Estudio del efecto de los ?cidos grasos poliinsaturados, polifenoles e iminociclitoles sobre marcadores relacionados con el s?ndrome metab?lico Eunice Mar?a Molinar Toribio ADVERTIMENT. La consulta d?aquesta tesi queda condicionada a l?acceptaci? de les seg?ents condicions d'?s: La difusi? d?aquesta tesi per mitj? del servei TDX (www.tdx.cat) i a trav?s del Dip?sit Digital de la UB (diposit.ub.edu) ha estat autoritzada pels titulars dels drets de propietat intel?lectual ?nicament per a usos privats emmarcats en activitats d?investigaci? i doc?ncia. No s?autoritza la seva reproducci? amb finalitats de lucre ni la seva difusi? i posada a disposici? des d?un lloc ali? al servei TDX ni al Dip?sit Digital de la UB. No s?autoritza la presentaci? del seu contingut en una finestra o marc ali? a TDX o al Dip?sit Digital de la UB (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant al resum de presentaci? de la tesi com als seus continguts. En la utilitzaci? o cita de parts de la tesi ?s obligat indicar el nom de la persona autora. ADVERTENCIA. La consulta de esta tesis queda condicionada a la aceptaci?n de las siguientes condiciones de uso: La difusi?n de esta tesis por medio del servicio TDR (www.tdx.cat) y a trav?s del Repositorio Digital de la UB (diposit.ub.edu) ha sido autorizada por los titulares de los derechos de propiedad intelectual ?nicamente para usos privados enmarcados en actividades de investigaci?n y docencia. No se autoriza su reproducci?n con finalidades de lucro ni su difusi?n y puesta a disposici?n desde un sitio ajeno al servicio TDR o al Repositorio Digital de la UB. No se autoriza la presentaci?n de su contenido en una ventana o marco ajeno a TDR o al Repositorio Digital de la UB (framing). Esta reserva de derechos afecta tanto al resumen de presentaci?n de la tesis como a sus contenidos. En la utilizaci?n o cita de partes de la tesis es obligado indicar el nombre de la persona autora. WARNING. 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Instituto de Qu?mica Avanzada de Catalu?a (IQAC) Consejo Superior de Investigaciones Cient?ficas (CSIC) Facultad de Farmacia, Universidad de Barcelona, Departamento de Bioqu?mica y Biolog?a Molecular, Programa de Biotecnolog?a Estudio del efecto de los ?cidos grasos poliinsaturados, polifenoles e iminociclitoles sobre marcadores relacionados con el s?ndrome metab?lico Eunice Mar?a Molinar Toribio 2015 ii iii UNIVERSIDAD DE BARCELONA FACULTAD DE FARMACIA Departamento de Bioqu?mica y Biolog?a Molecular Programa de doctorado en Biotecnolog?a Estudio del efecto de los ?cidos grasos poliinsaturados, polifenoles e iminociclitoles sobre marcadores relacionados con el s?ndrome metab?lico Memoria presentada por Eunice Mar?a Molinar Toribio para optar al T?tulo de Doctor por la Universidad de Barcelona Dirigida por: Tutora: Dr. Josep Llu?s Torres Sim?n Dra. Josefa Bad?a Palac?n Doctoranda: Eunice Mar?a Molinar Toribio iv v A mi familia, y a todas aquellas personas que creyeron en m?? vi vii AGRADECIMIENTOS El primer lugar, agradecer a m? directo de tesis Josep Llu?s Torres Sim?n. Antes que nada por la confianza depositada en mi persona y por permitirme formar parte de su grupo. Gracias por su gran disponibilidad, su asesoramiento y consejos en todo el proceso de investigaci?n y por sus atinadas correcciones y sugerencias en la elaboraci?n de la tesis. En segundo lugar, a la Secretaria Nacional de Ciencia, Tecnolog?a e Innovaci?n (SENACYT) y al Instituto para la Formaci?n y Aprovechamiento de Recursos Humanos (IFARHU). Este agradecimiento debo personificarlo en el Dr. Rub?n Berrocal y la Mgter. Sonia de Luzcando, respectivamente, por haberme otorgado una Beca de Excelencia del Programa Nacional de Formaci?n de Investigadores para Estudios Doctorales y Pos-doctorales 2009, de la Rep?blica de Panam?. En tercer lugar, al Plan Nacional de I+D+I 2008-2012 del Ministerio de Ciencia e Innovaci?n, por financiar el trabajo de investigaci?n gracias a la ayuda para Proyectos de Investigaci?n Fundamental no orientada AGL2009-12374-C03- 03. A los grupos con los que hemos colaborado durante la parte experimental de este trabajo: Al grupo de la Universidad de Barcelona a la Dra. Marta Cascante y a An?bal; al grupo del Instituto de Investigaciones Marinas del CSIC (IIM-CSIC) en Vigo, a la Dra. Isabel Medina, al Dr. Manuel y a Luc?a, y al grupo de la Facultad de Medicina de la Universidad Rovira i Virgili en Reus, a la Dra. Rosa Nogu?s, a la Dra. Montserrat Giralt, a la Dra. Marta Romeu, a M?nica, a N?ria, a Laura y a Vanesa. Gracias por todos los conocimientos transmitidos y los momentos tan entretenidos que hemos pasado. A mis compa?eros de grupo, que estuvieron durante esta experiencia, a los que a?n est?n y a los que se han ido. Gracias por ofrecerme generosamente su calidez humana, sus conocimientos y experiencias. En especial a la Dra. Susana Am?zqueta por hacerme sentir como en casa. Un agradecimiento especial a la Dra. Jara P?rez, la Dra. Elizabet Fuguet, a la Dra. Olga J?uregui y a Dra. Sara Ramos con las cuales compart? parte experimental de esta tesis, gracias por los conocimientos transmitidos. Al servicio de estabulaci?n de animales del CSIC, en especial a Eva Prats a Juan Manuel Rodr?guez y a Alejandro Padilla por su amistad, conocimiento, apoyo y colaboraci?n en todo momento de la investigaci?n. viii Al servicio de inform?tica del CSIC, en especial a Ra?l y a Sergi por auxiliarme en los retos inform?ticos que se me presentaron a lo largo de la parte experimental de la tesis. Al Dr. Jes?s Joglar Tamargo del Departamento de Qu?mica Biol?gica y Modelizaci?n Molecular del Instituto de Qu?mica Avanzada de Catalu?a del CSIC por sus conocimientos en qu?mica, por escuchar mis inquietudes e ideas, por su disposici?n a ayudar y colaborar en todo momento. A la Unidad de Espectrometr?a de masas, Servicio Cient?fico-T?cnico de la Universidad de Barcelona, en especial al Dr. Isidre Casals, al Dr. Alberto Adeva y a David por la amistad, paciencia y conocimiento que me brindaron durante mis largas visitas all?. A todos mis verdaderos amigos, cercanos y lejanos, por haberme soportado con paciencia, haberme animado e impulsado en todo momento. Por ?ltimo, y no por ello menos importante a mis padres, mis hermanas, hermanos, a mis sobrinos y sobrina, por la comprensi?n de mi distancia y el amor que siempre me han brindado y que me ha acompa?ado en esta etapa de mi vida. En especial quiero agradecer a mi hermana Ren? quien ha sido mi representante legal, por atender con responsabilidad todos mis compromisos legales en Panam?. A m? querida cu?ada Gina por el cari?o y amistad. A mi esposo por acompa?arme en esta aventura. A todos, mil gracias? ix RESUMEN La prevalencia del denominado S?ndrome Metab?lico (SM) est? aumentando r?pidamente en todo el mundo a tal punto que se est? convirtiendo en un problema de salud global. Se conoce como SM a un conjunto de factores de riesgo para la salud, que incluyen la obesidad (obesidad central), resistencia a la insulina (RI), dislipidemia, h?gado graso no alcoh?lico y la hipertensi?n. Estas alteraciones se han relacionado con un alto riesgo de desarrollar diabetes tipo 2 (DM2) y enfermedades cardiovasculares (ECV). Todo esto ha estimulado el estudio de sus causas y la b?squeda de estrategias preventivas. Los roedores se han utilizado como modelos de enfermedades humanas, para mejorar la comprensi?n de las causas, la progresi?n de los s?ntomas y para poner a prueba nuevas intervenciones terap?uticas o preventivas. En el caso de estudios relacionados con el SM tres modelos son los de mayor uso, modelos gen?ticos, diet?ticos y farmacol?gicos. En esta memoria nos hemos centrado en los dos primeros, el gen?tico y el diet?tico. El modelo gen?tico empleado, consisti? en ratas obesas espont?neamente hipertensas (SHROB) ratas Koletsky. Las ratas SHROB presentan una mutaci?n (fak/fak) sin sentido del gen para el receptor de la leptina, que es una hormona producida principalmente en el tejido adiposo cuya funci?n principal es de se?alizaci?n al sistema nervioso central (SNC) para conservar el balance energ?tico y el peso corporal estable. En las ratas SHROB esta se?alizaci?n est? truncada porque el receptor es inactivo, el animal no regula la ingesta y la acumula en forma de l?pidos. El modelo diet?tico empleado consisti? en ratas hembras Wistar Kyoto (WKY) sanas y ratas machos Sprague-Dawley (SD) sanos a los que les suministr? una dieta alta en grasa y alta en sacarosa (HFHS) que mimetiza h?bitos diet?ticos humanos que se reconocen como inadecuados (alto consumo de grasas y az?car refinado). Desde hace d?cadas ciertos compuestos naturales como los ?cidos grasos poliinsaturados (AGPIs) polifenoles, y m?s recientemente iminociclitoles, han sido propuestos como agentes preventivos de algunos de los factores del SM. La tesis se propon?a evaluar el efecto de diferentes mezclas de AGPIs, el posible efecto colaborativo o sin?rgico entre AGPIs y polifenoles y explorar un iminociclitol presente en la dieta (D-fagomina) como nuevo agente preventivo. En el modelo gen?ticamente modificado (ratas SHROB) la suplementaci?n con mezclas de AGPIs EPA/DHA a distintas proporciones contrarrest? las alteraciones del perfil lip?dico; disminuy? los niveles de triglic?ridos (TG) x plasm?ticos, colesterol total, l?pidos totales; aument? la cantidad de AGPIs n-3 en plasma y en la membrana de los eritrocitos; y disminuy? la cantidad de AGs n-6 en los eritrocitos. Mezclas de EPA/DHA en las proporciones 1:1 y 2:1 disminuyeron significativamente la inflamaci?n (nivel de PCR) y aument? significativamente la cantidad de ?cidos grasos monoinsaturados (AGMIs) y AGPIs en plasma. Las suplementaciones redujeron el nivel de isoprostanos en orina (principalmente la mezcla EPA/DHA, 1:2), y aumentaron las actividades de las enzimas antioxidantes como la SOD en los eritrocitos, h?gado, grasa abdominal, ri??n, coraz?n y cerebro (especialmente EPA/DHA, 1:1); SOD, CAT, GR, GPx en los ri?ones (EPA/DHA, 2:1). La concentraci?n de LDL-ox aument? en todos los casos. Estos resultados son compatibles con la estimulaci?n de las defensas antioxidantes por las mezclas de EPA/DHA que inducen la reducci?n del estr?s oxidativo (EO) junto con una disminuci?n de los factores de riesgo de ECV (LDL-c y la inflamaci?n). En conjunto, nuestros resultados indican que EPA es especialmente relevante para la disminuci?n de la hiperlipidemia y la inflamaci?n as? como en la activaci?n de los sistemas antioxidantes end?genos mientras que DHA es m?s eficaz en la reducci?n de los isoprostanos. En el modelo de SM inducido por dieta HFHS se observaron cambios en el peso corporal, perfil lip?dico, insulina y EO. La suplementaci?n conjunta de EPA/DHA (1:1) y extracto polifen?lico de semillas de uva (GSE) produjo un efecto colaborativo protector frente al SM: reducci?n del incremento de peso corporal, la acumulaci?n de grasa abdominal, TG, colesterol total e insulina. Adem?s, la administraci?n conjunta de EPA/DHA (1:1) y GSE aument? significativamente la excreci?n de metabolitos conjugados de EC y EGC, y de sus metabolitos microbianos. Los resultados sugieren que EPA y DHA aumentaron la cantidad de polifenoles disponibles porque contribuyen a la reducci?n del EO. La tesis examina por primera vez, la posible acci?n preventiva del iminociclitol D-fagomina sobre la adiposidad, la dislipidemia; la homeostasis de la glucosa, la RI, el EO y la inflamaci?n en el modelo de SM inducido por dieta (HFHS). Por la poca informaci?n con que se dispon?a fue necesario realizar estudios in vitro para explorar sus mecanismos de acci?n y postprandiales in vivo para establecer la dosis efectiva. D-Fagomina redujo la concentraci?n de glucosa plasm?tica tras la ingesta de sacarosa y almid?n de forma dosis dependiente. Adem?s, se describe una nueva actividad de este iminociclitol: la inhibici?n selectiva de la adhesi?n bacteriana a la mucosa intestinal, lo cual abre la puerta a nuevas aplicaciones de la mol?cula y a la explicaci?n de su actividad in vivo. El modelo de SM inducido por dieta HFHS y suplementado con D-fagomina redujo la xi ganancia de peso corporal, mejor? el perfil lip?dico, atenu? los efectos de la dieta HFHS sobre el EO y los niveles de glucosa grelina, leptina, glucag?n e insulina. En esta tesis se han evaluado distintos modelos animales de SM y se han examinado los efectos de AGPIs, polifenoles y el iminociclitol D-fagomina. Los resultados muestran que diferentes suplementos nutricionales pueden ejercer efectos diferentes sobre factores del SM y que sus acciones pueden ser complementarias, como se ha visto con los AGPIs y los polifenoles de semilla de uva. La tesis abre adem?s el camino para la utilizaci?n de D-fagomina como un agente complementario a otros suplementos disponibles para el consumidor. En el futuro, nuevos estudios sobre efectos colaborativos como los descritos aqu? podr?an ofrecer nuevas opciones nutricionales para la prevenci?n de trastornos metab?licos relacionados con la dieta. xii xiii ?NDICE 1. INTRODUCCI?N 1 1.1. OBESIDAD: CONSIDERACIONES GENERALES 3 1.2. S?NDROME M?TABOLICO (SM) 5 1.2.1. Fisiopatolog?a del SM 8 1.2.2. Tratamiento del SM 11 1.2.3. Modelos animales de SM 15 1.3. ?CIDOS GRASOS POLIINSATURADOS 19 1.3.1. Definici?n, localizaci?n y bios?ntesis 19 1.3.2. Propiedades biol?gicas 27 1.3.3. Aplicaciones preventivas y modo de acci?n 29 1.4. POLIFENOLES 31 1.4.1. Definici?n, biodisponibilidad y metabolizaci?n 31 1.4.2. Propiedades biol?gicas 38 1.4.3. Aplicaciones preventivas y modo de acci?n 41 1.5. IMINOCICLITOLES 44 1.5.1. Definici?n y antecedentes hist?ricos 44 1.5.2. Propiedades biol?gicas 45 1.5.3. Aplicaciones preventivas y modo de acci?n 47 2. OBJETIVOS 51 3. RESULTADOS Y DISCUSI?N 55 3.1. ESTUDIO 1. Efecto de ?cidos grasos poliinsaturados (AGPIs) en un modelo animal de SM modificado gen?ticamente 57 3.1.1. Evaluaci?n de la cepa de ratas espont?neamente hipertensas y obesas (SHROB) como modelo de SM modificado gen?ticamente 57 3.1.2. Par?metros relacionados con el SM en ratas Wistar Kyoto (WKY) suplementadas con EPA/DHA a distintas proporciones 67 3.1.3. Par?metros relacionados con el SM en ratas SHROB suplementadas con EPA/DHA a distintas proporciones 79 3.1.4. Discusi?n de los resultados del estudio 1 92 3.2. ESTUDIO 2. Efecto de la combinaci?n de AGPIs y polifenoles de un extracto de semilla de uva (GSE)en un modelo animal xiv de SM inducido por la dieta 100 3.2.1. Evaluaci?n de la cepa de rata WKY como modelo de SM inducido por una dieta rica en grasas y sacarosa (HFHS) 100 3.2.2. Par?metros relacionados con el SM en ratas WKY alimentadas con una dieta STD suplementada con EPA/DHA (1:1) y/o polifenoles de semilla de uva 106 3.2.3. Par?metros relacionados con el SM en ratas WKY alimentadas con una dieta HFHS suplementada con EPA/DHA (1:1) y/o polifenoles de semilla de uva 112 3.2.4. Metabolizaci?n, bioaccesibilidad y biodisponibilidad de polifenoles de semilla de uva 119 3.2.5. Discusi?n de los resultados del estudio 2 139 3.3. ESTUDIO 3. Efectos a corto plazo de D-fagomina y determinaci?n de dosis efectiva 147 3.3.1. Efecto de D-fagomina sobre la glucosa postprandial in vivo 147 3.3.2. Actividad inhibitoria de D-fagomina sobre disacaridasas intestinales in vitro 149 3.3.3. Actividad aglutinante y antiadhesiva de D-fagomina en bacterias fimbriadas 150 3.3.4. Discusi?n de los resultados del estudio 3 152 3.4. ESTUDIO 4. Efecto de D-fagomina en el modelo de SM inducido por una dieta HFHS 156 3.4.1. Evaluaci?n de la cepa de rata Sprague-Dawley (SD) como modelo animal de SM inducido por una dieta HFHS 156 3.4.2 Par?metros relacionados con el SM en ratas SD alimentadas con una dieta HFHS y suplementadas con D-fagomina 159 3.4.3. Discusi?n de los resultados del estudio 4 163 4. CONCLUSIONES 167 5. SECCI?N EXPERIMENTAL 171 5.1. EQUIPOS, REACTIVOS Y M?TODOS GENERALES 173 5.1.1. Equipos 173 5.1.2. Reactivos 178 5.1.3. M?todos 179 5.1.3.1. Manipulaci?n, estabulaci?n y sacrificio de los animales 179 xv 5.1.3.2. Obtenci?n, procesamiento y conservaci?n de las muestras durante los estudios 180 5.1.3.3. Obtenci?n, procesamiento y conservaci?n de las muestras al final de los estudios (sacrificio) 181 5.1.3.4. Determinaciones 182 5.1.3.4.1. Peso corporal 182 5.1.3.4.2. Presi?n sist?lica (PS) y presi?n diast?lica (PD) 182 5.1.3.4.3. ?cido ?rico 183 5.1.3.4.4. Perfil lip?dico de ?cidos grasos (AGs) en plasma y en la membrana de los eritrocitos por cromatograf?a de gases (CG) 184 5.1.3.4.5. Ratios de actividad de las enzimas esteroil- CoAdesaturasa-1 (SCD-1), esteroil- CoAdesaturasa-2 (SCD-2), delta cinco desaturasa(?5) y delta seis desaturasa (?6) 185 5.1.3.4.6. Triglic?ridos (TG) 186 5.1.3.4.7. Colesterol total 187 5.1.3.4.8. Colesterol de lipoprote?nas de baja densidad (LDL-c) 187 5.1.3.4.9. Lipoprote?nas de baja densidad oxidada (LDL-ox) 188 5.1.3.4.10. Colesterol de lipoprote?nas de alta densidad (HDLc) 189 5.1.3.4.11. Hemoglobina glicosilada (HbA1c) 190 5.1.3.4.12. Prote?na C reactiva (PCR), mol?cula de adhesi?n celular vascular-1 (VCAM-1) mol?cula de adhesi?n intracelular (ICAM-1) e inhibidor del activador del plasmin?geno-1 (PAI-1) 190 5.1.3.4.13. Insulina por ELISA 192 5.1.3.4.14. Glucag?n, p?ptido C, leptina y grelina por MilliPlex 193 5.1.3.4.15. Glucosa plasm?tica 194 5.1.3.4.16. Prueba de tolerancia a la glucosa 194 5.1.3.4.17. Creatinina 194 xvi 5.1.3.4.18. Isoprostanos por cromatograf?a de gases con ionizaci?n qu?mica negativa acoplado a espectrometr?a de masas (GC?NCI?MS) 195 5.1.3.4.19. Isoprostanos por cromatograf?a l?quida de alta eficiencia acoplada a espectrometr?a de masas en t?ndem con ionizaci?n por electroespray (HPLC?ESI?MS/MS) 198 5.1.3.4.20. Biodisponibilidad de polifenoles por HPLC?ESI?MS/MS 204 5.1.3.4.21. Evaluaci?n del sistema antioxidante end?geno en diferentes tejidos y ?rganos 208 5.1.3.5. Tratamiento estad?stico de los datos 211 5.2. ESTUDIO 1 213 5.2.1. Equipos y reactivos 213 5.2.2. M?todos 213 5.2.2.1. Animales y suplementaci?n 213 5.3. ESTUDIO 2 216 5.3.1. Equipos y reactivos 216 5.3.2. M?todos 216 5.3.2.1. Animales y suplementaci?n 216 5.4. ESTUDIO 3 222 5.4.1. Equipos y reactivos 222 5.4.2. M?todos 222 5.4.2.1. Animales y tratamiento 222 5.4.2.2. Administraci?n de sacarosa/almid?n mediante sonda g?strica 222 5.4.2.3. Determinaci?n de la actividad de la sacarosa en homogenizados y sacos de intestino al rev?s 222 5.4.2.4. Aglutinaci?n bacteriana 224 5.4.2.5. Evaluaci?n de la adhesi?n bacteriana a la mucosa Intestinal 225 5.4.2.6. Estad?stica del estudio 3 225 5.5. ESTUDIO 4 226 5.5.1. Equipos y reactivos 226 5.5.2. M?todos 226 5.5.2.1. Animales y suplementaci?n 226 xvii 6. REFERENCIAS 229 7. ANEXOS 253 7.1. APORTACIONES CIENT?FICAS DERIVADAS DE ESTA TESIS 255 7.1.1. Publicaciones cient?ficas 255 7.1.2. Asistencia a congresos 297 7.1.3. Publicaciones complementarias 298 7.2. EVALUACI?N DEL EFECTO MATRIZ (EM), RECUPERACI?N (RE) Y EFICIENCIA DEL PROCESO (EP) DE HPLC?ESI?MS/MS PARA LA DETERMINACI?N DE ISOPROSTANOS EN ORINA 333 7.3. CURVAS DE LOS PATRONES DEL ESTUDIO DE BIODISPONIBILIDAD DE POLIFENOLES EN ORINA Y HECES 338 7.4. ESPECTROS DE MASAS DE PATRONES DEL ESTUDIO DE BIODISPONIBILIDAD DE POLIFENOLES EN ORINA Y HECES 344 7.5. IDENTIFICACI?N DE LOS METABOLITOS DE POLIFENOLES DE SEMILLA DE UVA EXCRETADOS EN ORINA Y HECES 349 7.6. MATERIAL SUPLEMENTARIO DEL ART?CULO: Cardiovascular disease-related parameters and oxidative stress in SHROB rats, a model for metabolic syndrome 377 7.7. MATERIAL SUPLEMENTARIO DEL ART?CULO: Effect of omega-3 PUFA supplementation at different EPA/DHA ratios on Spontaneously Hypertensive Obese Rat (SHROB) model of metabolic syndrome 381 7.8. MATERIAL SUPLEMENTARIO DEL ART?CULO: D-Fagomine lowers postprandial blood glucose and modulates bacterial adhesion 386 xviii ABREVIATURA AA: ?cido araquid?nico AACE: Asociaci?n Americana de Endocrin?logos Cl?nicos (del ingl?s, American Association of Clinical Endocrinology) ACN: acetonitrilo AcOEt: Acetato de etilo AF: ?cido f?rmico AGLs: ?cidos grasos libres AGMIs: ?cidos grasos monoinsaturados AGPIs: ?cidos grasos poliinsaturados AGPIs n-3: ?cidos grasos poliinsaturados omega-3 AGs n-3: ?cidos grasos omega-3 AGs n-6: ?cidos grasos omega-6 AGs: ?cidos grasos AGSs: ?cidos grasos saturados AHA: Asociaci?n Americana del Coraz?n (del ingl?s, American Heart Association) ALA: ?-linol?nico AMPA: ?cido ?-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropi?nico ANOVA: An?lisis de la varianza Apo A-I: Apoliprote?na A-I Apo A-II: Apoliprote?na A-II Apo B-100: Apolipoprote?na B-100 Apo C-III: Apoliprote?na C-III ARA II: Antagonista de receptores de la angiotensina II ATP III: III Panel de Tratamiento del Adulto (del ingl?s, Adult Treatment Panel III) AUC: ?rea bajo la curva (del ingl?s, area under the curve) BSTFA: N,O-bis-(trimetilsilil)-trifluoro-acetamida CAT: Catalasa CD36: Receptores scavenger clase B CE: Energ?a de colisi?n (del ingl?s, collision energy) CG: Carga gluc?mica CHE: Colesterol esterasa CHOD: Colesterol oxidasa ChREBP: Prote?na de uni?n al elemento de respuesta a hidratos de carbono (del ingl?s, carbohydrate-responsive element-binding protein) COMT: Catecol-O-metil-transferasa COX: Ciclooxigenasa CXP: Potencial de salida de la celda de colisi?n (del ingl?s, collision cell exit potential) Da: Dalton DAB: 1,4-dideoxi-1,4-imino-D-arabinitol DAP: Dihidroxiacetona fosfato DHA: ?cido docosahexaenoico DHA: ?cido docsahexaenoico xix DHGLA: ?cido dihomo-?-linol?nico DHGLA: ?cido docosatetraenoico DHGLA: Dihomo-?-linol?nico DIPE: N,N-diisopropiletilamina DM2: Diabetes Mellitus tipo 2 DNJ: 1-Deoxinojirimicina DP: Potencial de desagrupaci?n (del ingl?s, declustering potential) DPA: ?cido docosapentaenoico DS: Desviaci?n est?ndar EC: Epicatequina ECTP: Prote?nas de transferencia de ?steres de colesterol ECV: Enfermedades cardiovasculares EDTA: ?cido etilendiaminotetraac?tico EFSA: Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria EGC: Epigalocatequina EGIR: Grupo Europeo para el Estudio de la Resistencia a la Inulina (del ingl?s, European Group for the study of Insulin Resistance) EMAG: ?steres met?licos de ?cidos grasos EO: Estr?s oxidativo EP: Potencial de entrada (del ingl?s, entrance potential) EPA: ?cido eicosapentaenoico ERN: Especies reactivas de nitr?geno ERO: Especies reactivas de ox?geno ESI: Ionizaci?n electroespray (del ingl?s, electrospray ionization) ESM: Error est?ndar de la media FAF: Cofactor 3?-fosfoadenosil-5?-fosfosulfato FAO: Organizaci?n de las Naciones Unidas para la Alimentaci?n y la Agricultura (del ingl?s, Food and Agriculture Organization of the United Nations) FP: Potencial de enfoque (del ingl?s, focusing potential) FST: Fenol sulfotransferasa G3P: Glicerol-3-fosfato GABA: ?cido ?-aminobut?rico GC: Cromatograf?a de gases (del ingl?s, gas chromatography) GC?NCI?MS: Cromatograf?a de gases con ionizaci?n qu?mica negativa acoplado a espectrometr?a de masas (del ingl?s, gas chromatography?negative ion chemical ionization?mass spectrometry) GK: Glicerol quinasa GLA: ?cido ?-linol?nico GLUT: Transportadores de glucosa GLUT-2: Transportador de glucosa-2 GLUT-4: Transportador de glucosa-4 GLUT-5: Transportador de fructosa-5 GPO: Glicerolfosfato deshidrogenasa Gpx: Glutati?n peroxidasa xx GR: Glutati?n reductasa GSE: Extracto de semilla de uva (del ingl?s, grape seed extract) GSH: Glutati?n reducido GSSG: Glutati?n oxidado HbA1c: Hemoglobina glicosilada HDL-c: Colesterol de lipoprote?nas de alta densidad (del ingl?s, high density lipoprotein) HETE: ?cidos hidroxieicosatetraenoico HFHS: Alta en grasa y alta en sacarosa (del ingl?s, high-fat high-sucrose) HPETE: ?cidos hidroperoxitetraenoicos HPLC: Cromatograf?a l?quida de alta eficacia (del ingl?s, high-performance liquid chromatography) HPLC?ESI?MS/MS: Cromatograf?a l?quida de alta eficiencia acoplada a espectrometr?a de masas en t?ndem con ionizaci?n por electroespray (del ingl?s, high-performance liquid chromatography? electrospray ionization?tandem mass spectrometry) ICAM-1: Mol?cula de adhesi?n intracelular-1 (del ingl?s, intercellular adhesion molecule- 1) IDF: Federaci?n Internacional de Diabetes (del ingl?s, International Diabetes Federation) IG: ?ndice gluc?mico IL: Interluquina IMC: ?ndice de masa corporal IRS-1: Sustrato receptor de insulina-1 (del ingl?s, insulin receptor substrate-1) IRS-2: Sustrato receptor de insulina-2 (del ingl?s, insulin receptor substrate 2) IS: Patr?n interno (del ingl?s, internal standard) LA: ?cido linoleico LB: Luria Bertani LC: L?mite de cuantificaci?n LD: L?mite de detecci?n LDL-c: Colesterol de lipoprote?nas de baja densidad (del ingl?s, low density lipoprotein cholesterol) LDL-ox: Lipoprote?nas de baja densidad oxidada (del ingl?s, oxidized low density lipoprotein cholesterol) LOX: Lipooxigenasa LPL: Lipasa lipoproteica LPS: Polisac?ridos LT: Leucotrienos LX: Lipoxinas MCP-1: Prote?na quimiot?ctica de los monocitos-1 (del ingl?s, monocyte chemoattractant protein-1) MDA: Malondialdehido MLX: Max-like factor X MRM: Monitorizaci?n de reacciones m?ltiples (del ingl?s, multiple reaction monitoring) MS/MS: Masa en t?ndem MS: Espectrometr?a de masas (del ingl?s, mass spectrometry) NADPH: ?-nicotinamida adenina dinucle?tido 2?-fosfato reducido xxi NCEP: Programa nacional de educaci?n en colesterol (del ingl?s, National Cholesterol Education Program) NCEP-ATP III: Tratamiento del adulto del programa nacional de educaci?n en colesterol (del ingl?s, National Cholesterol Education Program-Adult Treatment Panel III, or ATP III) NCI: Ionizaci?n qu?mica negativa (del ingl?s, negative ion chemical ionization) NEM: N-etilmaleimida NF-?B: Factor nuclear-?B (del ingl?s, nuclear factor kappa-B) NHLBI: Instituto Nacional de Coraz?n, Pulm?n y Sangre (del ingl?s, National Heart, Lung, and Blood Institute) NJ: Nojirimicina NK: asesina natural (del ingl?s, natural killer) O2.-: Ani?n super?xido OMS: Organizaci?n Mundial de la Salud OPT: O-ftalaldeh?do PA: Presi?n arterial PAI-1: Inhibidor del activador del plasmin?geno-1(del ingl?s, plasminogen activator inhibitor-1) PBS: Tamp?n fosfato salino PCR: Prote?na C reactiva PD: Presi?n diast?lica PFBB: Bromuro de pentafluorobencilo (del ingl?s, pentafluorobenzyl bromide) PG: Prostaglandinas PGI: Prostaciclinas PGN: Peptidoglicano PIS: Escaneo del ion precursor (del ingl?s, precursor ion scan) PMAPs: Patrones moleculares asociados a pat?genos (del ingl?s, pathogen-associated molecular patterns) POD: Peroxidasa PPAR-?: Receptores ? activados de proliferaci?n de los peroxisomas (del ingl?s, peroxisome proliferator-activated receptor-gamma) PPAR-?: Receptores ? activados de proliferaci?n de los peroxisomas (del ingl?s, peroxisome proliferator-activated receptor-alpha) PS: Presi?n sist?lica PTFE: Politetrafluoroetileno QC: Controles de calidad (del ingl?s, quality controls) QqQ: Triple cuadrupolo RCV: Riesgo cardiovascular RI: Resistencia a la insulina S/N: Se?al/ruido (del, ingl?s, signal to noise ratio) SAM: S-adenosil metionina SCD-1: Esteroil-CoA desaturasa-1(del ingl?s, stearoyl-CoA desaturase-1) SCD-2: Esteroil-CoA desaturasa-2 (del ingl?s, stearoyl-CoA desaturase-2) SD: Sprague-Dawley xxii SDA: ?cido estearid?nico (del ingl?s, stearidonic acid) SHR: Rata espont?neamente hipertensa (del ingl?s, spontaneously hypertensive rat) SHROB: Ratas espont?neamente hipertensas y obesas (del ingl?s, spontaneously hypertensive obese rat) SHRSP: Ratas propensas a accidentes cerebrovasculares espont?neamente hipertensas (del ingl?s, stroke-prone spontaneously hypertensive rat) SM: S?ndrome metab?lico SNA: Sistema nervioso aut?nomo SNC: Sistema nervioso central SOD: Super?xido dismutasa (del ingl?s, superoxide dismutase) SPE: Extracci?n en fase s?lida (del ingl?s, solid phase extraction) SREBP-1: Prote?na de uni?n al elemento de respuesta a esteroles (del ingl?s, sterol regulatory element-binding protein-1) STD: Dieta est?ndar (del ingl?s, standard diet) t-BuOOH: Tert-butil hidroperoxido TCA: Tricloroac?tico TG: Triglic?ridos TLC: Cromatograf?a de capa fina (del ingl?s, thin-layer chromatography) TMB: 3`3`5`5`-tetrametilbenzidina TMCS: Trimetil-clorosilano TNF-?: Factor de necrosis tumoral alfa (del ingl?s, tumor necrosis factor alpha) TX: Tromboxanos UFC: Unidades formadoras de colonias UGT: Uridina glucuroniltransferasas UV: Ultra violeta VCAM-1: Mol?cula de adhesi?n celular vascular-1 (del ingl?s, vascular cell adhesion molecule-1) VHB: Virus de la hepatitis B VIH: Virus de inmunodeficiencia humana VLDL: Lipoprote?nas de muy baja densidad (del ingl?s, very-low-density lipoprotein) WKY: Wistar Kyoto ?5: Delta cinco desaturasa ?6: Delta seis desaturasa 4-AF: 4-aminofenazona 1 1. INTRODUCCI?N 2 3 1.1. OBESIDAD: CONSIDERACIONES GENERALES La Organizaci?n Mundial de la Salud (OMS) ha declarado epidemia mundial la propagaci?n de la obesidad. De hecho, un nuevo t?rmino ?globesity?, se ha acu?ado para describir el reciente aumento de sobrepeso y obesidad en toda la poblaci?n mundial. La obesidad es una enfermedad cr?nica compleja y multifactorial que implica factores medio ambientales (sociales y culturales), gen?ticos, fisiol?gicos, metab?licos, conductuales y componentes psicol?gicos, que resulta en la acumulaci?n excesiva de grasa corporal en diferentes partes del cuerpo (Figura 1), con una prevalencia que se incrementa d?a a d?a, acarreando graves consecuencias sobre la salud.