Estudi estructural i genètic del nucli del lipopolisacàrid de "Serratia marcescens" N28b

Abstract

[cat] Serratia marcescens és un bacteri gramnegatiu que es comporta com un patogen oportunista i és responsable d'un nombre creixent d'infeccions nosocomials. Les infeccions més comuns causades per aquest bacteri són pneumònies, infeccions del tracte urinari, septicèmies i meningitis.A la membrana externa de la paret dels bacteris gramnegatius s'hi localitzen unes molècules amfifíliques, anomenades lipopolisacàrids, que consten de tres regions principals: el lípid A, que constitueix la part lipídica, i el nucli i l'antigen O, que formen la part polisacarídica, que es projecta cap a l'exterior. Aquesta particular disposició comporta que el LPS sigui l'antigen superficial més important en els bacteris gramnegatius i un dels principals factors de virulència. Per aquest motiu, ens els últims anys s'han estudiat les estructures químiques i les funcions dels LPSs d'un nombre important de bacteris gramnegatius, així com també els responsables genètics de la seva biosíntesi. Aquesta tesi s'ha centrat en l'estudi estructural i genètic del nucli del LPS de S. marcescens N28b O4. Anàlisis químiques i estructurals realitzades sobre l'oligosacàrid majoritari de la regió del nucli del LPS d'un mutant de S. marcescens N28b deficient en antigen O juntament amb anàlisis de complementació ens van permetre proposar la següent estructura química: β-Glc-(1→6)-α-Glc-(1→4)-α-D-GlcN-(1→4)-α-D-GalA-[(2←1)-α-D,D-Hep-(2←1)-α-Hep]-(1→3)-α-L,D-Hep[(7←1)-α-L,D-Hep]-(1→3)-α-L,D-Hep-[(4←1)-β-D-Glc]-(1→5)-Kdo. La configuració D dels residus de β-Glc, α-GlcN, i α-GalA es va deduir a partir de les dades genètiques i per això s'ha de considerar temptativa. Diversos anàlisis comparatius realitzats sobre la regió del nucli del LPS de la soca salvatge i del mutant deficient en antigen O van demostrar que aquesta regió és compartida per ambdós bacteris i per tant l'estructura de nucli proposada és perfectament extrapolable a la de la soca salvatge S. marcescens N28b. A més, per espectrometria de masses de ressonància d'ió ciclotró per transformada de Fourier i ionització per electrosprai (ESI FT-ICR-MS) es van identificar altres oligosacàrids en aquesta regió que probablement contenien substitucions addicionals per residus de D-glicero-D-talo-oct-2-ulosonic (Ko) o d'àcid hexosurònic, que hi eren presents tant a la regió del nucli de la soca salvatge com del mutant deficient en antigen O. D'altra banda la identificació de diferents ions que diferien uns dels altres per masses de +80 Da, suggeriren la presència de substitucions no-estequiomètriques per residus monofosfats.La identificació de l'estructura del nucli del LPS de S. marcescens N28b va permetre poder completar, en la segona part del treball, la caracterització funcional dels gens de l'agrupació waa d'aquesta soca bacteriana, implicada en la biosíntesi del nucli del seu LPS. Estudis previs realitzats sobre aquesta agrupació, constituïda per 14 pautes de lectura oberta, havien permès identificar la funció dels gens compartits amb la resta d'enterobacteris. La caracterització de la resta de gens no compartits es va realitzar a partir d'anàlisis químics i de complementació gènica sobre mutants no polars en aquests gens obtinguts en aquest treball. D'aquesta manera, l'estudi de les estructures de nucli incomplert d'aquests mutants o dels canvis fenotípics que es produïen com a conseqüència de la mutació en comparació amb la soca salvatge van permetre proposar funcions per la resta de gens de l'agrupació waa de S. marcescens N28b. Com a més rellevant, es pot citar la identificació dels gens responsables de la transferència del disacàrid lateral d'heptosa, dels residus d'àcid galacturònic i glucosamina i dels tres residus de glucosa.

[eng] Genetic and Structural Study of the Core Region of the Lipopolysaccharide from Serratia marcescens N28b""Serratia marcescens" is a recognised nosocomial gram-negative pathogen that mainly causes pneumonia, septicaemia, meningitis and urinary tract infections. In gram-negative bacteria, the lipopolysaccharide (LPS) is one of the major structural and immunodominant molecules of the outer membrane. It consists of three domains: lipid A, core oligosaccharide and O-antigen. Lipopolysaccharides are important virulence factors in pathogenic strains. Thus, structures and functions of lipopolysaccharides from many gram-negative bacteria as well as the genetic determinants of their biosynthesis have been intensely investigated. This doctoral thesis has focused in the structural and genetic characterisation of the LPS core region of S. marcescens N28b.Chemical and structural analyses of the major oligosaccharide from the LPS core region of an O-antigen-deficient mutant of S. marcescens N28b as well as complementation analyses led to the following proposed structure: β-Glc-(1→6)-α-Glc-(1→4)-α-D-GlcN-(1→4)-α-D-GalA-[(2←1)-α-D,D-Hep-(2←1)-α-Hep]-(1→3)-α-L,D-Hep[(7←1)-α-L,D-Hep]-(1→3)-α-L,D-Hep-[(4←1)-β-D-Glc]-(1→5)-Kdo. The D configuration of the β- Glc, α-GlcN and, α-GalA was deduced from genetic data and thus is tentative. Several comparative chemical analyses demonstrated that the wild strain S. marcescens N28b and the O-antigen-deficient mutant share the same core region and therefore the proposed core structure is completely applicable to that of the wild strain. Furthermore, other oligosaccharides were identified by ion cyclotron resonance-Fourier-transformed electrospray ionisation mass spectrometry, which presumably contained additional residues of D-glycero-D-talo-oct-2-ulosonic acid (Ko) or of hexuronic acid. Several ions were identified that differed from others by a mass of +80 Da, suggesting a nonstoichiometric substitution by a monophosphate residue. The elucidation of the structure shown above, allowed us to complete the functional characterisation of the genes in the S. marcescens N28 waa gene cluster involved in the biosynthesis of its LPS core region. Previous studies had led to the identification of waa genes shared by all known "Enterobacteriaceae". Chemical and/ or complementation analyses of several nonpolar mutants within the S. marcescens gene cluster generated in this work allowed us to propose functions for the remaining waa genes. Among others, genes involved in the transfer of the galacturonic acid, glucosamine and the tree glucose residues of the core region as well as in the transfer of the branched heptose disaccharide were identified.