PROBLEMAS

Espectrofotometría

Enzimología

Bioenergética
Cadena respiratoria

PROBLEMAS DE ESPECTROFOTOMETRÍA

01.- Se pretende determinar el efecto de 24 horas de ayuno sobre la concentración de glucosa en la sangre de la rata. Para esto, muestras de sangre procedentes de ratas alimentadas y ayunadas se desproteínizan de la siguiente forma: a 0,2 ml de sangre se añaden 0,6 ml de agua destilada, 0,1 ml de Ba(OH)2 y 0,1 ml de ZnSO4. Después de centrifugar, del sobrenadante neutro y libre de proteínas se cogen 0,2 ml por duplicado.

Por otra parte, se prepara una estándar de glucosa, diluyendo una solución al 1% en una proporción 1/25 (solución D1). A partir de esta se prepara una serie de soluciones (D2, D3, D4 i D5), en la que cada una se obtiene diluyendo 1/2 la solución precedente, y también se prepara un blanco (D6) que contiene nada más agua destilada. De cada uno de estos tubos se toman 0,2 ml por duplicado.

Para poder determinar la concentración de glucosa, tanto a las muestras como a la estándar se añaden 2 ml de un reactivo que contiene todo lo necesario para que puedan darse las siguientes reacciones:

glucosa + O2 -----> glucono-d-lactona + H2O2

H2O2+ dianisidina (reducida) -----> H2O + dianisidina (oxidada)

Después de 30 min. se añaden 0,2 ml de HCl para parar las reacciones enzimáticas y que el color de la dianisidina oxidada vire a amarillo, que se lee en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 415 nm. Los valores de absorbancia obtenidos se presentan a continuación:

Estándar: D1: 0,70-0,67

D2: 0,34-0,36

D3: 0,18-0,19

D4: 0,10-0,11

D5: 0,07-0,06

D6: 0,02-0,02

rata alimentada: 0,38-0,39

rata ayunada: 0,29-0,31

Calcular la concentración de glucosa en la sangre de las ratas alimentadas y ayunadas. Expresar el resultado en mM (peso molecular de la glucosa: 180 g/mol).

RESULTADO: 1 y 2

02.- Para determinar la cantidad de proteína de una muestra de hígado de rata, se hace el siguiente procedimiento: se prepara un homogenado de hígado cogiendo 0,2 g de tejido y poniéndolos con 2 ml de tampón fosfatos (pH 7,4), y se cogen del homogenado resultante (por duplicado) 0,002 ml, que se llevan a un volumen de 0,5 ml con NaOH 0,1 N.

Por otra parte se prepara una patrón de albúmina: se cogen 0,1 ml de una solución de albúmina al 1% y se añaden 0,9 ml de NaOH 0,1 N (solución D), y con esta solución se prepara el siguiente banco de diluciones:

tubo 1: 1,00 ml NaOH 0,1 N + 0,00 ml solución D

tubo 2: 0,95 ml NaOH 0,1 N + 0,05 ml solución D

tubo 3: 0,90 ml NaOH 0,1 N + 0,10 ml solución D

tubo 4: 0,80 ml NaOH 0,1 N + 0,20 ml solución D

tubo 5: 0,60 ml NaOH 0,1 N + 0,40 ml solución D

De cada uno de los tubos del anterior banco de diluciones se cogen (por duplicado) 0,5 ml. A los tubos de la patrón y a los de la muestra se añaden los reactivos correspondientes, y una vez finalizada la reacción se lee la absorbancia al espectrofotómetro, obteniéndose los siguientes resultados:

tubo 1: 0,002-0,002

tubo 2: 0,118-0,122

tubo 3: 0,208-0,212

tubo 4: 0,358-0,362

tubo 5: 0,598-0,602

muestra: 0,150-0,154

Calcular la concentración de proteínas en el hígado de rata, expresando el resultado en mg de proteína por gramo de tejido.