[1-4] Figura 1. Dep?sitos de tejido adiposo en un individuo obeso. El tejido adiposo se encuentra mayormente subcut?neo y visceral. En condiciones de obesidad, el tejido adiposo se extiende a otras partes del cuerpo y se deposita all?. Los sitios comunes de acumulaci?n del tejido adiposo incluyen el coraz?n, los pulmones, los ri?ones, m?dula ?sea, la adventicia de los vasos sangu?neos, entre otros. Estos dep?sitos de grasa pueden afectar el funcionamiento de ?rganos y el metabolismo sist?mico del individuo.[5] Pero, ?Qu? tan grave es el problema? De acuerdo con OMS, la obesidad en todo el mundo se ha m?s que duplicado desde 1980. En 2008, 1.5 billones de adultos, mayores de 20 a?os, ten?an sobrepeso.[6] Adem?s de que casi 43 millones de ni?os menores de 5 a?os ten?an sobre peso en 2010.[4, 6, 7] En la poblaci?n estadounidense la prevalencia de la obesidad se estima en un 36% (>78 millones de personas),[8] con una situaci?n de alarma derivada de la Tejido adiposo epic?rdico Tejido adiposo subcut?neo Tejido adiposo visceral Tejido adiposo pulmonar Tejido adiposo periadventicial Tejido adiposo perirrenal Tejido adiposo m?dula ?sea 4 asociaci?n de la obesidad en un gran n?mero de comorbosidades: Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2) y aumento del riesgo cardiovascular (RCV).[3, 9, 10] Seg?n la plataforma Europea de Acci?n sobre Alimentaci?n, Actividad F?sica y Salud de la Uni?n Europea, el n?mero de ni?os obesos en la Uni?n Europea aumenta a un ritmo de 400,000 al a?o. Este aumento excesivo de la prevalencia de sobrepeso y obesidad tambi?n se ha observado en la poblaci?n espa?ola adolecente.[11-13] Es importante destacar que la obesidad en la adolescencia constituye un antecedente metab?lico para el desarrollo de enfermedades cardiovasculares (ECV) y DM2. Teniendo en cuenta que los adolescentes obesos tienen una alta probabilidad de convertirse en adultos obesos, esta situaci?n mantenida en el tiempo, as? como las comorbosidades asociadas, suponen en conjunto un gran problema sanitario y social. La necesidad de disponer de medidas de f?cil aplicabilidad y reproducibilidad, que a su vez permitan establecer comparaciones poblacionales, llev? a decidir la aceptaci?n como criterio diagn?stico el c?lculo del ?ndice de masa corporal (IMC), que relaciona la proporci?n de peso (en kilogramos) y la talla corporal (en metros elevados al cuadrado). La OMS ha propuesto una clasificaci?n del grado de obesidad utilizando el IMC como criterio: Peso normal: IMC 18.5-24.9 kg/m2 Sobrepeso: IMC 25.0-29.9 kg/m2 Obesidad grado I con IMC 30.0-34.9 kg/m2 Obesidad grado II con IMC 35.0-39.9 kg/m2 Obesidad grado III (m?rbida) con IMC ? 40 kg/m2 Por otra parte, la medida del IMC no guarda una relaci?n exacta con el patr?n de distribuci?n de la grasa corporal a nivel individual que determine el riesgo asociado a la obesidad. La distribuci?n de la grasa corporal permite distinguir con frecuencia tres tipos de obesidad (Figura 2).[14] ? Obesidad androide o central o abdominal (en forma de manzana). El exceso de grasa se localiza preferentemente en la cara, el t?rax y el abdomen. Se asocia a un mayor riesgo de dislipemia, diabetes, enfermedad cardiovascular y de mortalidad en general. ? Obesidad ginoide o perif?rica (en forma de pera). La grasa se acumula b?sicamente en la cadera y en los muslos. Este tipo de distribuci?n se relaciona principalmente con problemas de retorno venoso en las extremidades inferiores (varices) y con artrosis de rodilla (genoartrosis). ? Obesidad de distribuci?n homog?nea. Es aquella en la que el exceso de grasa no predomina en ninguna zona del cuerpo. 5 Para determinar qu? tipo de obesidad se tiene, tenemos que dividir el per?metro de la cintura por el per?metro de la cadera. En la mujer, cuando es superior a 0.9 y en el var?n cuando es superior a 1, se considera obesidad de tipo androide.[14] 1.2. S?NDROME METAB?LICO (SM) El SM es un cuadro pluripatol?gico cuya definici?n y utilidad diagn?stica son controvertidas.[15] Reaven introdujo el concepto en 1988 y lo denomin? s?ndrome X,[16] con el nexo com?n de la resistencia a la insulina (RI); la OMS lo defini? como SM, requiriendo la existencia de RI o alteraciones gluc?micas.[17] En el 2001 el Programa Nacional de Educaci?n en Colesterol (NCEP), a trav?s del III Panel de Tratamiento del Adulto (ATP III), lo defini? mediante criterios cl?nicos y anal?ticos de f?cil aplicaci?n, a nivel primario de atenci?n, que marcaron el inicio del cambio.[18] La obesidad es uno de los criterios necesarios para el diagn?stico del SM. Desde Reaven en 1988, hasta los ?ltimos criterios de la Federaci?n Internacional de Diabetes (IDF), la presencia de obesidad, bien de acuerdo con el IMC o con la distribuci?n de la grasa corporal (per?metro abdominal), est? presente en todas las clasificaciones, asociado a los criterios, dando origen a este cuadro multifactorial con un perfil metab?lico aterog?nico y con el rasgo com?n seg?n diversos autores, de un estado de RI cronificado. Existe una relaci?n directa entre el incremento de la obesidad y el SM.[1, 3, 5] Todo lo reflejado en las evidencias, han motivado la adopci?n de medidas institucionales, que promueven la investigaci?n en este campo. Figura 2. La distribuci?n de la grasa corporal permite distinguir con frecuencia la obesidad androide y la ginoide.[14] Obesidad androide Obesidad ginoide 6 Criterios de diagn?sticos Revisando de forma cronol?gica la evoluci?n diagn?stica del SM, se observa el cambio producido en los criterios de diagn?sticos publicados, desde la descripci?n de Reaven en 1988 (Tabla 1),[16] a partir de una alteraci?n patog?nica com?n basada en la RI con hiperinsulinemia secundaria, a la que se asocian los elementos descritos en el Tabla 1, pasando por los dictados por la OMS en 1998 (Tabla 2),[17] el Grupo Europeo para el Estudio de la Resistencia a la Inulina (EGIR) (Tabla 3),[19] los criterios de la Asociaci?n Americana de Endocrin?logos Cl?nicos (AACE) (Tabla 4),[20] la vigencia de los establecidos de acuerdo con el III Panel de Tratamiento de Adulto del Programa Nacional de Educaci?n en Colesterol (NCEP-ATP III) (Tabla 5),[18] hasta llegar a los criterios de la IDF (Tabla 6). Tabla 1. Criterio de s?ndrome X (seg?n Reaven). ? RI ? Tolerancia alterada a la glucosa o DM2 ? Obesidad de predominio central ? Hipertensi?n arterial ? Estado procoagulante ? Dislipemia aterog?nica Fuente.[16] Tabla 2. Criterios de diagn?sticos seg?n la OMS. Criterios Mayores ? DM2 o ? Intolerancia oral a la glucosa y/o ? RI Criterios Menores ? Hipertensi?n arterial: presi?n arterial ? 140/90 mmHg ? Obesidad: -IMC ? 30 kg/m2 -?ndice cintura/cadera: > 0.90 hombre y > 0.85 mujer ? Dislipidemia: -Hipertrigliceridemia > 150 mg/dL o -HDL-c < 35 (hombre) y < 39 (mujer) mg/dL ? Microalbuminuria: -Cociente alb?mina/creatinina > 30 mg/g -Excreci?n urinaria de alb?mina 20-199 mg/min o 30-299 mg/min Diagn?stico: 1 criterio mayor + 2 criterios menores Fuente.[17] 7 Tabla 3. Criterios de diagn?stico seg?n el EGIR. Criterios Mayores ? Existencia de RI o ? Hiperinsulinemia en ayunas superior al percentil 75 Criterios Menores ? Glucemia basal en plasma ? 110 (sin llegar a rango diab?tico) ? Hipertensi?n arterial: -Presi?n arterial ? 140/90 mmHg o -Seguir tratamiento antihipertensivo ? Dislipidemia: -Hipertrigliceridemia (triglic?ridos ? 180 mg/dL o -HDL-c < 40 mg/dL ? Obesidad central: -Cociente cintura/cadera: ? 94 cm (hombre)/? 80 cm (mujeres) o -IMC > 30 kg/m2 Diagn?stico: 1 criterio mayor + 2 o m?s criterios menores Fuente.[19] Tabla 4. Criterios de diagn?stico seg?n la AACE. Criterios Mayores ? Insulinorresistencia ? Obesidad abdominal: -Per?metro de cintura > 120 cm (hombre) / > 88 cm (mujer) ? Dislipidemia: -TG > 150 mg/dL -HDL-c < 35 mg/dL (hombre) / < 45 mg/dL (mujer) ? Hipertensi?n arterial ? DM2 o intolerancia oral a la glucosa ? Hiperuricemia Criterios Menores ? Hipercoagulabilidad ? S?ndrome del ovario poliqu?stico ? Disfunci?n endotelial ? Enfermedad coronaria Fuente.[20] Tabla 5. Criterios de diagn?stico seg?n el NCEP-ATP III. ? Obesidad abdominal -Per?metro abdominal > 102 cm (hombre) / > 88 cm (mujer) ? Dislipidemia: -Hipertrigliceridemia (Triglic?ridos ? 150 mg/dL) -HDL-c < 40 mg/dL (hombre) / < 50 mg/dL (mujer) ? Presi?n arterial ? 130/85 mmHg ? Glucemia basal en plasma > 110 mg/dL Diagn?stico: 3 o m?s criterios Fuente.[18] 8 Tabla 6. Criterios de diagn?stico seg?n la IDF. ? Obesidad abdominal: per?metro abdominal ? 94 cm (hombre) / ? 80 cm (mujer) europeos ? Dislipidemia: -Hipertrigliceridemia ? 150 mg/dL o tratamiento espec?fico -HDL-c < 40 mg/dL (hombre) / < 50 mg/dL (mujer) o tratamiento espec?fico ? Hipertensi?n arterial: presi?n arterial ? 130/85 mmHg o tratamiento espec?fico ? Glucemia basal en plasma 100 mg/dL o diagn?stico previo DM2 Diagn?stico: obesidad central + 2 o m?s de los siguientes factores Fuente.[21] No existen unas bases diagn?sticas consensuadas; de forma un?nime, se ha dado prioridad desde una posici?n cl?nica y pr?ctica, a los propuestos por el NCEP-ATP III por su aplicabilidad en datos cl?nicos y anal?ticos, que son sencillos y pr?cticos, con posibilidad de ser obtenidos en atenci?n primaria. M?s recientes son los criterios fijados por la IDF, con la finalidad de unificar criterios y con el hecho diferencial de establecer diferentes per?metros de cintura, de acuerdo con criterios geogr?ficos por continentes.[15, 22] Existen tambi?n dudas respecto a la consideraci?n del SM como una verdadera entidad cl?nica, o bien una asociaci?n de car?cter epidemiol?gico, incluso cuestionando la utilidad del concepto. La multiplicidad de bases diagnosticas contribuyen a esta controversia en la que s? existe unanimidad en que los pacientes con SM presentan un alto RCV, y se recomienda una intervenci?n terap?utica agresiva para conseguir la disminuci?n de este riesgo.[15] 1.2.1. Fisiopatolog?a del SM La RI es el v?nculo que relaciona los diferentes componentes del SM. La obesidad desempe?a un papel muy importante en el desarrollo de ?sta. Adicional a su papel como almacenador de energ?a, el tejido adiposo tiene un papel activo en varios procesos homeost?ticos, como el gasto energ?tico y la regulaci?n del apetito y la glucosa.[5, 23] Adem?s, es un tejido cr?tico en la funci?n tiroidea, la respuesta inmunitaria, el mantenimiento ?seo, la coagulaci?n y la secreci?n de hormonas.[24-27] El tejido adiposo es un inmunomodulador activo y, adem?s, un ?rgano endocrino que secreta adipoquinas relacionadas con la inflamaci?n, como la leptina, adiponectina, resistina, factor de necrosis tumoral alfa (TNF-?), interluquina (IL) 1? e IL-6, sustancias procoagulantes, como el inhibidor del activador del plasmin?geno- 1 (PAI-1), sustancias vasoactivas, como endotelinas o angiotensin?geno, y mol?culas que pueden contribuir a la RI, como ?cidos grasos libres (AGLs), TNF-? y resistina.[28] Aparte de ello, segrega tambi?n otras sustancias, como la prote?na 9 quimiot?ctica de los monocitos-1 (MCP-1), que participa en el reclutamiento de macr?fagos por parte del tejido adiposo. La interrupci?n o desequilibrio de estas v?as hormonales deriva en efectos da?inos tanto locales, por acci?n de las adipoquinas, como sist?micos a trav?s de la sobrerregulaci?n de los niveles plasm?ticos de citoquinas infamatorias (Figura 3).[3] Figura 3. Fisiopatolog?a del SM. Los AGL son liberados abundantemente a partir de la masa total de tejido adiposo. En el h?gado, la presencia de AGL hace que aumente la producci?n de glucosa, triglic?ridos (TG) y se secreten lipoprote?nas de muy baja densidad (VLDL). Las anormalidades concomitantes en los l?pidos/lipoprote?nas incluyen disminuci?n del colesterol de lipoprote?nas de alta densidad (HDL-c) y aumento del colesterol de lipoprote?nas de baja densidad (LDL-c). Los AGL tambi?n disminuyen la sensibilidad a la insulina en los m?sculos al inhibir la captaci?n de glucosa. Otros efectos coexistentes comprenden una mayor acumulaci?n de l?pidos en TG. Los incrementos en la glucosa circulante hacen que aumente la secreci?n de insulina por el p?ncreas y con ellos surge hiperinsulinemia; esta ?ltima estimula la reabsorci?n de sodio y aumenta la actividad del sistema nervioso aut?nomo (SNA) con hipertensi?n arterial. Existe un estado proinflamatorio que contribuye a la RI. Las citoquinas y los AGL tambi?n aumentan la producci?n de fibrin?geno por el h?gado y la producci?n del PAI-1 por adipocitos, todo lo cual origina un estado protromb?tico. Tambi?n se estimula la producci?n de prote?na C reactiva (PCR).[2] A medida que el individuo va ganando peso y sus adipocitos aumentan, el tejido adiposo sufre alteraciones moleculares y celulares que afectan su funci?n metab?lica. Este tejido responde mediante el reclutamiento de preadipocitos, que proliferan, y la hipertrofia de los adipocitos maduros, con el consiguiente crecimiento estronal y vascular ante la hipoxia adipocitaria (Figura 3).[29] La cantidad de macr?fagos en el tejido adiposo aumenta con la obesidad y ?stos act?an 10 destruyendo los adipocitos apopt?ticos. Se ha demostrado que el n?mero de macr?fagos presentes en el tejido adiposo se correlaciona de forma positiva con la adiposidad tanto en seres humanos como en ratas, y tambi?n parece que existe una expresi?n g?nica diferencial de factores proinflamatorios y antiinflamatorios relacionados con el aumento de los adipocitos, lo cual provoca un cambio hacia un marcado dominio de factores proinflamatorios como resultado de esta hipertrofia de la c?lula.[30] Al igual que en los adipocitos, los macr?fagos presentes en este tejido expresan y secretan gran cantidad de citoquinas, las cuales alcanzan el h?gado con la circulaci?n portal, con lo cual estimulan la inflamaci?n del ?rgano y la producci?n de PCR y provoca as? una respuesta inflamatoria sist?mica (Figura 3).[30] Asimismo, el equilibrio energ?tico positivo incrementa la concentraci?n de AGL en la circulaci?n sist?mica. Este aumento de AGL se debe al menor efecto antilipol?tico de la insulina y a la p?rdida de la inhibici?n de la lipasa sensible a hormonas, la lipasa lipoproteica (LPL) en el tejido adiposo. A ra?z de esto se produce en el h?gado un incremento en la s?ntesis de TG y en la formaci?n de apolipoprote?nas B-100 (Apo B-100), as? como el ensamblaje y secreci?n de VLDL, lo que conduce a hipertrigliceridemia (Figura 3).[31] Al aumentar los TG plasm?ticos, se incrementa la tasa de transferencia de ?steres de colesterol desde las HDL-c hacia las VLDL, catalizada por las prote?nas de transferencia de ?steres de colesterol (ECTP); cuanto m?s alta es la concentraci?n de VLDL, m?s altas ser? la tasa de transferencia y, como consecuencia, disminuir?n los niveles de HDL-c.[2, 27, 32] Asimismo, la lipasa hep?tica y la lipasa endotelial est?n sobreexpresadas, lo que provoca un hipercatabolismo de HDL-c, que conlleva a la formaci?n de LDL-c peque?as y densas, que atraviesan con m?s facilidad la pared arterial, se unen de manera m?s ?vida a los proteoglucanos y son m?s susceptibles a la oxidaci?n. Existen evidencias que indican que la tasa de fraccionamiento catab?lico de la apolipoprote?na A-1, componente estructural del HDL-c, aumenta como consecuencia de la hipertrigliceridemia, lo cual es otro factor que contribuye a la disminuci?n del HDL-c.[2, 33] La acumulaci?n de estos AGL en los diferentes ?rganos, como h?gado o m?sculo esquel?tico, genera lipotoxicidad con la consecuente disminuci?n de la sensibilidad de la captaci?n de glucosa mediada por hormonas, que promueve la RI. En s?ntesis, la RI est? relacionada con la acumulaci?n de l?pidos en el h?gado y en el tejido muscular (Figura 3).[2] Esta resistencia insul?nica, junto con la insulina en s?, y los estados proinflamatorios y protromb?ticos producen un aumento de la presi?n arterial y una disfunci?n vascular y endotelial que son el inicio de la arterosclerosis (Figuras 3).[2, 27, 34] 11 1.2.2. Tratamiento del SM El tratamiento del SM se basa en establecer objetivos de acuerdo con las alteraciones individuales de cada persona y en una serie de recomendaciones cl?nicas que ayuden a la mejora tanto de los componentes individuales del SM como en su conjunto. El enfoque principal del tratamiento del SM consiste en modificaciones del estilo de vida, las cuales incluyen bajar de peso si se tiene sobrepeso, hacer m?s actividad f?sica, seguir una dieta saludable y dejar de fumar. Cuando la persona lo necesita, adem?s, se utiliza la terapia farmacol?gica.[35, 36] Para lograr cambios en el estilo de vida de los pacientes el consejo m?dico sigue siendo el arma m?s potente, sobre todo cuando se realiza de forma sistem?tica y reiterada, habi?ndose demostrado su eficacia en numerosos estudios.[37, 38] ? Mantener un peso saludable. Su m?dico puede medir su IMC para determinar un peso saludable para su estatura. Del mismo modo puede ayudarle a elaborar un plan para bajar de peso si se tiene sobre peso y a mantener su peso con una dieta saludable y actividad f?sica regular. ? Hacer m?s actividad f?sica. No hacer actividad f?sica es uno de los mayores factores de RCV. Es importante hacer alg?n tipo de ejercicio en forma regular. Una buena meta para muchas personas es llegar a hacer ejercicio 4 a 6 veces a la semana de 30 a 60 minutos cada vez. ? Dieta saludable. Cuando se combina con ejercicio, una dieta saludable puede ayudar a bajar de peso, a reducir los niveles de colesterol y a mejorar el funcionamiento del cuerpo. Los alimentos altos en fibra, deben ser una parte regular de nuestra dieta. Debemos comer varias porciones de fruta, verduras y pan integral todos los d?as. Adem?s limitar la cantidad de grasa saturada, sal y azucares agregada a la dieta. ? No fumar. Si se fuma mediante ayuda profesional puede dejar de hacerlo y brindarle asesoramiento sobre c?mo evitar empezar nuevamente. Si no fuma, no empezar a hacerlo.[39] a) Tratamiento de la obesidad Tratamiento quir?rgico: en algunos casos el tratamiento quir?rgico, como la cirug?a bari?trica o la liposucci?n se realizan como tratamiento a la obesidad, bajo criterios m?dico. Tratamiento farmacol?gico: el tratamiento farmacol?gico en la obesidad se indica en pacientes con IMC > 30 kg/m2, o en pacientes con IMC < 30 kg/m2 con 12 comorbosidad asociada que no responden al tratamiento no farmacol?gico. Algunos f?rmacos indicados para la obesidad son: ? Orlistat (1, Figura 4). Principio activo de Alli?, inhibe la hidr?lisis de grasas en el intestino impidiendo as? la incorporaci?n sist?mica de un 30% de los TG ingeridos. Los efectos secundarios se limitan a la incomodidad causada por un exceso de grasa en el colon.[8, 40] ? Lorcaserina (2, Figura 4). Principio activo de Belviq?, provocar p?rdida de apetito mediante una acci?n agonista sobre los receptores de la serotonina del tipo 5-HT2C situados en el cerebro, lo cual ocasiona sensaci?n de saciedad. Los estudios indican que la p?rdida de peso por este medicamento pueden ser de 3.2 kg en paciente que lo tomen durante un a?o. Entre los efectos secundarios se indica dolor de cabeza, mareos, fatiga, n?useas, sequedad de boca, tos y el estre?imiento.[8] O NH O H H O (H2C)10 H O O H H O O O H OHO F OH N O OH F O O OH N NH N HN HO OH HN NH OH N H N NH N OH OH N H N N N N O OH N N N N O O O O NH2 O N H N NH2 NH NH N N O NH S O O O O HO O HO OH H3C O HO OH OH OH OH OH O HO HO OH OH HN N OH HO HO OH OH Orlistat (1) Lavostatina (5) (Estatina) Ezetimibe (6) Gemfibrocilo (7) (Fibrato) Colestipol (8) Telmisartan (9) Doxazosina (10) Metformina (11) Rosiglitazona (12) Acarbosa (13) Miglitol (14) Cl NH Lorcaserina (2) NH2 Fentermina (3) Topiramato (4) O O OO O H H H O S NH2 O O Figura 4. Principios activos de f?rmacos empleados en el tratamiento del SM. 13 ? Fentermina+Topiramato (3, 4, Figura 4). Principio activo de Qsymia? es la combinaci?n de la fentermina y el topiramato. La fentermina estimula a las neuronas para que liberen un grupo particular de neurotransmisores conocidos como catecolaminas (p.e. dopamina, epinefrina, norepinefrina), que provocan la supresi?n del apetito por su acci?n sobre el sistema nervioso central (SNC). El topiramato usado principalmente para tratar la epilepsia y la migra?a ha presentado efectos positivo en la reducci?n de peso, debido a que estimula los canales de cloro activados por ?cido ?-aminobut?rico (GABA). Adem?s, inhibe neurotransmisores a trav?s de su acci?n sobre el receptor de kainato GluR5 y los receptores ?cido ?-amino-3-hidroxi-5-metil- 4-isoxazolpropi?nico (AMPA). Los efectos secundarios m?s comunes de Qsymia? son hormigueo en las manos y los pies, mareo, sensaci?n de alteraci?n del gusto, aumento de ritmo cardiaco, insomnio, estre?imiento y boca seca.[8, 41] b) Tratamiento de la dislipidemia En la actualidad se dispone de varios grupos de f?rmacos que han demostrado incidir favorablemente en el perfil lip?dico alterado, disminuyendo el colesterol total, los TG, las HDL-c, y las LDL-c. ? Estatinas. Son inhibidores de la enzima 3-hidroxi-3-metil-glutaril-coenzima A reductasa, limitante de la s?ntesis del colesterol fundamentalmente a nivel hep?tico, por lo que consiguen descensos del LDL-c entre 34-55% seg?n el tipo de estatina y la dosis. Las diversas estatinas comercializadas son: fluvastatina, pravastatina, simvastatina, atorvastatina, rosuvastatina y lovastatina (5, Figura 4). Entre los efectos figuran las molestias gastrointestinales y dolores musculares.[42] ? Ezetimibe. Es un inhibidor del transporte del colesterol en la pared intestinal, con su administraci?n, asociados a estatina se consigue reducir el LDL-c m?s que lo logrado por las estatinas solas, a la vez que se consigue elevaciones adicionales del HDL-c y reducciones del TG. La asociaci?n de ezetimibe (6, Figura 4).[43] ? Fibratos. Son f?rmacos que act?an sobre los receptores ? activados de proliferaci?n de los peroxisomas (PPAR-?), siendo sus tejidos dianas el hep?tico y muscular. Estos f?rmacos aumentan la captaci?n de AGL al activar la enzima LPL; disminuyen la s?ntesis de apoliprote?na C-III (Apo C- III), por lo que se produce un descenso de las VLDL ricas en TG, disminuyendo los TG plasm?tico; aumentan la s?ntesis de apoliprote?na A-I 14 (Apo A-I) y apoliprote?na A-II (Apo A-II), por lo que se elevan las concentraciones del HDL-c. Los fibratos son eliminados por v?a renal, por lo que se debe tener especial cuidado cuando se utilice en pacientes con insuficiencia renal. Los diversos fibratos comercializadas en Espa?a son: fenofibratos, benzafibratos y gemfibrocilo (7, Figura 4).[44] ? Resinas secuestrantes de los ?cidos biliares. Su acci?n es quelar las sales biliares, impidiendo su adsorci?n intestinal y promoviendo la p?rdida de colesterol por las heces. Consiguen reducciones del LDL-c entre el 10-20%. Elevan los TG plasm?ticos, presentan efectos secundarios gastrointestinales con frecuencia, interfieren la absorci?n de muchos f?rmacos y vitaminas liposolubles, por lo que su uso en muy restringido. Se utiliza cundo no se puede administrar otro hipolipemiantes. Ejemplo de estos f?rmacos: colestiramina y colestipol (8, Figura 4).[45, 46] c) Tratamiento de la hipertensi?n arterial Los m?s utilizados para la hipertensi?n: ? Telmisartan (9, Figura 4). Es un antagonista de receptores de la angiotensina II (ARA II) ampliamente utilizado en el tratamiento de la hipertensi?n arterial, tiene una actividad agonista parcial sobre los receptores ? activadores de proliferaci?n de los peroxisomas (PPAR-?), los cuales tienen un papel relevante en la regulaci?n del metabolismo gluc?dico y lip?dico.[47] ? ?-bloqueantes. El m?s estudiado es la doxazosina (10, Figura 4), ha demostrado que no modifica los niveles plasm?ticos de glucosa, insulina, hemoglobina glicosilada (HbA1C) y p?ptido C, pero disminuye la RI y mejora el perfil lip?dico; estas caracter?sticas pueden ser de inter?s para su utilizaci?n en el tratamiento del SM.[48, 49] d) F?rmacos sensibilizadores a la insulina En pacientes diab?ticos se utilizan los siguientes f?rmacos: ? Metformina (11, Figura 4). Act?a fundamentalmente disminuyendo la producci?n hep?tica de glucosa y modificando el llamado fen?meno de glucotoxicidad, mejorando tambi?n el perfil lip?dico. Es eficaz en reducir la HbA1C. No produce hipoglucemias, puede ocasionar molestias gastrointestinales y parece inducir una discreta disminuci?n del apetito, lo que facilitar?a el control de peso.[50, 51] 15 ? Glitazonas o Tiaozolidinedionas. Disminuyen la RI como resultado de la activaci?n de los denominadores receptores PPAR-?, mejorando la utilizaci?n de la glucosa en tejido perif?rico (adiposo y tejido muscular). Tanto la pioglitazona como la rosiglitazona (12, Figura 4), est?n indicados para pacientes con mal control metab?lico en los que no se logra alcanzar la normoglucemia con metformina.[52, 53] ? Inhibidores de las ?-glucosidasas. Act?an inhibiendo las ?-glucosidasas intestinales, con lo que provocan una disminuci?n de la disponibilidad de glucosa. Reducen la glucemia postprandial y mejoran la RI en pacientes con DM2. Los principales efectos adversos son los trastornos gastrointestinales, como la diarrea o el meteorismo. Los f?rmacos con estas propiedades son: acarbosa (13, Figura 4) y miglitol o Glyset? (14, Figura 4).[54] 1.2.3. Modelos animales de SM La prevalencia del SM ha estimulado el estudio de sus causas la b?squeda de estrategias preventivas. Estos estudios requieren modelos animales viables que mimeticen adecuadamente los principales factores del s?ndrome en humanos, especialmente la obesidad central, la RI, la dislipemia, la hipertensi?n arterial y el estr?s oxidativo (EO). Los roedores se han utilizado durante muchos a?os como modelos para simular enfermedades humanas, para mejorar la comprensi?n de las causas y la progresi?n de los s?ntomas y para poner a prueba nuevas intervenciones terap?uticas o preventivas. En el caso de los factores relacionados con el SM los modelos se han centrado en la hipertensi?n, la RI y la obesidad.[55-58] El criterio principal para un modelo de SM es que presente m?s de uno de los factores del s?ndrome.[59] a) Modelos modificados gen?ticamente Los modelos gen?ticos de obesidad y diabetes que incluyen ratones o ratas son ?tiles en la evaluaci?n de determinados mecanismos moleculares que pueden estar implicados en el desarrollo de la obesidad, pero debe tenerse en cuenta que el SM en los humanos no es una enfermedad monog?nica.[60] En los ?ltimos a?os, el avance de la ingenier?a gen?tica ha permitido el desarrollo de modelos de ratones, ya sean transg?nicos o por knockout, para estudiar los efectos normales y anormales de una prote?na en particular o de un conjunto de mol?culas de se?alizaci?n y hormonas, importantes en el desarrollo de la diabetes y obesidad (p.e. transportador de glucosa-4 (GLUT-4), sustrato del receptor de insulina-1(IRS-1) y el sustrato del receptor de insulina-2 (IRS-2)).[61-63] 16 Las ratas espont?neamente hipertensas y obesas (SHROB) o ratas Koletsky, es un modelo animal ?til para el estudio del SM humano, debido a que presenta m?s de uno de los factores de riesgos. Surgi? a partir de una mutaci?n espont?nea ocurrida en 1969,[64] cuando de una colonia de ratas Wistar Kyoto (WKY) (normotensa) del Instituto Nacional de Coraz?n, Pulm?n y Sangre, (NHLBI) naci? anticipadamente una rata hembra espont?neamente hipertensa (SHR), que luego se apare? con una rata macho Sprague-Dawley (SD). De este cruce result? una descendencia hipertensa con presi?n arterial sist?lica > 150 mmHg, que m?s tarde se retrocruz? con SHR, manteniendo la selecci?n de la presi?n arterial alta. Una cepa SHR que desarrollaba obesidad fue nombrada SHROB o Koletsky. En esta cepa el genotipo obeso es independiente del sexo y corresponde a individuos homocigotos para un alelo recesivo inicialmente designado como f[64] y m?s tarde reclasificado como fak.[65] Se ha determinado que la mutaci?n fak/fak en SHROB es una mutaci?n sin sentido del gen para el receptor de la leptina, que ocurre en el cod?n 763 del gen, que produce un corte justo antes del dominio transmembrana citoplasm?tica.[66] Debido a este cod?n de parada temprana, estas ratas no presentan ninguna de las isoformas del receptor de leptina.[67] Otra mutaci?n relacionada con el gen de la leptina, lo presenta la rata Zucker obesa (fa/fa), la cual es el resultado de una substituci?n de bases (Gln 269 Pro) en el nucle?tido 880 del gen. Esta mutaci?n reduce el n?mero de receptores en la superficie celular.[68] La leptina es una hormona producida principalmente en el tejido adiposo, no se almacena.[69] Por lo tanto, la s?ntesis y secreci?n de la misma, es primariamente regulada por mecanismos transcripcionales. La funci?n principal de la leptina es suministrar se?al al SNC para conservar el balance energ?tico y el peso corporal estable. Tambi?n participa en otros procesos fisiol?gicos mediados a trav?s del SNC, o por acci?n directa sobre los tejidos perif?ricos como pulm?n, ri??n, h?gado, p?ncreas, corteza adrenal, endotelio capilar, ovario, test?culo, m?sculo esquel?tico, c?lulas hematopoy?ticas, tejido adiposo y tracto gastrointestinal.[70-72] Los modelos que incluyen alteraciones en los receptores para la leptina son insensibles a esta hormona y desarrollan obesidad por falta de se?al saciante al SNC. Por lo que respecta a sus limitaciones como modelo de SM hay que tener en cuenta que mutaciones en el gen de la leptina o de su receptor son una alteraci?n gen?tica recesiva muy rara, con solo 4 mutaciones en 15 pacientes detectados hasta el a?o 2009.