Obtenció i caracterització de mutants PHA-negatius en soques de “Pseudomonas” per la producció de compostos d'interès industrial

Abstract

[cat] Pseudomonas aeruginosa 47T2 i P. aeruginosa 42A2, van ser aïllats a partir sols i aigües, respectivament, contaminades amb residus oliosos. Ambdues soques van ser seleccionades per la seva capacitat per sintetitzar compostos hidrofòbics, com polihidroxialcanoats (PHAs), ramnolípids (Rhls), o estòlids. Els PHAs són polièsters biodegradables i biocompatibles de gran interès biotecnològic per ser una bona alternativa als plàstics petroquímics.

A més de produir PHAs, P. aeruginosa 47T2 és capaç de produir Rhls, compostos glicolípids coneguts com surfactants microbians que presenten activitats antimicrobiona i/o antifúngica. En canvi, P. aeruginosa 42A2 no produeix Rhls, però si és capaç de convertir els olis residuals en mono-, di- o tri-hidroxi àcids grassos i més tard polimeritzar-los en estòlids. Els estòlids són biopoliesters són coneguts per ser bons emulsificadors amb interessants aplicacions industrials.

Donades les diferències metabòliques a nivell lipídic detectades entre ambdues soques, s’ha estudiat el seu sistema lipolític comparant-lo amb la soca tipus Pseudomonas aeruginosa PA01. Assajos SDS-Page i zimogrames, tant dels extractes cel.lulars com dels sobrenedants de les soques, indiquen l’existència d’un sistema lipolític complex constituït per diversos enzims, però la seva caracterització bioquímica no denota diferències significatives a nivell de preferència de substrat, temperatura i pH entre les tres soques.

Es decideix doncs no continuar estudiant la dotació enzimàtica, que no ha estat determinant per saber a què es deuen les diferències en el metabolisme lipídic, i s’opta per estudiar productes lipídics d’interès d’aquestes soques. Prenent els productes lipídics comuns i diferents, i tenint en compte que comparteixen intermediaris comuns a les seves rutes biosintètiques, s’ha decidit obtenir mutants negatius per la producció de PHA per tal d’estudiar el flux de carbonis i poder així dilucidar part de les rutes metabòliques que generen determinats productes. Aquests mutants es generen per ambdues soques P. aeruginosa 47T28AD i P. aeruginosa 42A28AD.

Desprès d’haver provat diferents estratègies de mutagènesi aleatòria sense èxit (irradiació controlada amb llum UV i transposició), els mutants s’obtenen a través de mutagènesi dirigida amb la qual es força la recombinació i per tant la mutació dels gens que codifiquen per l’enzim PHA sintasa, mitjançant el plasmidi suïcida pEX100Tlink. S’analitzen els mutants obtinguts per microscòpia electrònica de transmissió (MET) i la producció de PHAs s’analitza per ressonància magnètica nuclear (RMN). Ambdós processos permeten determinar que els potencials mutants no produeixen PHAs i per tal de confirmar-ho s’extreu i quantifica el PHA observant que la producció de PHAs desapareix en els mutants.

Una cop obtinguts els mutants cal veure si aquesta mutació afecta a la producció d’altres metabòlits. En la soca P. aeruginosa 47T2, s’estudien els Rhls produïts a partir d’olis residuals, tant a nivell de quantitat de producció com de qualitat del producte. Es quantifiquen per gravimetria i HPLC-MS i es caracteritzen a nivell fisicoquímic (determinació de CMCs, diagrames ternaris de fases, capacitat emulsionant). Si bé la producció de PHAs desapareix en els mutants seleccionats, sembla que la producció de Rhls augmenta lleugerament respecte a la soca parental, però no de manera proporcional a la desaparició de PHAs. Per altra banda la caracterització dels biotensioactius tampoc mostra diferències significatives entre els productes obtinguts a partir del mutant i de la soca parental, però si és interessant per les possibilitats a nivell d’aplicacions biotecnològiques dels Rhls. Pel que fa a la soca P. aeruginosa 42A2, els mutants serviran per fer el mateix estudi quantitatiu i qualitatiu d’un altre producte, els estòlids, però això forma part d’un altre estudi del grup. En la tesi el que s’ha quantificat són els derivats hidroxilats (mono- i di-hidroxilats) a partir dels quals es formen els estòlids, que també tenen propietats tensioactives i antimicrobianes i/o antifúngiques.

[eng] "Obtaining and characterization of PHA-negative mutants on Pseudomonas strains for the production of interesting industrial compounds"

Pseudomonas aeruginosa 47T2 and P. aeruginosa 42A2 were isolated from oil wastes contaminated environment, soil and water respectively. Both strains were selected for their capacity to synthesize hydrophobic compounds such as polyhydroxyalkanoates (PHAs), rhamnolipids (Rhls), or estolides. PHAs are biodegradable and biocompatible polyesters with a high biotechnological interest for being a good alternative to the petrochemical plastics.

In addition, P. aeruginosa 47T2 is able to produce rhamnolipids, glycolipid compounds well-known as microbial surfactants that present antimicrobial and/or antifungal activities. Although P. aeruginosa 42A2 is not producing Rhls, it is capable to convert waste oils into mono, di or –tri hydroxyfatty acids and later polymerize these compounds into estolides. Estolides are biopolyesters that are known for being good emulsifiers with interesting industrial applications.

The aim of this thesis was to compare the differences in the lipid metabolism of the selected strain using P. aeruginosa PA01 as a type strain. SDS-page assays and zimmograms of cellular extracts and supernatants, revealed a complex lipolytic system constituted by different enzymes with no relevant differences regarding substrate affinity, temperature or pH. Therefore, the next step was the study of the different lipidic products.

Considering that on PHAs, Rhls and estolides biosynthesis, the different involved metabolic pathways are competing for the same substrates, PHA-negative mutants for P. aeruginosa 42A2 and P. aeruginosa 47T2 were constructed by site-directed mutagenesis in order to elucidate the carbon flows. PHA accumulation, in both PHA-negative mutants, was evaluated by means of transmission electron microscopy (TEM) and nuclear magnetic resonance analysis (NMR), confirming thus the mutant strains were handicapped for PHA production.

Consequently, rhamnolipids production in P. aeruginosa 47T2 and its PHA-negative mutant was gravimetrically quantified and showed a slightly increase of the Rhls production in the PHA-negative mutant (P. aeruginosa 47T2 4AD). Furthermore, the biopolymers were characterized by HPLC-MS and their physicochemical properties evaluated by determining the critical micelle concentration (CMC), the surfactant capacity and constructing the ternary phase diagrams. The biotransformation of oleic acid into hydroxyfatty acids was followed and quantified in P. aeruginosa 42A2 and its PHA-negative mutant (P. aeruginosa 42A2 4AD) by gas chromatography (GC).