RESULTADO: 1 y 2

PROBLEMAS DE ENZIMOLOGÍA

01.- La fumarasa cataliza la hidratación que transforma el fumarato en L-malato, según la reacción:

HOOC-CH=CH-COOH + H2O <------> HOOC-CHOH-CH2-COOH

Se utilizó fumarato como substrato y se midió la velocidad inicial (en mmol L-malato . min-1. l-1) de la reacción a 25°C, obteniéndose los siguientes resultados:

Fumarato (mM) vel. inicial

2,0 2,5

3,3 3,1

5,0 3,6

10,0 4,2

Calcular los valores de la VMAX y de la KM en estas condiciones, teniendo en cuenta que la concentración de enzima en el ensayo fue de 2 mM.

RESULTADO: problema 1

02.- Se estudió el efecto del pH sobre la actividad de la 6-fosfogluconato deshidrogenasa de hígado de rata, enzima que cataliza la reacción:

6-fosfogluconato + NADP+ <------> ribulosa-5-fosfato + CO2 + NADPH + H+

El estudio se realizó utilizando dos tampones, de pH 7,6 y 9,0. Para llevarlo a cabo se dispuso de cubetas con 0,9 ml de una mezcla del tampón correspondiente, 6-fosfogluconato y NADP+, a la que se añadió 0,1 ml de la preparación de la enzima; la actividad enzimática se cuantificó espectrofotométricamente, midiendo la aparición de NADPH a 340 nm (e = 6,22 ml . mmol-1), obteniéndose los siguientes resultados:

[substrat] (D D.O. als 5 min.)

(mM) pH 7,6 pH 9,0

17,4 0.074 0.034

26,7 0.085 0.047

52,6 0.098 0,075

166,6 0,114 0,128

400,0 0,121 0,167

Se pide analizar los efectos del pH sobre la actividad de la enzima, determinando a qué pH muestra la enzima una mayor afinidad por el substrato.

RESULTADO: problema 2 y 2’

03.- Se analizaron las constantes cinéticas de la succinato deshidrogenasa, utilizando diferentes concentraciones de substrato y determinando la velocidad en cada caso. Se realizó un segundo experimento bajo las mismas condiciones pero añadiendo una concentración 10 mM de un inhibidor de la enzima. Los resultados obtenidos se presentan a continuación:

[substrato] Vo (mkat . ml-1)

(mM) sin inhibidor con inhibidor

0,125 0,28 0,11

0,166 0,34 0,14

0,250 0,44 0,20

0,500 0,63 0,33

a) Calcular las constantes cinéticas de la enzima para esta preparación.

b) Identificar el tipo de inhibición y calcular la KI.

c) Calcular la concentración de substrato a la que la Vo será el 80% de la VMAX, tanto en ausencia del inhibidor como en presencia de este en concentraciones de 1 mM y de 10 mM.

RESULTADO: problema 3 y 3’

04.- En un experimento se estudió la actividad enzimática de la papaína, utilizando como substrato el hipurato de p-nitrofenilo, encontrándose que este proceso era inhibido por el N-benzoilamino-acetaldehído:

[substrato] Vo (mmol . l-1 . min-1)

(mM) sin inhibidor con inhibidor (33 mM)

0,710 0,20 0,18

0.400 0,18 0,15

0,310 0,16 0,11

0,098 0,12 0,07

0,066 0,10 0,05

0,040 0,07 0,04

A partir de la información de la tabla adjunta se pide:

a) Calcular la KM para el substrato y la VMAX (considerando que la concentración de enzima utilizada en el ensayo fue de 1,2 . 10-7 M).

b) Identificar el tipo de inhibición y calcular la KI.

c) Calcular la fracción de enzima unida al substrato (en ausencia del inhibidor) si la concentración de substrato es de 66 mM.

RESULTADO: problema 4

05.- La UDP-glucosa pirofosforilasa cataliza la reacción reversible:

glucosa-1-fosfato + UTP ------> UDP-glucosa + PPi

Se comprobó que el pirofosfato era un inhibidor de la síntesis de UDP-glucosa, por lo que se estudió la cinética de la enzima para conocer el comportamiento de este inhibidor. Los resultados obtenidos (obtenidos en presencia de concentración saturante de glucosa-1-fosfato) se presentan a continuación:

[UTP] Vo (mmol . min-1 . ml-1)

(mM) sin inhibidor con inhibidor (4 mM)

0,5 5,56 1,92

0,2 5,00 1,67

0,1 4,17 1,39

0,05 3,13 1,00

0,025 2,00 0,67

a) Calcular la VMAX y la KM de la enzima.

b) Identificar el tipo de inhibición y calcular la KI.

