Caracterització del Cromoplast com a Orgànul Bioenergètic i Respiratori durant la Maduració del Tomàquet

Abstract

[cat] Els cloroplasts presenten una activitat respiratòria anomenada clororespiració, que consisteix en una cadena de transport electrònic des del NAD(P)H fins a l’oxigen i que està situada a les membranes tilacoidals. En aquesta cadena respiratòria participen el complex NAD(P)H deshidrogenasa (Ndh), la plastoquinona i la oxidasa terminal plastidial (PTOX). La seva funció està probablement relacionada amb l’adaptació de la fotosíntesi en situacions d’estrès o davant dels canvis en l’ambient. La possible existència d’una activitat respiratòria en plastidis no fotosintètics ha estat molt poc estudiada. Durant la maduració del tomàquet, els cloroplasts del fruit verd es diferencien en cromoplasts, els quals acumulen carotenoides i són fotosintèticament inactius. Durant aquest procés les membranes tilacoidals es desmantellen i l’aparell fotosintètic es degrada. No obstant, diversos transportadors electrònics es mantenen (Ndh, citocrom b6f i PTOX), així com l’ATP sintasa. Aquest fet suggereix que els cromoplasts podrien mantenir una activitat respiratòria similar a la clororespiració. En aquest treball es van realitzar estudis de respiració utilitzant cromoplasts aïllats de tomàquets madurs. Es va observar que els cromoplasts consumeixen oxigen activament, i aquest consum és estimulat pels donadors d’electrons NADH i NADPH. A més, la respiració de cromoplasts respon al desacoblador CCCP, suggerint que possiblement està relacionada amb la creació de gradients de protons a través de membranes. Per últim, es va comprovar que el consum d’oxigen és inhibit per un inhibidor de la PTOX, l’octil gal·lat, indicant que la PTOX és l’oxidasa terminal de la cadena respiratòria. Per altra banda, es va observar que els cromoplasts aïllats són capaços de sintetitzar ATP en presència de NADH i NADPH. Igual que el consum d’oxigen, la síntesi d’ATP és inhibida per l’octil gal·lat i respon al CCCP. Es van realitzar mesures en presència d’un inhibidor específic del complex citocrom b6f i la síntesi d’ATP va quedar parcialment inhibida, la qual cosa suggereix que el citocrom b6f participa en la cromorespiració. A més, es va estudiar l’efecte d’un inhibidor de les NAD(P)H deshidrogenases i es va observar que produïa un efecte diferent segons el donador d’electrons emprat, suggerint la presència de dues NAD(P)H deshidrogenases diferents. Per confirmar la presència del citocrom b6f en els cromoplasts, es va fer un estudi per tècniques d’immunocitoquímica fent servir un anticòs contra el citocrom f i es va localitzar a l’interior dels cromoplasts de tomàquet. En la cromorespiració, un possible acceptor d’electrons per al citocrom b6f és el citocrom c6, doncs es va observar que la seva expressió augmenta durant la maduració. Per altra banda es va intentar identificar una possible NAD(P)H deshidrogenasa alternativa al complex Ndh que participés en la cromorespiració. Les NAD(P)H deshidrogenases tipus II (Ndh-2) són enzims monomèrics que es troben a plastidis, mitocondris i peroxisomes. El genoma del tomàquet conté set gens que codifiquen Ndh-2. Es va estudiar l’expressió dels set gens en diversos teixits de tomaquera i durant la maduració del tomàquet, i es va trobar que quatre Ndh-2 són presents en el fruit madur. A continuació, es va estudiar la seva localització subcel·lular mitjançant la fusió d’aquestes Ndh-2 amb la YFP i l’expressió transitòria de les proteïnes quimèriques en fulles de plantes de tabac, i es va comprovar que dues Ndh-2 són plastidials. Per tant, aquestes Ndh-2 són candidates que podrien participar en la cromorespiració. Per comprovar quina podia ser la contribució de la cromorespiració en relació a la respiració total del tomàquet, es van realitzar estudis amb fragments de pericarp fent servir l’inhibidor octil gal·lat. Els resultats obtinguts mostren que la respiració associada a l’activitat de la PTOX augmenta durant la maduració del fruit i representa un 25% de la respiració total quan és madur. A més, també es va comprovar que la cromorespiració contribueix significativament al contingut d’ATP total del pericarp de fruit madur.

[eng] Chloroplasts present a respiratory process called chlororespiration. This activity consists in an electron transport pathway from NAD(P)H to oxygen which it is located in thylakoidal membranes, and it involves the plastidial terminal oxidase (PTOX) and the NAD(P)H dehydrogenase complex (Ndh). Its function is related with photoprotection and the adaptation of photosynthesis in changing environmental conditions. However, the existence of a similar respiratory process in non-photosynthetic plastids was less studied. During tomato (Solanum lycopersicum) fruit ripening, chloroplasts differentiate into photosynthetically inactive chromoplasts. In this work, we have shown that isolated tomato fruit chromoplasts present an oxygen consumption activity which is stimulated by the electron donors NADH and NADPH. This respiratory activity is sensitive to the uncoupler CCCP, suggesting that it could be related to the generation of membrane proton gradients. It is also affected by octyl gallate (Ogal), a PTOX inhibitor. The ATP synthesis rate of isolated chromoplasts was quantified, and we observed that it is dependent on the supply of NAD(P)H and is fully inhibited by Ogal. Also, the ATP synthesis is sensitive to a cytochrome b6f complex inhibitor, and the possible participation of this complex in chromorespiration is supported by the detection of cytochrome f in chromoplasts using immunoblot and immunocytochemical techniques. The observed increased expression of cytochrome c6 during ripening suggests that it could act as electron acceptor of the cytochrome b6f complex in chromorespiration. In addition, we studied the family of type II NAD(P)H dehydrogenases in tomato (Ndh-2), which includes seven genes. Four Ndh-2 are expressed in ripe tomato fruit, and two of them (nda2 and ndc1) are located in plastids, so they are candidates to participate in chromorespiration. On the other hand, the effects of Ogal on respiration and ATP levels were also studied in tissue samples. Oxygen uptake of mature green fruit and leaf tissues was not affected by Ogal, but was inhibited increasingly in fruit pericarp throughout ripening (up to 25% in red fruit). Similarly, Ogal caused a significant decrease in ATP content of red fruit pericarp. The number of energized mitochondria, as determined by confocal microscopy, strongly decreased in fruit tissue during ripening. Therefore, the contribution of chromoplasts to total fruit respiration appears to increase in late ripening stages.