Identificación del origen de la contaminación fecal en aguas con Bifidobacterium spp. y/o Bacteroides spp. específicas de huéspedes

Abstract

[spa] El agua es un recurso renovable y fundamental para el sustento y desarrollo de la vida en el planeta. Debido al crecimiento de la población humana junto con la expansión de la actividad industrial, la agricultura y ganadería intensivas y el cambio climático han provocado un gran deterioro en la calidad del agua. La contaminación de origen fecal es una de las fuentes más relevantes de la polución del agua, ya que puede comportar la presencia de microrganismos patógenos, los cuales implican un alto riesgo sanitario y grandes pérdidas económicas. La discriminación del origen de la contaminación fecal es por tanto esencial para la actuación directa sobre la fuente, conocer el impacto y los riesgos derivados de dicha contaminación. Existen diversos métodos para la determinación del origen de la contaminación fecal. En primer lugar los métodos químicos, los cuales consisten en la detección de compuestos como la cafeína o los esteroles y estanoles fecales. En segundo lugar, los métodos microbiológicos (Microbial Source Tracking). Estos están enfocados a encontrar microrganismos capaces de discriminar el origen de la contaminación fecal. Se asume que estos microrganismos están relacionados con la flora gastrointestinal de cada uno de los huéspedes y que son diferentes unos de otros debido a las condiciones intestinales de cada hospedador, a la selección natural, y a que la progenie producida por subsiguientes replicaciones es genéticamente idéntica. Los primeros microrganismos utilizados (E. coli, coliformes fecales, enterococos o clostridios reductores de sulfitos) no eran capaces de determinar el origen contaminante. Por ello se desarrollaron otras metodologías con nuevos indicadores. La primera utilizada para los estudios de MST fueron la determinación de bacteriófagos que infectaban cepas de Bacteroides específicas de huésped (humano, bovino, porcino y aviar). En este primer estudio se comprueba que las cepas seleccionadas para cada origen muestran una alta detección de fagos en las muestras con carga fecal elevada de su mismo origen, no detectando fagos (salvo alguna excepción) en muestras de origen distinto. También identificaron con éxito la fuente contaminante en muestras de agua con carga fecal moderada. En el segundo estudio se diseñaron cuatro sets (cebadores comunes y sondas específicas) de qPCRs específicas de Bifidobacterium asociados a huésped. Se comprobó que los pasos previos de extracción y purificación del ADN de la muestra eran necesarios para su correcto análisis, que cada uno de los sets era capaz de discriminar su origen contaminante sin producirse reacciones cruzadas en aguas tanto de elevada como moderada carga fecal. En el tercer estudio se aplicaron estas técnicas junto con las metodologías de PCR del ADN mitocondrial y una PCR multiplex de Bif. adolescentis y Bif. dentium para la puesta a punto de un programa de aprendizaje inductivo (Ichnaea) capaz de establecer modelos predictivos para su aplicación en muestras ambientales con bajos niveles de contaminación. Para ello se estudiaron tres tipos de muestra: de elevada y moderada carga fecal, donde todos los métodos resultaron efectivos; y de baja carga fecal (canal de riego del Delta del Ebro), donde en muchos casos la diana de las metodologías se encontraba por debajo de su límite de detección. Este programa informático también estableció qué parámetros poseían mayor relevancia según el nivel de la dilución y la antigüedad de la muestra. En el último estudio se diseñó un set de qPCRs específicas de Bacteroides asociados a huésped (a partir de las bandas predominantes del ADN 16S analizadas por DGGE de cada origen fecal). Esta nueva metodología continúa en estudio. La conclusión principal de este trabajo es que no existe una metodología única y universal capaz de discriminar el origen de la contaminación fecal, si no que para una mayor fiabilidad en la discriminación es necesario el análisis conjunto de diversos indicadores y que los programas de aprendizaje inductivo indican cuáles son los más relevantes en cada caso.

[eng] Due to the growing human population along with the expansion of industrial activity, intensive agriculture and animal husbandry and climate change have led to a severe deterioration in water quality. Faecal pollution is one of the most important sources of water pollution because it can involve the presence of pathogenic microorganisms, which involve a high health risk and large economic losses. The discrimination of the origin of faecal pollution is so essential for the direct action on the source, knowing the impact and risks of such contamination. There are several methods for determining the source of faecal contamination, such as chemical methods and microbiological methods, which are known as Microbial Source Tracking. MST is focused on finding microorganisms capable of discriminating the source of faecal contamination. The first used microorganisms (E. coli, faecal coliforms, etc.) were not able to determine the contaminant source. Therefore, other methodologies with new indicators were developed. The first study was determining bacteriophages which infect host-specific Bacteroides strains for each faecal origin. They successfully identified the contaminating source in water samples with high and moderate faecal load. In the second study, four sets of qPCRs associated to host-specific Bifidobacterium were designed. It was found that the previous steps of extraction and purification of DNA from the sample were needed for proper analysis; each set was able to discriminate its own origin without crossed-reactions in contaminated water samples with high or moderate faecal load. In the third study, these techniques were applied together with the methodologies of mitochondrial DNA PCR and multiplex PCR of Bif. adolescentis and Bif. dentium for the development of inductive learning program (Ichnaea) able to establish predictive models for use in environmental samples and to establish which parameters showed greater relevance according to the level of dilution and aged pollution. In the last study, four sets of host-specific Bacteroides qPCRs were designed (from the predominant 16S DNA bands analysed by DGGE of each faecal origin). This new methodology is still under study. The main conclusion is that there is no single and universal methodology able to discriminate the origin of faecal pollution. For increased reliability in discriminating, sets of different indicators and their analysis are necessary and that the inductive learning programs indicate which the most relevant ones in each case are.