Mecanismes d'alliberació d'ATP a travès de la membrana plasmàtica: paper de la CD39 i les connexines.

Abstract

[cat] L'ATP és una molècula molt carregada elèctricament important per a l'obtenció de l'energia necessària per l'activitat cel·lular. A més a més, també actua com a molècula de senyalització cel·lular. Normalment, la secreció controlada d'ATP té lloc a través de l'exocitosi de grànuls o vesícules. Tot i això, en algunes cèl·lules, altres mecanismes poden controlar l'alliberació d'ATP. En aquesta tesi s'han estudiat dos d'aquests mecanismes: l'alliberació d'ATP a través de la proteïna CD39 i l'alliberació d'ATP a través de connexines.La CD39, o NTPDasa 1, és una proteïna que hidrolitza nucleòtids trifosfat i difosfat fins a nucleòtids monofosfat. Resultats anteriors del nostre laboratori suggerien que, aplicant polsos hiperpolaritzants en la membrana dels oòcits de Xenopus, l'ectoenzim NTPDasa1 podia esdevenir permeable per l'ATP. Continuant amb l'estudi d'aquesta proteïna, es va voler determinar també si estava relacionada amb l'alliberació d'ATP induïda per estrès hipertònic descrita en oòcits. Per portar a terme aquests estudis, era necessari aconseguir un oligonucleòtid antisentit contra la CD39 dels oòcits de Xenopus. Per tant, el nostre primer objectiu va ser sintetitzar i validar aquest oligonucleòtid, per tal de poder-lo utilitzar posteriorment a l'hora de fer els experiments. Mitjançant el disseny de dos oligonucleòtids antisentit per dita proteïna es va mesurar l'alliberació d'ATP en grups d'oòcits injectats amb els oligonucleòtids i en grups control, després de ser sotmesos a un xoc hiperosmòtic. Al mateix temps, per a comprovar l'efectivitat dels oligonucleòtids injectats, es va mesurar l'activitat ATPàsica en aquests oòcits. Es va observar com l'antisentit per la CD39 reduïa de manera significativa l'alliberació d'ATP i el corrent iònic després de 13 minuts d'exposició hipertònica.Els hemicanals, formats per connexines, és un altre dels possibles mecanismes de regulació de l'alliberació d'ATP. En les gap junctions, les connexines uneixen el citoplasma de dues cèl·lules adjacents establint un canal intercel·lular que permet el pas d'ions i molècules més petites d'1 KDa. Es va estudiar aquest mecanisme en oòcits de Xenopus, estudiant la Cx38, un tipus específic de connexina endògena dels oòcits, i la Cx32, expressada en els oòcits de manera heteròloga. En els experiments amb la Cx38, vam observar que solucions lliures d'ions divalents activaven un corrent d'entrada en els oòcits que era inhibit per octanol i àcid flufenàmic, dos inhibidors de les gap junctions. Aquest corrent sensible a calci, depenia de l'expressió de Cx38: disminuïa en oòcits injectats amb un oligonucleòtid antisentit per la Cx38 (ASCx38) i augmentava en oòcits que sobrexpressaven la Cx38. A més, l'activació dels hemicanals de Cx38 induïa l'alliberació d'ATP, la qual era inhibida per l'àcid flufenàmic, l'octanol i l'ASCx38 i augmentada en la sobrexpressió de Cx38. Aquests resultats suggerien que l'activació dels hemicanals era responsable de l'alliberació d'ATP en els oòcits de Xenopus.D'altra banda, vam investigar l'alliberació d'ATP a través dels hemicanals formats per Cx32 expressada en oòcits. Aquesta proteïna s'expressa en la majoria d'òrgans humans, però, particularment, mutacions de la Cx32 en les cèl·lules de Schwann produeixen la malaltia de Charcot-Marie-Tooth lligada al cromosoma X (CMTX). En oòcits que expressen la Cx32, vam combinar l'ús de tècniques de fixació de voltatge per registrar els corrents iònics generats pels hemicanals i la reacció bioluminiscent de la luciferina-luciferasa per mesurar l'alliberació d'ATP. Els hemicanals formats per la Cx32 eren estimulats mitjançant polsos despolaritzants generant un corrent iònic de sortida. Després de l'estimulació, en el període de repolarització, hi havia un corrent de cua que coincidia amb el moment d'alliberació d'ATP. L'àrea d'aquest corrent tenia una relació lineal amb la quantitat d'ATP alliberada. El conjunt de resultats d'aquesta tesi ens suggereixen que, tant les connexines com la CD39, participen en l'alliberació d'ATP a través de la membrana plasmàtica.

[eng] ATP is an electrically charged molecule required to obtain the energy necessary for cellular activity; in addition, it is an intercellular signaling molecule. Usually, the controlled secretion of ATP occurs through the exocytosis of granules and vesicles. However, in some cells, other mechanisms control ATP release. Two of these mechanisms have been studied in this thesis: ATP release through CD39 and ATP release through connexin hemichannels. CD39, or NTPDasa 1, is a protein that hydrolyze nucleotide triphosphates and nucleotide diphosphates to nucleotide monophosfates. To study its relationship with ATP release we have synthetized an antisense oligonucleotide against Xenopus oocyte CD39. Our results indicate that the antisense against CD39 significanty reduce ATP release and also the ionic current due to the activation of CD39 by hypertonic solution. It has been suggested that hemichannels, formed by connexins, may be an alternative pathway for ATP release. In gap junctions, connexins link the cytoplasm of two adjacent cells by establishing an intercellular channel. We have investigated the release of ATP from Xenopus oocytes through hemichannels formed by connexin 38 (Cx38), an endogenous, specific type of connexin, and by connexin32 (Cx32) heterologously expressed in Xenopus oocytes. In Xenopus oocytes, calcium-free solution reversibly activates an inward current that is inhibited by octanol and flufenamic acid. This calcium-sensitive current depends on Cx38 expression: it's decreased in oocytes injected with an antisense oligonucleotide against Cx38 (ASCx38) and is increased in oocytes overexpressing Cx38. Moreover, the activation of Cx38 also induce the release of ATP, which is inhibited by flufenamic acid, octanol and ASCx38 and increased by Cx38 overexpression. Connexin 32 is expressed in most of human organs but, particularly, Cx32 mutations present in Schwann cells produce X-linked Charcot-Marie-Tooth disease. In oocytes expressing Cx32, application of depolarizing pulses to positive potentials induce outward hemichannel currents that become inward during the repolarization phase. The release of ATP occurred during the repolarization period and the amount of ATP released correlate with the area of the tail current.