Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2445/65553
Title: TREXI and SAMHD1, and Aicardi-Goutières Syndrome
Author: Valverde Estrella, Lorena
Director: Celada Cotarelo, Antonio
Lloberas Cavero, Jorge
Keywords: Macròfags
Inflamació
Autoimmunitat
Reparació de l'ADN
Macrophages
Inflammation
Autoimmunity
DNA repair
Issue Date: 6-Feb-2015
Publisher: Universitat de Barcelona
Abstract: [cat] La síndrome d'Aicardi-Goutières (AGS), és una malaltia autoimmunitària recessiva que mimetitza una infecció vírica intrauterina, i la qual és caracteritzada per calcificacions intracranials, atròfia cerebral i augment d'IFN-alfa al líquid cefaloraquidi. L'AGS és una malaltia genètica heterogènia associada amb mutacions al gen que codifica per a l'exonucleasa TREX1, a qualsevol dels gens codificants per a les components de la ribonucleasa RNASE H2, a la fosfo­hidrolasa SAMHD1, a la deaminasa ADAR1 o al sensor citoplasmàtic MDA5. El coneixement d'aquestes funcions és fonamental per tal d'entendre la patogènesi de l'AGS. En aquesta tesi s'ha aprofundit en el coneixement del mecanisme regulador de la transcripció de Samhd1. Hem vist que Samhd1 es troba expressat en diferents òrgans sense necessitat de cap estímul previ, com el pàncrees, l’intestí prim i els macròfags derivats de moll d’os, i en diferents quantitats en altres òrgans de ratolí. Donada la important afectació que té l’AGS al cervell, també es va analitzar la seva expressió en neurones i cèl·lules de la micròglia. També hem vist que Samhd1 es troba induït en presència de citocines proinflamatòries, però no es troba afectada la seva expressió en presència de citocines antiinflamatòries així com tampoc en presència de TNF-gamma. Utilitzant macròfags derivats de ratolins deficients en STAT1, hem pogut demostrar que l’expressió de Samhd1 per IFN-alfa és a través d’STAT1, ja que la seva expressió es troba completament reprimida en aquestes cèl·lules. Ens vam centrar en la inducció de Samhd1 i per la seva comprensió vam focalitzar en l’estudi del seu promotor. Es van clonar 1500 parells de bases del promotor de Samhd1 en un plasmidi reporter de luciferasa, i es va veure que aquest fragment era suficient per induir l’expressió de luciferasa. A partir d’aquest constructe, es van realitzar llavors noves construccions delecionant cada vegada una regió del promotor. Es va veure que en delecionar una regió específica de 161pb, l’expressió de luciferasa es trobava completament reprimida, indicant que aquesta regió del promotor és crítica per a la inducció de Samhd1. Experiments de retard en gel (EMSA) van mostrar que Samhd1 es troba reprimit en condicions basals per una proteïna que no hem arribat a caracteritzar, i experiments de precipitació de cromatina (ChIP) van mostrar que IRF1 es troba involucrada en la inducció de Samhd1 per IFN-alfa. La nostra hipòtesi doncs, és que l’expressió de Samhd1 té un mecanisme de regulació doble: en condicions basals es troba reprimit i en presència d’IFN-alfa s’indueix una via de senyalització independent d’STAT1 que fa saltar el complex repressor del promotor, i també s’indueix una via de senyalització dependent d’STAT1, que indueix l’expressió d’IRF1 i que activa la transducció de Samhd1. Fins ara no hem caracteritzat la proteïna o complex de proteïnes que reprimeix l’expressió de Samhd1 en condicions basals, però s’està investigant mitjançant anàlisis proteòmics. En aquesta tesi també s’ha fet la construcció d’un ratolí KO condicional per a TREX1. Una vegada aconseguit aquest animal condicional, el qual conté el gen de Trex1 flanquejat per dues dianes LoxP, aquest s’està encreuant amb diferents soques que expressen CRE sota regulació de diferents Socs2 promotors. Els ratolins homozigots KO i que expressen CRE, tenen un fenotip similar al fenotip que mostren els ratolins KO totals de TREX1. Estem en el procés d’obtenció de ratolins homozigots KO i que expressen CRELysM però, donat a problemes amb la penetrància d’aquest al·lel, hem tingut algunes dificultats. Els resultats d’aquesta tesi en conjunt poden ajudar a entendre una mica més el funcionament de l'AGS.
[eng] Aicardi-Goutières Syndrome (AGS) is a rare encephalopathy which mimics a viral intrauterine infection and is characterized by calcifications of the basal ganglia, cerebral atrophy and IFN-a in the cerebrospinal fluid. AGS is a heterogenic disease associated with mutations in the gene of the exonuclease TREX1, in any of the genes codifying for the ribonuclease H2, in the phosphohydrolase SAMHD1, in the deaminase ADAR1 or in the cytoplasmic sensor MDA5. The knowledge of these functions is basic for the comprehension of the beginning of the pathogenesis of AGS. In this thesis we focused in the mechanism of Samhd1 transcription. We have seen that Samhd1 is induced by pro-inflammatory stimuli but neither by anti-inflammatory stimuli nor TNF-a, and that the induction of Samhd1 is through STAT1 pathway. We wanted to know a bit more about Samhd1 induction so we focused on the study of its promoter. We did a construct in a luciferase-reporter vector with 1500bp of Samhd1 promoter, and we saw that this region of the promoter is enough to induce luciferase expression. From this construct, we did new plasmids and when deleting a specific region, the luciferase expression was abolished, indicating that in Samhd1 promoter, 161bp are critical for Samhd1 induction. EMSA assays showed that Samhd1 expression is repressed in basal conditions by an unknown protein, and ChIP assays also showed that IRF1 is involved in Samhd1 induction by IFN-.. We hypothesized that the regulation mechanism is depending in an STAT1-depending pathway, through IRF1, and also in an STAT1-independing pathway, through an unknown mechanism up to date. We checked with proteomics analysis the protein which might be involved in Samhd1 repression but the results were not significant. We also constructed a conditional KO mouse for TREX1, and now we are crossing it with different CRE­Socs2 expressing strands. Homozygous KO expressing CRElitter, show a similar phenotype to TREX1 total KO. We are in the process to obtain homozygous KO expressing CRELysM, but due to problems with the penetrance of this CRE allele we have some difficulties. All together, the results of this thesis will shed light in the inner operation of AGS.
URI: http://hdl.handle.net/2445/65553
Appears in Collections:Tesis Doctorals - Departament - Fisiologia i Immunologia

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
LVE_PhD_THESIS.pdf17.37 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.