Àcids nucleics químicament modificats amb potencial terapèutic: oligoncleòtids cíclics i àcids nucleics peptídics amb abraçadores de guanina

Abstract

[cat] Utilitzant un mètode de síntesi prèviament desenvolupat s'han obtingut una sèrie d'oligodesoxiribonucleòtids cíclics de seqüència complementària al mRNA de la dihidrofolat reductasa (DHFR). Els oligonucleòtids cíclics sintetitzats han mostrat activitat citotòxica sobre cèl·lules de hàmster xinès, presumiblement per un mecanisme antisentit que implica la inhibició de l'expressió de la DHFR. La mida de l'oligonucleòtid cíclic influeix en la seva activitat citotòxica i per a tots ells existeix una concentració a la que l'activitat és més gran. L'activitat dels oligonucleòtids cíclics, que és menor que la dels oligonucleòtids lineals amb unions internucleosídiques de tipus fosforotioat, i és molt major que la dels lineals que contenen unions naturals fosfodiester, és atribuïble al seu caràcter cíclic i a la conseqüent resistència front a les exonucleases. Per a possibilitar l'obtenció d'oligonucleòtids cíclics que també siguin resistents a l'acció de les endonucleases, s'ha comprovat que la metodologia general de síntesi és aplicable a l'obtenció d'oligonucleòtids cíclics amb unions internucleosídiques fosforotioat en totes les posicions, excepte en la que uneix l'oligòmer al suport sòlid en el precursor lineal. D'altra banda, s'ha desenvolupat un esquema de síntesi per a, a partir de 5-bromouracil i en 8 etapes, obtenir dos nous monòmers d'àcid nucleic peptídic que incorporen com a nucleobase modificada a anàlegs de citosina, anomenats abraçadores de guanina. Aquests són potencialment capaços de formar fins a quatre i cinc enllaços d'hidrogen amb una guanina d'una seqüència complementària. L'elaboració de l'anell de fenoxazina de les abraçadores de guanina té com a etapa clau la incorporació del 2-aminoresorcinol en la posició 4 de l'uracil. Per a això, es parteix del N1-tert-butoxicarbonilmetil derivat del 5-bromouracil i s'activa la posició 4 del 5-bromouracil en forma de triazole derivat per a la substitució nucleòfila amb el 2-aminoresorcinol. En l'esquema desenvolupat, la ciclació de l'aminoresorcinol derivat del 5-bromouracil per a formar la fenoxazina i la incorporació dels apèndixs de 2-etanolamina i 2-hidroxietilguanidina, condueix a millors resultats si es duu a terme en aquest ordre degut a que els esquemes de síntesi de les dues abraçadores tenen un intermedi més comú i els rendiments globals són superiors. S'ha dut a terme la síntesi en fase sòlida mitjançant l'estratègia Fmoc/Bhoc d'una sèrie de decàmers de PNA, uns que contenen únicament nucleobases naturals i uns altres en els que alguna citosina de les anteriors seqüències ha estat substituïda per abraçadores de guanina. En els acoblaments dels monòmers s'ha emprant HATU com a agent activant i han tingut lloc amb rendiments entre el 95 i el 98% per als que contenen nucleobases naturals i lleugerament inferiors (aproximadament del 90%) per als monòmers modificats amb les abraçadores. Per primer cop s'ha posat a punt la utilització de l'energia de microones per a activar les reaccions d'acoblament en la síntesi de PNA. La qualitat dels productes crus de síntesis de PNA és millor que quan les reaccions es realitzen a temperatura ambient. Finalment, per tal d'avaluar l'afinitat dels decàmers de PNA sintetitzats per les seves seqüències de DNA complementàries s'han enregistrat les corbes de fusió per espectroscòpia d'UV dels corresponents dúplexs PNA-DNA a partir de les quals s'han determinat les temperatures de fusió, TM. Per als PNAs que contenen únicament nucleobases naturals s'ha observat una bona correlació lineal entre les temperatures de fusió i el nombre de parells de bases G-C del dúplex. La substitució en els PNAs d'alguna citosina per abraçadores de guanina, tant si contenen un grup amino com un grup guanidino, produeix una pronunciada desestabilització dels corresponents dúplexs. S'interpreta que la capacitat de les abraçadores de guanina per a estabilitzar dúplexs PNA-DNA és enormement dependent del seu entorn (seqüència i tipus d'àcid nucleic).