[73] 17 b) Modelos de inducci?n qu?mica de diabetes El aloxano y la estreptozotocina son an?logos estructurales de la glucosa que entran en las c?lulas ?-pancre?ticas mediante el transportador de glucosa-2 (GLUT- 2).[74] Inyecciones puntuales de aloxano o estreptozotocina producen la necrosis selectiva de las c?lulas ?-pancre?ticas en ratas, ratones y conejos con lo que se genera un modelo de diabetes tipo 1. En contraste con los pacientes con SM, las ratas diab?ticas inducidas por aloxano o estreptozotocina no aumentan de peso aunque por lo general presentan hipotensi?n.[75] Se puede inducir DM2 por bajas dosis de estreptozotocina neonatalmente lo que produce hiperglucemia moderada en ratas adultas con disminuci?n del HDL-c, pero sin otras anormalidades en los l?pidos.[76] En ratas tratadas en el d?a 2 de vida con estreptozotocina se observ? a las 14 semanas RI y un aumento de los niveles plasm?ticos de PCR y TNF-?.[77] c) Modelos de inducci?n de SM por cambios en la dieta La dieta moderna, sobre todo en los pa?ses occidentales, es rica en carbohidratos como la fructosa y la sacarosa, as? como en grasas saturadas. Este tipo de ingesta cal?rica se ha asociado con SM, enfermedades cardiovasculares e h?gado graso no alcoh?lico.[78, 79] ? Modelo de administraci?n de fructosa. La ingesta de una dieta prolongada con altos contenidos de fructosa (60%) en rata, condujo a la dilataci?n ventricular, hipertrofia ventricular y disminuci?n de la fuerza contr?ctil del ventr?culo, infiltraci?n de c?lulas inflamatorias en el coraz?n y esteatosis hep?tica.[80-82] En el h?gado, el exceso de fructosa en ratas produjo tanto esteatosis microvesicular como macrovesicular, fibrosis periportal e inflamaci?n lobular.[81, 83] Por otro lado, en ratas alimentadas tambi?n con altos contenidos de fructosa se observ? en el ri??n da?os tubulares, deposici?n de col?geno en el intersticio y aumento de la infiltraci?n de macr?fagos.[84] Se ha observado que la fructosa no estimula la secreci?n de insulina en las c?lulas ? del p?ncreas, posiblemente debido a la ausencia del transportador de fructosa-5 (GLUT-5) en estas c?lulas.[80] La fructosa tambi?n carece de la capacidad para estimular la secreci?n de leptina (saciante), aunque tiene la capacidad de activar la lipog?nesis de novo en el h?gado.[85] Por tanto, la alimentaci?n con niveles altos de fructosa (60-40 %) induce en roedores el desarrollo de criterios del SM, por lo que se utilizan como modelo de SM.[80] 18 ? Modelos de dietas altas en grasa. Las dietas altas en grasa se han utilizado como modelo de obesidad, dislipemia y RI en roedores. Las complicaciones desarrolladas por dietas ricas en grasas se parecen mucho al SM humano incluyendo la hipertrofia cardiaca, fibrosis cardiaca, necrosis del miocardio y esteatosis hep?tica.[86-88] Una alimentaci?n rica en grasas en ratones aument? la presi?n sist?lica (PS) y la disfunci?n endotelial.[89] Los diferentes tipos de dietas ricas en grasas que se han utilizado oscilan entre 20% y 60% de energ?a en forma de grasa, ya sea de origen animal (sebo o manteca de cerdo o vacuno) o aceites vegetales tales como aceite de oliva o de coco. El aumento de peso es evidente despu?s de 4 semanas de alimentaci?n con una dieta alta en grasas.[90] Dietas enriquecidas con altos contenidos de grasas finalmente conduce a la aparici?n de criterios del SM.[91] ? Modelos de dietas altas en grasa y en sacarosa. Las dietas altas en grasa y altas en sacarosa (HFHS; high fat, high sucrose), se utiliza para inducir el SM en animales sanos, ya que imita en cierta medida, las dietas de alta densidad energ?tica frecuentemente consumidas por muchos individuos. Esta dieta mantiene un flujo alto de l?pidos y conduce a la acumulaci?n de grasa y alteraciones en la glucosa y el metabolismo de los l?pidos[92] que son similares a los observados en el SM humano.[93, 94] Estos efectos, pueden derivar a un menor transporte de glucosa a nivel muscular que de forma compensatoria tienden a elevar los niveles plasm?ticos de insulina, estas modificaciones en la sensibilidad perif?rica a la insulina se incrementan a mayor tiempo de exposici?n a la dieta HFHS.[95] De forma paralela se ha observado, un incremento en las concentraciones plasm?ticas de TG. Por otro lado, una reducci?n en la disponibilidad de factor relajante ?xido n?trico (ON), inducida por el consumo de una dieta HFHS, podr?a ser cr?tica en el desarrollo y/o la progresi?n de la RI mediante la reducci?n de la glucosa y el suministro de insulina a los tejidos sensibles a la insulina.[96, 97] 19 1.3. ?CIDOS GRASOS POLIINSATURADOS 1.3.1. Definici?n, localizaci?n, bios?ntesis Los ?cidos grasos de la dieta m?s comunes han sido subdivididos en tres grupos seg?n el grado de insaturaci?n: los ?cidos grasos saturados (AGSs) no poseen dobles enlaces, los ?cidos grasos monoinsaturados (AGMIs) poseen un doble enlace y los ?cidos grasos poliinsaturados (AGPIs) poseen dos o m?s doble enlaces. Estos ?cidos grasos se caracterizan por poseer un n?mero par de ?tomos de carbono y estructuras no ramificadas. Los dobles enlaces de ?cidos grasos insaturados que existen en la naturaleza son muy a menudo de orientaci?n cis. Una configuraci?n cis significa que los dos ?tomos de hidr?geno unidos al doble enlace se encuentran en el mismo lado del doble enlace. Si los ?tomos de hidr?geno se encuentran en lados opuestos, la configuraci?n se denomina trans. ?cidos grasos saturados (AGSs) La Comisi?n de Expertos la Organizaci?n de las Naciones Unidas para la Alimentaci?n y la Agricultura (FAO) y la OMS recomend? la siguiente clasificaci?n de los AGSs en cuatro subgrupos seg?n la longitud de su cadena: corta (de 3 a 7 ?tomos de carbono), media (de 8 a 13 ?tomos de carbono), larga (de 14 a 20 ?tomos de carbono) o muy larga (con 21 ?tomos de carbono). En la Tabla 7 se muestran algunos de los AGSs de la dieta y sus principales fuentes.[98] Tabla 7. Algunos AGSs comunes en grasas y aceites de la dieta. Nombre com?n Nombre sistem?tico Abreviatura* Fuentes principales But?rico Butanoico C4:0 Grasa l?ctea Caproico Hexanoico C6:0 Grasa l?ctea Capr?lico Octanoico C8:0 Grasa l?ctea, aceite de coco y palma C?prico Decanoico C10:0 Grasa l?ctea, aceite de coco y palma L?urico Dodecanoico C12:0 Aceite de coco y palma Mir?stico Tetradecanoico C14:0 Grasa l?ctea, aceite de coco y palma Palm?tico Hexadecanoico C16:0 La mayor?a de grasas y aceites Este?rico Octadecanoico C18:0 La mayor?a de grasas y aceites Araqu?dico Eicosanoico C20:0 Aceite de cacahuete Beh?nico Docosanoico C22:0 Aceite de cacahuete Lignoc?rico Tetracosanoico C24:0 Aceite de cacahuete *El primer n?mero indica el n?mero de carbonos y el segundo el n?mero de dobles enlaces. 20 ?cidos grasos monoinsaturados (AGMIs) En la naturaleza existe m?s de un centenar de AGMI cis, pero la mayor?a son componentes poco comunes. El ?cido oleico es el AGMI m?s com?n y est? presente en cantidades considerables en fuentes tanto de origen animal como vegetal. En la Tabla 8 se muestran los AGMIs de las dietas m?s comunes. Tabla 8. Algunos AGMIs cis comunes en grasas y aceites. Nombre com?n Nombre sistem?tico Abreviatura* Fuentes principales Palmitoleico cis-9-hexadec?noico 9c-16:1 Aceite de origen marino, aceite de macadamia, la mayor?a de aceites animales y vegetales. Oleico cis-9-octadecenoico 9c-18:1 Todos los aceites y grasas, especialmente el aceite de oliva, el aceite de canola, los aceites de girasol son ricos en ?cidos oleico. cis- vacc?nico cis-11-octadecenoico 11c-18:1 La mayor?a de los aceites vegetales. Gadoleico cis-9-eicosenoico 9c-20:1 Aceite de origen marino Er?cico cis-13-docosenoico 13c-22:1 Aceite de semilla de mostaza, aceite de colza. Nerv?nico cis-15-tetracosenoico 15c-24:1 Aceite de origen marino *El primer n?mero indica la posici?n del doble enlace cis, el segundo el n?mero de carbonos y el tercero el n?mero de dobles enlaces. ?cidos grasos poliinsaturados (AGPIs) Los AGPIs naturales, con dobles enlaces separados por grupos metileno y de configuraci?n cis pueden dividirse en 12 familias diferentes: pueden comprender entre dobles enlaces situados en la posici?n n-1 hasta la n-12, con respecto al grupo metilo terminal.[98] Las familias m?s importantes, por lo que se refiere a su abundancia e incidencia en la salud y nutrici?n humana, son la n-6 y n-3. En la Tabla 9 y Tabla 10 aparecen enumerados los miembros de estas familias. El ?cido linoleico (LA) (15, Figura 5) es el ?cido graso esencial primario o generador de la familia n-6. Posee 18 ?tomos de carb?n y dos dobles enlaces, el primer doble enlace en la posici?n 6. El LA puede ser desaturado y alargado en humanos para formar series de AGPI n-6 (Tabla 9). 21 Tabla 9. AGPIs n-6 m?s importantes a nivel nutricional. Nombre com?n Nombre sistem?tico Abreviatura* Fuentes principales ?cido linoleico ?cido cis-9,cis-12- octadecadienoico C18:2n-6 (LA) La mayor?a de aceites vegetales ?cido ?-linol?nico ?cido cis-6,cis-9,cis- 12-octadecatrienoico C18:3n-6 (GLA) Aceites de semilla de onagra, borraja y grosella negra ?cido dihomo-?- linol?nico ?cido cis-8,cis-11,cis- 14-eicosatrienoico C20:3n-6 (DHGLA) Cantidades m?nimas en tejidos animales ?cido araquid?nico ?cido cis-5,cis-8,cis- 11,cis-14- eicosatetraenoico C20:4n-6 (AA) Grasas animales, h?gado, l?pidos del huevo, pescado ?cido docosatetraenoico ?cido cis-7,cis-10,cis- 13, cis-16- docosatetraenoico C22:4n-6 (DHGLA) Componente en cantidades m?nimas en tejidos animales ?cido docosapentaenoico ?cido cis-4,cis-7,cis- 10,cis-13,cis-16- docosapentaenoico C25:5n-6 (DPA) Componente en cantidades m?nimas en tejidos animales *El primer n?mero indica el n?mero de carbonos, el segundo el n?mero de dobles enlaces y el tercero la posici?n del primer doble enlace con respecto al extremo metilo de la cadena hidrocarbonada. El ?cido ?-linol?nico (ALA) (16) (Figura 5) es el ?cido graso esencial primario o generador de la familia n-3. Cuenta igualmente con 18 ?tomos de carbono, pero posee tres dobles enlaces. A diferencia del LA, el primer doble enlace del ALA se encuentra en el tercer ?tomo de carbono partiendo del extremo metilo de la cadena de ?cido graso. Al igual que el LA, el ALA tambi?n puede ser desaturado y alargado para formar series del AGPI n-3 (Tabla 10). Tabla 10. AGPIs n-3 m?s importantes a nivel nutricional. Nombre com?n Nombre sistem?tico Abreviatura* Fuentes principales ?cido ?-linol?nico ?cido cis-9,cis-12,cis- 15-octadecatrienoico C18:3n-3 (ALA) Aceite de lino, canola y soja ?cido estearid?nico ?cido cis-6,cis-9,cis- 12,cis-15- octadecatetraenoico C18:4n-3 (SDA) Aceite de pescado, aceite de semillas de grosella negra y aceite de c??amo ?cido eicosapentaenoico ?cido cis-5,cis-8,cis- 11,cis-14,cis-17- eicosapentaenoico C20:5n-3 (EPA) Pescado azul (salm?n, arenque, anchoa, esperlano y caballa) ?cido docosapentaenoico ?cido cis-7,cis-10,cis- 13,cis-16,cis-19- docosapentaenoico C22:5n-3 (n-3 DPA) Pescado azul (salm?n, arenque, anchoa, esperlano y caballa) ?cido docsahexaenoico ?cido cis-4,cis-7,cis- 10,cis-13,cis-16,cis- 19-docosahexaenoico C22:6n-3 (DHA) Pescado azul (salm?n, arenque, anchoa, esperlano y caballa) *El primer n?mero indica el n?mero de carbonos, el segundo el n?mero de dobles enlaces conjugados y el tercero la posici?n del primer doble enlace con respecto al extremo metilo de la cadena hidrocarbonada. 22 El LA y el ALA se encuentran en todas las grasas de la dieta y presentan mayores proporciones en la mayor?a de los aceites vegetales.[99] El ALA se encuentra sobre todo en las plantas y presenta mayores concentraciones en algunas semillas y frutos secos y en algunos aceites vegetales. El ?cido araquid?nico (AA) (17, Figura 5) es el AGPI n-6 m?s importante de todos los ?cidos grasos n-6 porque es el precursor principal de los eicosanoides derivados de la familia n-6. El AA se encuentra en menor proporci?n en carnes, huevos y pescado, algas y otras plantas acu?ticas.[100, 101] El ?cido eicosapentaenoico (EPA) (18, Figura 5) y el ?cido docosahexaenoico (DHA) (19, Figura 5) son los ?cidos grasos n-3 m?s importantes de la nutrici?n humana. El EPA y el DHA son componentes de los aceites de vegetales y animales marinos, en la Tabla 10 podemos ver sus principales fuentes.[100] De hecho, dado que los vertebrados no pueden sintetizar AGPIs de novo, EPA y DHA en peces provienen de su dieta (algas).[102, 103] Los aceites de pescado que contienen un 60% de EPA y DHA se venden como fuentes de estos importantes ?cidos grasos n-3. Tambi?n se encuentran disponibles en aceites de algas y otros aceites de fuentes unicelulares que proporcionan EPA+DHA+AA.[104] Adem?s, aceites modificados gen?ticamente, producidos mediante manipulaci?n de la soja y otras plantas, se est?n desarrollando actualmente y estar?n disponibles en un futuro cercano. ?cido linoleico (15) (LA) OH O ?cido ?-linol?nico (16) (ALA) OH O OH O ?cido araquid?nico (17) (AA) OH O ?cido eicosapentaenoico (18) (EPA) ?cido docosahexaenoico (19) (DHA) OH O Figura 5. Estructura de los principales ?cidos grasos poliinsaturados. 23 Oxidaci?n de los ?cidos grasos La grasa almacenada en forma de TG representa la fuente de energ?a m?s concentrada del cuerpo. El rendimiento energ?tico de un gramo de grasa catabolizada es de 9 kcal (37.7 kJ/g), frente a las 4 kcal (16.8 kJ/g), de las prote?nas y los hidratos de carbono. Los ?cidos grasos producen energ?a mediante la ?-oxidaci?n en las mitocondrias. En general, el proceso de ?-oxidaci?n no es muy eficiente ya que requiere de transporte a la mitocondria mediante la carnitina, que consta de cuatro pasos. Por consiguiente, los ?cidos grasos son m?s lentos para producir energ?a que los hidratos de carbono, y son almacenados preferentemente en el tejido adiposo. Adem?s, lo oxidaci?n de ?cidos grasos de cadena muy larga se llevan a cabo inicialmente en los peroxisomas. La estructura de los ?cidos grasos influye en la velocidad de oxidaci?n. Por lo general, los ?cidos grasos de cadena larga se oxidan m?s lento y los ?cidos grasos insaturados se oxidan m?s r?pidamente que los saturados. La oxidaci?n de los AGSs disminuye al aumentar la longitud de la cadena de carbono (laurato>miristato>palmitato>estearato).[105] En el caso de los ?cidos grasos insaturados, la oxidaci?n que tiene lugar en 24 horas se produce en el siguiente orden ALA>OA>LA>AA. S?ntesis de novo de los ?cidos grasos El proceso de s?ntesis implica la conversi?n de los hidratos de carbono que est?n en exceso en la dieta en unidades de acetato, y la condensaci?n de acetato, como acetil coenzima A (acetil CoA), con bicarbonato para formar malonil CoA. El acetil CoA se combina con una serie de mol?culas de malonil CoA para formar ?cidos grasos saturados de diferentes longitudes de carbono, siendo el producto final el ?cido palm?tico (C16:0). Las reacciones de s?ntesis de los AGs hasta esta etapa tienen lugar en el complejo multienzim?tico de la s?ntesis de AGs. Una vez que el ?cido graso palm?tico se libera de dicho complejo, puede ser alargado a ?cido este?rico e incluso a AGSs superiores si se a?aden grupos acetilos, mediante la acci?n de los sistemas de alargamiento de los AGs. En los tejidos animales la desaturaci?n de los ?cidos grasos saturados sintetizados de novo se detiene con la formaci?n de AGMI de la serie n-9. Esta conversi?n se llevada a cabo por la ?9-desaturasa, que es una enzima muy activa en los tejidos de los mam?feros, y que introduce dobles enlaces en la posici?n 9-10 de la cadena. El ?cido oleico (C18:1?9 o C18:1n-9) es el producto principal. Los productos de la s?ntesis de novo son esterificados con glicerol para formar TG. En el h?gado estos TG se incorporan a las VLDL y se transportan a la circulaci?n. En el 24 tejido adiposo se almacenan en forma de peque?os dep?sitos intracelulares.[106, 107] Los AGs de la dieta tienen una gran influencia en la s?ntesis de novo y es probable que todos los ?cidos grasos, excepto los ?cidos grasos de cadena corta, la inhiban.[106, 108] S?ntesis de AGPI a partir de LA y ALA LA y ALA son necesarios para el crecimiento y la reparaci?n de las c?lulas, adem?s pueden utilizarse para producir otros ?cidos, como el AA que se obtiene del LA, mientras que el EPA y DHA se obtiene a partir del ALA (Figura 6), pero las cantidades producidas no son suficientes para cubrir las necesidades de EPA y DHA en el organismo de los animales vertebrados, por lo que deben obtenerse de la dieta.[109, 110] Numerosos estudios cient?ficos en humanos y en modelos animales, reflejan la importancia de las familias de los n-6 y n-3, como componentes importantes de las membranas de las c?lulas y los precursores de muchas otras sustancias del organismo, como los que regulan la PA y la respuesta inflamatoria. Cada vez hay m?s pruebas que indican que los AGPIs n-3 tienen un efecto protector frente a las ECV y reducen la inflamaci?n en enfermedades cr?nicas como c?ncer, artritis, entre otras.[111-114] 25 ?-oxidaci?n elongasa C24:4n-6 (n-6-tetracosatetraenoico) C24:5n-6 (n-6-tetracosapentaenoico) C22:5n-6 (n-6-docosapentaenoico) C24:5n-3 (n-3-tetracosapentaenoico) C24:6n-3 (n-3-tetracosahexaenoico) C22:6n-3 (DHA) (docosahexaenoico) 6-desaturasa LOX resolvinas serie DCOX-2 C22:4n-6 (adr?nico) C22:5n-3 (n-3-docosapentaenoico) elongasa TX3COXTX2 COX COX-2 Serie n-6 Serie n-3 6-desaturasa elongasa C18:3n-6 (?-linol?nico) C20:3n-6 (dihomo-?-linol?nico) C20:4n-6 (AA) (araquid?nico) C18:4n-3 (estearid?nico) C20:4n-3 (eicosatetraenoico) C20:5n-3 (EPA) (eicosapentaenoico) C18:2n-6 (LA) (linoleico) C18:3n-3 (ALA) (?-linol?nico) (C20:2n-6) eicosadienoides (C20:3n-3) eicosatrienoides 6-desaturasa 6-desaturasa 5-desaturasa LOX LOX PGH3 PGH2 PG3 PGI3 PG2 PGI2 resolvinas serie E HPETE HPETE HETE HETE LT5 LT4 LX5 LX4 protectinas D1 Figura 6. Rutas metab?licas de n-3 y n-6 AGPI. PG, prostaglandinas; PGI, prostaciclinas; TX, tromboxanos; LT, leucotrienos; HPETE, ?cidos hidroperoxitetraenoicos; HETE, ?cidos hidroxieicosatetraenoico; y LX, lipoxinas.[115, 116] Una vez obtenidos de la dieta, LA y ALA se pueden convertir en familias n-6 y n-3 de AGPIs C20 y C22 mediante reacciones alternas de desaturaci?n y alargamiento (Figura 6). Estas rutas s?lo necesitan las desaturasas ?6 y ?5, una elongasa del sistema micros?mico y una fase de acortamiento de la cadena, lo que implica la ?-oxidaci?n en los peroxisomas.[117, 118] El primer paso consiste en la inserci?n de un doble enlace en la posici?n ?6 del LA y del ALA mediante la acci?n de la ?6-desaturasa, a la cual le sigue el alargamiento de dos unidades de carbono de la cadena mediante la elongasa y la introducci?n de otro doble enlace en la posici?n ?5 mediante la ?5-desaturasa para formar el ?cido araquid?nico (C20:4n-6 o AA) y el ?cido eicosapentaenoico (C20:5n-3 o EPA), respectivamente. En el siguiente paso, 26 el AA y EPA son alargados mediante dos unidades de carbono a C22:4n-6 y C22:5n- 3 (n-3 DPA), respectivamente. Un alargamiento adicional de C22:4n-6 y C22:5n-3 mediante dos unidades de carbono produce C24:4n-6 y C24:5n-3, respectivamente. A continuaci?n, estos AGPIs C24 son desaturados por la ?6-desaturasa para producir C24:5n-6 y C24:6n-3. Esta es la misma enzima que desatura al LA y ALA.[119] El DHA se forma a partir de C24:6n-3 a trav?s de un acortamiento de la cadena por dos unidades de carbono durante un ciclo de la ruta ?-peroxis?mica. Mediante el mismo mecanismo de acortamiento de la cadena, el C22:5n-6 se produce a partir del C24:5n-6. Las dos rutas son independientes la una de la otra y no hay reacci?n cruzada. Sin embargo, ambas rutas emplean las mismas enzimas, por lo que las dos series compiten por las transformaciones. Puesto que el LA es el AGPI predominante en la dita humana y la ingesta de ALA es generalmente baja, los niveles de de los AGPIs n-6 derivados del LA tienden a ser m?s altos que los niveles de los AGPIs n-3 tanto en el plasma como en el interior celular. Por otro lado, algunos factores ambientales afectan a la actividad de las desaturasas ?5 y ?6 y por lo tanto, a la transformaci?n del LA y del ALA en sus correspondientes AGPIs. El colesterol de la dieta disminuy? la actividad de las desaturasas en ratas.[120, 121] Las dietas ricas en grasas tambi?n disminuyeron la actividad de las desaturasas en ratas.[121] La actividad de la ?5-desaturasa parece ser baja en personas con diabetes.[122, 123] Formaci?n de eicosanoides y docosanoides Los eicosanoides son importantes para el organismo porque controlan funciones cruciales sobre diversos procesos biol?gicos como la inflamaci?n y la hemostasia, se les conoce por su acci?n inmunomoduladoras y neuroprotectoras.[111, 124, 125] La formaci?n de eicosanoides se hace a partir de los AGPIs de C20 de las familias n-6 y n-3, tienen una vida muy corta y act?an de modo local en forma autocrina o paracrina. Los eicosanoides incluyen prostaglandinas (PG), prostaciclinas (PGI), tromboxanos (TX), leucotrienos (LT), ?cidos hidroperoxitetraenoicos (HPETE), ?cidos hidroxieicosatetraenoico (HETE) y lipoxinas (LX).[116] Hay dos rutas principales en las que participan dos enzimas micros?micas. La ciclooxigenasa (COX) transforma los ?cidos grasos C20 en prostanoides (PG, PGI y TX), mientras que la lipooxigenasa (LOX) los transforma en HPETE, los cuales se transforman r?pidamente en LT, HETE y LX.[126, 127] Los tres ?cidos grasos m?s importantes que participan en la producci?n de eicosanoides son el ?cido dihomo-?-linol?nico (DHGLA) el AA y el EPA. Puesto que su n?mero de dobles enlaces es diferente, cada uno de ellos da lugar a una serie diferente de eicosanoides. Los prostanoides de 27 la serie 1 y los leucotrienos de la serie 3 se forman a partir del DHGLA. Los prostanoides de la serie 2 y los leucotrienos de la serie 4 se forman a partir del AA, mientras que los prostanoides de la serie 3 y los leucotrienos de la serie 5 se producen a partir del EPA.[126, 128, 129] Adem?s de los eicosanoides, en los ?ltimos a?os se ha identificado un nuevo grupo de mediadores formados a partir del EPA por COX-2, denominadas resolvinas de serie E.[130] Las resolvinas son peque?as mol?culas derivadas del EPA y del DHA que inhiben la generaci?n de citoquinas, el reclutamiento de leucocitos, la diap?desis leucocitaria y la formaci?n de exudados.[131-133] M?s recientemente se han identificado derivados bioactivos del DHA, originados por la COX-2 y la LOX, que han sido denominados resolvinas de serie D y protectinas (neuroprotectinas D1) y que reciben el t?rmino gen?rico de docosanoides (Figura 6).[115, 116, 130, 134] 1.3.2. Propiedades biol?gicas Los dos ?cidos grasos esenciales, el LA y el ALA, as? como sus productos de cadena larga (AA, EPA y DHA) tienen importantes funciones fisiol?gicas en diferentes ?rganos. Tras incorporarse a los l?pidos estructurales, estos ?cidos grasos pueden modificar la fluidez y el espesor de la membrana y alterar las interacciones especificas con las prote?nas de membrana.[109, 110] Estudios en cultivos celulares han demostrado que los AGPIs n-3 pueden disminuir la expresi?n endotelial de una variedad de mol?culas de adhesi?n de los leucocitos inducidas por citoquinas y los productos prote?nicos secretados implicados en la incorporaci?n de leucocitos y la ampliaci?n local de la inflamaci?n.[111] Las citoquinas son una familia de prote?nas producidas y liberadas por las c?lulas implicadas en el proceso de inflamaci?n y en la regulaci?n del sistema inmunitario. El DHA, a diferencia del EPA, es eficaz a la hora de reducir la expresi?n endotelial de la E-selectina, la mol?cula de adhesi?n intercelular-1 (ICAM-1) y la mol?cula de adhesi?n celular vascular-1 (VCAM-1), y reduce la capacidad de los ligandos de los monocitos para adherirse al endotelio vascular observada tanto en cultivos celulares como en ratas.[135, 136] La magnitud de este efecto es paralela a la de la incorporaci?n del DHA a los fosfol?pidos celulares.[137] Otro papel biol?gico importante de los AGMIs n-3 y n-6 es la regulaci?n de las enzimas implicadas en el metabolismo lip?dico. Los AGMIs activan la expresi?n de los genes de transporte y oxidaci?n de ?cidos grasos (acil-CoA sintetasa, acil-CoA oxidasa, prote?na de uni?n de ?cidos grasos, carnitina palmitioiltransferasa-1 y citocromo P450A1) y reduce la expresi?n de genes que regulan la s?ntesis de novo de los l?pidos (la estearoil CoA desaturasa (SCD), la acetil-CoA carboxilasa y la sintasa 28 de ?cido grasos).[110, 138-140] Estudios en humanos y en modelos animales indican que los AGMIs ejercen estos efectos sobre la expresi?n g?nica mediante la regulaci?n de tres factores principales de la transcripci?n que controlan m?ltiples rutas involucradas en el metabolismo lip?dico. Los AGMI activan a los PPAR-? y reducen la concentraci?n nuclear de la prote?na de uni?n al elemento de respuesta a hidratos de carbono (ChREBP)/Max-like factor X (MLX) y de la prote?na de uni?n al elemento de respuesta a esteroles (SREBP-1).[110, 141] La acci?n de los PPAR? por los AGMIs asegura la oxidaci?n de los AGs, mientras que la reducci?n de las SREBP-1 y (ChREBP)/MLX tiene como resultado la inhibici?n de la s?ntesis de novo de los ?cidos grasos. Como tales, los AGMI promueven un cambio en el metabolismo hacia la oxidaci?n de ?cidos grasos y no hacia la s?ntesis de los AGs y su almacenamiento. El resultado de esta doble acci?n es un balance negativo de grasas. Los factores de transcripci?n muestran una respuesta diferencial a los AGMIs. El EPA es un potente activador de los PPAR-? y el DHA controla la abundancia nuclear de la SREBP-1. Por otra parte, la abundancia nuclear de la (ChREBP)/MLX, parece sensible por igual a una amplia gama de AGMIs n-3 y n-6 de carbonos C18-C22.[139] Los AGMIs n-3 y n-6 inhiben la sintasa de ?cidos grasos en el tejido adiposo. Los AGMIs tambi?n reprimen la transcripci?n del gen de la leptina. Se ha relacionado el aumento de los niveles plasm?ticos de leptina con una mayor adiposidad, mientras que la p?rdida de peso tiene como resultado la disminuci?n de los niveles plasm?ticos de leptina.[142] La sustituci?n de los AGSs por los AGMIs en la dieta provoca una disminuci?n en los niveles plasm?ticos de leptina.[143, 144] Los eicosanoides derivados del AA y EPA, as? como los docosanoides derivados de DHA est?n involucrados en varios procesos biol?gicos entre los que se incluyen la modulaci?n de la inflamaci?n, la agregaci?n plaquetaria, la respuesta inmunitaria, el crecimiento y proliferaci?n celular, y la contracci?n y la dilataci?n de las c?lulas del musculo liso.[111, 112] Los eicosanoides derivados del EPA son generalmente menos potentes que los derivados del AA. Este es el caso, por ejemplo, de la PGI y el TX. El TX se produce en las plaquetas mientras que la PGI se origina en el endotelio vascular. El TXA2 derivado del AA es un potente agregante plaquetario y vasoconstrictor mientras que la PGI2 es antiagregante y vasodilatadora. La PGI3, derivada del EPA, tiene tambi?n acci?n antiagregante. Sin embargo, el TXA3, derivado del EPA, es muy poco agregante. Un desequilibrio en la s?ntesis de eicosanoides en los tejidos puede conducir al desarrollo de ciertas patolog?as, entre las que se incluyen la trombosis, la enfermedad renal, el asma, enfermedades inflamatorias intestinales y otros trastornos inflamatorios.[110, 111] 29 1.3.3. Aplicaciones preventivas y modo de acci?n Diferentes autoridades sanitarias y asociaciones cient?ficas han establecido algunas recomendaciones de consumo de EPA y DHA. La Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) recomienda 250 mg/d?a para la poblaci?n en general[145] y la OMS ha establecido recientemente nuevas recomendaciones de ingesta para adultos (250 mg/d?a de EPA+DHA) y para mujeres embarazadas o en periodo de lactancia (300 mg/d?a EPA+DHA, de los cuales 200 mg deben ser de DHA).[146] Asimismo, para los individuos con hipertrigliceridemia, la Asociaci?n Americana del Coraz?n (AHA) recomienda 2-4 g/d?a de EPA+DHA,[146] y para las personas con ECV, esta misma asociaci?n recomienda 1 g/d?a[146] para ayudar a mantener la funci?n card?aca, reducir los niveles de TG y tambi?n, el riesgo de cardiopat?a coronaria. a) Efecto de EPA y DHA en el SM Se ha observado que en personas y en modelos animales con SM, el uso de EPA y DHA ofrece beneficios mediante la reducci?n de algunos factores de riesgo. Sin embargo, por el momento, no existen recomendaciones de consumo. ? Efectos sobre los l?pidos en sangre. Diferentes estudios han demostrado que el EPA y el DHA disminuyen los l?pidos plasm?ticos en humanos.[147] Asimismo, en ratones se ha observado que previenen la obesidad y la hipertrofia de los adipocitos.[148] Esto se debe probablemente a que el EPA y el DHA aumentan la ?-oxidaci?n en el tejido adiposo y en el h?gado, e inhiben la lipog?nesis, esto tambi?n trae como consecuencia la reducci?n de la VLDL.[149, 150] ? Efecto en la presi?n arterial (PA). La p?rdida de peso disminuye la PA en humanos debido a la ingesta de EPA y DHA.[151] No obstante, existen otros mecanismos por los cuales los AGPIs n-3 afectan de forma directa la PA. Se ha observado en ratas que la incorporaci?n de EPA y DHA a los fosfol?pidos de las membranas celulares ayuda a la elasticidad y a mantener el tono muscular.[152] Asimismo, estudios en animales de experimentaci?n han demostrado que la administraci?n de DHA producen un aumento de la liberaci?n de ON, que ayuda a la relajaci?n muscular.