RESULTADO: problema 5

06.- La enzima ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa cataliza la reacción de fijación del CO2 a la ribulosa-1,5-bisfosfato. Utilizando una preparación de esta enzima purificada a partir de hojas de espinaca, se comprobó que el cianuro (a concentración 10 mM) tenía un efecto inhibidor. Los estudios cinéticos realizados con el fin de identificar el tipo de inhibición proporcionaron los siguientes resultados:

[substrato] Vo (mmol 14CO2 fixat . min-1)

(mM) sin inhibidor con inhibidor (10 mM)

8,00 7,7 5,6

2,00 5,9 4,4

1,33 4,5 3,8

0,94 3,8 3,1

0,67 3,0 2,6

0,47 2,4 2,1

a) Calcular la VMAX y la KM de la enzima.

b) Identificar el tipo de inhibición y calcular la KI.

RESULTADO: problema 6

PROBLEMAS DE BIOENERGÉTICA

01.- Calcular el valor de D G o' (pH 7,0 y 25°C) de la reacción:

glutamato + oxalacetato <------> aspartato + a-cetoglutarato (Keq' = 6,8)

02.- Calcular el valor de Keq' (pH 7,0 y 25°C) de la reacción:

lactosa + H2O ------> glucosa + galactosa (D G o' = -15,9 kJ/mol)

03.- Calcular el valor de D G o' y de Keq' de la reacción de hidrólisis del acetil-CoA:

acetil-CoA + H2O ------> acetato + HSCoA

sabiendo que: citrato ------> acetato + oxalacetato (D G o' = -2,85 kJ/mol)

acetil-CoA + oxalacetato + H2O ----> citrato + HSCoA (D G o' = 13,39 kJ/mol)

04.- ¿Cuál será la concentración de malato mínima para que la reacción:

malato ------> fumarato + H2O (D G o' = 3,14 kJ/mol)

vaya en el sentido indicado, si la concentración intracelular de fumarato es de 1 mM?

RESULTADOS: problemas 1 al 4

05.- Considerando la reacción: ATP + piruvato ------> ADP + PEP

a) Determinar D G o' y Keq' si: PEP + H2O ----> piruvato + Pi (D G o' = -61,92 kJ/mol)

b) ¿Cuál será la relación piruvato/PEP en el equilibrio si la de ATP/ADP es de 10?

06.- En una célula de levadura que respira activamente, la relación ATP/ADP es 10. ¿Cuál ha de ser la relación 3-P-glicerato/1,3-bisP-glicerato para que la reacción:

ATP + 3-P-glicerato<------> ADP + 1,3-bisP-glicerato (D G o' = 17,99 kJ/mol)

vaya en el sentido de formación de 1,3-bisP-glicerato?

RESULTADOS: problemas 5 y 6

07.- La hexoquinasa cataliza la reacción de fosforilación de la glucosa:

glucosa + ATP ------> glucosa-6-P + ADP (Keq' = 2210)

a) ¿Cuál será el sentido en que funcionará la reacción en el interior de una célula de mamífero a la que la concentración de glucosa y de glucosa-6-P son de 3,7 y 0.35 mM respectivamente, y la relación ATP/ADP es de 6?

b) ¿Qué pasaría en otra célula a la que dicha reacción fuese catalizada por la glucoquinasa? (KM (hexoquinasa) = 0,1 mM; KM (glucoquinasa) = 10 mM)

08.- La Keq' de la reacción de transfosforilación entre el ATP y el 3-P-glicerato para formar ADP y 1,3-bisP-glicerato es (a pH 7,0) de 3,1 . 10-4, mientras que la Keq' de la reacción de isomerización del 3-P-glicerato en 2-P-glicerato es de 0,24. Se pide:

a) el valor de D G°' de la reacción de formación de ADP y 1,3-bisP-glicerato a partir de ATP y 2-P-glicerato.

b) el valor mínimo de la relación ATP/ADP con el fin de mantener la reacción en equilibrio si las concentraciones de 2-P-glicerato y 1,3-bisP-glicerato son iguales.

