Caracterización estructural de bacterias antárticas adaptadas al frío y detección de nuevos emulsionantes: estudio de la cepa "Shewanella vesiculosa M7(T)”

Abstract

[spa] Esta memoria doctoral forma parte del proyecto financiado por el Ministerio de Ciencia e Innovación (CICYT, CTQ2010-21183-C02-01), el cual tiene entre sus objetivos la búsqueda de nuevas cepas con capacidad para producir emulsionantes naturales poliméricos. Existe un interés real en el aislamiento y caracterización estructural y funcional de nuevos exopolímeros (EPS) obtenidos a partir de microorganismos de ambientes extremos que pudieran ser utilizados con estos fines en diversas industrias.

Para ello, se realizó en primer lugar el estudio de los EPS desde el punto de vista ultraestructural, de cepas antárticas adaptadas al frío, mediante técnicas de microscopía electrónica de transmisión (MET) después de procesar las muestras por criofijación a alta presión seguida de criosustitución (HPF-FS). Estas técnicas aportaron numerosos detalles sobre la ultraestructura de las distintas cepas y el material extracelular que producen, al lograr preservar el material biológico próximo a su estado natural. Se observó que este material polimérico extracelular es para la mayoría de las cepas complejo con la presencia de material capsular alrededor de las células y abundantes estructuras vesiculares dispersas en la matriz extracelular secretada por las bacterias. Es la primera vez que se describen y visualizan de manera tan clara y abundante las vesículas de membrana externa (VME) que producen bacterias no patógenas de ambientes naturales antárticos. De igual forma, es la primera vez que se reporta la presencia de estas estructuras en cepas de los géneros Marinobacter y Psychrobacter.

Asimismo, se estudió el origen de las proteínas presentes en las VME mediante geles SDS-PAGE donde se mostraron los perfiles proteicos comparados con las proteínas de membrana externa. Esto evidenció el origen de estas VME formadas a partir de esta membrana, al presentar proteínas en la fracción de VME, que comigraron con proteínas que estaban presentes en la fracción de membrana externa, además en el perfil proteico de la membrana externa se detectaron proteínas adicionales que no estaban presentes en VME.

Se estudió la influencia de la temperatura sobre la producción y morfología de VME producidas en la cepa S. livingstonensis NF22T Para esta bacteria psicrotolerante se demostró que la temperatura influye en la producción de VME. A bajas temperaturas la cantidad de VME que produce la cepa es mayor, su tamaño es menor y más regular y el perfil electroforético muestra la expresión diferencial de algunas proteínas, viéndose sobrexpresadas proteínas relacionadas con funciones de transporte a nivel de membrana.

Se realizaron análisis proteómicos para identificar las proteínas presentes en las VME producidas a 4 y 16 ºC a partir de S. livingstonensis NF22T y S. vesiculosa M7T. Para ambas cepas se identificaron fundamentalmente proteínas de membrana externa y periplasmáticas con diferentes funciones fisiológicas, destacando por su abundancia las proteínas implicadas en el transporte y metabolismo de iones inorgánicos así como las relacionadas en la biogénesis de las envueltas celulares.

El material extracelular (EPS) obtenido y purificado a partir de Shewanella vesiculosa M7T presentó mayor actividad emulsionante frente a aceites comestibles que los emulsionantes comercializados goma arábiga y xantano y su caracterización reveló que contiene abundantes VME y polímeros polisacarídicos, siendo sus componentes químicos mayoritarios azúcares neutros y aminados, lípidos de membrana y aminoácidos.

[eng] The present work is part of the research project (CICYT, CTQ2010-21183-C02-01), which has among its objectives the search for new strains capable to produce natural polymeric emulsifiers. There is a real interest in the isolation and structural and functional characterization of new exopolymers (EPS) derived from microorganisms of extreme environments that could be used for these purposes in various industries. Many Gram-negative, cold-adapted bacteria from the Antarctic environment produce large amounts of extracellular matter, which has potential biotechnology applications. We examined the ultrastructure of extracellular matter from Antarctic bacteria by transmission electronic microscopy after high pressure freezing and freeze substitution. All analyzed extracellular matter appeared as a netlike mesh composed of a capsular polymer around cells and large numbers of outer membrane vesicles (OMV), which have not been described for members of the genera Psychrobacter and Marinobacter so far. OMV showed the typical characteristics described for these structures, and seemed to be surrounded by the same capsular polymer as that found around cells. The analysis of OMV proteins from Antarctic strains by SDS-PAGE showed different banding profiles in OMV compared to the outer membrane, suggesting some kind of protein sorting during membrane vesicle formation. For the psychrotolerant bacterium, S. livingstonensis NF22T, the growth temperature seemed to influence the amount and morphology of OMV. In an initial attempt to elucidate the functions of OMV from S. livingstonensis NF22T and S. vesiculosa M7T we conducted a proteomic analysis on membrane vesicles obtained at 4 and 16°C. At both temperatures, OMV were highly enriched in outer membrane proteins and periplasmic proteins related to nutrient processing and transport in Gram-negative bacteria, suggesting that OMV could be related with nutrient sensing and bacterial survival. Differences were observed in the expression of some proteins depending on incubation temperature but further studies will be necessary to define their roles and implications in the survival of bacteria in the extreme Antarctic environment. The extracellular material (EPS) obtained and purified from Shewanella vesiculosa M7T had a higher emulsifying activity against edible oils than commercial emulsifiers like arabic and xanthan gums. Characterization of this EPS revealed that it contains abundant OMV and polysaccharides polymers, with neutral and amino sugars, membrane lipids and aminoacids as its major chemical components.