[153] ? Efectos sobre la glucemia. Estudios en seres humanos no presentan una evidencia clara sobre los efectos ben?ficos del EPA y el DHA sobre el metabolismo de la glucosa.[147, 154, 155] No se detectaron cambios en la concentraci?n de la HbA1C.[147] Pero en modelos animales los AGPIs n-3 30 reducen la RI, mejora la tolerancia a la glucosa y aumenta los niveles de adiponectina, un efecto que podr?a estar mediado por PPAR-?.[156] ? Efectos sobre marcadores de inflamaci?n. Se ha observado que los AGPIs n-3, entre ellos el EPA y el DHA, compiten con el AA n-6 en la formaci?n de mediadores de inflamaci?n y son menos inflamatorios los derivados de la serie n-3 (Figura 6).[157] Por otro lado, se ha demostrado que EPA y DHA inhiben la expresi?n de citoquinas proinflamatorias, como IL-1?, IL-6, TNK-?, MCP-1 o PAI-1. Adem?s, EPA y DHA afectan de forma directa las v?as de se?alizaci?n intracelular asociada con factores de transcripci?n, factor nuclear-?B (NF-?B) y PPAR-?, que regulan la expresi?n de una serie de genes cuyos productos son proinflamatorios.[158] Estudios in vitro e in vivo en animales y en humanos han demostrado el papel antiinflamatorio de resolvinas de la serie E derivadas del EPA y de la serie D y protectinas D1 derivadas del DHA.[110, 125, 137] b) Aterosclerosis La inflamaci?n es uno de los factores en el origen de la aterosclerosis. Marcadores de inflamaci?n tales como PCR, IL-6 y TNF-? son tambi?n marcadores de riesgo de ECV. PCR es un marcador inflamatorio sintetizado primariamente por los hepatocitos en respuesta al IL-6, TNF-?, y otras citoquinas, datos recientes en humanos y en modelos animales sugieren su importante papel en la arterog?nesis.[137, 159] c) C?ncer Estudios en humanos y modelos animales han demostrado que la ingesta de pescado o AGPIs n-3 reduce el riesgo de aparici?n de c?ncer.[160-162] Las hip?tesis sobre los mecanismos se centran en los efectos antiinflamatorios de los AGPIs n- 3.[155, 162] Las c?lulas cancer?genas necesitan poner en marcha los mecanismos de inflamaci?n para asegurar su crecimiento, por ello segregan mediadores inflamatorios (p.e. citoquinas, prostaglandinas).[112] El sistema inmunol?gico en humanos y modelos animales, se ve fortalecido por el consumo de omega-3, poniendo en alerta a las c?lulas naturales asesinas (NK) que destruyen c?lulas anormales.[114, 163] 31 1.4. POLIFENOLES 1.4.1. Definici?n, biodisponibilidad y metabolizaci?n Los efectos beneficios sobre la salud del consumo de una dieta rica en frutas y vegetales se ha relacionado con la presencia de compuestos polifen?licos, principalmente por su capacidad de captar radicales libres oxidantes potencialmente t?xicos. Por esta raz?n se considera que los polifenoles son antioxidantes. Actualmente, se piensa que los polifenoles y sus metabolitos pueden regular funciones celulares y tisulares mediantes mecanismos relacionados con su capacidad antiradicalaria o con otras propiedades estructurales.[164, 165] Los polifenoles poseen un anillo arom?tico con uno o m?s grupos hidroxilo adem?s de otros grupos funcionales, tales como ?steres, metil?steres y gluc?sidos entre otros.[166] Se acumulan en cantidades relativamente altas en plantas donde podr?an ejercer diversas funciones: atrayentes de animales para la polinizaci?n y propagaci?n de semillas; agentes protectores contra la luz ultra violeta (UV), mol?culas se?alizadores en las interacciones entre las plantas y el medio ambiente, entre otras.[167] Entre los compuestos polifenolicos frecuentes en los alimentos se pueden distinguir dos grandes familias, los no flavonoides y los flavonoides, constituidas cada una de ellas por diferentes subfamilias de compuestos. Los no flavonoides se clasifican en ?cidos fen?licos (20), estilbenos (21) y taninos hidrolizables (22) (Figura 7a). Los flavonoides, presentan un esqueleto b?sico com?n (Figura 7b), que permite una multiplicidad de patrones de sustituci?n y variaciones en el anillo C. En funci?n de sus caracter?sticas estructurales los flavonoides se pueden clasificar en flavonoles (23), flavonas (24), isoflavonas (25), flavan-3-oles (26), flavanonas (27), y antocianidinas (28) (Figura 7). La polimerizaci?n por bios?ntesis de unidades de flavan-3-oles, (26) forma los taninos condensados (29), tambi?n conocidos como procianidinas. El enlace de uni?n entre los mon?meros es C4-C6 ? C4-C8, generalmente.[167] 32 COOHHO HO HO OH HO HO O OH HO OH OH OH O HO OH HO C O HO HO HO C O OH OH OHCO OH OHHO C O HO HO HO C O O OOH HO OH OH OHO OH OH OH OH A O C B O OH OHOH HO O O OH OH HO O OH OH OH OH HO ?cido g?lico (20) (?cidos fen?licos) a) b) Resveratrol (21) (Estilbenos) Pentagaloilglucosa (22) (Taninos hidrolizables) 1 2 3 45 6 7 8 1` 2` 3` 4` 5` 6` Esqueleto com?n de los flavonoides Quercetina (23) (Flavonoles) Geniste?na (25) (Isoflavonas) Luteolina (24) (Flavonas) Cianidina (28) (Antocianidinas) Naringenina (27) (Flavanonas) (epi)catequina (26) (Flavan-3-oles) O OH OH OH OH HO O OH OH OH OH HO (epi)catequina-(4? 8)-(epi)catequina (29) (Tanino condensado) OOO OO O Bios?stesis Figura 7. Clasificaci?n de los polifenoles. a) No flavonoides, b) Flavonoides.[165, 167] Biodisponibilidad de polifenoles La biodisponibilidad de un nutriente es su concentraci?n en sangre a un tiempo determinado tras la ingesta y se entiende com?nmente como ?la proporci?n de nutriente que se digiere, se absorbe y se metaboliza a trav?s de las rutas metab?licas habituales de asimilaci?n del organismo?.[168, 169] La biodisponibilidad de un compuesto implica procesos de liberaci?n, absorci?n, distribuci?n, metabolismo y excreci?n (Figura 8).[170] Existen numerosos factores que pueden afectar la biodisponibilidad de un compuesto. Estos factores pueden ser clasificados como ex?genos (estructura qu?mica del compuesto, matriz del alimento, solubilidad, ionizaci?n, concentraci?n) y end?genos (el tracto 33 intestinal, la velocidad de vaciado g?strico, interacci?n con prote?nas, competencia por los transportes de membrana y el metabolismo). La interacci?n de todos estos factores puede dar lugar a grades variaciones inter- e intra-individuos.[171] Polifenoles dieta intestino delgado Colon/transformaci?n col?nica Heces Bilis H?gado Tejidos Ri??n Liberaci?n Orina Enterocitos, Pared intestinal Compuestos no absorbidos Eliminaci?n Eliminaci?n Metabolismo Metabolismo Absorci?n Absorci?n Eliminaci?n Distribuci?n Figura 8. Proceso de liberaci?n, absorci?n, distribuci?n y eliminaci?n de los polifenoles consumidos a trav?s de diferentes v?as del organismo.[170] La mayor?a de los polifenoles est? presente en los alimentos como ?steres, gluc?sidos o pol?meros, formas que no se pueden absorber. Para su liberaci?n, absorci?n y su posterior distribuci?n a diferentes ?rganos como cerebro, test?culos, tejido muscular y sangre, los flavonoides son hidrolizados. As?, la quercetina 4?- glucosa y genistina-7-glucosa (u otros flavonoides conjugados con una glucosa) son r?pidamente hidrolizados en la saliva y absorbidos por las c?lulas epiteliales bucales. Este mecanismo de hidr?lisis se realiza gracias a las ?-glucosidasas, aunque tambi?n se ha comprobado que las bacterias de la cavidad bucal humana desempe?an un papel importante en este proceso.[172] Otros grupos de flavonoides como las antocianinas, son hidrolizados en el intestino a la forma de aglicona mediante la enzima hidrolasa florizina lactasa y posteriormente absorbidos.[173] Otros estudios en cultivos celulares, sugieren que los gluc?sidos son absorbidos intestinalmente v?a transporte sodio dependiente (SGLT-1).[174] 34 Los flavan-3-oles que se encuentran de forma libre monom?rica son f?cilmente absorbibles por procesos de transporte de difusi?n pasiva. En el caso de los ?steres de galato, existen evidencias de que el ?cido g?lico en humanos es liberado mediante enzimas esterasas.[175] La absorci?n de olig?meros y pol?meros de flavan-3-ol es un tema controvertivo. Algunos autores que han empleado modelos animales sugieren que ni los olig?meros ni los pol?meros pueden ser absorbidos por los enterocitos (c?lulas que forman la pared intestinal) de manera que llegan intactos al colon donde posteriormente son degradados por las bacterias colonicas.[176] Sin embargo, otros investigadores han observado la absorci?n de olig?meros en el intestino tras una previa hidr?lisis de sus unidades monom?ricas.[177-179] Por otro lado, recientes estudios han detectado d?meros en el torrente sangu?neo de ratas indicando que, al menos algunos olig?meros de peque?o tama?o pueden ser absorbidos.[180] Los principales objetivos de los estudios de biodisponibilidad son determinar cu?les son los polifenoles que mejor se absorben, valorar qu? polifenoles dan lugar a metabolitos activos, y caracterizar la actividad biol?gica de estos metabolitos. Para estudiar indirectamente la biodisponibilidad de los polifenoles se puede evaluar el incremento en la capacidad antioxidante del plasma tras el consumo de alimentos ricos en estos compuestos.[181] Para realizar estudios directos de biodisponibilidad, se puede medir la concentraci?n del compuesto en el plasma y en la orina tras la ingesti?n de alimentos con cantidades conocidas, de los polifenoles que se quieren analizar.[182] Metabolismo o biotransformaci?n de polifenoles En general, el metabolismo o biotransformaci?n de los polifenoles se produce a trav?s de una secuencia de reacciones com?n para todos ellos, que es similar a la detoxificaci?n metab?lica que sufren muchos xenobi?ticos para reducir su potencial efecto citot?xico e incrementar su hidrofilicidad o hidrofobicidad para facilitar su eliminaci?n urinaria o biliar (Figura 8).[183] Las transformaciones metab?licas que sufren los polifenoles, pueden ser llevadas a cabo por enzimas, presentes en el tejido intestinal u otros ?rganos. Estas transformaciones incluyen procesos tales como: hidr?lisis, reducci?n, descarboxilaci?n, apertura de anillos heteroc?clicos (como el anillo C de los flavonoides).[164, 165] a) Transformaciones enzim?ticas Los procesos enzim?ticos de biotransformaci?n son clasificados como procesos de fase I y de fase II. Las biotransformaciones dependen de la polaridad de los compuestos, principalmente. No todos los compuestos xenobi?ticos sufren las dos 35 biotransformaciones, algunos ?nicamente son sometidos a biotransformaciones de fase I y otros sufren biotransformaci?n de fase II. Sin haber sufrido previamente la fase I.[184] ? Biotransformaci?n de fase I. Se realizan cambios relativamente peque?os en las mol?culas. Oxidaci?n, reducci?n e hidrolisis son las biotransformaciones de Fase I m?s comunes, la finalidad es adicionar grupos funcionales como (-OH), carboxilos (-COOH) o (-NH2) para aumentar la polaridad de los compuestos y permitir posteriores reacciones de conjugaci?n en la mol?cula. Estas reacciones son mediadas fundamentalmente por enzimas del complejo citocromo P-450, localizadas en el ret?culo endoplasm?tico y mitocondrias de las c?lulas. La mayor concentraci?n de este tipo de enzimas se encuentran en las c?lulas del h?gado, aunque tambi?n se ha detectado una actividad considerable en la pared intestinal, ri?ones, pulmones e incluso cerebro.[185] Otras enzimas como las alcohol deshidrogenasas o las esterasas tambi?n participan en las biotransformaciones de fase I. Los flavonoides debido a su polaridad no suelen verse afectados por este tipo de biotransformaciones. ? Biotransformaci?n de fase II. Se realizan reacciones de conjugaci?n catalizadas por enzimas tipo transferasas que permiten eliminar f?cilmente a los xenobi?ticos o polifenoles por la orina o la bilis. A continuaci?n se describen estos tipos de reacciones (Figura 9). La glucuronidaci?n es la reacci?n de conjugaci?n m?s frecuente. Las enzimas encargadas de esta reacci?n son las uridina glucuroniltransferasas (UGT) que utiliza el UDP-glucuronido como cofactor, los flavonoides sufren este tipo de transformaciones y son considerados como buenos sustratos para estas enzimas (Figura 9).[186] Las UGTs est?n localizadas en el ret?culo endoplasm?tico, principalmente, en las c?lulas hep?ticas, aunque tambi?n est?n presentes en otros tejidos como, intestino, bazo, ri??n, piel y test?culos.[187] 36 La reacci?n de sulfataci?n consiste en la transferencia de un grupo sulfato desde el cofactor 3?-fosfoadenosil-5?-fosfosulfato (FAF) a un grupo hidroxilo de los flavonoides. La reacci?n es catalizada por la fenol sulfotransferasa (FST) en el citosol de c?lulas de h?gado, ri??n, intestino y pulmones. Las enzimas pueden conjugar m?s de un grupo hidroxilo en la misma mol?cula. El sulfato inorg?nico libre necesario para la s?ntesis de FAFs puede ser un factor limitante de esta reacci?n y genera variaciones inter/intra-individuos.[188] Cuando un flavonoide se conjuga con un sulfato se convierte en un compuesto ionizado, soluble en agua que se excreta por la orina. La enzima catecol-O-metil-transferasa (COMT) es la encargada de transferir un grupo metilo a uno de los hidroxilos que forman parte de grupo catecol en presencia de Mn2+ utilizando compuestos donadores de grupos metilos la S-adenosil metionina (SAM).[189] Las COMTs se encuentran en el citosol de casi todas las c?lulas y al igual que las otras enzimas implicadas en los procesos de biotransformacion de fase II, el h?gado es el tejido donde se concentra un mayor n?mero.[190] La glutationizacion, que consiste en la adici?n de glutati?n reducido (GSH), a trav?s de un grupo sulfhidrilo, y la aminoacidaci?n, que consiste en la formaci?n de una uni?n pept?dica entre el grupo amino de la glicina y un carboxilo en el xenobi?tico, son otras reacciones de biotransformaci?n de fase II. O OH OH O OH HO O HO COOH OH OH O O OH OH OH HO O HO COOH OH OH O OH O OH OH HOO OH O OH OH HO S OH OO Uridina glucuroniltransferasas (UGT) Glucuronidaci?n Sulfataci?n Fenol sulfotransferasas (FST) Metilaci?n Catecol-O-metil-transferasas (COMT) Figura 9. Algunas transformaciones enzim?ticas de (epi)catequina en las c?lulas epiteliales humanas del intestino delgado.[165] 37 b) Transformaciones producidas por la microbiota intestinal El intestino esta colonizado por un elevado n?mero de microorganismos (en el colon, m?s de 1012 microrganismos/cm3), que viven en simbiosis con los organismos a los que colonizan. Las bacterias del tracto gastrointestinal contribuyen a aumentar el rendimiento de la digesti?n, fermentando prote?nas y carbohidratos que no fueron digeridos en el intestino delgado, produciendo adem?s, ?cidos grasos de cadena corta (butirato, acetato, propionato) que son utilizados como fuente de energ?a para el organismo.[191, 192] A diferencia de las transformaciones enzim?ticas que producen compuestos polares de mayor tama?o molecular, las transformaciones llevadas a cabo con la microbiota intestinal consisten fundamentalmente en reacciones de reducci?n, hidrolisis y rotura de anillos que generen compuestos menos polares de bajo peso molecular.[164, 193] Los flavonoides y otros xenobi?ticos que no son absorbidos en el intestino delgado, llegan intactos al intestino grueso donde se exponen a la actividad de los microorganismos. A estos se les suman los flavonoides que han sido absorbidos y excretados al interior del intestino por la bilis, o aquellos que son absorbidos en los enterocitos y devueltos al tracto gastrointestinal (Figura 8).[194, 195] Estudios in vitro[196, 197] e in vivo[198] han demostrado que los flavonoides tanto monom?ricos como oligom?ricos (Figura 10), son degradados a compuestos fen?licos m?s peque?os tras la abertura del anillo C.[164] Los compuestos resultantes pueden sufrir posteriormente reacciones de conjugaci?n de fase II principalmente en h?gado. 38 O OH OH OH HO OH O OH OH OH HO O OH OH OH HO OH OH OH OH OH HO OH A C B 26 3,4-Dihidroxifenilvalerolactona (33) 29 OH OH O HO ?cido 3,4-dihidroxifenilac?tico (30) OH O HO ?cido 3-hidroxifenilac?tico (31) OH O O HO ?cido 3-metoxi-4-hidroxifenilac?tico (32) OO OH OH 3-hidroxifanilvalerolactona (49) OO OH O OH OH OH O OH OH O O OH OH ?cido ferulico (47) ?cido m-cum?rico (45) O OH OH ?cido 3-hidroxifenilpropi?nico (46) O OH OH ?cido 3,4-dihidroxifenilpropi?nico (35) O OH OH OH OH OH HO OH OH HO OH OH ?cido 3-hydroxihip?rico (44) ?cido 4-hydroxihip?rico (42) H NHO O O H NHO O O OH ?cido 3-hydroxibenzoico (43) ?cido 3,4-dihidroxibenzoico (39) HO OH ?cido 4-hydroxibenzoico (41) OH HO OH ?cido vainillinico (40) OH O ?cido cafeico (37) O OH OH OH ?cido p-cum?rico (36) O OH OH ?cido ferul?co (38) O OH OH OH ?cido 3,4-dihidroxifenilval?rico (34) ?cido 3-hidroxifenilval?rico (48) Figura 10. Transformaciones producidas por la microbiota intestinal y posterior metabolizaci?n hep?tica de (epi)catequinas y procianidinas.[164] 1.4.2. Propiedades biol?gicas Existen diversas especies de ox?geno altamente reactivas (especies reactivas de nitr?geno, ERN y especies reactivas de ox?geno, ERO), como ON, ox?geno singlete (1O2), ani?n super?xido (O2.-) o radicales hidroxilo (OH.), entre otras, que son regularmente producidas en el organismo. Se ha observado en humanos y en modelos animales que estas especies reactivas pueden causar da?o a l?pidos, prote?nas y ?cidos nucleicos y participar en la g?nesis de patolog?as diversas y del envejecimiento, y que los polifenoles podr?an modular sus efectos.[199-201] Los compuestos polifenolicos, entre ellos los flavonoides, son considerados como antioxidantes gracias a la capacidad de captar radicales libres. Los grupos hidroxilo que forman parte de la estructura donan electrones o hidrogeniones inactivando a los radicales. El radical fenoxilo generado es poco reactivo, debido a que est? estabilizado por resonancia con los electrones pi del anillo arom?tico (Figura 11). 39 Entre las caracter?sticas estructurales con mayor influencia sobre la eficacia antioxidante y captadora de radicales de los flavonoides se encuentran[202] ? Presencia de dos grupos hidroxilo en posici?n orto (catecol) en el anillo B, que le confiere mayor estabilidad a la forma radical y participa en la deslocalizaci?n de los electrones. ? Un doble enlace entre C2-C3 conjugado con la funci?n 4-oxo del anillo C que es responsable de la deslocalizaci?n de los electrones en el anillo B. ? Presencia de dos grupos hidroxilos en posici?n meta posiciones C5 y C7. Diversos estudios indican que aunque la quercetina cumple con estas tres caracter?sticas estructurales por lo que presumiblemente ser? un antioxidante m?s potente que otros flavonoides como la cianidina, la cual carece de la segunda caracter?stica estructural, al comparar sus actividades antioxidantes, dieron resultados similares.[203] La naturaleza qu?mica de posibles sustituyentes (galatos, az?car, entre otros) y la posici?n del hidroxilo al que se unen determinan propiedades, tales como solubilidad y facilidad de donaci?n de electrones, que son importantes en la capacidad antioxidante.[203] Los flavonoides y los taninos (tanto los hidrolizables como, los condensados (Figura 7) presentan capacidad quelante que contribuye a la actividad antioxidante. Metales, como hierro y cobre, forman parte de las ferroprote?nas y otros complejos necesarios en el organismo. Generalmente estos complejos se encuentran en su OHO O. OH OHO O OH Otras especies oxidasas olig?meros, pol?meros Semiquinona radical orto-quinona Rad. Rad. Rad-H Rad-H 23 OH OH A O C B1 2 3 45 6 7 8 1` 2` 3` 4` 5` 6` OH OH OH HO O O O OH OH O Figura 11. Mecanismo de captaci?n de radicales libres (Rad.) de la quercetina. 40 forma inactiva (oxidada) (Fe3+), (Cu2+). Sin embargo, cambios de pH en el medio pueden generar la forma activa (reducida) (Fe2+) (Cu1+) que interviene en la reacci?n de Fenton transformando per?xidos de hidr?geno (especie poco reactiva) en el radical hidroxilo (altamente reactivo) (Figura 12a).[204] Los flavonoides act?an impidiendo la reacci?n de Fenton, mediante el secuestro de hierro u otro metal. La presencia del grupo catecol del anillo B (Figura 12b) parece ser determinante en la quelaci?n de metales.[205] La actividad quelante puede ser independiente de la actividad de los flavonoides como captadores de radicales libres.[206] H2O2 Fe 2+(Cu1+) OH. OH- Fe3+(Cu2+)+ a) + + OHO OH OH OH OHO OH O OH Mn+ OHO HO O OH OHO OH OH OH b) O HO OHO M n+ H H Mn+ Figura 12. a) Reacci?n de Fenton. b) Mecanismo de quelaci?n de metales por parte de la (epi)catequina.[204, 206] Por otro lado, algunos flavonoides han sido directamente relacionados con una actividad pro-oxidante y mutag?nica.[207, 208] La actividad pro-oxidante podr?a relacionarse[209] con presencia de un grupo pirogalol, en el anillo B, como factor clave capaz de iniciar la formaci?n de H2O2[208] y en algunos casos, en presencia de ERN o ERO, provocar incluso lesiones en el ADN.[210] Existe evidencia de que el enlace insaturado entre el carbono C2-C3 junto con la funci?n 4-oxo del anillo C de las flavonas tambi?n pueden promover la formaci?n de ERO en presencia de Cu+2.[209] Precisamente conjugaci?n que sufren los grupos hidroxilos in vivo indica que el organismo tiende a atenuar el comportamiento pro-oxidante de los flavonoides.[211] Adem?s, se ha observado in vitro que la vitamina C aten?a la formaci?n de ERO por los flavonoides.[212] 41 1.4.3. Aplicaciones preventivas y modo de acci?n Estudios epidemiol?gicos han demostrado que la dieta Mediterr?nea contribuye a disminuir el riesgo de padecer patolog?as cr?nicas como son ECV,[213] la obesidad,[214] la diabetes[215] y algunos tipos de c?ncer.[216] Esta dieta tiene como base una elevada ingesta de frutas y verduras ricas en productos antioxidantes. La evidencia acumulada en las ?ltimas d?cadas apunta a que los polifenoles podr?an contribuir de manera significativa a los efectos beneficiosos de la dieta mediterr?nea.[217, 218] A continuaci?n, se expone los efectos de estos compuestos sobre la salud. a) Efecto de los polifenoles en el SM En el caso de las personas con SM, el uso de polifenoles podr?a ofrecer beneficios mediante la reducci?n de algunos factores de riesgo. Sin embargo, pocos estudios han investigado los efectos de estos compuestos en este tipo de sujetos y por el momento, no existen recomendaciones de consumo aunque entre las recomendaciones para la prevenci?n del SM, se aconseja elevar el consumo de frutas y verduras. ? Efectos sobre la obesidad. Algunos de los flavonoides m?s estudiados tanto en humanos como en modelos animales para el tratamiento de la obesidad son los extra?dos del t? cuyos compuestos mayoritarios son las catequinas, principalmente (?)-epicatequina (EC), (?)-epicatequina-3-galato (ECG), (?)- epigalocatequina (EGC) y (?)-epigalocatequina-3-galato (EGCG).[219] Los extractos de hojas del t? mostraron una importante actividad hipolipemiante en ratas despu?s de 63 semanas de tratamiento.[220] Se ha observado que los polifenoles del t? estimulan la absorci?n de glucosa acompa?ada de una reducci?n en la translocaci?n del transportador de glucosa-4 (GLUT-4) en el tejido adiposo, mientras que en el m?sculo esquel?tico el aumento de absorci?n de glucosa se acompa?a de un aumento en la translocaci?n de GLUT-4 a la membrana celular. Adem?s, estos polifenoles suprimen la expresi?n de PPAR? y activan SREBP-1 en el tejido adiposo. En resumen, los polifenoles del t? muestran efectos biol?gicos en la prevenci?n de la obesidad modulando la absorci?n de glucosa en el tejido adiposo y en el m?sculo esquel?tico y suprimiendo la expresi?n de factores de transcripci?n relacionados con la adipog?nesis.[221] ? Efectos sobre los l?pidos sangu?neos. Polifenoles como los flavanoles, taninos y chalconas inhiben la LPL.[222] Un flavonoide con actividad inhibitoria de la LPL es la hesperidina, obtenida de la c?scara de Citrus 42 unshiu.[223] Las proantocianidinas en ratas reducen la concentraci?n plasm?tica de TG bloqueando la absorci?n de l?pidos de la dieta[224] e inhiben enzimas digestivos como la tripsina, la amilasa y la lipasa.[225] De hecho, se ha observado en ratones que los polifenoles pueden actuar sobre el metabolismo lip?dico incidiendo en la actividad de la ?-6 desaturasa[226] y la expresi?n del gen de la ?-9 desaturasa.[227, 228] ? Efectos en los marcadores de inflamaci?n. El EO produce un aumento de enzimas tales como la COX y la LOX, implicadas en la liberaci?n de factores tales como interleuquinas y quimiocinas. Se ha demostrado que los polifenoles, y especialmente la quercetina, inhiben la COX y la LOX.[229] Estudios en humanos y modelos animales, indican que el resveratrol presenta acci?n antiinflamatoria, ya que es capaz de inhibir la bios?ntesis de prostaglandinas.[230] Badia y colaboradores observaron que el consumo moderado de vino tinto en humanos era capaz de reducir la adhesi?n de los monocitos a las c?lulas endoteliales, y este efecto se relacionaba con la regulaci?n de las mol?culas de adhesi?n localizadas sobre la superficie del monocito.[181] Los polifenoles del cacao, han mostrado propiedades antioxidantes y antiinflamatorias, que ayudan a modular y a mejorar los mediadores inflamatorios, en personas o en modelos animales con alto riesgo de ECV.[182, 231, 232] b) Aterosclerosis La oxidaci?n del LDL-c mediada por macr?fagos es un marcador de la arteriosclerosis temprana y depende del estado oxidativo del LDL-c y de los macr?fagos.[233] La relaci?n inversa entre el consumo de polifenoles de la dieta y enfermedades cardiovasculares puede ser debida a la capacidad de estos compuestos de atenuar la oxidaci?n del LDL-c, la formaci?n de las c?lulas espumosas y con ello de la arteriosclerosis.[234, 235] Por otro lado, los polifenoles pueden reducir la peroxidaci?n de los l?pidos del LDL-c eliminando radicales libres, o provocando quelaci?n de metales de transici?n (Cu1+, Fe2+), de efectos proxidantes reconocidos.[236] Polifenoles como la miricetina y la fisetina reducen la oxidaci?n del LDL-c y disminuyen la expresi?n de receptores scavenger clase B (CD36) (receptor cuya expresi?n se incrementa en la diferenciaci?n de monocitos a macr?fagos; se ha observado en cultivos celulares que desempe?a un papel clave en la formaci?n de la c?lula espumosa).[237] Ambas acciones favorecen la reducci?n de la formaci?n de c?lulas espumosas y por lo tanto son considerados protectores contra la 43 aterosclerosis. Cabe se?alar tambi?n, que estudios en humanos indican que los macr?fagos ubicados en las placas de ateroma pueden absorber conjugados de quercetina y convertirlos de nuevo a quercetina activa.[238] El mismo mecanismo (prevenci?n de la oxidaci?n del LDL-c y reducci?n de la expresi?n de CD36) se ha descrito para ECG, el kaempferol y la rhamnocitrina que, curiosamente, parece ejercer esta acci?n espec?ficamente en las lesiones ateroscler?ticas en humanos.[239, 240] Lo mismo se ha observado en modelos animales con la catequina, epicatequina, y epigalocatequina.[241, 242] Se ha demostrado que el resveratrol ejerce efectos protectores en el desarrollo de la placa ateroscler?tica en ratones, ya que disminuye la expresi?n de VCAM-1 y ICAM-1 en los vasos sangu?neos.[243] c) C?ncer Se ha observado una relaci?n entre un alto consumo de frutas y verduras y un menor riesgo de desarrollar diferentes tipos c?ncer. En general, se cree que los mecanismos de estos efectos beneficiosos se deben a la inhibici?n de la fosfolipasa A2, cicloxigenasa, fosfodiestearasa y varias prote?nas quinasa vinculadas a la se?alizaci?n celular.[244, 245] Las tirosinas-quinasas son enzimas necesarias para el funcionamiento de numerosos receptores de factores de crecimiento. La fosforilaci?n de la tirosina desempe?a un importante papel en la proliferaci?n celular. La geniste?na ha demostrado ser un inhibidor de la actividad de la tiroxina-quinasa.[246] Por otro lado, las topoisomerasas son enzimas que alteran la conformaci?n del ADN, y son cruciales para la divisi?n celular.[247] La geniste?na es un potente inhibidor de estas enzimas.[248] La quercetina, fisetina y morina tambi?n inhiben las ADN topoisomerasas I y II en humanos, mientras que el kaempferol s?lo inhibe la ADN topoisomerasa II.[249] Uno de los principales factores proinflamatorios liberados por las c?lulas cancerosas es el NF-?B y se ha observado en c?lulas cancerosas humanas que las catequinas del t? verde y la geniste?na inhiben su secreci?n.[250, 251] En el tracto gastrointestinal, donde los polifenoles de la dieta son especialmente bioaccesibles, las prontocianidinas polim?ricas podr?an ejercer un efecto protector frente a la tumorig?nesis, a trav?s de distintos mecanismos, tal como se ha observado en ratas y ratones.[252, 253] 44 H H OHHO OH HO OH Nojirimicina (50) (NJ) H H OHHO OH OH 1-Deoxinojirimicina (51) (DNJ) 1.5. IMINOCICLITOLES 1.5.1. Definici?n y antecedentes hist?ricos Los iminociclitoles, tambi?n llamados iminoaz?cares o alcaloides polihidroxilados, son heterociclos que resultan de la sustituci?n del ?tomo de ox?geno endoc?clico del carbohidrato por un ?tomo de nitr?geno. Por su analog?a estructural con los carbohidratos, se les considera glicomim?ticos. La configuraci?n de los grupos hidroxilo y la distribuci?n de cargas que confiere el ?tomo de nitr?geno son caracter?sticas esenciales que definen su actividad sobre glicosidasas y glicosiltransferasas.[254-256] El primer alcaloide polihidroxilado aislado de fuentes naturales fue la nojirimicina (NJ) (50, Figura 13)) que se describi? en 1966.[257] La 1- deoxinojirimicina (DNJ) (51, Figura 13) fue inicialmente sintetizada a partir de NJ por eliminaci?n del grupo hidroxilo anom?rico; posteriormente se aisl? de plantas y cultivos bacterianos.