Tumores germinales testiculares: mecanismos de adquisición de resistencia al cisplatino y desarrollo de una aproximación terapéutica para el tratamiento de tumores refractarios

Abstract

[spa] Los tumores germinales testiculares (TCGT) son una neoplasia poco frecuente, ya que sólo representa alrededor del 2% de los cánceres que afectan al varón. Sin embargo, son el tumor más frecuente en hombres caucásicos de entre 15 y 40 años, siendo la principal causa de muerte en este rango de edad. Aunque un elevado porcentaje de estos tumores (alrededor del 80%) presentan una alta sensibilidad a la quimioterapia basada en cisplatino (CDDP), incluso en casos de enfermedad diseminada, aún existe un porcentaje no menospreciable de pacientes que no lograrán una respuesta completa duradera debido al desarrollo de recidivas resistentes a la quimioterapia y que acabarán falleciendo a causa de la enfermedad. Por este motivo, el estudio y la comprensión de los mecanismos mediante los cuales los tumores consiguen evadir los efectos citotóxicos del CDDP es de vital importancia para mejorar la efectividad de las terapias actuales, así como para definir nuevas estrategias de tratamiento. Partiendo de esta base, el presente trabajo se ha centrado en dos objetivos principales: a) el estudio de las mutaciones y cambios genéticos relevantes en el proceso de adquisición de resistencia al CDDP en estos tumores, y b) desarrollo y evaluación de la eficacia de una nueva terapia combinada basada en CDDP y un inhibidor de poli (ADP-ribosa) polimerasas, olaparib, para tratar tumores testiculares refractarios a la quimioterapia convencional. Para abordar el primer objetivo, se realizó un estudio mutacional de la línea celular de cáncer testicular SuSa mediante secuenciación de última generación (NGS). Utilizando esta técnica, se compararon las mutaciones presentes en el genoma de la línea celular original sensible al fármaco y su derivada resistente. Una vez seleccionadas las mutaciones potencialmente implicadas en el proceso de adquisición de resistencia, se evaluó la relevancia de los genes candidatos mediante un screen con siRNAs. Esta técnica también nos permitió estudiar la implicación de otros genes que, aún no presentando mutaciones en su secuencia, pudiesen estar relacionados con la resistencia debido a otros tipos de desregulaciones funcionales. Paralelamente, gracias a la generación en nuestro grupo de un modelo murino de xenoinjertos ortotópicos de cáncer testicular, se pudo conseguir mimetizar in vivo el fenómeno de adquisición de resistencia a CDDP, tratando tumores sensibles de origen humano implantados en los testículos de ratones con concentraciones crecientes de fármaco, hasta obtener tumores resistentes. Esto nos permitió la realización de otro experimento de NGS para comparar el exoma de tumores primarios humanos sensibles y sus derivados resistentes al CDDP, con el objetivo de estudiar los cambios producidos in vivo en el proceso de adquisición de resistencia utilizando un modelo más cercano a la clínica. En cuanto al segundo objetivo, partiendo de la base de que los TCGTs son tumores cuya sensibilidad se caracteriza por niveles reducidos de mecanismos de reparación de lesiones en el DNA, y que durante el proceso de adquisición de resistencia parece ser que estos tumores son capaces de incrementar esta capacidad de reparación, pensamos que sería muy interesante utilizar un fármaco cuya actividad estuviera dirigida a inhibir la reparación en el DNA. Así, evitando una reparación eficiente, podríamos potenciar el efecto citotóxico producido por las lesiones en el DNA causadas por el CDDP. De esta manera, se estudió el efecto del olaparib sólo o en combinación con el CDDP sobre diferentes líneas celulares de TCGT, tanto a nivel molecular como in vitro, y, posteriormente, in vivo en ratones xenoinjertados con tumores que habían demostrado su resistencia en la clínica, obteniendo unos resultados altamente prometedores.

[eng] Testicular germ cell tumors (TGCTs) are the most common malignancy in young Caucasian men. Despite the generally favorable outcome for TGCTs treated with cisplatin (CDDP)-based chemotherapy, it is still the leading cause of cancer deaths in this group of age. Hence, the study and comprehension of the mechanisms underlying the acquisition of resistance is crucial to improve the effectiveness of current therapies, as well as to define new treatment strategies. The present study has focused in two main goals: identification of mutations relevant to the process of resistance acquisition in TGCTs, and efficacy evaluation of a novel drug combination to treat refractory tumors. Using next generation sequencing (NGS) technology we studied the mutational profile in a CDDP sensitive testicular cell line and its resistant counterpart. Potentially relevant mutations were selected and siRNA screens were carried out both to validate the role of those changes in the onset of resistance and to study other genes not mutated but potentially deregulated and, thus, involved in the process. Results pointed out 4 candidates frequently mutated or deregulated capable of modifying the response of the tumors to CDDP: FANCA, SMARCB1, ALX4 and PARP6. Additionally, we generated a murine orthoxenograft model of testicular cancer, which allowed us to reproduce and study in vivo the onset of resistance, using an approach closer to the clinic scenario. Nude mice engrafted with sensitive human tumor samples were treated with increasing CDDP concentrations until they were completely unresponsive to the drug. We next used NGS technology to compare paired sensitive and resistant tumor samples and studied their mutational profile, obtaining a list of candidates potentially relevant to the development of resistance. Finally, we assessed the effectiveness of a new drug combination to overcome resistance in testicular tumors. The treatment was based on a multi-target approach, damaging DNA with CDDP and inhibiting its repair with a PARP inhibitor, aka olaparib, at the same time. Both in vitro and in vivo results where highly promising, producing a great decrease in tumor viability while showing no major side effects. More research will shed light on the potential of this novel combination as a feasible option for non-responding or relapsed patients.