y una discapacidad de utilización de la amonabactina y de la enterobactina como fuente de hierro. Estas alteraciones fueron relacionadas en el caso del mutante AH-768 con la carencia de una IROMP de 70 kDa de P.M. aparente y con un fenotipo atenuado en su virulencia. Los estudios de inmunodetección empleando antisuero específico contra la proteína FapA, nos permitieron detectar una IROMP en las cepas de Aeromonas productoras de amonabactina, y en algunas cepas de Aeromonas productoras de un sideróforo que no es amonabactina ni enterobactina. Pero en ningún caso se observó reacción alguna con las IROMP de las cepas de Aeromonas productoras de enterobactina. La determinación del punto de inserción del transposón en el cromosoma de los mutantes AH-768 (fapA) y AH-777 (fapG), permitió obtener la secuencia nucleotídica de la agrupación génica relacionada con la captación de hierro de elevada afinidad en A. hydrophila AH-3. Dicha agrupación génica consta de quince genes entre los cuales se localizan genes que codifican para la biosíntesis del ácido dihidroxidobenzoico (genes amlABC), genes que codifican para una sintetasa de péptidos no ribosomales (genes amlDEFGHB), para un receptor de ferri-sideróforos de membrana externa (denominado fapA), para un sistema transportador ABC dependiente de proteína periplasmática (genes fapBDGC) y para un putativo componente del sistema de secreción de sideróforos (gen mrp). Se observó una relación entre la presencia de los genes amlF, amlH y fapA y el sistema de captación de hierro en cepas de Aeromonas mesófilas cuyo sideróforo había sido caracterizado como amonabactina mediante la técnica del bioensayo. La predicción de la funcionalidad de la SPNR codificada por la agrupación génica de sideróforos de la cepa A. hydrophila AH-3 a partir de su composición en dominios catalíticos, concordó con las actividades catalíticas necesarias para la formación de amonabactina. A destacar, la presencia de un dominio de epimerización y la presencia de dominios de adenilación específicos para la activación de L-Lisina, L-aminoácido aromático (L-triptófano o L-fenilalanina) y L-glicina.La obtención de un mutante con alteraciones en la ruta de biosíntesis de sideróforos previas a la formación del 2,3-DHBA, nos permitió afirmar que la cepa AH-3 secreta únicamente sideróforos de tipo catecolato y que dicha cepa utiliza la amonabactina como fuente de hierro de forma mucho más eficiente que la enterobactina. A su vez, el mutante no productor de sideróforos mostró un fenotipo atenuado en su virulencia. La obtención y caracterización fenotípica de mutantes por recombinación en un punto de los diferentes componentes del sistema de transporte de sideróforos (fapA, fapB, fapG, fapC) nos permitió afirmar que el receptor de ferri-sideróforos de membrana externa y el sistema transportador ABC dependiente de proteína periplasmática intervienen en la captación del hierro de la ferri-amonabactina y de la ferri-enterobactina. Se demostró también la independencia entre el sistema de captación de hierro de elevada afinidad y el sistema de captación del hierro de los compuestos que contienen grupo hemo.Clonamos el receptor de hemo de la cepa A. hydrophila AH-3 mediante complementación interespecífica de un mutante de E. coli hemA aroB, cuya membrana externa es impermeable al hemo. La reconstitución en E. coli del sistema de utilización del grupo hemo y de la hemoglobina como fuente de hierro y como fuente de porfirina, mediada por el gen ahuR y su entorno en el genoma, es un proceso TonB dependiente. La presencia de AhuR en la cepa AH-3 se mostró imprescindible para la utilización del hierro de diferentes compuestos que presentan grupo hemo. El gen ahuR está ampliamente distribuido entre las diferentes cepas de Aeromonas mesófilas, a pesar del elevado grado de heterogeneidad de las secuencias nucleotídicas de dichos microorganismos.