[257, 258] Figura 13. Primeros iminociclitoles naturales descritos. Desde finales del siglo XX, el n?mero de iminociclitoles aislados de fuentes naturales como plantas, bacterias y hongos, se ha incrementado de manera espectacular, desarroll?ndose al mismo tiempo una amplia variedad de estrategias sint?ticas que han permitido el acceso a este tipo de compuestos, que en algunos casos s?lo se pueden aislar de las fuentes naturales en cantidades muy reducidas. Desde un punto de vista estructural est?n clasificados en siete clases: pirrolidinas (52), piperidinas (53), azepanos (54), pirrolizidinas (55), indolizidinas (56), quinolizidinas (57), y nortropanos (58) (Figura 14). 45 N OH HO HO OHH Castanospermina (56) (Indolizidina) N HO OH HO Nectrisina (52) (Pirrolidina) Calistegina A3 (58) (Nortropano) N HO OHHHO HO Australina (55) (Pirrolizidina) N H OH H 1-Desoxiadenoforina (53) (Piperidina) OH H N HO OH OH HO Azepano (54) (Azepano) N Lupinina (57) (Quinolizidina) H OH N OH OH OH H H HO 1.5.2. Propiedades biol?gicas Los iminoaz?cares, por ser an?logos de az?cares, pueden ocupar su lugar en ciertas reacciones enzim?ticas, especialmente en la hidr?lisis o formaci?n de los enlaces glicos?dicos de oligosac?ridos y glicoconjugados, catalizados por las glicosidasas y glicosiltransferasas.[259, 260] Las glicosidasas y glicosiltransferasas juegan un papel fundamental en algunos procesos bioqu?micos como la digesti?n de los alimentos, el catabolismo de glicoconjugados en los lisosomas celulares, o en los procesos de post-traducci?n de glicoprote?nas. Una caracter?stica notable de estas enzimas es su selectividad, ya que son capaces de discriminar tanto los monosac?ridos constituyentes como el tipo de enlace glicos?dico (? o ?). El mecanismo general de acci?n de glicosidasas y glicosiltransferasas fue propuesto por primera vez por Koshland en 1953[261] y, con pocas modificaciones,[262-264] ha sido confirmado por multitud de estudios bioqu?micos.[265-267] La hidr?lisis de los gluc?sidos y la transglicosilaci?n puede considerarse como una reacci?n de desplazamiento nucleof?lico del ?tomo de carbono anom?rico del resto de glicon[268] la reacci?n puede ocurrir de dos maneras: con retenci?n o inversi?n de la configuraci?n anom?rica del producto respecto al sustrato. Sea cual sea la configuraci?n resultante, ambas transcurren a trav?s de un estado de transici?n que tiene car?cter de cati?n oxacarbenio, con la intervenci?n de dos restos de ?cidos carbox?licos (aunque hay excepciones) en el sitio activo de la enzima (Figura 15).[269-271] La inversi?n de la configuraci?n se produce a trav?s de un ?nico mecanismo de desplazamiento, en el que un ?cido carbox?lico act?a como una base y el otro como un ?cido (Figura 15a). La retenci?n de la configuraci?n procede de un doble mecanismo de desplazamiento, con la formaci?n de un intermediario glicosil-enzima y dos inversiones consecutivas (Figura 15b). Figura 14. Tipos de iminociclitoles. 46 Figura 15. a) Mecanismo de ?-glucosidasa con inversi?n de la configuraci?n. b) Mecanismo de ?-glucosidasa con retenci?n de la configuraci?n.[269, 270] La actividad moduladora o inhibitoria de los iminoaz?cares hacia las glicosidasas y glicosiltransferasas radica en su analog?a con el estado de transici?n de hidr?lisis de los restos de az?cares durante la cat?lisis glicos?dica debido a la protonaci?n del ?tomo de nitr?geno endoc?clico en condiciones de pH fisiol?gicas (Figura 16).[271] a) b) 47 Estado de transici?n de la ?-glucosidasa Complejo DNJ-enzima NH2 OH HO O O O OH HO HO O? ? ?? ?+ HO HOHO O Figura 16. Mimetizaci?n del estado de transici?n de ?-glucosidasa por parte de 1- deoxinojirimicina (DNJ). 1.5.3. Aplicaciones preventivas y modo de acci?n El origen del uso terap?utico de los iminoaz?cares se remonta a la medicina tradicional china. En occidente, el aceite de Haarlem, extra?do de hojas de Morus alba (morera blanca), rico en alcaloides polihidroxilados, se utilizaba en el tratamiento de la diabetes y en el blanqueamiento de la piel.[272, 273] Las glicosidasas participan en importantes v?as bioqu?micas, tales como la digesti?n de hidratos de carbono en el tracto intestinal, catabolismo lisosomal de glicoconjugados y procesamiento de glicoprote?na post-traduccional. Los trastornos en las v?as de glicosilaci?n afectan la comunicaci?n c?lula-c?lula, interacci?n c?lula- matriz y la respuesta inmunol?gica y est?n relacionados con enfermedades tales como DM2, c?ncer, infecciones virales, fibrosis qu?stica, artritis reumatoide, o trastornos de almacenamiento lisosomal, entre otras.[274-276] Las principales aplicaciones terap?uticas de iminociclitoles son: a) Diabetes Los compuestos que modulan o inhiben la actividad de las glucosidasas digestivas pueden reducir la glucemia postprandial, lo que los convierten en potenciales medicamentos coadyuvantes de anti-diab?ticos.[277] Actualmente existe en el mercado el miglitol o Glyset? (14, Figura 4), derivado de 51, que es un inhibidor de ?-glucosidasas disponible desde 1999.[278, 279] Iminociclitoles inhibidores de gluc?geno fosforilasas suprimen la producci?n de glucosa hep?tica y por tanto disminuyen la glucosa en sangre en pacientes con DM2.[280-283] El 1,4-dideoxi-1,4-imino-D-arabinitol (DAB) (59, Figura 17) es un potente inhibidor de fosforilasas, que impide la degradaci?n del gluc?geno basal y del estimulado por glucag?n. Diversos estudios en modelos animales o en humanos han demostrado que este tipo de inhibidor de gluc?geno fosforilasas es potencialmente ?til para el tratamiento de DM2.[279, 283-285] 48 N H HO OH HO DAB (59) Figura 17. Estructura de DAB. D-Fagomina (1,2-dideoxinojirimicina) (60) es un iminociclitol con un anillo de seis miembros que fue aislado por primera vez a partir de semillas de trigo sarraceno (o alforf?n, Fagopyrum sculentum Moench, Polygonaceae)[286] y est? tambi?n presente en otras fuentes vegetales tales como la hoja de morera (Morus Alba, Moraceae)[287] y ra?ces de gogi (Lycium chinense).[288] Adem?s, D-fagomina fue el primer iminoaz?car encontrado en plantas y est? presente en la dieta humana, ya que la harina de alforf?n se utiliza en la elaboraci?n de muchos alimentos tradicionales incluyendo fideos japoneses (soba), galletes de la breta?a francesa y polenta italiana. D-Fagomina presenta la configuraci?n molecular de D-glucosa (61) y D-manosa (62) en los carbonos 3, 4 y 5, mientras que DNJ es un az?car mim?tico de D-glucosa (Figura 18). La D-fagomina y DNJ son compuestos especialmente estables, tanto qu?mica como metab?licamente.[259] Se ha comprobado que extractos de hojas de morera estandarizados para DNJ retrasan la digesti?n de sacarosa en humanos,[289, 290] debido a que es un inhibidor de disacaridasas intestinales tales como sacarasa, maltasa y lactasa.[287, 291] Los extractos de morera se comercializan como suplementos nutricionales y podr?an ser utilizados para la prevenci?n del SM.[277] No se descarta que los iminociclitoles puedan actuar como antidiab?ticos mediante otros mecanismos relacionados con la modulaci?n del metabolismo de los l?pidos, ya que recientes investigaciones en modelos animales ponen de manifiesto el papel regulador de los glicoesfingol?pidos en la patog?nesis de la resistencia a la insulina.[292-294] b) C?ncer N 1 2 3 4 5 6 OH OH HO HO H 1-Deoxinojirimicina (51) DNJ N 1 2 3 4 5 6 OH HO HO H O 12 3 4 5 6 OH OH HO HO O 12 3 4 5 6 OH HO HO D-Manosa (62)D-Glucosa (61) OH OH OH 1,2-Dideoxinojirimicina (60) D-Fagomina Figura 18. Estructuras qu?micas de: a) 1-deoxinojirimicina, b) D-fagomina, c) D-glucosa, d) D-manosa. 49 Muchas c?lulas cancerosas muestran una glicosilaci?n aberrante debido a una expresi?n alterada de las glicosiltranferasas.[295] Entre los alcaloides polihidroxilados con actividad antic?ncer destacan la castanospermina y la swainsonina (Figura 14). La castanospermina en ratones inhibi? el crecimiento celular del tumor, la met?stasis y la angiog?nesis.[296] Por su parte, la swainsonina ensayada en ratas y ratones, adem?s de inhibir el crecimiento de c?lulas tumorales y prevenir la met?stasis, tiene un efecto directo en la estimulaci?n del sistema inmunol?gico.[297] Actualmente, se cree que la actividad antimetast?sica es una combinaci?n de diferentes mecanismos, que incluyen la interferencia con la s?ntesis de N-glicanos y la estimulaci?n de la muerte celular mediada por el sistema inmune.[298, 299] c) Infecciones v?ricas Las glicoprote?nas de la envoltura v?rica son esenciales en los procesos de ensamblaje e invasi?n de muchos virus infecciosos. Por ello, los compuestos que interfieren en los procesos de glicosidaci?n de glicoprote?nas virales son potenciales agentes terap?uticos. Los inhibidores de ?-glucosidasas tales como la DNJ, la castanospermina, la N-butil-DNJ (63) y la 6-O-butanoilcastanospermina (64) impiden la replicaci?n del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) (Figura 19). Por otro lado, el N-nonil-DNJ (65), interfiere en la glicosilaci?n del virus de la hepatitis B (VHB) y dengue evitando que se produzca su transporte fuera de la c?lula hu?sped.[300, 301] d) Otras aplicaciones Miglustat? o Zavesca? son nombres comerciales de N-butil-DNJ (63) un f?rmaco inhibidor de la glucosylceramida sintasa que se utiliza para el tratamiento de la enfermedad de Gaucher de Tipo I leve o moderada.[302] La enfermedad de Gaucher es un trastorno gen?tico en el que se acumula glucosilceramida en varios ?rganos.[303] La aplicaci?n de algunos alcaloides polihidroxilados ha sido investigada para el tratamiento de la esclerosis m?ltiple y la artritis, as? como de la inhibici?n del rechazo en el trasplante de ?rganos.[304-306] Otra aplicaci?n potencial de ciertos iminoaz?cares, es su uso como agentes de chaperona para el tratamiento de Figura 19. Estructura de iminociclitoles con actividad antiviral. N OH OH OHHO C4H9 N OH OH OHHO C9H19 N OH HHO OH O N-butil-DNJ (63) N-nonil-DNJ (64) 6-O-butanoilcastanospermina (65) 50 enfermedades neurodegenerativas (p.e. enfermedades de Alzheimer y Parkinson) asociadas con trastornos de plegado de prote?nas.[307] Desde hace d?cadas ciertos compuestos naturales como los ?cidos grasos poliinsaturados (AGPIs) polifenoles, y m?s recientemente iminociclitoles, han sido propuestos como agentes preventivos de algunos de los factores del SM. La tesis se propon?a evaluar en modelo animal, el efecto de diferentes mezclas de AGPIs, el posible efecto colaborativo o sin?rgico entre AGPIs y polifenoles y explorar un iminociclitol presente en la dieta (D-fagomina) como nuevo agente preventivo. 51 2. OBJETIVOS 52 53 El objetivo general de la presente tesis es contribuir al conocimiento de los efectos de diferentes ingredientes funcionales (?cidos grasos poliinsaturados, polifenoles e iminociclitoles) sobre factores del s?ndrome metab?lico (SM). La presente tesis est? enmarcada en un proyecto del Plan Nacional de I+D+I 2008-2012 del Ministerio de Ciencia e Innovaci?n AGL2009-12374-C03-03 (Mecanismo de acci?n de los ?cidos grasos poliinsaturados de origen marino en el s?ndrome metab?lico y sinergia con los polifenoles e iminociclitoles). Las aportaciones de la tesis incluyen estudios in vivo sobre la acci?n de mezclas de ?cidos grasos poliinsaturados, acci?n conjunta de ?stos con polifenoles y acci?n de iminociclitoles (D-fagomina). En el caso de los dos primeros se dispon?a de informaci?n previa sobre mecanismos y dosis efectivas. En el caso de D-fagomina no se dispon?a de informaci?n. Los objetivos concretos planteados fueron los siguientes: 1. Poner a punto modelos animales para el estudio de los factores de riesgo del SM adecuados para la evaluaci?n del efecto preventivo de mezclas de ?cidos grasos poliinsaturados EPA/DHA, un extracto de polifenoles de semilla de uva y el iminociclitol D-fagomina. 2. Evaluar los efectos de mezclas de EPA/DHA a distintas proporciones (1:1; 2:1 y 1:2) en un modelo de SM para obtener informaci?n sobre los efectos relativos de estos dos principales ?cidos grasos poliinsaturados. 3. Evaluar los efectos de la combinaci?n de EPA/DHA y un extracto de polifenoles de semilla de uva, en un modelo de SM para establecer posibles sinergismos o efectos colaborativos entre los dos tipos de ingredientes funcionales. 4. Evaluar los efectos del iminociclitol D-fagomina in vitro e in vivo sobre par?metros relevantes con el SM, para obtener informaci?n sobre mecanismos de acci?n y dosis efectivas. 54 55 3. RESULTADOS Y DISCUSI?N 56 57 3.1. Estudio 1. Efecto de ?cidos grasos poliinsaturados (AGPIs) en un modelo animal de s?ndrome metab?lico (SM) modificado gen?ticamente 3.1.1. Evaluaci?n de la cepa de ratas espont?neamente hipertensas y obesas (SHROB) como modelo de SM modificado gen?ticamente Ratas hembras SHROB y ratas hembras Wistar Kyoto (WKY) utilizadas como controles sanos, se compararon en esta secci?n del estudio 1, ambas cepas de ratas recibieron una dieta est?ndar (STD) y suplementadas v?a intrag?strica durante 13 semanas con aceite de soja a una dosis ?nica semanal de (0.8 mL/kg de peso corporal). Se observ? que el peso corporal fue mayor en el grupo SHROB-soja que en el grupo WKY-soja (P<0.001) (Figura 20a). El incremento de peso corporal fue mayor a la semana 5 (P<0.05) y a las semanas 9 y 13 (P<0.01) (Figura 20b). Al final del estudio, se observ? que el porcentaje de grasa abdominal fue mayor en el grupo SHROB-soja que en el grupo WKY-soja (P<0.01) (Figura 20c). 1 5 9 13 0 100 200 300 400 500 600 700 WKY-soja SHROB-soja a) *** *** *** *** Periodo experimental, semanas Pe so co r po r a l, g 5 9 13 0 10 20 30 WKY-soja SHROB-soja b) * ** ** Periodo experimental, semanas In cr em en to de pe so co r po r a l, % 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 c) WKY-soja SHROB-soja ** Periodo experimental, semana 16 Pe so de gr a sa ab do m in al , % Figura 20. a) Peso corporal, b) incremento de peso corporal y c) contenido de grasa abdominal en ratas WKY vs SHROB suplementadas con aceite de soja. Los valores son la media con el error est?ndar de la media (ESM). Valores de la media significativamente diferentes del grupo WKY-soja: *P<0.05, **P<0.01 y ***P<0.001. Por otro lado, se observ? mayor presi?n diast?lica (PD) a la semana 5 (P<0.001), a la semana 9 (P<0.01) y a la semana 13 (P<0.05) en el grupo SHROB- soja que en el grupo WKY-soja (Figura 21a); en cuanto a la presi?n sist?lica (PS), se observ? mayor valor en el grupo SHROB-soja que en el grupo WKY-soja (P<0.001) (Figura 21b), mientras que en el ?cido ?rico no se observaron diferencias significativas entre los grupos (Figura 21c). 58 5 9 13 0 50 100 150 200 WKY-soja SHROB-soja a) *** ** * Periodo experimental, semanas Pr es i? n di a st ?l ic a , m m H g 5 9 13 0 50 100 150 200 250 WKY-soja SHROB-soja b) *** *** *** Periodo experimental, semanas Pr es i? n si st ?l ic a , m m H g 0 5 10 15 20 WKY-soja SHROB-soja c) Periodo experimental, semana 14 y 15 ?c id o ?r ic o, m g/ dL Figura 21. a) Presi?n diast?lica, b) presi?n sist?lica y c) ?cido ?rico en ratas WKY vs SHROB suplementadas con aceite de soja. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo WKY-soja: *P<0.05, **P<0.01 y ***P<0.001. En la Tabla 11 se muestra el perfil lip?dico de los ?cidos grasos (AGs) en plasma en el grupo WKY-soja y en el grupo SHROB-soja. Se observ? que los AGs C14:0 y C18:3n-3 presentaron mayor nivel en el grupo SHROB-soja que en el grupo WKY-soja (P<0.01). Los AGs C15:0 y C22:6n-3 presentaron menor nivel en el grupo SHROB-soja que en el grupo WKY-soja (P<0.05), mientras que los AGs C16:0, C16:1n-7, C18:1n-9, C18:1n-7 y C20:3n-6 presentaron mayor nivel en el grupo SHROB-soja que en el grupo WKY-soja (P<0.001). Los AGs C17:0, C18:0, C18:2n-6 y C20:4n-6 presentaron menor nivel en el grupo SHROB-soja que en el grupo WKY-soja (P<0.001) y los AGs C18:3n-6, C20:5n-3 y C22:5n-3 no presentaron diferencias significativas entre los grupos. En la cantidad total de ?cidos grasos omega-3 (AGs n-3) y ?cidos grasos saturados (AGSs) no se observaron diferencias significativas entre los grupos, pero en la cantidad total de ?cidos grasos omega-6 (AGs n-6), ?cidos grasos monoinsaturados (AGMIs) y ?cidos grasos poliinsaturados (AGPIs) se observaron las siguientes diferencias significativas. Los AGs n-6 y AGPIs presentaron menor nivel en el grupo SHROB-soja que en el grupo WKY-soja (P<0.001). Por su parte, los AGMIs presentaron mayor nivel en el grupo SHROB-soja que en el grupo WKY- soja (P<0.001). 59 Tabla 11. Perfil lip?dico de los AGs en plasma de ratas WKY y SHROB despu?s de 13 semanas de suplementaci?n con aceite de soja. Los resultados se expresan para cada AG como porcentaje molar. WKY-soja SHROB-soja C14:0 0.43?0.02 0.73?0.08** C15:0 0.24?0.01 0.20?0.01* C16:0 20.76?0.70 25.51?0.45*** C16:1n-7 2.11?0.18 6.21?0.52*** C17:0 0.33?0.01 0.21?0.01*** C18:0 12.76?0.83 7.97?0.57*** C18:1n-9 11.53?1.39 26.26?1.26*** C18:1n-7 1.91?0.08 3.01?0.2*** C18:2n-6 15.18?0.56 12.08?0.27*** C18:3n-6 0.42?0.04 0.45?0.03 C18:3n-3 0.31?0.04 0.53?0.04** C20:3n-6 0.39?0.002 0.77?0.08*** C20:4n-6 26.57?1.85 9.99?0.96*** C20:5n-3 0.81?0.05 0.75?0.12 C22:5n-3 0.71?0.04 0.91?0.09 C22:6n-3 5.55?0.29 4.43?0.24* AGs n-3 7.38?0.21 6.61?0.31 AGs n-6 42.56?1.31 23.29?0.81*** AGSs 34.51?0.20 34.61?0.41 AGMIs 15.55?1.64 35.49?1.35*** AGPIs 49.94?1.50 29.90?1.07*** AGs: ?cidos grasos; EPA: ?cido eicosapentaenoico; DHA: ?cido docosahexaenoico; AGs n-3: ?cidos grasos omega-3; AGs n-6: ?cidos grasos omega-6, AGSs: ?cidos grasos saturados; AGMIs: ?cidos grasos monoinsaturados y AGPIs: ?cidos grasos poliinsaturados. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo WKY- soja: *P<0.05, **P<0.01 y ***P<0.001. En la evaluaci?n del perfil lip?dico de los AGs en la membrana de los eritrocitos (Tabla 12), se observ? que los AGs C15:0, C17:0, C18:1n-7, y C20:4n-6 presentaron menor nivel en el grupo SHROB-soja que en el grupo WKY-soja (P<0.001). Los AGs C18:1n-9 y C20:3n-6 presentaron mayor nivel en el grupo SHROB-soja que en el grupo WKY-soja (P<0.001). Los AGs C16:1n-7, C18:0 y C22:6n-3 presentaron mayor nivel en el grupo SHROB-soja que en el grupo WKY- soja (P<0.01). El AG C20:5n-3 present? mayor nivel en el grupo SHROB-soja que en el grupo WKY-soja (P<0.05). Los AGs C14:0, C16:0, C18:2n-6 y C22:5n-3 no presentaron diferencias significativas. La cantidad total de AGs n-3 y AGMIs fue mayor en el grupo SHROB-soja que en el grupo WKY-soja (P<0.001) y los AGSs tambi?n presentaron mayor contenido en el grupo SHROB-soja que en el grupo WKY-soja (P<0.01), mientras que los AGs n-6 y AGPIs presentaron menor nivel en el grupo SHROB-soja que en el grupo WKY-soja (P<0.001). 60 Tabla 12. Perfil lip?dico de los AGs en la membrana de los eritrocitos de ratas WKY y SHROB despu?s de 13 semanas de suplementaci?n con aceite de soja. Los resultados se expresan para cada AG como porcentaje molar. WKY-soja SHROB-soja C14:0 0.44?0.05 0.43?0.03 C15:0 0.25?0.01 0.18?0.01*** C16:0 22.48?0.32 22.78?0.15 C16:1n-7 0.63?0.06 1.28?0.16** C17:0 0.46?0.02 0.26?0.02*** C18:0 14.60?0.11 16.11?0.36** C18:1n-9 6.62?0.15 9.56?0.42*** C18:1n-7 2.51?0.03 1.99?0.02*** C18:2n-6 6.95?0.11 6.74?0.35 C18:3n-6 ND ND C18:3n-3 ND ND C20:3n-6 0.47?0.01 1.20?0.11*** C20:4n-6 23.32?0.38 19.65?0.46*** C20:5n-3 0.56?0.05 0.77?0.08* C22:5n-3 2.09?0.04 2.41?0.17 C22:6n-3 5.70?0.09 6.70?0.25** AGs n-3 8.35?0.14 9.88?0.09*** AGs n-6 30.74?0.29 27.59?0.13*** AGSs 38.24?0.29 39.74?0.25** AGMIs 9.77?0.22 12.83?0.56*** AGPIs 39.09?0.34 37.47?0.14*** AGs: ?cidos grasos; EPA: ?cido eicosapentaenoico; DHA: ?cido docosahexaenoico; AGs n-3: ?cidos grasos omega-3; AGs n-6: ?cidos grasos omega-6; AGSs: ?cidos grasos saturados; AGMIs: ?cidos grasos monoinsaturados; AGPIs: ?cidos grasos poliinsaturados y ND: no detectado. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo WKY-soja: *P<0.05, **P<0.01 y ***P<0.001. En la determinaci?n de la actividad en plasma de las diferentes desaturasas expresadas mediante la relaci?n de producto y precursor de AGs (Tabla 13), se observ? que las enzimas esteroil-CoA desaturasa-1 (SCD-1) y esteroil-CoA desaturasa-2 (SCD-2) presentaron mayor actividad en el grupo SHROB-soja que en el grupo WKY-soja (P<0.001), mientras que las enzimas delta cinco desaturasa (?5) y delta seis desaturasa (?6) presentaron menor actividad en el grupo SHROB-soja que en el grupo WKY-soja (P<0.001). 61 Tabla 13. Actividad de las desaturasas SCD-1, SCD-2, ?5 y ?6 calculada a partir de la relaci?n entre producto de AG y su precursor en plasma de ratas WKY y SHROB despu?s de 13 semanas de suplementaci?n con aceite de soja. WKY-soja SHROB-soja SCD-1[C16:1n-6/C16:0] 0.10?0.01 0.24?0.02*** SCD-2[C18:1n-9/C18:0] 0.95?0.18 3.41?0.33*** ?5 [C20:4n-6/C20:3n-6] 68.18?4.62 13.41?1.48*** ?6 [C18:3n-6/C18:2n-6] 0.12?0.01 0.04?0.002*** SCD-1: esteroil-CoA desaturasa-1; SCD-2: esteroil-CoA desaturasa-2; ?5: delta cinco desaturasa; ?6: delta seis desaturasa y AG: ?cido graso. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo WKY-soja: ***P<0.001. En cuanto a la actividad de desaturasas en la membrana de los eritrocitos expresada mediante la relaci?n de producto y precursor de AGs (Tabla 14), se observ? que las enzimas SCD-1 y SCD-2 presentaron mayor actividad en el grupo SHROB-soja que en el grupo WKY-soja (P<0.01), mientras que la enzima ?5 present? menor actividad en el grupo SHROB-soja que en el grupo WKY-soja (P<0.001). Por su parte, no se detect? actividad de la enzima ?6. Tabla 14. Actividad de las desaturasas SCD-1, SCD-2, ?5 y ?6 calculada a partir de los ratios entre producto de AG y su precursor en la membrana de los eritrocitos de ratas WKY y SHROB despu?s de 13 semanas de suplementaci?n con aceite de soja. WKY-soja SHROB-soja SCD-1[C16:1n-6/C16:0] 0.03?0.003 0.06?0.01** SCD-2[C18:1n-9/C18:0] 0.45?0.01 0.60?0.03** ?5 [C20:4n-6/C20:3n-6] 49.65?1.16 17.29?2.11*** ?6 [C18:3n-6/C18:2n-6] ND ND SCD-1: esteroil-CoA desaturasa-1; SCD-2: esteroil-CoA desaturasa-2; ?5: delta cinco desaturasa; ?6: delta seis desaturasa; ND: no detectado y AG: ?cido graso. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo WKY-soja: **P<0.01 y ***P<0.001. Los niveles de triglic?ridos (TG) (Figura 22a) en plasma fue mayor a las semanas 4 y 8 (P<0.001), y a la semana 12 (P<0.01) en el grupo SHROB-soja que en el grupo WKY-soja. El colesterol total evaluado en plasma tambi?n fue mayor a la semana 4 (P<0.05), a la semana 8 (P<0.001) y a la semana 12 (P<0.01) en el grupo SHROB-soja que en el grupo WKY-soja (Figura 22b). Por su parte, el contenido de l?pidos totales en plasma fue mayor en el grupo SHROB-soja que en el grupo WKY-soja (P<0.01) (Figura 22c). No se observaron diferencias significativas en el peso del h?gado en porcentaje con respecto al peso corporal en los grupos (Figura 22d). 62 4 8 12 0 1000 2000 WKY-soja SHROB-soja a) *** *** ** Periodo experimental, semanas Tr ig lic ?r id o s, m g/ dL 4 8 12 0 100 200 300 400 WKY-soja SHROB-soja b) *** ** * Periodo experimental, semanas C o le st e r o l t o ta l, m g/ dL 0 1000 2000 3000 c) WKY-soja SHROB-soja ** Periodo experimental, semana 16L ?p id o s to ta le s en pl as m a, m g/ dL 0 1 2 3 4 d) WKY-soja SHROB-soja Periodo experimental, semana 16 Pe so de h? ga do , % Figura 22. a) Triglic?ridos, b) colesterol total, c) l?pidos totales en plasma y d) peso de h?gado en porcentaje con respecto al peso corporal en ratas WKY vs SHROB suplementadas con aceite de soja. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo WKY-soja: *P<0.05, **P<0.01 y ***P<0.001. Por otro lado, el grupo SHROB-soja present? mayor nivel de colesterol asociado a lipoprote?na de baja densidad (LDL-c) que el grupo WKY-soja (P<0.05) (Tabla 15). En cuanto al colesterol asociado a lipoprote?na de baja densidad oxidada (LDL-ox) no se observaron diferencias significativas entre los grupos. En el colesterol asociado a lipoprote?na de alta densidad (HDL-c) el grupo SHROB-soja present? mayor nivel que el grupo WKY-soja (P<0.01) (Tabla 15). Se observ? tambi?n que el porcentaje de hemoglobina glicosilada (HbA1c) y el contenido de la mol?cula de adhesi?n celular vascular-1 (VCAM-1) fue similar para todos los grupos. Sin embargo, en la prote?na C reactiva (PCR), en la mol?cula de adhesi?n intracelular (ICAM-1) y en el inhibidor del activador del plasmin?geno-1 (PAI-1), se observ? mayor nivel en el grupo SHROB-soja que en el grupo WKY-soja (P<0.01). 63 Tabla 15. Marcadores de riego cardiovascular relacionados con el SM en ratas WKY y SHROB despu?s de 13 semanas de suplementaci?n con aceite de soja. WKY-soja SHROB-soja LDL-c (mg/dL) 10.4?1.0 91.8?27.5* LDL-ox (ng/mL) 109.0?10.2 154.6?21.4 HDL-c (mg/dL) 51.3?3.5 76.8?6.5** HbA1c (%) 6.4?0.4 6.8?0.4 PCR (?g/mL) 172.9?15.6 285.9?23.8** VCAM-1 (?g/mL) 3.4?0.7 2.7?0.3 ICAM-1 (ng/mL) 0.5?0.04 1.0?0.07** PAI-1 (?g/mL) 6.4?0.3 11.6?0.6** LDL-c: colesterol de lipoprote?nas de baja densidad; LDL-ox: lipoprote?nas de baja densidad oxidada; HDL-c: colesterol de lipoprote?nas de alta densidad. HbA1c: hemoglobina glicosilada; PCR: prote?na C reactiva; VCAM-1: mol?cula de adhesi?n celular vascular-1; ICAM-1: mol?cula de adhesi?n intracelular y PAI-1: inhibidor del activador del plasmin?geno-1. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo WKY-soja: *P<0.05 y **P<0.01. El contenido de insulina plasm?tica fue mayor a las semanas 4 y 9 (P<0.001), y a la semana 12 (P<0.01) en el grupo SHROB-soja que en el grupo WKY-soja (Figura 23a). En la glucosa plasm?tica no se observaron diferencias significativas entre los grupos (Figura 23b). 4 8 12 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 WKY-soja SHROB-soja a) *** *** ** Periodo experimental, semanas In su lin a pl as m ?t ic a, n g/ m L 4 8 12 0 10 20 30 40 50 60 70 80 WKY-soja SHROB-soja b) Periodo experimental, semanas G lu co sa pl as m ?t ic a, m g/ dL Figura 23. a) Insulina plasm?tica y b) glucosa plasm?tica en ratas WKY vs SHROB suplementadas con aceite de soja. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo WKY-soja: **P<0.01 y ***P<0.001. 64 En la prueba de tolerancia a la glucosa (Figura 24) no se observaron diferencias significativas entre los grupos. 0 50 10050 75 100 125 WKY-soja SHROB-soja a) Tiempo, minutos G lu co sa pl as m ?t ic a , m g/ dL 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 b) WKY-soja SHROB-soja Periodo experimental, semana 14 y 15 A U C gl u co sa , m g x 12 0 m in /d L Figura 24. a) Prueba de tolerancia a la glucosa y b) ?rea bajo la curva en ratas WKY vs SHROB suplementadas con aceite de soja. Los valores son la media con el ESM. En la Figura 25 se muestra el contenido del isoprostano 15-F2t-IsoP determinado por cromatograf?a de gases con ionizaci?n qu?mica negativa acoplado a espectrometr?a de masas (CG?NCI?MS). Se observ? un mayor nivel de isoprostano en el grupo SHROB-soja, aunque la diferencia con el grupo WKY-soja no llego a ser estad?sticamente significativa. 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 WKY-soja SHROB-soja Periodo experimental, semana 14 y 15 15 - F 2 t- Is oP , n g/ m g cr ea tin in a Figura 25. 15-F2t-IsoP en ratas WKY vs SHROB suplementadas con aceite de soja. Los valores son la media con el ESM. El sistema antioxidante end?geno se evalu? en los eritrocitos, h?gado, grasa abdominal, ri??n, coraz?n, y cerebro de los grupos WKY-soja y SHROB-soja al final del estudio (Tabla 16). 65 Las actividades de las enzimas super?xido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT), se evaluaron en los eritrocitos, h?gado, grasa abdominal, ri??n, coraz?n y cerebro. No se observaron diferencias significativas en las diferentes muestras evaluadas en la actividad de la SOD en los grupos. En cuanto a la actividad de la CAT, el cerebro fue el ?nico ?rgano donde se observaron diferencias significativas en los grupos (P<0.01). A partir de los valores de glutati?n reducido (GSH) y oxidado (disulfuro de glutati?n, GSSG), se calcul? la relaci?n GSH/GSSG; tambi?n se midi? la actividad de las enzimas asociadas, glutati?n reductasa (GR), que regenera el glutati?n reducido y glutati?n peroxidasa (GPx), que cataliza la oxidaci?n de GSH a GSSG. Se observ? mayor concentraci?n de GSH en el h?gado (P<0.01), en la grasa abdominal (P<0.05) y en el cerebro (P<0.01), en el grupo SHROB-soja que en el grupo WKY-soja. La relaci?n GSH/GSSG fue mayor en el tejido adiposo en el grupo SHROB-soja que en el grupo WKY-soja (P<0.05). La actividad de la enzima GPx fue mayor en la grasa abdominal y en el cerebro en el grupo SHROB-soja que en el grupo WKY-soja (P<0.01). Por otro lado, mayor concentraci?n de GSSG se observ? en el coraz?n y en el cerebro en el grupo SHROB-soja que en el grupo WKY-soja (P<0.01). Adem?s, el grupo SHROB-soja present? menor actividad de GPx en los eritrocitos y en el h?gado que el grupo WKY-soja (P<0.05). Finalmente, la actividad de GR fue menor en el h?gado en el grupo SHROB-soja que en el grupo WKY-soja (P<0.05). 