RESULTADOS: problemas 7 y 8

09.- La concentración de ATP en tejido muscular (en el que el 70% del peso es agua) es del orden de 8 mM. Durante un ejercicio intenso se gasta ATP a una tasa de 300 mmol/min.g tejido para la contracción.

a) Puede el ATP celular proveer de energía suficiente para una carrera de 100 metros (un buen atleta la hace en alrededor de 10 segundos).

b) Lo mismo, pero teniendo en cuenta que el músculo contiene fosfocreatina (40 mM).

c) En base a todo lo anterior, ¿cómo puede un atleta correr una maratón?

10.- En una célula en condiciones anaeróbicas tiene lugar el proceso:

glucosa ------> 2 lactato (D G o' = -217,6 kJ/mol)

que permite la síntesis de 2 moléculas de ATP por glucosa. Determinar:

a) la eficiencia en condiciones estándar.

b) la eficiencia real, si les condiciones intracelulares son: [glucosa] = 4,8 mM, [lactato] = 1,1 mM, [ATP] = 3,4 mM, [ADP] = 1,3 mM, y [Pi] = 4,8 mM.

RESULTADOS: problemas 9 y 10

11.- Calcular cuantas moléculas de ATP pueden formarse al oxidarse una molécula de etanol hasta CO2 y H2O, considerando una eficiencia del 44%:

glucosa ------> 2 etanol + 2 CO2 (D G o' = -23 kJ/mol)

glucosa + 6 O2 ------> 6 CO2 + 6 H2O (D G o' = -2870 kJ/mol)

RESULTADO: problema 11

PROBLEMAS DE CADENA RESPIRATORIA

01.- Teniendo las siguientes reacciones:

A + 2e- + 2H+ ------> C (E o' = + 0,23 V)

B + 2e- + 2H+ ------> D (E o' = - 0,13 V)

E ------> F (D G o' = 52,3 kJ/mol)

Calcular el valor de Keq' de la reacció: A + D + E ------> B + C + F.

02.- Con relación a la reacción:

succinato + FAD <------> fumarato + FADH2

determinar el sentido en que funcionará dentro de una célula en la que la relación FAD/FADH2 es de 10 y la de succinato/fumarato es de 100 (los valores de E o' son de -0,22 V para la pareja FAD/FADH2 y de +0,03 V para la pareja fumarato/succinato).

RESULTADOS: problemas 1 y 2

03.- Sabiendo que en el citosol de una célula la relación NADH/NAD+ es de 0,68 . 10-3:

a) calcular la relación malato/oxalacetato mínima para que la reacción:

malato + NAD+ <------> oxalacetato + NADH

vaya en el sentido de formación de oxalacetato (los valores de E o' son de -0,19 V para la pareja oxalacetato/malato y de -0,32 V para la pareja NAD+/NADH).

b) calcular la relación lactato/piruvato máxima para que la reacción:

piruvato + NADH <------> lactat o+ NAD+

vaya en el sentido de formación de lactato (el valor de E o' es de -0,17 V para la pareja piruvato/lactato).

RESULTADO: problema 3

04.- Teniendo en cuenta que la rotenona inhibe la NADH deshidrogenasa, y que la antimicina A inhibe la oxidación del CoQH2, y asumiendo que son igualmente efectivos en sus inhibiciones, explicar por que la antimicina A es un veneno más potente que la rotenona.

05.- Explicar como se vería afectado el consumo de oxígeno y la producción de ATP de una incubación de mitocondrias funcionales, sin limitación de oxígeno, ADP ni fosfato, por la presencia de:

a) dinitrofenol (desacoplador de la cadena respiratoria)

b) oligomicina (inhibidor de la ATP sintasa)

c) rotenona (inhibidor del complejo I de la cadena respiratoria)

d) cianuro (inhibidor de la citocromo-oxidasa)

e) atractilósido (inhibidor de la translocasa ADP/ATP)

si se añade un substrato que proporcione NADH. Lo mismo, pero en el caso de un substrato que proporcione FADH2.

RESULTADOS: problemas 4 y 5