Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2445/42542
Title: Estudi de la unió de la toxina èpsilon de "Clostridium perfringens" a diferents teixits i el seu pas a través de la barrera hematoencefàlica
Author: Dorca Arévalo, Jonatan
Director: Blasi Cabús, Joan
Martín Satué, Mireia
Keywords: Clostridium perfringens
toxina-ε
Proteïna verda fluorescent GFP
Issue Date: 4-Nov-2011
Publisher: Universitat de Barcelona
Abstract: [cat] La toxina-ε, produïda per la soca D de Clostridium perfringens, és la principal responsable de l’enterotoxèmia en animals de granja. Produeix un edema generalitzat, uns efectes citotòxics molt greus al ronyó (mort de les cèl•lules epitelials dels túbuls distals) i també efectes neurològics (mort neuronal provocada per excitotoxicitat). Tots aquests efectes porten finalment a la mort de l’animal. Actualment existeixen tractaments preventius de la toxina mitjançant la vacunació, però encara es desconeix el mecanisme d’acció letal, el seu receptor i els primers passos que porten a la citotoxicitat. Amb la finalitat d’estudiar el comportament d’aquesta toxina, al nostre laboratori vàrem produir una proteïna de fusió formada per la toxina-ε i la proteïna verda fluorescent GFP (toxina-ε-GFP). Aquesta eina va ser de gran utilitat, ja que es comportava igual que la toxina-ε nativa i podia localitzar-se de manera directa utilitzant microscòpia de fluorescència. De fet, injeccions i.v de toxina-ε-GFP a ratolí, varen revelar un edema generalitzat i una mort de les cèl•lules epitelials dels túbuls distals del ronyó de manera idèntica a la toxina nativa. A més, també mostrava citotoxicitat en cultius de la línia cel•lular MDCK, on heptameritzava a la membrana cel•lular, formava porus i provocava la mort cel•lular (Soler-Jover et al., 2004). L’objectiu d’aquesta tesi va ser aprofundir en el coneixement de les primeres etapes de la intoxicació per la toxina-ε, caracteritzant la seva unió i distribució en els diferents òrgans i sistemes, en especial el renal i nerviós. Per dur a terme aquest objectiu general, vàrem realitzar dues aproximacions experimentals: 1. Vàrem incubar la toxina-ε-GFP sobre seccions de teixits, on vàrem observar la seva unió a la mielina tant del SNC com del SNP. També vàrem veure que en el sistema renal, la toxina-ε-GFP reconeixia cèl•lules epitelials dels túbuls distals i col•lectors del ronyó, així com cèl•lules de l’uroteli. Els estudis realitzats en aquest treball (tractaments amb pronasa E, detergents, Nglicosidasa F i beta-eliminació) apunten que el receptor podria tractar-se d’una Oglicoproteïna tant en el sistema nerviós com en el renal, i que un ambient lipídic (o la integritat de la membrana) seria necessari per permetre la unió de la toxina-ε al seu receptor. A més, els estudis realitzats amb cross-linkers en les cèl•lules MDCK han permès identificar una proteïna d’uns 36 kDa (Annexina A2) que podria actuar com a correceptor o intervenir en l’oligomerització i formació de porus a la membrana plasmàtica. Mitjançant un assaig d’ELISA en cèl•lules MDCK, vàrem observar que només hi ha un sol lloc d’unió per a la toxina-ε, i aquest és saturable i d’alta afinitat. 2. Vàrem reproduir a ratolí els efectes de la toxina injectant i.v dosi letals de toxina-ε- GFP, i vàrem estudiar la seva distribució en el sistema nerviós. Vàrem veure que la toxina-ε-GFP a banda d’unir-se a les cèl•lules endotelials també era capaç de travessar la barrera hematoencefàlica (BHE) i arribar així al parènquima del cervell, on provocaria la mort neuronal ja fos d’una manera directa o indirecta (Soler-Jover et al., 2007). Donat l’interés en trobar nous vehicles capaços de travessar la BHE, vàrem analitzar aquesta propietat en diferents mutants de toxina-ε, tot i que encara no hem identificat cap mutant que hagi perdut la capacitat tòxica però no seva capacitat invasiva. La futura identificació del receptor de la toxina-ε, la formació dels heptàmers i la seva inserció a la membrana són, sens dubte, els grans reptes que ajudaran a caracteritzar el mecanisme d’acció de la toxina-ε de Clostridium perfringens.
[eng] ε-Toxin, produced by Clostridium perfringens type D, is the main agent responsible for enterotoxaemia in livestock. ε-Toxin accumulates specifically in the renal and nervous system were it produces the death of the epithelial cells from the distal tubules and neurons, respectively. Vaccines are very useful in the prevention of the ε-toxin intoxication, but nothing is known about the receptor and the first intoxication steps. We produced a recombinant ε-toxin protein with the green fluoresence protein GFP (ε- toxin-GFP) which is a useful tool because it behaves as the native ε-toxin and it can be detected by fluorescence (Soler-Jover et al., 2004). The aim of this thesis is to go into detail in the knowledge of the first steps in the intoxication pathway, characterizing the binding and distribution of the ε-toxin in different organs and tissues, especially in the renal and nervous system. To achieve this aim we performed two experimental approaches. On one hand, we incubated the ε-toxin-GFP on tissue sections, were its binding to myelin from CNS and PNS was observed. We also observed binding of ε-toxin to the urothelium and epithelial cells from distal and collecting tubules in the kidney. Our work revealed that the receptor in the nervous and renal system could be an Oglycoprotein, and that a lipidic environment (or the membrane integrity) would be required for the binding of ε-toxin to its receptor. In addition, an ELISA-based binding assay revealed a single high-affinity binding site for ε-toxin in MDCK cells. Moreover, cross-linking experiments identified a 36 kDa protein (Annexin A2) which could be involved in the membrane pore formation step. On the other hand, we reproduced in mice the in vivo effects by injecting i.v ε-toxin- GFP. The toxin crossed the BBB and penetrated the brain parenchyma producing neuronal death (Soler-Jover et al., 2007). We are interested in the finding of new vehicles to cross the BBB. In fact, some ε-toxin mutants have been studied but no one is able to cross the BBB without producing cell damage and animal death.
URI: http://hdl.handle.net/2445/42542
Appears in Collections:Tesis Doctorals - Departament - Patologia i Terapèutica Experimental

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
JDA_TESI.pdf11.1 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.