66 Tabla 16. Actividades del sistema antioxidante end?geno en ratas WKY y SHROB despu?s de 13 semanas de suplementaci?n con aceite de soja. ?rganos Par?metros WKY-soja SHROB-soja Eritrocitos SOD (U/g Hb) 1444.0?161.0 768.0?224.0 CAT (mmol/min/g Hb) 41.5?13.1 51.9?4.1 GR (U/g Hb) 0.9?0.1 0.9?0.1 GPx (U/g Hb) 101.5?14.4 51.5?10.3* H?gado SOD (U/mg prote?na) 8.7?0.6 8.3?0.5 CAT (?mol/min/mg prote?na) 81.1?10.9 70.8?9.8 GR (mU/mg prote?na) 88.8?8.3 66.7?3.1* GPx (mU/mg prote?na) 383.8?37.1 245.4?31.0* GSH (nmol/mg prote?na) 29.9?2.6 61.2?9.6** GSSG (nmol/mg prote?na) 61.2?9.6 133.7?12.1 GSH/GSSG 0.5?0.1 0.5?0.1 Grasa abdominal SOD (U/mg prote?na) 6.5?1.4 4.2?0.7 CAT (?mol/min/mg prote?na) 28.3?2.5 27.8?4.9 GR (mU/mg prote?na) 28.3?2.1 31.2?7.3 GPx (mU/mg prote?na) 15.8?4.0 38.7?2.6** GSH (nmol/mg prote?na) 41.7?6.4 110.4?24.9* GSSG (nmol/mg prote?na) 47.7?3.0 49.8?4.8 GSH/GSSG 0.9?0.1 2.2?0.5* Ri??n SOD (U/mg prote?na) 2.8?0.4 2.2?0.3 CAT (?mol/min/mg prote?na) 33.5?7.6 24.1?3.1 GR (mU/mg prote?na) 41.6?3.9 47.1?11.7 GPx (mU/mg prote?na) 48.0?3.8 57.2?9.1 GSH (nmol/mg prote?na) 36.7?3.7 33.4?7.4 GSSG (nmol/mg prote?na) 0.6?0.1 0.5?0.1 GSH/GSSG 64.5?8.6 71.0?18.1 Coraz?n SOD (U/mg prote?na) 5.6?0.7 6.0?0.5 CAT (?mol/min/mg prote?na) 13.4?1.1 15.1?0.6 GR (mU/mg prote?na) 27.4?2.3 23.6?1.4 GPx (mU/mg prote?na) 159.6?9.0 146.6?9.9 GSH (nmol/mg prote?na) 18.1?2.1 21.5?2.8 GSSG (nmol/mg prote?na) 4.5?0.3 6.4?0.6** GSH/GSSG 4.0?0.5 3.4?0.5 Cerebro SOD (U/mg prote?na) 7.?1.5 8.0?0.2 CAT (?mol/min/mg prote?na) 2.2?0.7 6.4?0.9** GR (mU/mg prote?na) 49.8?3.7 67.4?7.3 GPx (mU/mg prote?na) 30.9?1.5 49.0?5.3** GSH (nmol/mg prote?na) 24.2?7.3 87.2?16.5** GSSG (nmol/mg prote?na) 3.0?1.0 5.2?0.4** GSH/GSSG 8.0?3.5 16.8?3.4 SOD: super?xido dismutasa; CAT: catalasa; GR: glutati?n reductasa; GPx: glutati?n peroxidasa; GSH: glutati?n reducido; GSSG: disulfuro de glutati?n y Hb: hemoglobina. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo WKY-soja: *P<0.05 y **P<0.01. 67 3.1.2. Par?metros relacionados con el SM en ratas Wistar Kyoto (WKY) suplementadas con EPA/DHA a distintas proporciones Se compararon en esta secci?n del estudio 1 ratas hembras WKY a las cuales se suministr? una dieta est?ndar (STD) y suplementadas v?a intrag?strica durante 13 semanas aceite de soja y mezclas de aceites EPA/DHA a distintas proporciones a una dosis ?nica semanal de (0.8 mL/kg de peso corporal). Aunque no se observaron diferencias significativas en el peso corporal (Figura 26a), en el incremento de peso corporal (Figura 26b) y grasa abdominal (Figura 26c) entre los grupos, se observ? que el grupo WKY-EPA/DHA (1:1) present? mayor incremento de peso corporal a lo largo del estudio y el grupo WKY- EPA/DHA (1:2) present? menor incremento de peso corporal. En general, el incremento de peso corporal cada 4 semanas fue de un 3% y al final del estudio fue de un 12 % en total. 1 5 9 13 0 100 200 300 WKY-soja WKY-EPA/DHA (1:1) WKY-EPA/DHA (2:1) WKY-EPA/DHA (1:2) a) Periodo experimental, semanas Pe so co rp or al , g 5 9 13 0 5 10 15 WKY-soja WKY-EPA/DHA (1:1) WKY-EPA/DHA (2:1) WKY-EPA/DHA (1:2) b) Periodo experimental, semanas In cr em en to de pe so co rp o ra l, % 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 c) WKY-soja WKY-EPA/DHA (1:1) WKY-EPA/DHA (2:1) WKY-EPA/DHA (1:2) Periodo experimental , semana 16 Pe so de gr as a ab do m in a l , % Figura 26. a) Peso corporal, b) incremento de peso corporal y c) contenido de grasa abdominal en ratas WKY suplementadas con EPA/DHA a diferentes proporciones. Los valores son la media con el ESM. En la evaluaci?n de la PD, PS y ?cido ?rico no se observaron diferencias significativas entre los grupos (Figura 27). 68 En la evaluaci?n de perfil lip?dico de los AGs en plasma (Tabla 17) al final del estudio, se observ? que el AG C18:3n-6 present? menor nivel en los grupos suplementados con EPA/DHA (1:1) y (1:2) que el grupo suplementado con soja (P<0.05). El AG C20:3n-6 present? mayor nivel en el grupo WKY-EPA/DHA (1:2) que el grupo WKY-soja (P<0.01). El AG C20:5n-3 present? mayor nivel en el grupo WKY-EPA/DHA (2:1) que en el grupo WKY-soja (P<0.05). Por su parte, el AG C22:6n-3 present? mayor nivel en los grupos suplementados con EPA/DHA (2:1) y (1:2) que el grupo WKY-soja (P<0.01). La proporci?n global de AGs n-3 en los grupos suplementados con EPA/DHA (1:1), (2:1) y (1:2) fue mayor que en el grupo suplementado con soja (P<0.05), (P<0.001) y (P<0.01), respectivamente. La proporci?n global de AGSs en el grupo WKY-EPA/DHA (2:1) fue mayor que en el grupo WKY-soja (P<0.05). Por su parte, no se observaron diferencias significativas en la cantidad total de los AGs n-6, AGMIs y AGPIs entre los grupos (Tabla 17). 5 9 13 0 50 100 150 200 WKY-soja WKY-EPA/DHA (1:1) WKY-EPA/DHA (2:1) WKY-EPA/DHA (1:2) a) Periodo experimental, semanas Pr es i? n di as t? lic a, m m H g 5 9 13 0 50 100 150 200 250 WKY-soja WKY-EPA/DHA (1:1) WKY-EPA/DHA (2:1) WKY-EPA/DHA (1:2) b) Periodo experimental, semanas Pr es i? n si st ?l ic a , m m H g 0 5 10 15 20 WKY-soja WKY-EPA/DHA (1:1) WKY-EPA/DHA (2:1) WKY-EPA/DHA (1:2) c) Periodo experimental, semana 14 y 15 ?c id o ?r ic o , m g/ dL Figura 27. a) Presi?n diast?lica, b) presi?n sist?lica y c) ?cido ?rico en ratas WKY suplementadas con EPA/DHA a diferentes proporciones. Los valores son la media con el ESM. 69 Tabla 17. Perfil lip?dico de ?cidos grasos en plasma en los grupos de ratas WKY suplementados con aceite de soja y con las mezclas de EPA/DHA (1:1), (2:1) y (1:2). Los resultados se expresan para cada AG como porcentaje molar. WKY Soja EPA/DHA (1:1) EPA/DHA (2:1) EPA/DHA (1:2) C14:0 0.43?0.02 0.47?0.03 0.48?0.04 0.48?0.02 C15:0 0.24?0.01 0.28?0.03 0.28?0.02 0.25?0.01 C16:0 20.76?0.70 21.63?0.84 22.08?1.14 20.82?0.38 C16:1n-7 2.11?0.18 2.09?0.27 2.03?0.18 2.01?0.14 C17:0 0.33?0.01 0.36?0.02 0.36?0.04 0.35?0.02 C18:0 12.76?0.83 12.32?0.80 12.35?1.32 13.34?0.27 C18:1n-9 11.53?1.39 11.12?1.43 10.92?1.56 10.58?0.44 C18:1n-7 1.91?0.08 1.86?0.12 1.77?0.09 1.92?0.05 C18:2n-6 15.18?0.56 15.99?1.02 15.46?1.23 15.09?0.44 C18:3n-6 0.42?0.04 0.30?0.02* 0.35?0.03 0.29?0.02* C18:3n-3 0.31?0.04 0.36?0.06 0.35?0.06 0.30?0.02 C20:3n-6 0.39?0.002 0.50?0.04 0.48?0.03 0.55?0.03** C20:4n-6 26.57?1.85 24.18?3.10 23.53?3.26 25.11?1.01 C20:5n-3 0.81?0.05 1.30?0.20 1.53?0.15* 1.21?0.15 C22:5n-3 0.71?0.04 0.79?0.05 0.94?0.10 0.85?0.02 C22:6n-3 5.55?0.29 6.46?0.06 7.10?0.39** 6.87?0.27** AGs n-3 7.38?0.21 8.90?0.31* 9.91?0.66*** 9.23?0.22** AGs n-6 42.56?1.31 40.97?2.11 39.82?2.09 41.03?0.66 AGSs 34.51?0.20 35.06?0.17 35.55?0.36* 35.24?0.22 AGMIs 15.55?1.64 15.07?1.79 14.72?1.80 14.50?0.57 AGPIs 49.94?1.50 49.87?1.80 49.73?1.55 50.26?0.66 AGs: ?cidos grasos; EPA: ?cido eicosapentaenoico; DHA: ?cido docosahexaenoico; AGs n-3: ?cidos grasos omega-3; AGs n-6: ?cidos grasos omega-6; AGSs: ?cidos grasos saturados; AGMIs: ?cidos grasos monoinsaturados y AGPIs: ?cidos grasos poliinsaturados. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo WKY- soja: *P<0.05, **P<0.01,***P<0.001. En cuanto al perfil lip?dico de los AGs en la membrana de los eritrocitos (Tabla 18), se observ? que el AG C18:1n-7 present? mayor nivel en los tres grupos suplementados con EPA/DHA (1:1), (2:1) y (1:2) que en el grupo WKY-soja (P<0.01). El AG C20:4n-6 present? menor nivel en los grupos suplementados con EPA/DHA (1:1) y (1:2) que en el grupo WKY-soja (P<0.05). El contenido de AGs C20:5n-3 y C22:5n-3 fue mayor en los grupos suplementados con EPA/DHA (1:1) y (2:1) que en el grupo WKY-soja (P<0.001), y fue tambi?n mayor en el grupo WKY- EPA/DHA (1:2) que en el grupo WKY-soja (P<0.001). AG C22:6n-3 se encontr? en mayor nivel para los grupos WKY-EPA/DHA (1:1) (P<0.001), WKY-EPA/DHA (2:1) (P<0.01) y WKY-EPA/DHA (1:2) (P<0.01) con respecto al grupo WKY-soja. En cuanto a la cantidad total de AGs n-3, se observ? que los grupos suplementados con EPA/DHA presentaron mayor nivel que el grupo WKY-soja (P<0.001). Por su parte, no se observaron diferencias significativas en la cantidad total de los AGs n-6, AGSs, AGMIs y AGPIs entre los grupos (Tabla 18). 70 Tabla 18. Perfil lip?dico de AGs en la membrana de los eritrocitos en los grupos de ratas WKY suplementados con aceite de soja y con las mezclas de EPA/DHA (1:1), (2:1) y (1:2). Los resultados se expresan para cada AG como porcentaje molar. WKY Soja EPA/DHA (1:1) EPA/DHA (2:1) EPA/DHA (1:2) C14:0 0.44?0.05 0.57?0.07 0.40?0.03 0.48?0.07 C15:0 0.25?0.01 0.31?0.03 0.23?0.01 0.26?0.03 C16:0 22.48?0.32 22.61?0.58 22.55?0.23 22.58?0.29 C16:1n-7 0.63?0.06 0.53?0.05 0.50?0.01 0.60?0.03 C17:0 0.46?0.02 0.44?0.02 0.42?0.02 0.50?0.04 C18:0 14.60?0.11 14.09?0.57 15.09?0.33 15.22?0.30 C18:1n-9 6.62?0.15 6.55?0.21 6.12?0.07 6.80?0.32 C18:1n-7 2.51?0.03 2.28?0.04** 2.22?0.07** 2.23?0.03** C18:2n-6 6.95?0.11 7.63?0.26 7.64?0.13 7.44?0.28 C18:3n-6 ND ND ND ND C18:3n-3 ND ND ND ND C20:3n-6 0.47?0.01 0.51?0.01 0.53?0.02 0.53?0.02 C20:4n-6 23.32?0.38 21.51?0.49* 21.63?0.52 21.42?0.33* C20:5n-3 0.56?0.05 1.03?0.08*** 1.09?0.06*** 0.89?0.06** C22:5n-3 2.09?0.04 2.77?0.09*** 3.02?0.08*** 2.53?0.05** C22:6n-3 5.70?0.09 7.11?0.29*** 6.82?0.18** 6.92?0.18** AGs n-3 8.35?0.14 10.91?0.42*** 10.94?0.26*** 10.34?0.18*** AGs n-6 30.74?0.29 29.64?0.38 29.80?0.46 29.40?0.51 AGSs 38.24?0.29 38.01?0.23 38.70?0.56 39.04?0.48 AGMIs 9.76?0.22 9.37?0.27 8.84?0.13 9.63?0.34 AGPIs 39.09?0.34 40.56?0.50 40.73?0.37 39.74?0.56 AGs: ?cidos grasos; EPA: ?cido eicosapentaenoico; DHA: ?cido docosahexaenoico; AGs n-3: ?cidos grasos omega-3; AGs n-6: ?cidos grasos omega-6; AGSs: ?cidos grasos saturados; AGMIs: ?cidos grasos monoinsaturados; AGPIs: ?cidos grasos poliinsaturados y ND: no detectado. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo WKY-soja: *P<0.05, **P<0.01,***P<0.001. En cuanto a la actividad de las enzimas SCD-1, SCD-2, ?5 y ?6, en plasma (Tabla 19) y en la membrana de los eritrocitos (Tabla 20), se observaron pocas diferencias significativas entre los grupos. En plasma no se observaron diferencias significativas para las enzimas SCD-1, SCD-2 y ?6. Por su parte, la actividad de la enzima ?5 en plasma fue menor en los grupos suplementados con EPA/DHA (1:1) y (1:2) que en el grupo suplementado con soja (P<0.05). 71 Tabla 19. Actividad de las desaturasas SCD-1, SCD-2, ?5 y ?6 calculada a partir de los ratios entre producto AG y su precursor en plasma en los grupos de ratas WKY suplementados con aceite de soja y con las mezclas de EPA/DHA (1:1), (2:1) y (1:2). WKY Soja EPA/DHA (1:1) EPA/DHA (2:1) EPA/DHA (1:2) SCD-1[C16:1n-6/C16:0] 0.10?0.01 0.10?0.01 0.09?0.004 0.10?0.01 SCD-2[C18:1n-9/C18:0] 0.95?0.18 0.94?0.16 1.02?0.31 0.80?0.04 ?5 [C20:4n-6/C20:3n-6] 68.18?4.62 48.46?5.06* 48.72?5.46 46.68?3.55* ?6 [C18:3n-6/C18:2n-6] 0.12?0.01 0.11?0.01 0.11?0.02 0.12?0.01 SCD-1: esteroil-CoA desaturasa-1; SCD-2: esteroil-CoA desaturasa-2; ?5: delta cinco desaturasa; ?6: delta seis desaturasa y AG: ?cido graso. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo WKY-soja: *P<0.05. En cuanto a la actividad de la enzima ?5 en la membrana de los eritrocitos, se observ? que el grupo WKY-EPA/DHA (1:1) present? menor actividad (P<0.05) y los grupos WKY-EPA/DHA (2:1) y (1:2) presentaron tambi?n menor actividad que el grupo WKY-soja (P<0.01) (Tabla 20). Tabla 20. Actividad de las desaturasas SCD-1, SCD-2, ?5 y ?6 calculada a partir de la relaci?n entre producto AG y su precursor en la membrana de los eritrocitos en los grupos de ratas WKY suplementados con aceite de soja y con las mezclas de EPA/DHA (1:1), (2:1) y (1:2). WKY Soja EPA/DHA (1:1) EPA/DHA (2:1) EPA/DHA (1:2) SCD-1[C16:1n-6/C16:0] 0.03?0.003 0.02?0.002 0.02?0.001 0.03?0.001 SCD-2[C18:1n-9/C18:0] 0.45?0.01 0.47?0.03 0.41?0.01 0.45?0.02 ?5 [C20:4n-6/C20:3n-6] 49.65?1.16 42.63?2.00* 40.87?1.86** 40.53?1.76** ?6 [C18:3n-6/C18:2n-6] ND ND ND ND SCD-1: esteroil-CoA desaturasa-1; SCD-2: esteroil-CoA desaturasa-2; ?5: delta cinco desaturasa; ?6: delta seis desaturasa; ND: no detectado y AG: ?cido graso. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo WKY-soja: *P<0.05 y **P<0.01. En la Figura 28a se muestran los niveles de TG en plasma. No se observaron diferencias significativas entre los grupos suplementados con EPA/DHA y el grupo suplementado con soja. En la determinaci?n del colesterol total Figura 28b, se observ? que el grupo WKY-EPA/DHA (1:1) present? menor nivel que el grupo WKY-soja (P<0.05) a la semana 4, aunque a las semanas 8 y 12 de suplementaci?n 72 no se observaron diferencias significativas entre los grupos. En la cantidad de l?pidos totales en plasma Figura 28c, se observ? que el grupo WKY-EPA/DHA (2:1) present? menor nivel que el grupo WKY-soja (P<0.05). No se observaron diferencias significativas en el peso del h?gado en porcentaje con respecto al peso corporal en los grupos Figura 28d. En la evaluaci?n de los niveles de LDL-c, HDL-c, PCR, VCAM-1 e ICAM- al final del estudio no se detectaron diferencias significativas entre los grupos mientras, que se observ? mayor nivel de LDL-ox en los grupos WKY-EPA/DHA (2:1) y (1:2) que en el grupo WKY-soja (P<0.001) y (P<0.001). Por otro lado, se observ? que la HbA1c present? menor nivel en los grupos WKY-EPA/DHA (1:1) (P<0.001), WKY- EPA/DHA (2:1) (P<0.01) y WKY-EPA/DHA (1:2) (P<0.01) que en el grupo WKY- soja (Tabla 21). Tambi?n, se observ? que el valor del PAI-1 fue mayor para los 4 8 12 0 100 200 300 400 WKY-soja WKY-EPA/DHA (1:1) WKY-EPA/DHA (2:1) WKY-EPA/DHA (1:2) a) Periodo experimental , semanas Tr ig lic ?r id os , m g/ dL 4 8 12 0 100 200 300 400 WKY-soja WKY-EPA/DHA (1:1) WKY-EPA/DHA (2:1) WKY-EPA/DHA (1:2) b) * Periodo experimental , semanas Co le st er ol to ta l, m g/ dL 0 100 200 300 400 c) WKY-soja WKY-EPA/DHA (1:1) WKY-EPA/DHA (2:1) WKY-EPA/DHA (1:2) * Periodo experimental , semana 16L ?p id os to ta le s en pl as m a, m g/ dL 0 1 2 3 4 d) W KY-soja W KY-EPA/DHA (1:1 ) W KY-EPA/DHA (2:1 ) W KY-EPA/DHA (1:2 ) P eriodo experimental , semana 16 Pe so de h? ga do , % Figura 28. a) Triglic?ridos, b) colesterol total, c) l?pidos totales en plasma y d) peso de h?gado en porcentaje con respecto al peso corporal en ratas WKY suplementadas con EPA/DHA a diferentes proporciones. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo WKY-soja: *P<0.05. 73 grupos WKY-EPA/DHA (2:1) (P<0.05) y WKY-EPA/DHA (1:2) (P<0.01) que en el grupo WKY-soja (Tabla 21). Tabla 21. Par?metros relacionados con el SM en ratas WKY determinados despu?s de 13 semanas de suplementaci?n con aceite de soja y con las mezclas de EPA/DHA (1:1), (2:1) y (1:2). WKY Soja EPA/DHA (1:1) EPA/DHA (2:1) EPA/DHA (1:2) LDL-c (mg/dL) 10.4?1.0 7.7?1.2 12.0 ?4.6 8.3?0.6 LDL-ox (ng/mL) 109.0?10.2 161.5?30.9 212.3?57.4** 239.4?70.0*** HDL-c (mg/dL) 51.3?3.5 37.4?4.2 50.8?8.9 47.3?3.6 HbA1c (%) 6.4?0.4 4.1?0.1*** 4.4?0.3** 4.2?0.1** PCR (?g/mL 172.9?15.6 147.0?7.7 147.1?8.5 140.1?23.6 VCAM-1 (?g/mL) 3.4?0.7 3.4?0.3 3.0?0.2 4.4?0.5 ICAM-1 (ng/mL) 0.5?0.04 0.6?0.1 0.6?0.1 0.5?0.1 PAI-1 (?g/mL) 6.4?0.3 7.5?1.3 8.7?1.8* 9.2?1.3** LDL-c: colesterol de lipoprote?nas de baja densidad; LDL-ox: colesterol de lipoprote?nas de baja densidad oxidada; HDL-c: colesterol de lipoprote?nas de alta densidad, HbA1c: hemoglobina glicosilada; PCR: prote?na C reactiva; VCAM-1: mol?cula de adhesi?n celular vascular-1; ICAM-1: mol?cula de adhesi?n intracelular y PAI-1: inhibidor del activador del plasmin?geno-1. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo WKY-soja: *P<0.05, **P<0.01,***P<0.001. En la evaluaci?n de la insulina plasm?tica (Figura 29a) no se observaron diferencias significativas entre los grupos. En la evaluaci?n de la glucosa plasm?tica el grupo WKY-EPA/DHA (1:1) present? mayor nivel a la semana 4 que el grupo WKY-soja (P<0.05), y los grupos WKY-EPA/DHA (2:1) y WKY-EPA/DHA (1:2) presentaron menor nivel que el grupo WKY-EPA/DHA (1:1) (P<0.05) y (P<0.01), respectivamente. A las semanas 8 y 12 de suplementaci?n no se observaron diferencias significativas (Figura 29b). 74 En la prueba de tolerancia a la glucosa (Figura 30) no se observaron diferencias significativas entre los grupos. 0 50 10050 75 100 125 150 WKY-soja WKY-EPA/DHA (1:1) WKY-EPA/DHA (2:1) WKY-EPA/DHA (1:2) a) Tiempo, minutos G lu co sa pl as m ?t ic a, m g/ dL 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 b) WKY-soja WKY-EPA/DHA (1:1) WKY-EPA/DHA (2:1) WKY-EPA/DHA (1:2) Periodo experimental, semana 14 y 15 A U C gl u co sa , m g x 12 0 m in /d L Figura 30. a) Prueba de tolerancia a la glucosa y b) ?rea bajo la curva (AUC) de la prueba de tolerancia a la glucosa en ratas WKY suplementadas con EPA/DHA a diferentes proporciones. Los valores son la media con el ESM. La evaluaci?n del contenido del 15-F2t-IsoP determinado por CG?NCI?MS, se muestra en la Figura 31. No se observaron diferencias significativas entre los grupos; pero se observ? que el grupo suplementado con EPA/DHA (1:2) present? menor nivel de isoprostano. 4 8 12 0 1 2 3 WKY-soja WKY-EPA/DHA (1:1) WKY-EPA/DHA (2:1) WKY-EPA/DHA (1:2) a) Periodo experimental , semanas In su lin a pl as m ?t ic a, n g/ m L 4 8 12 0 10 20 30 40 50 60 70 80 WKY-soja WKY-EPA/DHA (1:1) WKY-EPA/DHA (2:1) WKY-EPA/DHA (1:2) b) * $ $$ Periodo experimental , semanas G lu co sa pl as m ?t ic a, m g/ dL Figura 29. a) Insulina plasm?tica y b) glucosa plasm?tica en ratas WKY suplementadas con EPA/DHA a diferentes proporciones. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo WKY-soja: *P<0.05 y del grupo WKY- EPA/DHA (1:1): $P<0.05 y $$P<0.01. 75 El sistema antioxidante end?geno se evalu? en los eritrocitos, grasa abdominal, h?gado, ri??n, coraz?n y cerebro de las ratas WKY suplementadas con aceite de soja y con las mezclas de EPA/DHA (1:1), (2:1) y (1:2) al final del estudio (Tabla 22). Se observ? que la actividad de la enzima SOD en los eritrocitos fue menor en el grupo WKY-EPA/DHA (1:2) que en el grupo WKY-EPA/DHA (1:1) (P<0.05); en el h?gado los grupos WKY-EPA/DHA (2:1) y WKY-EPA/DHA (1:2) presentaron mayor actividad que el grupo WKY-EPA/DHA (1:1) (P<0.05); en ri??n el grupo WKY-EPA/DHA (1:1) present? mayor actividad que el grupo WKY-soja (P<0.05); mientras, que en la grasa abdominal, coraz?n y cerebro no se observaron diferencias significativas en SOD. En la evaluaci?n de la actividad de la enzima CAT, se observ? mayor actividad en coraz?n en el grupo WKY-EPA/DHA (1:1) que en el grupo WKY-soja (P<0.05) y los grupos suplementados con EPA/DHA (2:1) y (1:2) presentaron menor actividad que el grupo WKY-EPA/DHA (1:1) (P<0.05); en el cerebro se observ? mayor actividad en el grupo WKY-EPA/DHA (1:2) que en el grupo WKY-soja (P<0.01) y este mismo grupo present? mayor actividad que en el grupo WKY-EPA/DHA (1:1) (P<0.01); mientras que en eritrocitos, h?gado, grasa abdominal y ri??n no se observaron diferencias significativas en CAT. En la evaluaci?n de la actividad de la enzima GR, se observ? menor actividad en eritrocitos en el grupo WKY-EPA/DHA (1:1) que en el grupo WKY-soja (P<0.001) y el grupo WKY-EPA/DHA (2:1) present? mayor actividad que el grupo WKY-EPA/DHA (1:1) (P<0.05); en ri??n los grupos WKY-EPA/DHA (1:1) y (2:1) presentaron mayor actividad que el grupo WKY-soja (P<0.05) y (P<0.01), respectivamente. No se observaron diferencias significativas de la actividad de la enzima GR en el h?gado, grasa abdominal, coraz?n y cerebro. La actividad de la 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 WKY-soja WKY-EPA/DHA (1:1) WKY-EPA/DHA (2:1) WKY-EPA/DHA (1:2) Periodo experimental, semana 14 y 15 15 - F 2 t- Is oP , n g/ m g cr ea tin in a Figura 31. 15-F2t-IsoP en ratas WKY suplementadas con EPA/DHA a diferentes proporciones. Los valores son la media con el ESM. 76 enzima GPx en la grasa abdominal fue mayor en el grupo WKY-EPA/DHA (1:1) que en el grupo WKY-soja (P<0.01) y el grupo WKY-EPA/DHA (1:2) present? menor actividad que el grupo WKY-EPA/DHA (1:1) (P<0.05). En ri??n la enzima GPx present? mayor actividad en el grupo WKY-EPA/DHA (2:1) que en el grupo WKY-soja (P<0.05). No se observaron diferencias significativas de GPx en eritrocitos, h?gado, coraz?n y cerebro. En cuanto a la concentraci?n de GSH, en el h?gado se observ? menor concentraci?n en el grupo WKY-EPA/DHA (1:2) que en el grupo WKY-EPA/DHA (1:1) (P<0.05); por otro lado, en la grasa abdominal se observ? que el grupo WKY- EPA/DHA (1:1) present? mayor proporci?n que el grupo WKY-soja (P<0.05). No se observaron diferencias significativas de GSH en ri??n, coraz?n y cerebro. Tambi?n, se observ? que la concentraci?n GSSG en la grasa abdominal fue menor en los grupos WKY-EPA/DHA (1:1) y (2:1) que en el grupo WKY-soja (P<0.001) y (P<0.01), respectivamente. Adem?s, el grupo WKY-EPA/DHA (1:2) present? mayor concentraci?n que el grupo WKY-EPA/DHA (1:1) (P<0.01). En el coraz?n el grupo WKY-EPA/DHA (1:1) present? mayor concentraci?n que el grupo WKY-soja (P<0.05) y el grupo WKY-EPA/DHA (2:1) present? menor concentraci?n que el grupo WKY-EPA/DHA (1:1) (P<0.05). No se observaron diferencias significativas de GSSG en h?gado, ri??n y cerebro. Se observ? que la relaci?n GSH/GSSG fue significativamente menor en el h?gado en el grupo WKY-EPA/DHA (1:2) que en el grupo WKY-EPA/DHA (1:1) (P<0.05). En la grasa abdominal se observ? que el grupo WKY-EPA/DHA (1:1) present? mayor relaci?n que el grupo WKY-soja (P<0.001) y los grupos WKY- EPA/DHA (2:1) y (1:2) presentaron menor relaci?n que el grupo WKY-EPA/DHA (1:1) (P<0.001). En ri??n se observ? que los grupos WKY-EPA/DHA (1:1) y (2:1) presentaron menor relaci?n que el grupo WKY-soja (P<0.01) y (P<0.05), respectivamente. En coraz?n el grupo WKY-EPA/DHA (1:2) present? mayor relaci?n que el grupo WKY-EPA/DHA (1:1) (P<0.05). En cerebro no se observaron diferencias significativas entre los grupos. 77 Tabla 22. Actividades del sistema antioxidante end?geno en ratas WKY determinadas despu?s de 13 semanas de suplementaci?n con aceite de soja y con las mezclas de EPA/DHA (1:1), (2:1) y (1:2). ?rgano Par?metros WKY Soja EPA/DHA (1:1) EPA/DHA (2:1) EPA/DHA (1:2) Eritrocitos SOD (U/g Hb) 1444.0?161.0 2129.2?221.7 1880.9?129.0 1226.1?211.2$ CAT (mmol/min/g Hb) 41.5?13.1 57.4?4.2 76.7?10.7 61.4?5.4 GR (U/g Hb) 0.9?0.1 0.4?0.03*** 0.8?0.1$ 0.6?0.1 GPx (U/g Hb) 101.5?14.4 107.1?5.7 116.7?11.6 67.7?14.1 H?gado SOD (U/mg prote?na) 8.7?0.6 6.1?1.0 9.5?0.7$ 9.9?0.6$ CAT (?mol/min/mg prote?na) 81.1?10.9 46.1?7.5 67.0?10.7 82.5?7.7 GR (mU/mg prote?na) 88.8?8.3 59.0?7.3 63.4?7.8 91.4?9.9 GPx (mU/mg prote?na) 383.8?37.1 325.0?47.1 366.6?47.0 404.7?32.5 GSH (nmol/mg prote?na) 29.9?2.6 40.0?9.3 22.1?1.2 17.2?5.0$ GSSG (nmol/mg prote?na) 111.9?12.8 94.6?7.9 92.4?7.3 125.0?16.5 GSH/GSSG 0.3?0.09 0.4?0.3 0.3?0.08 0.1?0.09$ Grasa abdominal SOD (U/mg prote?na) 6.5?1.4 10.8?2.6 8.2?0.7 5.6?1.1 CAT (?mol/min/mg prote?na) 28.3?2.5 34.8?4.6 38.5?4.2 29.4?7.1 GR (mU/mg prote?na) 28.3?2.1 41.1?2.3 39.6?7.6 26.9?4.6 GPx (mU/mg prote?na) 15.8?4.0 39.0?3.5** 27.7?3.8 19.3?5.6$ GSH (nmol/mg prote?na) 41.7?6.4 139.1?35.9* 62.5?15.1 55.8?13.7 GSSG (nmol/mg prote?na) 47.7?3.0 11.4?2.4*** 25.2?5.7** 30.6?5.5$$ GSH/GSSG 0.9?0.2 11.8?1.9*** 3.0?0.7$$$ 2.2?0.7$$$ Ri??n SOD (U/mg prote?na) 2.8?0.4 5.9?0.7* 5.5?0.9 4.8?1.1 CAT (?mol/min/mg prote?na) 33.5?7.6 26.8?2.8 42.7?6.0 31.2?4.9 GR (mU/mg prote?na) 41.6?3.9 76.2?6.1* 83.8?10.7** 58.3?8.8 GPx (mU/mg prote?na) 48.0?3.8 73.6?4.5 90.3?13.4* 77.3?12.7 GSH (nmol/mg prote?na) 36.7?3.7 37.5?2.4 48.1?9.0 30.0?4.6 GSSG 0.6?0.1 1.2?0.1 1.2?0.2 0.7?0.2 78 (nmol/mg prote?na) GSH/GSSG 65.7?5.1 33.2?2.8** 41.8?0.3* 49.4?12.0 Coraz?n SOD (U/mg prote?na) 5.6?0.7 11.6?1.6 11.6?1.2 12.3?4.0 CAT (?mol/min/mg prote?na) 13.4?1.1 25.9?6.3** 13.0?1.7$ 14.9?2.1$ GR (mU/mg prote?na) 27.4?2.3 24.8?3.0 14.5?2.3 22.8?7.5 GPx (mU/mg prote?na) 159.6?9.0 227.5?29.1 187.9?9.2 184.6?13.6 GSH (nmol/mg prote?na) 18.1?2.1 13.0?2.6 14.2?2.8 26.0?5.5 GSSG (nmol/mg prote?na) 4.5?0.3 8.0?1.3* 4.4?0.5$ 6.0?0.8 GSH/GSSG 4.0?0.4 1.8?0.4 3.4?0.7 4.8?1.3$ Cerebro SOD (U/mg prote?na) 8.9?0.8 15.5?1.7 14.7?2.1 12.2?2.3 CAT (?mol/min/mg prote?na) 2.2?0.7 2.1?0.1 6.7?4.5 16.4?4.0**$$ GR (mU/mg prote?na) 49.8?3.7 79.9?11.5 77.0?8.8 78.9?7.9 GPx (mU/mg prote?na) 30.9?1.5 38.3?1.9 35.3?2.5 36.3?4.7 GSH (nmol/mg prote?na) 36.3?3.2 69.3?7.7 53.0?5.3 80.0?23.5 GSSG (nmol/mg prote?na) 4.6?0.7 3.4?0.5 3.1?0.5 5.9?1.4 GSH/GSSG 8.7?1.6 22.8?4.3 20.0?4.0 13.3?0.9 SOD: super?xido dismutasa; CAT: catalasa; GR: glutati?n reductasa; GPx: glutati?n peroxidasa; GSH: glutati?n reducido; GSSG: disulfuro de glutati?n; Hb: hemoglobina. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo WKY-soja: *P<0.05, **P<0.01 ***P<0.001 y del grupo WKY-EPA/DHA (1:1): $P<0.05, $$P<0.01, $$$P<0.001. 79 3.1.3. Par?metros relacionados con el SM en ratas SHROB suplementadas con EPA/DHA a distintas proporciones Se compararan en esta secci?n del estudio 1 ratas hembras SHROB alimentadas con una dieta est?ndar (STD) y suplementadas v?a intrag?strica durante 13 semanas con mezclas de aceites EPA/DHA a distintas proporciones a una dosis ?nica semanal de (0.8 mL/kg de peso corporal). En la evaluaci?n del peso corporal, el incremento de peso corporal y el porcentaje de grasa abdominal no se observaron diferencias significativas (Figura 32), pero en todos los grupos se observ? un incremento de peso corporal cada cuatro semanas de un 10% y de un 25-30% al final del estudio. 1 5 9 13 0 100 200 300 400 500 600 700 SHROB-soja SHROB-EPA/DHA (1:1) SHROB-EPA/DHA (2:1) SHROB-EPA/DHA (1:2) a) Periodo experimental, semanas Pe so co rp o ra l, g 5 9 13 0 5 10 15 20 25 30 35 SHROB-soja SHROB-EPA/DHA (1:1) SHROB-EPA/DHA (2:1) SHROB-EPA/DHA (1:2) b) Periodo experimental, semanas In cr em en to de pe so co rp o ra l, % 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 c) SHROB-soja SHROB-EPA/DHA (1:1) SHROB-EPA/DHA (2:1) SHROB-EPA/DHA (1:2) Periodo experimental, semana 16 Pe so de gr as a ab do m in al , % Figura 32. a) Peso corporal, b) incremento de peso corporal y c) grasa abdominal en ratas SHROB suplementadas con EPA/DHA a diferentes proporciones. Los valores son la media con el ESM. Por otro lado, en la PD, PS y ?cido ?rico (Figura 33), no se observaron diferencias significativas entre los grupos. 5 9 13 0 50 100 150 200 SHROB-soja SHROB-EPA/DHA (1:1) SHROB-EPA/DHA (2:1) SHROB-EPA/DHA (1:2) a) Periodo experimental, semanas Pr es i? n di as t? lic a, m m H g 5 9 13 0 50 100 150 200 250 SHROB-soja SHROB-EPA/DHA (1:1) SHROB-EPA/DHA (2:1) SHROB-EPA/DHA (1:2) b) Periodo experimental, semanas Pr es i? n si st ?l ic a , m m H g 0 5 10 15 20 SHROB-soja SHROB-EPA/DHA (1:1) SHROB-EPA/DHA (2:1) SHROB-EPA/DHA (1:2) c) Periodo experimental, semana 14 y 15 ?c id o ?r ic o , m g/ dL Figura 33. a) Presi?n diast?lica, b) presi?n sist?lica y c) ?cido ?rico en ratas SHROB suplementadas con EPA/DHA a diferentes proporciones. Los valores son la media con el ESM. 80 A continuaci?n se describen los resultados del perfil lip?dico de AGs en plasma (Tabla 23) y en la membrana de los eritrocitos (Tabla 24), evaluados al final del estudio. En plasma (Tabla 23), se observ? que los AGs C14:0 y C20:3n-6 presentaron mayor porcentaje en el grupo SHROB-EPA/DHA (1:1) que en el grupo SHROB-soja (P<0.05), mientras que el AG C18:1n-7 present? menor porcentaje en el grupo SHROB-EPA/DHA (2:1) que en el grupo SHROB-soja (P<0.05). El AG C18:1n-9 present? menor porcentaje en los grupos SHROB-EPA/DHA (1:1) y SHROB-EPA/DHA (2:1) que en el grupo SHROB-soja (P<0.01). Los AGs C20:5n- 3, C22:5n-3 y C22:6n-3 en los grupos SHROB-EPA/DHA (1:1) y SHROB- EPA/DHA (2:1) se encontraron en mayor porcentaje que en el grupo SHROB-soja (P<0.001). El grupo SHROB-EPA/DHA (1:2) present? mayor porcentaje en los AGs C22:5n-3 y C22:6n-3 que en el grupo SHROB-soja (P<0.05) y (P<0.001), y menor porcentaje de estos mismos AGs que en el grupo SHROB-EPA/DHA (1:1) (P<0.05) y (P<0.001). Por otro lado, los AGs C15:0, C16:0, C16:1n-7, C17:0, C18:0, C18:2n-6, C18:3n-6, C18:3n-3 y C20:4n-6 no presentaron diferencias significativas entre los grupos. El contenido total de los AGs n-3 en los tres grupos suplementados con EPA/DHA (1:1), (2:1) y (1:2) fue mayor que en el grupo SHROB-soja (P<0.001) y a su vez el grupo SHROB-EPA/DHA (1:2) present? menor porcentaje que el grupo SHROB-EPA/DHA (1:1) (P<0.001). En cuanto al contenido total de AGMIs, se observ? menor porcentaje en los grupos SHROB-EPA/DHA (1:1) y SHROB- EPA/DHA (2:1) que en el grupo SHROB-soja (P<0.05) y (P<0.01), respectivamente. Finalmente, se observ? en los grupos SHROB-EPA/DHA (1:1) y SHROB-EPA/DHA (2:1) mayor contenido de AGPIs que en el grupo SHROB-soja (P<0.01) y (P<0.001), respectivamente. No se observaron diferencias significativas en la cantidad de AGs n-6 y AGSs en los grupos. 81 Tabla 23. Perfil lip?dico de los AGs en plasma en los grupos de ratas SHROB suplementados con aceite de soja y con las mezclas de EPA/DHA (1:1), (2:1) y (1:2). Los resultados se expresan para cada AG como porcentaje molar. SHROB Soja EPA/DHA (1:1) EPA/DHA (2:1) EPA/DHA (1:2) C14:0 0.73?0.08 0.98?0.08* 0.81?0.02 0.87?0.05 C15:0 0.20?0.01 0.21?0.01 0.19?0.01 0.22?0.03 C16:0 25.51?0.45 24.23?0.39 24.43?0.23 24.64?0.24 C16:1n-7 6.21?0.52 7.26?0.27 6.56?0.24 7.28?0.23 C17:0 0.21?0.01 0.21?0.01 0.22?0.01 0.21?0.01 C18:0 7.97?0.57 9.20?0.39 9.23?0.35 8.22?0.42 C18:1n-9 26.26?1.26 21.48?0.86** 20.99?0.45** 24.45?0.84 C18:1n-7 3.01?0.20 2.68?0.19 2.42?0.08* 3.07?0.07 C18:2n-6 12.08?0.27 12.18?0.20 11.78?0.24 12.02?0.25 C18:3n-6 0.45?0.03 0.43?0.06 0.40?0.02 0.45?0.03 C18:3n-3 0.53?0.04 0.54?0.03 0.54?0.02 0.53?0.03 C20:3n-6 0.77?0.08 1.04?0.05* 0.99?0.02 0.98?0.08 C20:4n-6 9.99?0.96 7.93?0.39 9.30?0.43 8.55?0.60 C20:5n-3 0.75?0.12 2.35?0.25*** 2.52?0.19*** 1.29?0.09 C22:5n-3 0.91?0.09 1.48?0.06*** 2.03?0.02***$ 1.14?0.06*$ C22:6n-3 4.43?0.24 7.83?0.31*** 7.57?0.20*** 6.07?0.12***$$$ AGs n-3 6.61?0.31 12.19?0.53*** 12.66?0.34*** 9.03?0.23***$$$ AGs n-6 23.29?0.81 21.57?0.55 22.49?0.30 22.00?0.54 AGSs 34.61?0.41 34.83?0.38 34.88?0.33 34.17?0.35 AGMIs 35.49?1.35 31.40?0.93* 29.97?0.74** 34.80?0.89 AGPIs 29.90?1.07 33.77?0.63** 35.15?0.54*** 31.03?0.63 AGs: ?cidos grasos; EPA: ?cido eicosapentaenoico; DHA: ?cido docosahexaenoico; AGs n-3: ?cidos grasos omega-3; AGs n-6: ?cidos grasos omega-6; AGSs: ?cidos grasos saturados; AGMIs: ?cidos grasos monoinsaturados y AGPIs: ?cidos grasos poliinsaturados. