Proteïnes no estructurals de picornavirus: implicacions funcionals de les estructures cristal·logràfiques de 2B i 3DPOL

Abstract

[cat] Aquesta tesi doctoral presenta l'estudi estructural de dues proteïnes implicades en la replicació dels picornavirus: la proteïna 2B del virus de l'hepatitis A (HAV) i la proteïna 3D, la polimerasa d'ARN dependent d'ARN (RdRp), dels virus Coxsackie B3 i el virus de l'Encefalomiocarditis (EMCV). Aquest treball aporta la primera estructura tridimensional d'una proteïna 2B d'aquesta família de virus. La seva estructura i la disposició al cristall suggereixen un mecanisme mitjançant fibres, semblants a les amiloide, pel qual dur a terme la funció en la que està implicada: la reorganització de membranes cel-lulars per tal de crear espais de replicació viral dins el citoplasma de la cèl-lula infectada. Pel que fa a les RdRp, s'han estudiat amb l'objectiu de trobar el lloc d'unió de fàrmacs i entendre els mecanismes de resistència que desenvolupen certes soques de virus mitjançant mutacions en aquesta proteïna. L'estructura del complex de la RdRp de CVB3 amb el GPC-N114, molècula amb activitat antiviral contra enterovirus i cardiovirus, ha revelat que el lloc d'unió se solapa amb el del motlle-encebador. Les estructures de les RdRp d'EMCV mutants de les dues soques resistents del virus (M300V i I304V) han permès entendre que el solapament del loop del motiu B amb el lloc d'unió de l'inhibidor podria ser el mecanisme de resistència davant del GPC-N114. La resolució de l'estructura de la RdRp d'EMCV salvatge ha mostrat una conformació de la polimerasa que no s'havia observat abans en la qual el motiu A adopta una conformació alterada que la inactivaria i podria tenir a veure amb un mecanisme d'autoregulació de la replicació viral. La RdRp mutant S299T de CVB3 present en una soca resistent a la inhibició de la replicació de l'ARN provocada per l'amilorida, fàrmac actiu contra els cardiovirus, ha permès determinar la importància del contacte entre aquest residu i el motiu conservat del centre actiu (GDD) per una correcta activitat de la RdRp. En conclusió, aquest treball presenta resultats importants per ampliar el coneixement general de la replicació en picornavirus afegint nova informació per concretar el funcionament pas a pas de les RdRp i iniciant una nova via cap a l'estudi de les proteïnes auxiliars de la replicació que permeten que aquesta funcioni.

[eng] The PhD thesis "NON STRUCTURAL PROTEINS OF PICORNAVIRUS: FUNCTIONAL IMPLICATIONS OF THE 2B AND 3DPOL CRYSTAL STRUCTURES" presents the structural study of two proteins involved in the replication of picornaviruses: 2B protein of hepatitis A (HAV) and 3D protein, the RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) of Coxsackie virus B3 and Encephalomyocarditis virus (EMCV). This work provides the first three-dimensional structure of a protein 2B from this viral family. The structure of the protein and the arrangement in the crystal suggest a mechanism to perform the function that is involved in: the reorganization of cellular membranes in order to create spaces for viral replication in the infected cell cytoplasm. Regarding the RdRp, the study was focused on finding the binding site and understand the drug resistance mechanisms that certain strains of viruses develop through mutations in this protein. The structure of the CVB3 RdRp with GPC-N114 molecule, an antiviral against enterovirus and cardiovirus, complex has revealed that the binding site overlaps with the template-primer duplex. The structures of the RdRp of both EMCV mutant resistant strains of the virus (M300V and I304V) have led to understand that the overlap of loop B with the inhibitor binding site may be the mechanism of resistance to the GPC-N114. The structure of the RdRp of EMCV showed a wild non complexed polymerase conformation nat previously seen in which the motifA adopts an altered conformation, probably inactive that could be related to a self-regulation mechanism of the viral replication. The model proposed for the mutant RdRp S299T of CVB3 resistant to the RNA replication inhibition caused by amiloride, a drug active against cardiovirus, reveals the importance of the contact between this residue and the conserved motif active site (GDD) to properly develop the RdRp activity. In conclusion, this study presents important results to expand the general knowledge of picornavirus replication by adding new information to define step by step the RdRp function and initiating a new way to study the assistant proteins that allow the replication.