Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2445/43393
Title: Identificació i caracterització de nous factors associats als elements insulator de Drosophila melanogaster
Author: Cuartero i Betriu, Sergi
Director: Espinàs Janer, M. Lluïsa
Corominas, Montserrat (Corominas Guiu)
Keywords: Genètica molecular
Drosòfila melanogaster
Expressió gènica
Factors de transcripció
Molecular genetics
Drosophila melanogaster
Gene expression
Transcription factors
Issue Date: 10-Apr-2013
Publisher: Universitat de Barcelona
Abstract: [cat] Els elements insulator són seqüències al genoma que aïllen i separen regions reguladores. Clàssicament han estat definits per presentar dues propietats característiques: d’una banda són capaços d’aïllar un transgèn dels efectes posicionals de l’entorn cromosòmic —com mantenir-lo aïllat dels efectes silenciadors si el transgèn està situat en una regió heterocromàtica—, i per altra són capaços d’impedir l’activació d’un promotor per part d’un enhancer si l’insulator es troba entremig de tots dos (enhancer-blocking). A la regió reguladora del gen homeòtic Abdominal-B s’hi troben alguns dels insulators més ben estudiats de Drosophila melanogaster (Mcp, Fab-7 o Fab-8) que separen dominis reguladors (cadascun dirigint l’expressió d’Abdominal-B en un segment diferent). Al laboratori s’havien identificat prèviament zones d’hipersensibilitat a DNAsaI entre els dominis iab-5 i iab-6. Nosaltres hem les hem caracteritzat i n’hem identificat una (Fab-6) com a insulator, i que a més també té propietats de PRE (Polycomb response element). El Fab-6, situat en un transgèn entre un enhancer i un gen mini-white, atenua l’efecte activador de l’enhancer sobre el promotor. La manca de CP190 (proteïna necessària pels insulators) fa disminuir aquesta atenuació, demostrant que l’efecte és degut a una seqüència insulator. També hem demostrat que el Fab-6 es transcriu malgrat no ser codificant, i ho fa en el mateix sentit que el gen al qual regula, Abdominal-B. En canvi aquesta transcripció no té lloc en cèl•lules on Abdominal-B està silenciat. Hem vist que l’efecte enhancer-blocking d’alguns insulators també disminueix en mosques mutants de JIL-1. JIL-1 és una quinasa que fosforila la serina 10 de la histona H3 a interfase i que està relacionada amb activació de la transcripció i amb cromatina localment descondensada. Així, la participació de JIL-1 en l’activitat insulator pot venir donada per la necessitat d’aquests de transcriure’s. Per tal d’identificar més proteïnes que puguin estar involucrades en l’activitat insulator vam realitzar una purificació del complex format per CP190. CP190 és una proteïna que es troba a la major part d’insulators identificats fins el moment, i que és comú a tot els tipus d’insulator de Drosophila. Un cop purificat el complex en vam analitzar els components per espectrometria de masses. Entre les proteïnes identificades amb més robustesa hi havia les proteïnes ja conegudes d’insulator (CTCF, Su(Hw), Mod(mdg4)). Hi havia també altres proteïnes ja conegudes però fins ara no relacionades amb CP190 com Nurf-38 (component del complex remodelador de la cromatina NURF) i Z4 (relacionada amb manteniment de l’estructura de la cromatina, amb regions eucromàtiques i amb JIL-1). I també vam identificar dues proteïnes no descrites fins al moment que hem anomenat Ibf-1 i Ibf-2 per Insulator Binding Factor 1 i 2. Vam veure que es tractava de proteïnes amb localització nuclear i que s’unien a la cromatina a cromosomes politènics formant un patró de bandes que es solapa majoritàriament amb bandes de CP190. N’hem realitzat ChIP-seq (immunoprecipitació de cromatina seguida de seqüenciació) i hem observat que no només colocalitzen a la cromatina amb CP190 sinó també —tot i que amb menor mesura— amb les demés proteïnes d’insulator conegudes a Drosophila: Su(Hw), CTCF i BEAF. Els llocs d’unió mostren força diversitat: des de regions intergèniques a promotors de gens i també a introns i exons. Hi ha un particular enriquiment a gens que contenen promotors alternatius i a promotors que tenen un altre promotor proper. A nivell funcional hem vist per microarray que la seva manca causa desregulació de l’expressió de varis gens no relacionats funcionalment entre si. També hem vist en assaigs transgènics que la manca d’Ibf-1 i Ibf-2 disminueix l’efecte enhancer-blocking d’alguns insulators. Per tot plegat concloem que hem identificat dues noves proteïnes d’activitat insulator a Drosophila.
[eng] Insulator elements are genomic sequences that serve as boundaries for proper gene regulation. These sequences are bound by specific chromatin-binding proteins that help insulate and separate different regulatory regions. They are classically defined by having two properties: on one hand they can act as barriers to heterochromatin that can therefore insulate a transgene from positional effects due to genomic environment; and on the other hand they can block the interaction between an enhancer and a promoter when they are positioned in between. In this case, the activating effect of the enhancer will be attenuated in the presence of the insulator. We have investigated the insulators present in the Abdominal-B homeotic gene regulatory region of Drosophila melanogaster. This large region is divided into several domains each one controlling Abdominal-B expression in a different body segment. Previous work in the lab had uncovered two DNaseI hypersensitive sites between domains iab-5 and iab-6. We have characterized them and identified one as the insulator Fab-6, that separates the two domains. This insulator is dependent on CP190 and is transcribed in those cells where Abdominal-B is transcribed. In order to identify new proteins involved in insulator activity we purified the complex formed by CP190, which is an already well characterized insulator protein found in every type of insulator known in Drosophila. Using Mass Spectrometry we identified the components of the complex. We found other known insulator proteins like CTCF, Su(Hw) or Mod(mdg4). We also identified Nurf-38 (a component of NURF complex) and Z4 (an euchromatin binding protein). And we identified two previously uncharacterized proteins that we named Ibf-1 and Ibf-2 after Insulator Binding Factor 1 and 2. We have studied these two proteins and showed that not only they colocalize in chromatin with CP190 (and partially with the other insulator proteins) but also they have enhancer-blocking activity and their lack causes a misregulation in gene expression of several genes. Overall our results show that we have identified two new Drosophila insulator proteins that form complex with CP190.
URI: http://hdl.handle.net/2445/43393
Appears in Collections:Tesis Doctorals - Departament - Genètica

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
SCB_TESI.pdf32.11 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.