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo SHROB-soja: *P<0.05, **P<0.01,***P<0.001 y del grupo SHROB-EPA/DHA (1:1): $P<0.05, $$P<0.01, $$$P<0.001. En la membrana de los eritrocitos (Tabla 24) C16:0 y C16:1n-7 presentaron mayor porcentaje en los grupos SHROB-EPA/DHA (2:1) y SHROB-EPA/DHA (1:1) que en el grupo SHROB-soja (P<0.05). El AG C18:0 se detect? en menor cantidad en el grupo SHROB-EPA/DHA (1:1) que en el grupo SHROB-soja (P<0.01). El AG C18:2n-6 se encontr? en mayor cantidad en los grupos suplementados con EPA/DHA (1:1), (2:1) y (1:2) que en el grupo SHROB-soja (P<0.001), (P<0.01) y (P<0.05), respectivamente. Los AGs C20:4n-6, C20:5n-3, C22:5n-3 y C22:6n-3 se encontraron en mayor proporci?n que en el grupo SHROB- soja (P<0.001), mientras que el grupo SHROB-EPA/DHA (1:2) present? mayor porcentaje de AG C20:4n-6 que en el grupo SHROB-soja (P<0.001) y que el grupo SHROB-EPA/DHA (1:1) (P<0.001). El AG C20:5n-3 present? menor proporci?n (P<0.001) en el grupo SHROB-EPA/DHA (1:2) que en el grupo SHROB-EPA/DHA (1:1) y el AG C22:6n-3 present? mayor proporci?n (P<0.001) en el grupo SHROB- EPA/DHA (1:2) que en el grupo SHROB-soja. Por otro lado, los AGs C14:0, C15:0, 82 C17:0, C18:1n-9, C18:1n-7 y C20:3n-6 no presentaron diferencias significativas entre los grupos. En cuanto a la cantidad total de AGs n-3 y AGs n-6, se observ? que los tres grupos suplementados con EPA/DHA (1:1), (2:1) y (1:2) presentaron mayor porcentaje que en el grupo SHROB-soja (P<0.001) y a la vez el grupo SHROB- EPA/DHA (1:2) present? menor porcentaje de AGs n-3 y mayor porcentaje de AGs n-6 con respecto al grupo SHROB-EPA/DHA (1:1) (P<0.001). En cuanto a la cantidad de AGSs, se observ? mayor porcentaje en el grupo suplementado con EPA/DHA (2:1) que en el grupo suplementado con EPA/DHA (1:1) (P<0.01). Por su parte, no se observaron diferencias significativas en los AGMIs y AGPIs en los grupos. Tabla 24. Perfil lip?dico de los AGs en la membrana de los eritrocitos en los grupos de ratas SHROB suplementados con aceite de soja y con las mezclas de EPA/DHA (1:1), (2:1) y (1:2). Los resultados se expresan para cada AG como porcentaje molar. SHROB Soja EPA/DHA (1:1) EPA/DHA (2:1) EPA/DHA (1:2) C14:0 0.43?0.03 0.51?0.04 0.59?0.12 0.55?0.10 C15:0 0.18?0.01 0.20?0.02 0.19?0.03 0.17?0.01 C16:0 22.78?0.15 23.45?0.28 23.99?0.41* 23.51?0.27 C16:1n-7 1.28?0.02 1.83?0.19* 1.40?0.01 1.52?0.01 C17:0 0.26?0.02 0.25?0.005 0.25?0.01 0.25?0.01 C18:0 16.10?0.36 14.32?0.48** 15.34?0.17 15.14?0.21 C18:1n-9 9.56?0.42 10.82?0.92 9.00?0.22 9.77?0.36 C18:1n-7 1.99?0.02 1.98?0.03 1.97?0.03 2.07?0.03 C18:2n-6 6.74?0.35 8.21?0.14*** 7.67?0.07** 7.52?0.12* C18:3n-6 ND ND ND ND C18:3n-3 ND ND ND ND C20:3n-6 1.20?0.11 1.20?0.06 1.27?0.08 1.34?0.09 C20:4n-6 19.65?0.46 14.21?0.44*** 15.05?0.20*** 16.78?0.17***$$$ C20:5n-3 0.77?0.08 2.20?0.16*** 2.21?0.13*** 1.24?0.07$$$ C22:5n-3 2.41?0.17 3.10?0.11*** 3.80?0.04***$$$ 2.70?0.10 C22:6n-3 6.70?0.25 9.11?0.26*** 8.21?0.17***$ 8.47?0.06*** AGs n-3 9.88?0.09 14.41?0.34*** 14.22?0.29*** 12.40?0.15***$$$ AGs n-6 27.59?0.13 23.63?0.48*** 23.99?0.21*** 25.65?0.15***$$$ AGSs 39.74?0.25 38.72?0.36 40.36?0.42$$ 39.61?0.26 AGMIs 12.83?0.56 14.63?1.11 12.36?0.28 13.36?0.45 AGPIs 37.47?0.14 38.04?0.48 38.21?0.32 38.06?0.26 AGs: ?cidos grasos; EPA: ?cido eicosapentaenoico; DHA: ?cido docosahexaenoico; AGs n-3: ?cidos grasos omega-3; AGs n-6: ?cidos grasos omega-6; AGSs: ?cidos grasos saturados; AGMIs: ?cidos grasos monoinsaturados; AGPIs: ?cidos grasos poliinsaturados y ND: no detectado. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo SHROB-soja: *P<0.05, **P<0.01,***P<0.001 y del grupo SHROB- EPA/DHA (1:1): $P<0.05, $$P<0.01, $$$P<0.001. En cuanto a la actividad enzim?tica de SCD-1, SCD-2, ?5 y ?6 determinadas en plasma (Tabla 25) y en la membrana de los eritrocitos (Tabla 26), en general se observ? que la actividad en plasma fue mayor que en la membrana de los eritrocitos 83 para las enzimas SCD-1, SCD-2 y ?6, pero no as? para la actividad de la enzima ?5 que fue mayor en la membrana de los eritrocitos. Se observ? que la enzima SCD-1 en plasma present? mayor actividad en los grupos suplementados con EPA/DHA (1:1) y (1:2) que en el grupo SHROB-soja (P<0.05) (Tabla 25). En la membrana de los eritrocitos la actividad de la enzima SCD-1 no present? diferencias significativas entre los grupos (Tabla 26). Se observ? que la enzima SCD-2 en plasma present? menor actividad en los grupos suplementados con EPA/DHA (1:1) y (2:1) que los grupos suplementados con soja (P<0.05) (Tabla 25). En la membrana de los eritrocitos la actividad de la enzima SCD-2 no present? diferencias significativas entre los grupos (Tabla 26). Tabla 25. Actividad de las desaturasas SCD-1, SCD-2, ?5 y ?6 calculada a partir de la relaci?n entre producto AG y su precursor en plasma en los grupos de ratas SHROB suplementados con aceite de soja y con las mezclas de EPA/DHA (1:1), (2:1) y (1:2). SHROB Soja EPA:DHA 1:1 EPA:DHA 2:1 EPA:DHA 1:2 SCD-1[C16:1n-6/C16:0] 0.24?0.02 0.30?0.01* 0.27?0.01 0.30?0.01* SCD-2[C18:1n-9/C18:0] 3.41?0.33 2.38?0.21* 2.30?0.14* 3.06?0.27 ?5 [C20:4n-6/C20:3n-6] 13.41?1.48 7.66?0.37*** 9.37?0.51** 8.86?0.58** ?6 [C18:3n-6/C18:2n-6] 0.04?0.002 0.03?0.005 0.03?0.002 0.04?0.002 SCD-1: esteroil-CoA desaturasa-1; SCD-2: esteroil-CoA desaturasa-2; ?5: delta cinco desaturasa; ?6: delta seis desaturasa y AG: ?cido graso. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo SHROB-soja: *P<0.05, **P<0.01,***P<0.001. Por otro lado, se observ? que la actividad de la enzima ?5 en plasma fue menor en el grupo SHROB-EPA/DHA (1:1) que en el grupo SHROB-soja (P<0.001) y tambi?n se observ? menor actividad en los grupos suplementados con EPA/DHA (2:1) y (1:2) que en el grupo suplementado con soja (P<0.01) (Tabla 25). En la membrana de los eritrocitos, se observ? que la actividad de la enzima ?5 fue menor en los grupos SHROB-EPA/DHA (1:1) y SHROB-EPA/DHA (2:1) que en el grupo SHROB-soja (P<0.05) (Tabla 26). Se observ? que la actividad de la enzima ?6 en plasma no present? diferencias significativas entre los grupos. 84 Tabla 26. Actividad de las desaturasas SCD-1, SCD-2, ?5 y ?6 calculada a partir de los ratios entre producto AG y su precursor en la membrana de los eritrocitos en los grupos de ratas SHROB suplementados con aceite de soja y con las mezclas de EPA/DHA (1:1), (2:1) y (1:2). SHROB Soja EPA/DHA (1:1) EPA/DHA (2:1) EPA/DHA (1:2) SCD-1[C16:1n-6/C16:0] 0.06?0.01 0.08?0.01 0.06?0.003 0.06?0.004 SCD-2[C18:1n-9/C18:0] 0.60?0.03 0.77?0.09 0.59?0.02 0.65?0.03 ?5 [C20:4n-6/C20:3n-6] 17.29?2.11 11.93?0.42* 12.11?0.66* 12.87?0.99 ?6 [C18:3n-6/C18:2n-6] ND ND ND ND SCD-1: esteroil-CoA desaturasa-1; SCD-2: esteroil-CoA desaturasa-2; ?5: delta cinco desaturasa; ?6: delta seis desaturasa y AG: ?cido graso y ND: no detectado. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo SHROB- soja: *P<0.05. En la evaluaci?n de los TG a lo largo del estudio (Figura 34a), se observ? que en general los grupos suplementados con las mezclas de EPA/DHA presentaron niveles menores de TG que en el grupo suplementado con soja. En particular, se observ? menor nivel a la semana 4 en los grupos suplementados con las mezclas EPA/DHA (1:1) y EPA/DHA (2:1) con respecto al grupo SHROB-soja (P<0.05); por su parte el grupo SHROB-EPA/DHA (1:2) present? mayor nivel que el grupo SHROB-EPA/DHA (1:1) (P<0.001). El contenido de colesterol total a lo largo del estudio (Figura 34b), fue menor a las 8 semanas en todos los grupos suplementados con las mezclas EPA/DHA (1:1), (2:1) y (1:2) que en el grupo SHROB-soja (P<0.05), mientras que a la semana 12 no se observaron diferencias significativas. En la cantidad de l?pidos totales evaluados en plasma al final del estudio, se observ? que los grupos suplementados con EPA/DHA (1:1) y (2:1) presentaron menor nivel que en el grupo SHROB-soja (P<0.01) (Figura 34c). En cuanto al peso del h?gado expresado en porcentaje con respecto al peso corporal, no se observaron diferencias significativas entre los grupos (Figura 34d). 85 En la evaluaci?n del contenido de LDL-c, LDL-ox, HDL-c, HbA1c, PCR, VCAM-1, ICAM-1 y PAI-1 al final del estudio se observ? que el LDL-c present? menor nivel en los grupos suplementados con EPA/DHA (1:1) (P<0.01) y (2:1) (P<0.01), y (1:2) (P<0.05) que el grupo suplementado con soja. En cuanto al LDL- ox, se observ? que los grupos SHROB-EPA/DHA (1:1) y (1:2) presentaron mayor nivel que el grupo SHROB-soja (P<0.01) y el grupo SHROB-EPA/DHA (2:1) present? mayor nivel que el grupo SHROB-soja (P<0.001) (Tabla 27). No se observaron diferencias significativas en los valores de HDL-c. En los grupos suplementados con EPA/DHA (1:1), (2:1) y (1:2), se observ? menor porcentaje de HbA1c que en el grupo SHROB-soja (P<0.001), (P<0.01) y (P<0.05), respectivamente (Tabla 27). El valor de la PCR fue menor en los grupos suplementados con las mezclas EPA/DHA (1:1) y (2:1) que en el grupo SHROB- 4 8 12 0 500 1000 1500 2000 SHROB-soja SHROB-EPA/DHA (1:1) SHROB-EPA/DHA (2:1) SHROB-EPA/DHA (1:2) a) $$$ ** Periodo experimental , semanas Tr ig lic ?r id os , m g/ dL 4 8 12 0 100 200 300 400 SHROB-soja SHROB-EPA/DHA (1:1) SHROB-EPA/DHA (2:1) SHROB-EPA/DHA (1:2) b) ** * Periodo experimental, semanas C ol es te ro l t ot al , m g/ dL 0 1000 2000 3000 c) SHROB-soja SHROB-EPA/DHA (1:1) SHROB-EPA/DHA (2:1) SHROB-EPA/DHA (1:2) ** ** Periodo experimental, semana 16L ?p id os to ta le s en pl as m a, m g/ dL 0 1 2 3 4 d) SHROB-soja SHROB-EPA/DHA (1:1) SHROB-EPA/DHA (2:1) SHROB-EPA/DHA (1:2) Periodo experiemental , semana 16 Pe so de h? ga do , % Figura 34. a) Triglic?ridos, b) colesterol total, c) l?pidos totales en plasma y c) h?gado en ratas SHROB suplementadas con EPA/DHA a diferentes proporciones. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo SHROB- soja: *P<0.05, **P<0.01 y del grupo SHROB-EPA/DHA (1:1) $$$P<0.001. 86 soja (P<0.05) (Tabla 27). El valor de VCAM-1 fue mayor en el grupo suplementado con la mezcla EPA/DHA (1:2) que en el grupo SHROB-soja (P<0.001), as? como con respecto al grupo SHROB-EPA/DHA (1:1) (P<0.05), mientras que los resultados de ICAM-1 y PAI-1 no mostraron diferencias significativas (Tabla 27). Tabla 27. Par?metros relacionados con el SM en ratas SHROB determinados despu?s de 13 semanas de suplementaci?n con aceite de soja y con las mezclas de EPA/DHA (1:1), (2:1) y (1:2). SHROB Soja EPA/DHA (1:1) EPA/DHA (2:1) EPA/DHA (1:2) LDL-c (mg/dL) 91.8?27.5 25.5?9.3** 14.7?1.5** 34.2?11.2* LDL-ox (ng/mL) 154.6?21.4 279.3?14.6** 343.4?18.4*** 292.1?30.6** HDL-c (mg/dL) 76.8?6.5 72.4?5.1 58.9?2.9 67.7?4.8 HbA1c (%) 6.8?0.4 4.2?0.1*** 4.5?0.1** 5.0?0.7* PCR (pg/mL) 285.9?23.8 205.9?15.9* 205.2?16.0* 249.6?19.5 VCAM-1 (?g/mL) 2.7?0.3 3.8?0.1 3.6?0.4 5.6?0.7***$ ICAM-1 (ng/mL) 1.0?0.1 0.9?0.1 1.1?0.1 0.9?0.1 PAI-1 (?g/mL) 11.6?0.6 10.5?0.8 10.9?0.5 12.5?1.2 LDL-c: colesterol de lipoprote?nas de baja densidad; LDL-ox: lipoprote?nas de baja densidad oxidada; HDL-c: colesterol de lipoprote?nas de alta densidad; HbA1c: hemoglobina glicosilada; PCR: prote?na C reactiva; VCAM-1: mol?cula de adhesi?n celular vascular-1; ICAM-1: mol?cula de adhesi?n intracelular y PAI-1: inhibidor del activador del plasmin?geno-1. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo SHROB-soja: *P<0.05, **P<0.01,***P<0.001 y del grupo SHROB-EPA:DHA (1:1): $P<0.05. En la evaluaci?n de la insulina plasm?tica (Figura 35a), se observ? que a la semana 12 el grupo suplementado con la mezcla de EPA/DHA (1:1) present? mayor nivel que el grupo SHROB-soja (P<0.01), mientras el grupo suplementado con la mezcla EPA/DHA (1:2) present? menor nivel que el grupo SHROB-EPA/DHA (1:1) (P<0.05). En cuanto a la glucosa plasm?tica (Figura 35b), se observ? mayor nivel a la semana 4 en el grupo suplementado con la mezcla de EPA/DHA (1:1) que en el grupo SHROB-soja (P<0.05). Por otro lado, se observ? que los grupos suplementados con EPA/DHA (2:1) y EPA/DHA (1:2) presentaron menor nivel de glucosa que el grupo SHROB-EPA/DHA (1:1) (P<0.05) y (P<0.01), respectivamente. Sin embargo estas diferencias no se observaron a la semana 8 y 12 de suplementaci?n. 87 En la prueba de tolerancia a la glucosa (Figura 36a), se observ? a los 15 min un mayor incremento de glucosa en el grupo SHROB-EPA/DHA (2:1) que en el grupo SHROB-EPA/DHA (1:1) (P<0.05); tambi?n se observ? un mayor descenso de glucosa a los 120 min en el grupo SHROB-EPA/DHA (2:1) que en el grupo SHROB-soja (P<0.01), y con respecto al grupo SHROB-EPA/DHA (1:1) tambi?n se observ? un mayor descenso (P<0.01). Sin embrago, al calcular el ?rea bajo la curva (AUC), no se observaron diferencias significativas entre los grupos (Figura 36b). 4 8 12 0 5 10 15 20 SHROB-soja SHROB-EPA/DHA (1:1) SHROB-EPA/DHA (2:1) SHROB-EPA/DHA (1:2) a) ** $ Periodo experimental , semanas In su lin a pl as m ?t ic a, n g/ m L 4 8 12 0 10 20 30 40 50 60 70 80 SHROB-soja SHROB-EPA/DHA (1:1) SHROB-EPA/DHA (2:1) SHROB-EPA/DHA (1:2) b) * $$$ Periodo experimental , semanas G lu co sa pl as m ?t ic a, m g/ dL Figura 35. a) Insulina plasm?tica y b) glucosa plasm?tica en ratas SHROB suplementadas con EPA/DHA a diferentes proporciones. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo SHROB-soja: *P<0.05, **P<0.01 y del grupo SHROB-EPA/DHA (1:1): $P<0.05, $$P<0.01. 0 50 10050 75 100 125 150 SHROB-soja SHROB-EPA/DHA (1:1) SHROB-EPA/DHA (2:1) SHROB-EPA/DHA (1:2) a) ** $$ $ Tiempo, minutos G lu co sa pl as m ?t ic a, m g/ dL 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 SHROB-soja SHROB-EPA/DHA (1:1) SHROB-EPA/DHA (2:1) SHROB-EPA/DHA (1:2) b) Periodo experimental, semana 14 y 15 A U C gl u co sa , m g x 12 0 m in /d L Figura 36. a) Prueba de tolerancia a la glucosa, y b) ?rea bajo la curva en ratas SHROB suplementadas con EPA/DHA a diferentes proporciones. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo SHROB-soja: **P<0.01 y del grupo SHROB-EPA/DHA (1:1): $P<0.05, $$P<0.01. 88 En la Figura 37 se muestra el contenido de isoprostanos totales (isoprostanos libres + isoprostanos glucoronidados) en orina, determinados por cromatograf?a l?quida de alta eficiencia acoplada a espectrometr?a de masas en t?ndem con ionizaci?n por electroespray (HPLC?ESI?MS/MS). En general, se observ? que el isoprostano 15-F3t-IsoP que proviene directamente de EPA (suplementado) no se detect? en ninguna de las muestras, mientras que el 15-F2t-IsoP, 5-F2t-IsoP, 5-F2c- IsoP y 8-F2t-IsoP que se derivan del AA y el 2,3-dinor-15-F2t-IsoP (un metabolito derivado de 15-F2t-IsoP) se detectaron en todas las muestras. Adem?s, se observ? que el grupo suplementado con la mezcla de EPA/DHA (1:2) present? un nivel m?s bajo del 15-F2t-IsoP que en el grupo suplementado con soja (P<0.01), y a su vez este mismo grupo present? menor nivel que el grupo SHROB-EPA/DHA (1:1) (P<0.05). Los grupos suplementados con EPA/DHA (2:1) y (1:2) mostraron niveles m?s bajos del 2,3-dinor-15-F2t-IsoP que en el grupo SHROB-soja (P<0.001), y a su vez estos mismos grupos presentaron tambi?n menor nivel que en el grupo SHROB- EPA/DHA (1:1) (P<0.001). Los isoprostanos 5-F2t-IsoP y 5-F2c-IsoP fueron los que se encontraron en mayor concentraci?n. Se observ? que el grupo suplementado con la mezcla de EPA/DHA (1:2) present? menor nivel de estos compuestos que en el grupo SHROB-soja (P<0.01), y a su vez el grupo SHROB-EPA/DHA (1:2) present? menor nivel que el grupo SHROB-EPA/DHA (1:1) (P<0.05). Por otro lado, el 8-F2t- IsoP present? menor nivel en los grupos SHROB-EPA/DHA (2:1) y (1:2) que en el grupo SHROB-EPA/DHA (1:1) (P<0.05). - Iso P 2t 15 - F - Iso P 2t 2,3 - din or - 15 - F - Iso P 2t 5-F - Iso P 2c 5-F - Iso P 2t 8-F 0 100 200 300 400 500 1500 2000 2500 3000 SHROB-soja SHROB-EPA:DHA 1:1 SHROB-EPA:DHA 2:1 SHROB-EPA:DHA 1:2 ** *** $$$ ** $ *** $$$ $$ ** $ Is oP to ta l, pg /m g cr ea tin in a Figura 37. Isoprostanos totales en ratas SHROB suplementadas con EPA/DHA a diferentes proporciones. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo SHROB-soja: **P<0.01,***P<0.001 y del grupo SHROB-EPA/DHA (1:1): $P<0.05, $$$P<0.001. 89 El sistema antioxidante end?geno se evalu? en los eritrocitos, grasa abdominal, h?gado, ri??n, coraz?n y cerebro de las ratas SHROB suplementadas con aceite de soja y con las mezclas de EPA/DHA (1:1), (2:1) y (1:2) al final del estudio (Tabla 28). Se observ? que en eritrocitos y en cerebro el grupo SHROB-EPA/DHA (1:1) present? mayor actividad de la enzima SOD que en el grupo SHROB-soja (P<0.05), mientras que en coraz?n la actividad fue mayor en el grupo SHROB-EPA/DHA (1:1) que en el grupo SHROB-soja (P<0.001). Por su parte, la actividad enzim?tica de CAT en eritrocitos y en ri??n en el grupo SHROB-EPA/DHA (2:1) fue mayor que en el grupo SHROB-soja (P<0.05) y adem?s el grupo suplementado con EPA/DHA (2:1) present? mayor nivel que en el grupo SHROB-EPA/DHA (1:1) en eritrocitos (P<0.001) y ri??n (P<0.05). Se observ? que en eritrocitos la actividad de la enzima GR no present? diferencias significativas entre los grupos, pero en ri??n se observ? que la GR en el grupo SHROB-EPA/DHA (2:1) fue mayor que en el grupo SHROB-soja (P<0.01), mientras que en el coraz?n los grupos SHROB-EPA/DHA (1:1) y (2:1) presentaron menor nivel que el grupo SHROB-soja (P<0.001), y en el grupo SHROB-EPA/DHA (1:2) fue mayor que en el grupo SHROB-soja (P<0.05). Por otro lado, se observ? que en eritrocitos la actividad de GPx fue mayor en el grupo SHROB-EPA/DHA (1:1) y en el grupo SHROB-EPA/DHA (2:1) que en el grupo SHROB-soja (P<0.01), mientras el grupo SHROB-EPA/DHA (1:2) present? menor actividad que en el grupo SHROB-soja (P<0.01). En ri??n se observ? que los niveles de GPx en el grupo SHROB-EPA/DHA (2:1) fue mayor que en el grupo SHROB-soja (P<0.001), mientras que en el coraz?n el grupo SHROB-EPA/DHA (1:1) present? mayor nivel que en el grupo SHROB-soja (P<0.01), y que los grupos SHROB-EPA/DHA (2:1) y (1:2) presentaron menor nivel que el grupo SHROB-EPA/DHA (1:1) (P<0.01) y (P<0.001), respectivamente. En la evaluaci?n de la relaci?n GSH/GSSG se observ? que en el h?gado los grupos SHROB-EPA/DHA (1:1), (2:1) y (1:2) presentaron menor relaci?n que el grupo SHROB-soja (P<0.05), (P<0.001) y (P<0.01), respectivamente. En la evaluaci?n de la grasa abdominal se observ? que la relaci?n fue menor en el grupo SHROB-EPA/DHA (1:2) que en el grupo SHROB-EPA/DHA (1:1) (P<0.05). Mientras que en ri??n los grupos SHROB-EPA/DHA (1:1) y (2:1) presentaron menor relaci?n que en el grupo SHROB-soja (P<0.001) y el grupo SHROB- EPA/DHA (1:2) present? mayor relaci?n que en el grupo SHROB-EPA/DHA (1:1) (P<0.001). Por otro lado, en el coraz?n los grupos SHROB-EPA/DHA (2:1) y (1:2) presentaron mayor relaci?n que en el grupo SHROB-EPA/DHA (1:1) (P<0.05) y 90 (P<0.01), respectivamente. Finalmente, en cerebro no se observaron diferencias significativas entre los grupos. Tabla 28. Actividades del sistema antioxidante end?geno en ratas SHROB despu?s de 13 semanas de suplementaci?n con aceite de soja y con las mezclas de EPA/DHA (1:1), (2:1) y (1:2). ?rgano Par?metros SHROB Soja EPA/DHA (1:1) EPA/DHA (2:1) EPA/DHA (1:2) Eritrocitos SOD (U/g Hb) 768.0?224.0 1604.7?118.3* 1485.6?259.1 1454.5?163.1 CAT (mmol/min/g Hb) 51.9?4.1 71.8?8.8 114.6?9.2***$$ 70.5?8.9 GR (U/g Hb) 0.9?0.1 0.8?0.1 1.0?0.2 1.0?0.1 GPx (U/g Hb) 51.5?10.3 87.1?2.4** 106.8?6.1*** 48.6?5.5** H?gado SOD (U/mg prote?na) 8.3?0.5 9.8?1.5 8.5?0.4 10.7?0.9 CAT (?mol/min/mg prote?na) 70.8?9.8 78.2?7.6 73.9?5.5 74.8?5.7 GR (mU/mg prote?na) 66.7?3.1 62.2?4.1 56.2?4.2 73.0?5.8 GPx (mU/mg prote?na) 245.4?31.0 329.1?43.9 229.5?27.1 282.3?54.8 GSH (nmol/mg prote?na) 61.2?9.6 47.6?4.8 23.0?2.6***$ 30.8?3.2** GSSG (nmol/mg prote?na) 133.7?12.1 178.4?21.6 106.8?6.1$$ 135.2?13.0 GSH/GSSG 0.5?0.05 0.3?0.04* 0.2?0.02*** 0.2?0.03** Grasa abdominal SOD (U/mg prote?na) 4.2?0.7 7.6?1.3 5.7?0.3 3.7?0.6* CAT (?mol/min/mg prote?na) 27.8?4.9 35.9?3.6 25.4?7.0 31.4?6.9 GR (mU/mg prote?na) 31.2?7.3 32.6?6.1 42.6?7.6 44.4?6.5 GPx (mU/mg prote?na) 38.7?2.6 50.4?8.0 51.7?5.2 42.7?4.3 GSH (nmol/mg prote?na) 110.4?24.9 96.1?21.1 71.9?9.1 47.7?8.2 GSSG (nmol/mg prote?na) 49.8?4.8 15.3?1.5*** 28.1?2.6** 69.0?5.6*$$$ GSH/GSSG 2.5?0.8 6.6?1.7 2.5?0.06 0.7?0.2$ Ri??n SOD (U/mg prote?na) 2.2?0.3 3.3?0.2 5.4?1.0** 1.5?0.1 CAT (?mol/min/mg prote?na) 24.1?3.1 39.4?6.9 65.3?9.0***$ 24.5?2.0 GR (mU/mg prote?na) 47.1?11.7 71.5?8.1 118.2?18.7** 38.4?5.7 GPx (mU/mg 57.2?9.1 106.9?10.3 174.2?22.1***$ 70.5?11.4 91 prote?na) GSH (nmol/mg prote?na) 33.4?7.4 34.0?2.8 54.5?4.8*$ 31.5?2.1 GSSG (nmol/mg prote?na) 0.5?0.1 1.1?0.1*** 1.5?0.1***$$ 0.4?0.04$$$ GSH/GSSG 68.2?6.7 32.2?3.8*** 36.9?1.4*** 80.7?5.1$$$ Coraz?n SOD (U/mg prote?na) 6.0?0.5 19.4?3.3*** 10.5?1.3$ 11.0?1.5$ CAT (?mol/min/mg prote?na) 15.1?0.6 21.0?4.5 20.1?1.2 18.0?1.6 GR (mU/mg prote?na) 23.6?1.4 13.9?1.2*** 11.0?1.5*** 29.6?1.4*$$$ GPx (mU/mg prote?na) 146.6?9.9 211.9?14.5** 155.2?5.2$$ 146.2?8.7$$$ GSH (nmol/mg prote?na) 21.5?2.8 13.9?2.4 17.7?2.4 23.0?2.8 GSSG (nmol/mg prote?na) 6.4?0.6 7.0?1.1 4.3?0.9 4.8?0.5 GSH/GSSG 3.3?0.3 2.1?0.3 4.8?0.9$ 4.9?0.6$$ Cerebro SOD (U/mg prote?na) 8.0?0.2 15.1?2.0* 9.9?0.9 12.7?2.1 CAT (?mol/min/mg prote?na) 6.4?0.9 2.3?0.4 11.2?2.5 9.2?3.6 GR (mU/mg prote?na) 67.4?7.3 70.3?9.3 60.2?3.7 74.7?7.3 GPx (mU/mg prote?na) 49.0?5.3 38.1?3.0 38.3?2.8 36.7?1.6 GSH (nmol/mg prote?na) 87.2?16.5 61.6?4.8 48.2?4.2* 55.8?4.1 GSSG (nmol/mg prote?na) 5.2?0.4 4.0?0.4 5.3?1.3 6.7?1.4 GSH/GSSG 16.5?3.1 15.7?0.7 12.1?2.4 10.3?2.4 SOD: super?xido dismutasa; CAT: catalasa; GR: glutati?n reductasa; GPx: glutati?n peroxidasa; GSH: glutati?n reducido; GSSG: disulfuro de glutati?n y Hb: hemoglobina. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo SHROB-soja: *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 y del grupo SHROB-EPA/DHA (1:1): $P<0.05, $$P<0.01, $$$P<0.001. 92 3.1.4. Discusi?n de los resultados del estudio 1 Las ratas SHROB representan un modelo animal potencialmente interesante para el estudio de SM, un estado previo a la aparici?n de la diabetes Mellitus tipo 2 (DM2) o a las enfermedades cardiovasculares (ECV), en el que las alteraciones metab?licas se deben a una mutaci?n en el gen del receptor de leptina. El objetivo en la primera etapa del estudio 1 fue determinar la adecuaci?n del modelo al estudio del SM comparando con la cepa sana WKY mediante la evaluaci?n de par?metros relacionados con la funci?n cardiovascular, la inflamaci?n y el estr?s oxidativo (EO) que no hab?an sido descritos antes. Los resultados forman parte de un art?culo publicado que se incluye como Anexo 7.1.1 (art?culo: Cardiovascular disease- related parameters and oxidative stress in SHROB rats, a model for metabolic syndrome). Los par?metros de TG, colesterol total, insulina, glucosa en ayunas, HbA1c y presi?n arterial, ya han sido examinados y reportados con anterioridad para el modelo de ratas SHROB[308, 309] y comparados con ratas SHRSP (ratas espont?neamente hipertensas y propensas a accidentes cerebrovasculares) como control, despu?s de la suplementaci?n con aceite de soja.[310] Nuestro resultados concuerdan con los datos reportados, excepto para la glucemia; algunos autores reportan hiperglucemia en este modelo de SM,[308, 311, 312] mientras que otros informaron de normoglucemia.[309, 313] Nuestros resultados (Figura 23b), corroborados con la prueba de tolerancia a la glucosa (Figura 24) son concordantes con estos ?ltimos. Este trabajo aporta nuevos datos relacionados con el perfil lip?dico de ?cidos grasos en plasma y en la membrana de los eritrocitos, la actividad enzim?tica de desaturasas (SCD-1, SCD-2, ?5 y ?6), marcadores de disfunci?n endotelial (ICAM-1 y VCAM-1), inflamaci?n (PCR) y la actividad tromb?tica (PAI- 1). Las ratas SHROB mostraron alteraciones significativas en el peso corporal (Figura 20a, b), el porcentaje de grasa abdominal (Figura 20c), la presi?n arterial (Figura 21), perfil lip?dico en plasma (Tabla 11), perfil lip?dico en la membrana de los eritrocitos (Tabla 12), actividad de las enzimas desaturasa en plasma (Tabla 13), actividad de las enzimas desaturasas en la membrana de los eritrocitos (Tabla 14), TG (Figura 22a), colesterol total (Figura 22b), LDL-c (Tabla 15), HDL-c (Tabla 15), PCR, ICAM-1, PAI-1 (Tabla 15) e insulina (Figura 23a). Para algunos de estos par?metros los valores en las ratas SHROB fueron m?s de un 50% superiores que en las ratas WKY. El deterioro de la funci?n endotelial en ratas SHROB es bien conocido y relacionado con las alteraciones de la v?a del ?xido n?trico y la presencia de prostaglandinas viscerales derivadas del tejido adiposo perivisceral.[310, 311] Todos 93 estos resultados son consistentes con la alta circulaci?n de l?pidos, acumulaci?n de grasa visceral y un estado de inflamaci?n leve que precede a la resistencia a la insulina (RI).[314] La inflamaci?n parece ser el v?nculo entre la obesidad y el desarrollo de resistencia a la insulina en el SM.[315] La mutaci?n (fak) en el receptor de la leptina en las ratas SHROB es la responsable del deterioro de la capacidad de la leptina de regular la ingesta que explicar?a estos efectos como una relaci?n directa entre el descontrol en la ingesta y la acumulaci?n de grasa. El EO es un proceso complejo, en el que se dan diversas interacciones entre los sistemas antioxidantes end?genos, el progreso de la oxidaci?n en las biomol?culas y los niveles circulaci?n de antioxidantes ex?genos.[316] Se determinaron diferentes biomarcadores de EO correspondientes a cada uno de estos componentes del EO, lo cual supone una aportaci?n original a la descripci?n del modelo. La visi?n que surge de nuestros resultados es la de una marcada diferencia entre el EO en sangre (sistema antioxidante end?geno en los eritrocitos y LDL-ox en plasma) y el EO en orina y ?rganos (sistema antioxidante end?geno en tejidos y ?rganos, y a trav?s de l?pidos y oxidaci?n de prote?nas productos finales de oxidaci?n en los ?rganos y orina). Las actividades de SOD y GPx (Tabla 16) en eritrocitos fueron significativamente menores en las ratas SHROB, y esta depresi?n del sistema de defensa end?gena fue concomitante con un aumento de los niveles del LDL-ox. Esto es coherente con las anterior observaciones relacionadas con los biomarcadores de ECV, ya que EO, particularmente baja la actividad de las SOD, se ha demostrado que est?n presente en los sujetos con SM, que tambi?n muestran niveles elevados de prote?na C reactiva.[317] Este EO no parece haber alcanzado los diferentes ?rganos, ya que no se observaron diferencias significativas en los niveles de malondialdehido (MDA) en el h?gado, ri??n y el isoprostano 15-F2t-Isop en orina en las ratas SHROB. De hecho, en comparaci?n con las ratas WKY, la cepa SHROB present? un aumento significativo de GSH en el h?gado, la grasa abdominal y el cerebro (Tabla 16) as? como una disminuci?n significativa en la carbonilaci?n de prote?nas y oxidaci?n de l?pidos en la grasa abdominal. Aunque es conocido que las ratas SHROB, presentan alteraciones en ?rganos a largo plazo (p.e. aumento de la infiltraci?n de macr?fagos en el ri??n),[318] nuestros resultados sugieren que, en un per?odos de tiempo cortos (semanas), los ?rganos est?n a?n bajo la protecci?n de los sistemas de defensa que se encuentran activados. Es interesante remarcar que, aunque la carbonilaci?n total de prote?nas en ratas SHROB es menor que en ratas WKY, en un trabajo paralelo dentro del proyecto de investigaci?n en el que se enmarca esta tesis, se han detectado variaciones significativas en la carbonilaci?n de ciertas prote?nas. En concreto, la aldeh?do deshidrogenasa mitocondrial, la disulfuro isomerasa-A3 o la disulfuro- 94 isomerasa podr?an ser biomarcadores tempranos de EO en ?rganos.[319] Finalmente, la mayor capacidad antioxidante en plasma en ratas SHROB, es concordante con los bajos niveles de carbonilaci?n de prote?nas reportados en el plasma en las ratas SHROB.[319] Se observaron niveles elevados de marcadores relacionados con la inflamaci?n, disfunci?n endotelial, actividad tromb?tica, RI y EO (PCR, insulina, TG, colesterol total, LDL-c, HDL-c, componentes de los AGs en plasma y en la membrana de los eritrocitos, actividad de las enzimas desaturasas en plasma y en membrana de los eritrocitos, grasa abdominal, presi?n arterial, ICAM-1 y PAI-1). Todas estas observaciones son consistentes con un estado pre-diab?tico con un incipiente estado de EO y riesgo de desarrollar ECV. Los resultados muestran que las ratas SHROB podr?an ser un modelo adecuado para el estudio del SM, en particular, para la evaluaci?n de la eficacia de intervenciones nutricionales y que adem?s pueden ser utilizadas para evaluar los efectos. La segunda parte del estudio 1, consisti? en una intervenci?n nutricional con AGPIs n-3 de aceites de pescado, a los que se les ha atribuido un rol en la prevenci?n de eventos cardiovasculares y en la prevenci?n del SM, por sus propiedades hipolipemieantes y antidiabetog?nicas. Los mecanismos de los efectos ben?ficos de los AGPIs n-3 as? como la influencia de la composici?n de las mezclas est?n aun insuficientemente explorados.