Mecanismes de preactivació de substrat en 1,3-1,4-beta-glucanasa. Modelització mitjançant dinàmica molecular de primers principis

Abstract

[cat] Els hidrats de carboni presenten una elevada variabilitat estereoquímica i els organismes s'aprofiten d'aquesta elevada variabilitat utilitzant oligosacàrids i polisacàrids per a una multitud de diferents funcions biològiques. A part de les típiques funcions estructurals i d'emmagatzematge energètic, tenen important rellevància en altres funcions molt més específiques, com per exemple en senyalització cel·lular. Aquesta funcionalitat desperta l'interès de multitud d'aplicacions biotecnològiques, que són el fruit d'un nombre creixent d'estudis en glicobiologia. L'enllaç glicosidic, en especial entre dues unitats de glucosa, és un dels enllaços més estables que es troben en biopolímers naturals. El temps de vida mitja de la hidròlisi espontània d'aquest enllaç en cel·lulosa i en midó és de l'ordre dels 5 milions d'anys. Les glicosil hidrolases son els enzims responsables de la hidròlisi enzimàtica d'aquests biopolímers. Aquests enzims aconsegueixen portar a terme la hidròlisi en escales de temps de l'ordre de 1000 cicles per segon. Donada aquesta elevada activitat, les glicosil hidrolases són considerades un dels catalitzadors biològics més eficients. La present tesi centra el seu principal interès en l'estudi de la formació del complex de Michaelis entre una glicosil hidrolasa de la família 16 (la 1,3-1,4-β-glucanasa) i el seu corresponent substrat. Entendre el procés en el que el substrat s'uneix a l'enzim és un punt clau de cara a raonar les següents etapes de qualsevol mecanisme enzimàtic. Sovint aquest procés ja porta associats canvis conformacionals tant a nivell d'enzim com de substrat que contribueixen a la catàlisi, fent variar les diferències energètiques en el pas de reactius a productes. Per a les β-glicosil hidrolases, existeixen diferents evidències experimentals que recolzen aquest fet. Així, s'observen estructures distorsionades a nivell de substrat respecte les que correspondrien a les estructures més estables en solució. De totes maneres, es desconeixen els factors que determinen que el substrat prefereixi unir-se a l'enzim en una conformació o una altra, i les implicacions mecanístiques que això té. La present tesi tracta de donar resposta a algunes d'aquestes qüestions emprant diferents tècniques de dinàmica molecular (clàssica i de primers principis) en combinació amb mètodes que permeten l'acceleració d'esdeveniments al llarg d'una simulació. La present tesi està estructurada en tres grans blocs: un bloc introductori (capítols I i II) on s'introdueix la família d'enzims a la qual pertany la 1,3-1,4-β-glucanasa i s'estableixen els objectius generals del present estudi; al capítol II es resumeixen els fonaments de la metodologia computacional emprada. En un segon bloc (capítols III a VII) es descriuen les simulacions portades a terme per tal de donar resposta a les preguntes obertes plantejades al bloc introductori. Els resultats són analitzats i discutits en cinc capítols diferents: al capítol III s'analitza l'estructura del complex de Michaelis de la 1,3-1,4-β-glucanasa amb un substrat tipus metilumbeliferil-tetrasacàrid; al capítol IV s'avalua i es descriu el mapa d'energia lliure conformacional de l'anell de β-D-glucopiranosa, i s'analitzen les propietats estructurals i electròniques de cada conformació per tal de trobar una correlació amb les distorsions presents en diferents glucosidases; al capítol V s'avalua i es descriu el mapa d'energia lliure conformacional del substrat un cop unit a la 1,3-1,4-β-glucanasa, i s'analitza l'efecte de diferents mutacions puntuals del substrat; al capítol VI es porta a terme una simulació del primer pas de la reacció enzimàtica de la 1,3-1,4-β-glucanasa i s'analitza l'itinerari conformacional seguit pel substrat; al capítol VII es porta a terme una simulació del procés d'entrada del substrat a la cavitat enzimàtica i s'analitzen les reorganitzacions a nivell de substrat i de proteïna que tenen lloc al llarg del procés. Cada capítol conté una breu introducció específica de cada cas concret, informació sobre els detalls computacionals emprats, i la descripció i discussió dels resultats obtinguts. Finalment al darrer bloc (capítol VIII) es resumeixen els resultats més rellevants obtinguts en la present tesi i s'enumeren les principals conclusions. Addicionalment, s'han adjuntat tres annexes que complementen la informació dels diferents capítols.

[eng] Carbohydrates exhibit a high stereo chemical diversity. Living organisms take benefit of it by using oligosaccharides and polysaccharides for a large number of biological functions. In addition to the typical structural and energetic functions, carbohydrates play an important role in other more specific functions such as cellular signalling. This functionality is of special interest in different biotechnological applications as a result of an increasing number of studies in glycobiology. The glycosidic bond, specially the one between two glucose units, is one of the most stable bonds found in natural biopolymers. The half life time for the spontaneous hydrolysis of this bond in cellulose and starch is of the order of 5 million years. Glycosil hydrolases (GHs) are the enzymes responsible for the enzymatic hydrolysis of these biopolymers. GHs are able to hydrolyze the glycosidic bond in a time scale of the order of 1000 cycles per second. Due to this extremely high activity, GHs are considered some of the most efficient biological catalysts. This thesis is focused on the formation of the Michaelis complex in 1,3-1,4-β-glucanase, a family 16 glycosil hydrolase. Understanding the substrate binding process is a key point to rationalize the subsequent steps of any enzymatic process. Usually, this process involves conformational changes of both the enzyme and the substrate. These changes contribute to the catalysis by changing the relative energies of reactants and products. Recent experiments on β-glycosil hydrolases give evidence of a distorted structure of the substrate with respect to its structure in solution. However, the factors that dictate the preference of the substrate to be bound to the enzyme in one or another conformation remain unknown, as well as their mechanistic implications. This thesis tries to answer some of these questions using different techniques based on molecular dynamics (both classical and first principles) in combination with methods aimed to accelerate the simulation of rare events.