Biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos: caracterización microbiológica, química y ecotoxicológica

Abstract

[spa] La aprobación sucesiva de normativas acerca de la contaminación de suelos (RD 9/2005) y los cambios en el uso del suelo, están aumentando la demanda en la descontaminación de suelos. Sin embargo, aún existen áreas necesitadas de investigación como son el estudio de las poblaciones microbianas implicadas en los procesos de biorremediación; estudiar el destino de los contaminantes y evaluar la ecotoxicidad de los procesos de biorremediación. Se ha llevado a cabo una caracterización catabólica de tres consorcios microbianos no definidos, obtenidos mediante procesos de enriquecimiento con diferentes familias de hidrocarburos, para su utilización en la biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos. Para ello, se han incubado tres consorcios (TD, F1AA y AM) con crudo de petróleo ligero (Casablanca). Los resultados obtenidos muestran que la capacidad catabólica de los tres consorcios está en consonancia con el sustrato utilizado para su obtención. Asimismo, la amplificación de los consorcios en medio rico para su utilización en experiencias reales de bioaumento, no disminuye su potencial degradador. La adición de los ramnolípidos MAT10, producidos por Pseudomonas aeruginosa AT10 incrementa la biodegradación del crudo Casablanca por el consorcio AM, tanto la tasa de biodegradación como la degradación de algunos componentes como los isoprenoides de la fracción saturada y los HAPs alquilados de la fracción aromática.. Se ha realizado una caracterización de la diversidad microbiana del consorcio AM, degradador de HAPs, mediante métodos dependientes e independientes de cultivo. Para ello se han aislado cepas heterotrofas y degradadoras de HAPs, se han construido librerías de clones de genes 16S y 18S rRNA y se ha estudiado la población de genes 16S rRNA por DGGE. Se han identificado un total de 19 componentes microbianos diferentes pertenecientes al grupo filogenético de las Proteobacterias (16/19), Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides (CFB) (2/19) y Ascomicota (1/19). Los resultados obtenidos indican que es necesario realizar estudios polifásicos para conocer más profundamente la composición de un consorcio microbiano.Se ha diseñado un protocolo de ensayos de biotratabilidad, a escala de laboratorio, previo a la biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos, que consta de 2 fases de estudio. La primera fase evalúa la presencia de poblaciones microbianas, su actividad metabólica real y potencial y la biodegradabilidad de los contaminantes presentes en el suelo. La segunda fase estudia la optimización de las condiciones fisicoquímicas (humedad, aireación, nutrientes inorgánicos, biodisponibilidad) y biológicas (posibilidad de inocular poblaciones microbianas alóctonas) que pueden condicionar el proceso de biodegradación durante la biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos. Se han aplicado los ensayos de biotratabilidad para la biorremediación de un suelo contaminado por creosota y se ha profundizando en la caracterización microbiológica, química y ecotoxicológica del proceso de biodegradación. Los resultados obtenidos en la fase I, indican que el suelo es apto para la aplicación de la biorremediación. La aireación y la humedad del 40% de la capacidad de campo han sido los factores claves para alcanzar una importante biodegradación de los TPH y de los HAPs de 3 y 4 anillos, por parte de la población autóctona del suelo. El análisis por DGGE combinado con el análisis de componentes principales muestra que la estructura y la composición de las comunidades microbianas cambia de forma muy distinta con la adición de nutrientes, así como también a lo largo de todo el proceso de biodegradación. El proceso de biorremediación disminuye la toxicidad y la teratogenicidad de los lixiviados evaluados por los ensayos de Microtox® y FETAX, así como también la genotoxicidad potencial de los TPH analizada por microscopía de fuerzas atómicas (AFM), pero no disminuye la letalidad del suelo entero frente a Eisenia foetida. ENGLISH

[eng] Successful application of bioremediation technology to contaminated soil requires knowledge of the characteristics of the site and the parameters that affect the microbial biodegradation of pollutants.Three microbial consortia were obtained by sequential enrichment using a variety of oil products. The three consortia (TD, AM, F1AA) were incubated with a crude oil to assess their metabolic capacity and to identify possible differences in their pattern of biodegradation. Metabolic capacity was found to depend on the carbon source used in the enrichment procedures. Amplification of the consortia by subculture in rich media did not affect this capacity. Addition of rhamnolipids produced by Pseudomonas aeruginosa AT10 increased biodegradation by consortium AM,. A microbial consortium (AM) used for the aerobic degradation of polycyclic aromatic hydrocarbon (PAHs) was examined by a triple approach based on various cultivation strategies, denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and screening of 16S and 18S rRNA gene clone libraries. 19 microbial components were identified. Proteobacteria were the dominant group (16/19), whilst the Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides group (CFB) was 2/19, and the ascomycota fungi 1/19. The results indicate that polyphasic assessment is necessary for a proper understanding of the composition of a microbial consortium. A protocol for biotreatability assays in two phases was proposed. In the first phase we examined the type and metabolic activity of the soil indigenous microorganisms, the presence of possible inhibitors and the biodegradability of contaminants. In the second phase several parameters affecting bioremediation were evaluated in microcosms. The application of this protocol to 2 hydrocarbon-contaminated soils is described. The information obtained from the results in the first phase of the protocol indicates whether a biological treatment of contaminated soil is appropriate, whereas in the second phase the most appropriate treatment is evaluated. Biotreatability assays, bacterial community dynamics and biodegradation processes were investigated in a highly creosote-contaminated soil. Moisture content and aeration were established as the key factors of PAH bioremediation. TPH, three- and four-ringed PAHs were degraded significantly in all treatments (72-79% and 83-87% respectively). Enumeration of heterotrophic and PAH-degrading populations, DGGE analysis and Principal Component Analysis corroborated a dramatic shift in bacterial community, due to both the addition of nutrients and the biodegradation process. Acute toxicity and teratogenicity were evaluated by MicrotoxTM, Eisenia foetida and FETAX assays, and potential genotoxicity was assayed by atomic force microscopy (AFM).