[150, 320] El objetivo en esta segunda etapa del estudio 1, fue evaluar los efectos de mezclas EPA/DHA a distintas proporciones (1:1), (1:2) y (2:1) en ratas WKY sanas como un primer paso para el estudio de un posible efecto preventivo en el modelo SHROB. Parte de los resultados discutidos aqu? han sido publicados y se incluyen en el Anexo 7.1.3 (art?culo: Protective effect of the omega-3 polyunsaturated fatty acids: Eicosapentaenoic acid/Docosahexaenoic acid 1:1 ratio on cardiovascular disease risk markers in rats). Los par?metros de peso corporal (Figura 26), grasa abdominal (Figura 26c), presi?n arterial (Figura 27), ?cido ?rico (Figura 27c), insulina (Figura 29a), glucosa (Figura 29b), tolerancia a la glucosa (Figura 30), no se vieron alterados por la suplementaci?n con AGPIs n-3.[321-323] En cuanto al perfil lip?dico en plasma y en la membrana de los eritrocitos la suplementaci?n con EPA/DHA aumenta significativamente la cantidad de AGPIs n- 3 en plasma y en eritrocitos, y no se observaron diferencias en la cantidad de AGMIs y AGPIs con respecto al grupo control soja. Por otro lado, se observ? una disminuci?n no significativa en TG (Figura 28a), colesterol total (Figura 28b), LDL-c (Tabla 21) en los grupos suplementados con las diferentes proporciones de 95 AGPIs n-3. Adem?s, hay una reducci?n en HbA1c (Tabla 21) y en la PCR (Tabla 21), de manera tal que los AGPIs reducen el riesgo de la ECV, esencialmente mediante la mejora del metabolismo lip?dico, como se ha demostrado en otros estudios.[115, 324] Por lo que respecta al EO, la suplementaci?n con EPA/DHA aumenta la oxidaci?n de las LDL como se observ? en el estudio del modelo de SM de ratas SHROB, posiblemente mediante los mismos mecanismos ya explicados anteriormente. El MDA en h?gado no present? diferencias significativas, al igual que el isoprostano 15-F2t-IsoP (Figura 31) lo que nos indica un bajo EO a nivel sist?mico. Adem?s, estos resultados coinciden con los observados en un trabajo paralelo del mismo proyecto de investigaci?n donde se puso de manifiesto el efecto protector de la suplementaci?n con EPA/DHA en la carbonilaci?n de prote?nas.[325] Dietas enriquecidas con aceite de pescado disminuyeron la carbonilaci?n de prote?nas, especialmente la dieta con relaci?n de EPA/DHA (1:1). Las actividades de diversas enzimas antioxidantes aumento con la suplementaci?n: SOD en los eritrocitos, en la grasa abdominal, en ri??n, y en cerebro en la proporci?n EPA/DHA (1:1); CAT, GR, GPx en los ri?ones, en la proporci?n EPA/DHA (2:1). Los resultados indican ausencia de efectos o un leve efecto protector del EO de las mezclas EPA y DHA en animales sanos. Solamente se observ? cierta oxidaci?n de LDL-c y una activaci?n de los sistemas de defensa en ?rganos, compatible con un efecto horm?tico (estimulaci?n de sistemas de defensa activados por un est?mulo leve). La tercera parte del estudio 1, consisti? en evaluar la acci?n de las mezclas de AGPIs n-3 a distintas proporciones de EPA/DHA en ratas SHROB. Nuestros resultados indican que las mezclas de EPA/DHA mejoran claramente el perfil lip?dico alterado en ratas SHROB; la suplementaci?n a las tres proporciones probadas (1:1), (2:1) y (1:2) reduce los TG plasm?ticos (Figura 34a), el colesterol total (Figura 34b) y las LDL-c (Tabla 27). EPA/DHA (1:1) y (2:1) reducen significativamente (P<0.01) los niveles de l?pidos totales en plasma (Figura 34c). Se ha sugerido que los efectos de los AGPIs n-3 sobre el perfil lip?dico se derivan de su capacidad de regular la expresi?n de genes que codifican prote?nas implicadas en la oxidaci?n de los AGs y disminuyen la expresi?n de genes que codifican para prote?nas implicadas en la s?ntesis de l?pidos.[326] De acuerdo con nuestros resultados, mezclas de EPA y DHA con cantidades de EPA iguales o superiores a DHA son m?s efectivas que un exceso de DHA para el control de la dislipidemia en el SM y factores de riesgo de ECV. Por otro lado, estudios cl?nicos en humanos reportan que tanto el EPA con el DHA han sido igual de eficiente en la disminuci?n de los TG,[327] 96 de manera tal que los resultados obtenidos con este modelo de rata SHROB parece diferir de los resultados encontrados en humanos. La inflamaci?n cr?nica est? estrechamente relacionada con la obesidad[328] y es un importante factor de riesgo en las ECV.[329] En el presente estudio hemos encontrado una disminuci?n significativa en la concentraci?n de PCR en plasma (Tabla 27) en ratas SHROB suplementadas con EPA/DHA (1:1) y (2:1), indicativo de una disminuci?n de la inflamaci?n sist?mica. Se ha sugerido que los AGPIs n-3 presentan efectos anti-inflamatorios porque causan un desplazamiento parcial de la ruta de los AGs n-6 que son proinflamatorios, y al mismo tiempo, generan resolvinas anti-inflamatorios (del EPA y DHA), y protectinas (del DHA) (Figura 6).[130, 330] Adem?s, resultados recientes han demostrado que los AGPIs n-3 inhiben la activaci?n del inflamasoma NLRP3.[331] En base a nuestros resultados, las mezclas con igual o m?s cantidades de EPA parecen ser m?s eficaces que las mezclas con mayor proporci?n en DHA (1:2). De hecho, se observ? que la proporci?n EPA/DHA (1:2) aument? la concentraci?n de VCAM-1, considerado tambi?n un marcador de la inflamaci?n, que tambi?n se ha observado en ratas WKY normales. Por otro lado, ninguna de las mezclas tuvo ning?n efecto sobre los niveles de ICAM-1 o PAI-1. Los efectos de los AGPIs n-3 sobre las mol?culas de adhesi?n en estos momentos constituyen un punto de controversia.[332] En cuanto al metabolismo de la glucosa (Figura 35b), mientras que ninguna de las mezclas de EPA/DHA modific? los niveles de glucosa en ayunas, cabe destacar que todos ellos disminuyeron significativamente la HbA1c en plasma (Tabla 27). Esto es un efecto potencialmente beneficioso de los AGPIs n-3 que tambi?n se ha observado en ratas WKY normales. Al mismo tiempo, se observ? que la mezcla EPA/DHA (1:1) aument? la secreci?n de insulina (Figura 35a). Un estudio previo concluy? que el DHA, y no el EPA, pod?a reducir el aumento de la insulina circulante inducida por conjugado del ?cido linoleico.[333] En contraste, otros autores informan que los AGPIs n-3 no afectan a la secreci?n de insulina en cerdos sanos.[334] Considerando que el efecto general de los AGPIs en el metabolismo de la glucosa es a?n controvertido, hay evidencia de que el EPA y el DHA pueden actuar en diferentes lugares y participar en diferentes mecanismos relacionados con la resistencia a la insulina.[335] De manera tal, que mezclas con proporciones diferentes producen resultados diferentes. Por lo que respecta a los marcadores de EO, se encontr? que el EPA/DHA (1:1) provoca un aumento de la actividad de las SOD en el tejido adiposo, eritrocitos, coraz?n y cerebro de ratas SHROB (Tabla 28). Anteriormente (parte 1 del estudio 1) se ha comentado que la actividad de la enzima SOD en el tejido adiposo y en los 97 eritrocitos de las ratas SHROB es menor en comparaci?n con las ratas WKY. Ahora mostramos que la suplementaci?n con EPA/DHA (1:1) aumenta la actividad de la enzima SOD a valores cercanos a los encontrados en las ratas WKY sanas. Tambi?n, se ha comentado que las actividades de las enzimas antioxidantes en el coraz?n y en el cerebro de las ratas SHROB y las ratas WKY sanas fueron similares. En estos ?rganos, los AGPIs n-3 parecen activar este sistema de protecci?n en ratas SHROB. Esta activaci?n tambi?n se ha observado en los eritrocitos de las ratas WKY sanas que recibieron EPA/DHA (1:1). Adem?s, las mezclas de EPA/DHA tambi?n aumentan la actividad de otras enzimas, como la CAT y GPx en los eritrocitos, este efecto est? m?s marcado en las ratas suplementadas con EPA/DHA (2:1). En el ri??n, un ?rgano particularmente afectado en este modelo de rata,[336] la mezcla de EPA/DHA (2:1) fue m?s eficaz que la mezcla EPA/DHA (1:1). Se observ? que la mezcla de EPA/DHA (2:1) causa un aumento en la actividad de diferentes enzimas antioxidantes (CAT, GR y GPx) y un desplazamiento del sistema de glutati?n hacia la acumulaci?n de GSSG (una disminuci?n de la relaci?n GSH/GSSG). Todos estos resultados sugieren posiblemente que la suplementaci?n con EPA/DHA provoca algo de EO con la posterior activaci?n de mecanismos de defensa. Los cambios en los marcadores de estr?s oxidativo (LDL-ox en plasma y isoprostanos en orina) examinados en este estudio son compatibles con esto. Las diferentes proporciones de mezclas de EPA/DHA (1:1), (2:1) y (1:2) aumentaron significativamente los niveles plasm?ticos del LDL-ox en ratas SHROB. Un similar aumento del LDL-ox, ha sido descrito en un modelo animal de SM despu?s de la suplementaci?n con AGPIs n-3.[337] Los investigadores que llevaron a cabo dicha investigaci?n plantearon la hip?tesis de que el efecto observado se debi? a la incorporaci?n de los AGPIs n-3 en las membranas celulares, causando un aumento en el ?ndice de peroxidabilidad, es decir, aumento en el n?mero de sitios susceptibles a la peroxidaci?n de l?pidos. Sin embargo, al evaluar el perfil lip?dico de los AGs presentes en plasma y en la membranas de los eritrocitos nuestros resultados parecen contradecir esa hip?tesis ya que hemos observado que en plasma la suplementaci?n con EPA/DHA (1:2) result? en un menor contenido de AGPIs y mayor de AGMIs (Tabla 23), y en la membrana de los eritrocitos no se observaron diferencias significativas en los AGMIs y AGPIs con el control soja (Tabla 24). Adem?s no se detect? el 15-F3t-IsoP, un metabolito que solamente puede ser generado por EPA y DHA (suplementaci?n), lo que nos indica que la suplementaci?n con los AGPIs no contribuy? directamente a los per?xidos lip?dicos circulantes.[338, 339] Nuestros resultados ser?an m?s compatibles con el hecho de que las lipoprote?nas LDL-c son m?s sensibles a la peroxidaci?n lip?dica que los l?pidos de 98 membrana porque est?n m?s expuestas la acci?n de radicales libres circulantes en sangre. Adem?s, las colesterol oxidasas act?an sobre el LDL-c parcialmente oxidado convirti?ndolo en LDL-ox.[340] Se conoce la existencia de distintas etapas en el proceso de oxidaci?n de las LDL-c, en el que se generan una forma intermedia, biol?gicamente activa, constituida por una peque?a fracci?n de fosfol?pidos oxidados, conocidos como LDL m?nimamente oxidadas.[341, 342] Los AGs n-3 (EPA/DHA) podr?an aumentar la cantidad de posiciones peroxidables de tal manera que una baja concentraci?n de radicales libres (p.e. hidroxilo) llegaran a oxidar LDL-c circulante pero fuera insuficiente para modificar significativamente los l?pidos de membrana a la vez que activar?an los sistemas enzim?ticos defensa (hormesis). El efecto antioxidante global horm?tico (estimulaci?n de los sistemas de defensa por un estr?s suave) estar?a de acuerdo con nuestra observaci?n de que la capacidad antioxidante en el plasma aumenta despu?s de la suplementaci?n de ratas WKY con AGPIs n-3. Es interesante remarcar que en ratas SHROB la proporci?n EPA/DHA (1:2) parece ser m?s eficaz en la reducci?n de la concentraci?n de isoprostanos en orina. El efecto horm?tico del DHA (seis dobles enlaces) puede que sea m?s efectivo que el del EPA (cinco dobles enlaces) puesto que podr?a ser m?s susceptible al ataque por radicales libres circulantes. Parece que en conjunto, nuestros resultados indican que el EPA es especialmente relevante en la activaci?n de los sistemas antioxidantes end?genos y la disminuci?n de los TG y PCR, mientras que el DHA es m?s eficaz en la reducci?n de los isoprostanos. Estos efectos diferenciales pueden deberse a diferentes efectos del EPA y DHA en las v?as de se?alizaci?n o en la expresi?n de ciertos genes, en particular sobre los relacionados con la activaci?n de las enzimas antioxidantes. Se ha informado de que el EPA y DHA influyen en las v?as de transducci?n de manera diferente en relaci?n con el crecimiento celular, afectando as? a diferentes procesos biol?gicos,[343] la liberaci?n de citocinas inflamatorias por las c?lulas mononucleares de sangre perif?rica[344] y la expresi?n de genes implicados en el metabolismo de los l?pidos.[345] Adem?s, la incorporaci?n de EPA o DHA en las membranas celulares puede tener efectos diferentes dependiendo de su estructura, como se muestra para las c?lulas endoteliales, linfocitos y en los canales de iones, como se observ? en varios modelos celulares.[332] Otro factor importante es que el EPA y DHA pueden presentar interacciones espec?ficas con otros componentes de los alimentos pueden influir en el estado oxidativo, como la vitamina E, que act?a junto con el DHA en la expresi?n de ciertos genes.[346] De acuerdo a nuestras observaciones las proporciones 99 de EPA y DHA deben considerarse cuidadosamente cuando se llevan a cabo estudios con AGPIs n-3 o cuando se comparan los resultados de diferentes estudios. En resumen, las ratas SHROB empleadas como modelo de SM, que recibieron una suplementaci?n con mezclas de EPA/DHA a distintas proporciones, disminuyeron significativamente los l?pidos totales en plasma, el colesterol total, las LDL-c, aumentaron la cantidad de AGs n-3 en plasma y en la membrana de los eritrocitos, y disminuyeron en los eritrocitos la cantidad de AGs n-6, en comparaci?n con el grupo control suplementado con soja. Mezclas de EPA/DHA en las proporciones (1:1) y (2:1) disminuyeron significativamente la inflamaci?n (los niveles de PCR), aumentaron significativamente la cantidad de AGMIs y AGPIs en plasma, disminuyeron la concentraci?n de isoprostanos en orina (principalmente la mezcla EA/DHA, 1:2), y aumentaron las actividades de las enzimas antioxidantes SOD en los eritrocitos y en la grasa abdominal (EPA/DHA, 1:1); SOD, CAT , GR, GPx en los ri?ones (EPA/DHA, 2:1). La concentraci?n de LDL-ox aument? en todas las proporciones de EPA/DHA suplementadas. Estos resultados son compatibles con la estimulaci?n de las defensas antioxidantes por las mezclas de EPA/DHA que inducen la reducci?n del EO junto con una disminuci?n de los factores de riesgo de ECV, tales como LDL-c y la inflamaci?n en ratas SHROB. 100 3.2. Estudio 2. Efecto de la combinaci?n de AGPIs y polifenoles de pepita de uva en un modelo animal de SM inducido por dieta 3.2.1. Evaluaci?n de la cepa de rata WKY como modelo de SM inducido por una dieta rica en grasas y sacarosa (HFHS) Ratas hembras WKY sanas a las que se les suministr? una dieta STD o una dieta HFHS (Secci?n Experimental Tabla 45, composici?n de dieta) durante 25 semanas, se comparan en esta secci?n del estudio 2. La evaluaci?n de la ingesta y el contenido cal?rico de la ingesta se muestra en la Figura 38. Se observ? menor ingesta (P<0.001) en el grupo HFHS-soja que en el grupo STD-soja (Figura 38a). Por otra parte, el grupo HFHS-soja inger?a mayor cantidad de kilocalor?as con respecto al grupo STD-soja (Figura 38b). 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 268 10 12 14 16 18 20 STD-soja HFHS-soja a) *** ** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** Periodo experimental, semanas In ge st a, g/ d? a 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 2630 35 40 45 50 55 60 65 70 75 STD-soja HFHS-soja b) *** *** *** * ** *** *** *** *** ** ** * *** ** * *** *** *** *** *** *** *** *** *** Periodo experimental, semana In ge st a, kc al /g /d ?a /1 00 g pe so Figura 38. a) Ingesta en ratas WKY con una dieta STD-soja y con una dieta HFHS-soja y b) energ?a producto de la ingesta. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo STD-soja: *P<0.05, **P<0.01 y ***P<0.001. El grupo HFHS-soja present? mayor peso corporal que el grupo STD-soja (P<0.01) (Figura 39a). En cuanto al incremento de peso corporal, no se observaron diferencias significativas entre los grupos, aunque se mantiene la tendencia de un 101 mayor incremento de peso corporal en el grupo HFHS-soja (Figura 39b). El grupo HFHS-soja present? mayor proporci?n de grasa abdominal que el grupo STD-soja (P<0.01) (Figura 39c). 0 6 12 18 23 50 150 250 350 STD-soja HFHS-soja a) ** ** ** ** Periodo experimental, semanas Pe so co rp or al , g 6 12 18 23 40 60 80 100 120 140 STD-soja HFHS-soja b) Periodo experimental, semanas In cr em en to de pe so co rp or al , % 0 2 4 6 8 10 STD-soja c) ** HFHS-soja Periodo experimental, semana 25 Pe so de gr as a ab do m in al , % Figura 39. a) Peso corporal, b) incremento de peso corporal y c) grasa abdominal en ratas WKY con una dieta STD-soja y con una dieta HFHS-soja. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo STD-soja: **P<0.01. La evaluaci?n de la grelina y leptina plasm?ticas se muestra en la Figura 40. No se observaron diferencias significativas en los niveles de grelina en los grupos. Por otro lado, se observ? a la semana 23 un mayor incremento de leptina en el grupo HFHS-soja que en el grupo STD-soja (P<0.05) (Figura 40b). No se observaron diferencias significativas en la PD, PS y ?cido ?rico entre los grupos (Figura 41). 0 12 23 0 50 100 150 200 250 STD-soja HFHS-soja a) Periodo experimental, semanas G re lin a pl as m ?t ic a, pg /m L 0 12 23 0 1000 2000 3000 STD-soja HFHS-soja b) * Periodo experimental, semanas Le pt in a pl as m ?t ic a , pg /m L Figura 40. a) Grelina plasm?tica y b) leptina plasm?tica en ratas WKY con una dieta STD- soja y con una dieta HFHS-soja. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo STD-soja: *P<0.05. 102 0 12 23 40 60 80 100 120 140 STD-soja HFHS-soja a) Periodo experimental, semanas Pr es i? n di as t? lic a , m m H g 0 12 23 40 60 80 100 120 140 160 STD-soja HFHS-soja b) Periodo experimental, semanas Pr es i? n si st ?l ic a, m m H g 0 12 23 0 2 4 6 8 10 12 14 STD-soja HFHS-soja c) Periodo experimental, semanas ?c id o ?r ic o, m g/ dL Figura 41. a) Presi?n diast?lica, b) presi?n sist?lica y c) ?cido ?rico en ratas WKY con una dieta STD-soja y con una dieta HFHS-soja. Los valores son la media con el ESM. En la Figura 42 se muestran los resultados de la evaluaci?n de los TG, colesterol total y el peso del h?gado en porcentaje. Aunque no se observaron diferencias estad?sticamente significativas entre los grupos, el grupo HFHS-soja present? menor nivel de TG, colesterol total y porcentaje de h?gado. 0 12 23 0 1 2 3 4 5 STD-soja HFHS-soja a) Periodo experimental, semanas Tr ig lic ?r id o s, m g/ dL 0 12 23 0 50 100 150 200 250 STD-soja HFHS-soja b) Periodo experimental, semanas C o le st e ro l t o ta l, m g/ dL 0 1 2 3 STD-soja HFHS-soja c) Periodo experimental, semana 25 Pe so de h? ga do , % Figura 42. a) Triglic?ridos, b) colesterol total y c) peso de h?gado en ratas WKY con una dieta STD-soja y con una dieta HFHS-soja. Los valores son la media con el ESM. A la semana 23 el grupo HFHS-soja present? mayor nivel de insulina plasm?tica que el grupo STD-soja (P<0.001) (Figura 43a); por otro lado, no se observaron diferencias significativas en los niveles de glucag?n y glucosa (Figura 43b, d) entre los grupos. A la semana 23, se observ? que el grupo HFHS-soja present? mayor incremento en los niveles del p?ptido C que el grupo STD-soja (P<0.01) (Figura 43c). 103 0 12 23 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 STD-soja HFHS-soja a) *** Periodo experimental, semanas In su lin a pl as m ?t ic a, n g/ m L 0 12 23 0 10 20 30 40 50 60 70 STD-soja HFHS-soja b) Periodo experimental, semanas G lu ca g? n pl as m ?t ic o, pg /m L 0 12 23 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 STD-soja HFHS-soja c) ** Periodo experimental, semanas P? pt id o C pl a sm ?t ic o, pg /m L 0 12 23 50 60 70 80 STD-soja HFHS-soja d) Periodo experimental, semanas G lu co sa pl as m ?t ic a, m g/ dL Figura 43. a) Insulina plasm?tica b) glucag?n plasm?tico, c) p?ptido C plasm?tico y d) glucosa plasm?tica en ratas WKY con una dieta STD-soja y con una dieta HFHS-soja. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo STD-soja: **P<0.01 y ***P<0.001. En la Figura 44 se muestran los resultados de la prueba de tolerancia a la glucosa a la semana 3 y 22 del estudio. A la semana 3 se observ? mayor nivel de glucosa a los 60 y 90 min en el grupo HFHS-soja que en el grupo STD-soja (P<0.01) y (P<0.05). A la semana 22 se observ? a los 60 min en el grupo HFHS- soja un mayor nivel de glucosa que en el grupo STD-soja (P<0.05); el grupo HFHS- soja present? una mayor, no significativo AUC que el grupo STD-soja. 104 0 50 100 50 75 100 125 150 STD-soja HFHS-soja a) ** * Tiempo, minutos G lu co sa pl as m ?t ic a, m g/ dL 0 50 100 50 75 100 125 150 STD-soja HFHS-soja b) * Tiempo, minutos G lu co sa pl as m ?t ic a , m g/ dL 3 22 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 STD-soja HFHS-soja c) Periodo experimental, semanas A U C gl u co sa , m g x 12 0 m in /d L Figura 44. a) Prueba de tolerancia a la glucosa a la semana 3 del estudio b) prueba de tolerancia a la glucosa a la semana 22 del estudio y c) ?rea bajo la curva (AUC) a las semanas 3 y 22 del estudio en ratas WKY con una dieta STD-soja y con una dieta HFHS- soja. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo STD-soja: *P<0.05 y **P<0.01. En la Figura 45 se muestran los niveles de isoprostanos 15-F2t-IsoP, 2,3-dinor- 15-F2t-IsoP, 5-F2t-IsoP, 5-F2c-IsoP y 8-F2t-IsoP evaluados antes de iniciar el estudio, y a las semanas 12 y 23. A la semana 12 (Figura 45b), se detect? un menor nivel de los isoprostanos 15-F2t-IsoP, 2,3-dinor-15-F2t-IsoP y 8-F2t-IsoP (P<0.001), 5-F2t-IsoP (P<0.01) y 5-F2c-IsoP (P<0.05) en el grupo HFHS-soja que en el grupo STD-soja. A la semana 23 (Figura 45c), se observ? un menor nivel de isoprostanos 15-F2t-IsoP, 5-F2t-IsoP y 5-F2c-IsoP (P<0.05), 2,3-dinor-15-F2t-IsoP (P<0.001) y 8-F2t-IsoP (P<0.01) en el grupo HFHS-soja que en el grupo STD-soja. 105 - Iso P 2t 15 - F - Iso P 2t 2,3 - din or - 15 - F - Iso P 2t 5-F - Iso P 2c 5-F - Iso P 2t 8-F 0 10000 20000 30000 STD-soja HFHS-soja a) Iso P to ta l, pg /m g cr ea tin in a - Iso P 2t 15 - F - Iso P 2t 2,3 - din or - 15 - F - Iso P 2t 5-F - Iso P 2c 5-F Iso P 2t- 8-F 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 STD-soja HFHS-soja b) ** *** * *** *** Is o P to ta l, pg /m g cr ea tin in a - Iso P 2t 15 - F - Iso P 2t 2,3 - din or - 15 - F - Iso P 2t 5-F - Iso P 2c 5-F - Iso P 2t 8-F 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 STD-soja HFHS-soja c) * ** *** * * Iso P to ta l, pg /m g cr ea tin in a Figura 45. a) Isoprostanos antes del estudio, b) isoprostanos a la semana 12 y c) isoprostanos a la semana 23 en ratas WKY alimentadas con una dieta STD-soja y con una dieta HFHS-soja. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo STD-soja: *P<0.05, **P<0.01 y ***P<0.001. 106 3.2.2. Par?metros relacionados con el SM en ratas WKY alimentadas con una dieta STD suplementada con EPA/DHA (1:1) y/o polifenoles de semilla de uva Ratas hembras WKY sanas fueron alimentadas con una dieta STD y suplementadas con EPA/DHA (1:1) (17.4 g/kg de pienso) y/o con un extracto polifen?lico de semilla de uva (grape seed extract, GSE, 0.88 g/kg de pienso) (ver Secci?n Experimental Tabla 45, composici?n de dieta) durante 25 semanas. La evaluaci?n de la ingesta y el contenido cal?rico de la ingesta se muestra en la Figura 46. Si bien se observan diferencias significativas puntuales, la tendencia general es que la ingesta y el contenido cal?rico no difieren mucho entre grupos, sobre todo al principio y al final del experimento. En las semanas centrales (8 a 20) se observ? una mayor ingesta en los grupos suplementados con ?cidos grasos poliinsaturados, sobretodo el grupo STD-EPA/DHA+GSE. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 268 10 12 14 16 18 20 STD-soja STD-EPA/DHA (1:1) STD-GSE STD-EPA/DHA (1:1)+GSE a) ** *** $ **** *** *** *** * * *** *** $$$ * $$$ *** * *** $$$ *** $$$ *** $$$ $ $ $ *** $$$ $ $$$$ $ $$$ $$$ $$$ Periodo experimental, semanas In ge st a, g/ d? a 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 2630 35 40 45 50 55 60 65 70 75 STD-soja STD-EPA/DHA (1:1) STD-GSE STD-EPA/DHA (1:1)+GSE b) *** $$$ *** $$$ *** $$$ *** $$$ $ $ $$$** *** *** *** *** ** * $$$ $$$$$$ $$ *** $$$ * $$$ *** *** $$$ $$$ *** ** $ Periodo experimental , semana In ge st a, kc al /g /d ?a /1 00 g pe so Figura 46. a) Ingesta y b) energ?a producto de la ingesta en ratas WKY suplementadas con EPA/DHA y GSE. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo STD-soja: *P<0.05, **P<0.01,***P<0.001 y del grupo STD-EPA/DHA (1:1)+GSE: $P<0.05, $$P<0.01, $$$P<0.001. No se observaron diferencias significativas en el peso corporal (Figura 47a) ni en el incremento de peso corporal (Figura 47b). Al final del experimento los grupos STD-GSE y STD-EPA/DHA (1:1)+GSE presentaron mayor porcentaje de grasa 107 abdominal que el grupo STD-soja (P<0.001) y (P<0.05), respectivamente (Figura 47c). 0 6 12 18 23 50 150 250 350 STD-soja STD-EPA/DHA (1:1) STD-GSE STD-EPA/DHA (1:1)+GSE a) Periodo experimental, semanas Pe so co rp or al , g 6 12 18 23 40 60 80 100 120 140 STD-soja STD-EPA/DHA (1:1) STD-GSE STD-EPA/DHA (1:1)+GSE b) Periodo experimental , semanas In cr em en to de pe so co rp or al , % 0 2 4 6 8 10 STD-soja STD-EPA/DHA (1:1) STD-GSE STD-EPA/DHA (1:1)+GSE c) *** * Periodo experimental, semana 25 Pe so de gr as a ab do m in al , % Figura 47. a) Peso corporal, b) incremento de peso corporal y c) porcentaje de grasa abdominal en ratas WKY suplementadas con EPA/DHA y GSE. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo STD-soja: *P<0.05 y ***P<0.001. La evaluaci?n de la grelina y leptina plasm?ticas se muestra en la Figura 48. A la semana 23 el grupo STD-EPA/DHA (1:1)+GSE present? mayor nivel de grelina (P<0.01) que el grupo STD-soja, mientras que los grupos STD-EPA/DHA (1:1) y STD-GSE presentaron menor nivel que el grupo STD-EPA/DHA (1:1)+GSE, (P<0.01) y (P<0.05) respectivamente. A la semana 23 el grupo STD-EPA/DHA (1:1) present? mayor nivel de leptina que el grupo STD-EPA/DHA (1:1)+GSE (P<0.05) (Figura 48b). 0 12 23 0 50 100 150 200 250 STD-soja STD-EPA/DHA (1:1) STD-GSE STD-EPA/DHA (1:1)+GSE a) ** $$ ** $$ $ Periodo experimental , semanas G re lin a pl as m ?t ic a, pg /m L 0 12 23 0 1000 2000 3000 STD-soja STD-EPA/DHA (1:1) STD-GSE STD-EPA/DHA (1:1)+GSE b) * Periodo experimental, semanas Le pt in a pl as m ?t ic a, pg /m L Figura 48. a) Grelina plasm?tica y d) leptina plasm?tica en ratas WKY suplementadas con EPA/DHA y GSE. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo STD-soja: *P<0.05, **P<0.01 y del grupo STD- EPA/DHA (1:1)+GSE: $P<0.05, $$P<0.01. 108 No se observaron diferencias significativas en la PD, PS y ?cido ?rico entre los grupos (Figura 49). 0 12 23 40 60 80 100 120 140 STD-soja STD-EPA/DHA (1:1) STD-GSE STD-EPA/DHA (1:1)+GSE a) Periodo experimental, semanas Pr es i? n di a st ?l ic a , m m H g 0 12 23 40 60 80 100 120 140 160 STD-soja STD-EPA/DHA (1:1) STD-GSE STD-EPA/DHA (1:1)+GSE b) Periodo experimental, semanas Pr es i? n si st ?l ic a, m m H g 0 12 23 0 2 4 6 8 10 12 14 STD-soja STD-EPA/DHA (1:1) STD-GSE STD-EPA/DHA (1:1)+GSE c) Periodo experimental, semanas ?c id o ?r ic o, m g/ dL Figura 49. a) Presi?n diast?lica, b) presi?n sist?licos y c) ?cido ?rico en ratas WKY suplementadas con EPA/DHA y GSE. Los valores son la media con el ESM. En la Figura 50 se muestran los resultados de la evaluaci?n de los TG, colesterol total y peso del h?gado. A la semana 23 el grupo STD-GSE present? mayor nivel de TG que el grupo STD-EPA/DHA (1:1)+GSE (P<0.01). A la semana 23 el grupo STD-GSE present? mayor nivel de colesterol total que el grupo STD- EPA/DHA (1:1)+GSE (P<0.05). No se observaron diferencias significativas en el peso del h?gado entre los grupos. 0 12 23 0 1 2 3 4 5 6 STD-soja STD-EPA/DHA (1:1) STD-GSE STD-EPA/DHA (1:1)+GSE a) $$ Periodo experimental, semanas Tr ig lic ?r id o s, m g/ dL 0 12 23 0 50 100 150 200 250 STD-soja STD-EPA/DHA (1:1) STD-GSE STD-EPA/DHA (1:1)+GSE b) $ Periodo experimental, semanas C ol es te ro l t ot al , m g/ dL 0 1 2 3 STD-soja STD-EPA/DHA (1:1) STD-GSE STD-EPA/DHA (1:1)+GSE c) Periodo experimental, semana 25 Pe so de h? ga do , % Figura 50. a) Triglic?ridos, b) colesterol total y c) peso de h?gado en ratas WKY suplementadas con EPA/DHA y GSE. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo STD-EPA/DHA (1:1)+GSE: $P<0.05, $$P<0.01. En la Figura 51 se muestran los resultados de la evaluaci?n de la insulina, glucag?n, p?ptido C y glucosa. No se observaron diferencias significativas en la insulina, el glucag?n y la glucosa entre los grupos. S? se observaron algunas 109 diferencias en los niveles del p?ptido C. A la semana 12 el grupo STD-EPA/DHA (1:1)+GSE present? mayor concentraci?n del p?ptido C que el grupo STD-soja (P<0.05). A la semana 23 se observ? que el grupo STD-EPA/DHA (1:1)+GSE present? mayor nivel del p?ptido C que el grupo STD-soja (P<0.01), mientras que el grupo STD-GSE present? menor nivel que el grupo STD-EPA/DHA (1:1)+GSE (P<0.05). 0 12 23 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 STD-soja STD-EPA/DHA (1:1) STD-GSE STD-EPA/DHA (1:1)+GSE a) Periodo experimental, semanas In su lin a pl as m ?t ic a, n g/ m L 0 12 23 0 10 20 30 40 50 60 70 STD-soja STD-EPA/DHA (1:1) STD-GSE STD-EPA/DHA (1:1)+GSE b) Periodo experimental, semanas G lu ca g? n pl as m ?t ic o, pg /m L 0 12 23 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 STD-soja STD-EPA/DHA (1:1) STD-GSE STD-EPA/DHA (1:1)+GSE c) * $ ** Periodo experimental, semanas P? pt id o C pl a sm ?t ic o, pg /m L 0 12 23 50 60 70 80 STD-soja STD-EPA/DHA (1:1) STD-GSE STD-EPA/DHA (1:1)+GSE d) Periodo experimental, semanas G lu co sa pl as m ?t ic a, m g/ dL Figura 51. a) Insulina plasm?tica, b) glucag?n plasm?tico, c) p?ptido C plasm?tico y d) glucosa plasm?tica en ratas WKY suplementadas con EPA/DHA y GSE. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo STD-soja: *P<0.05, **P<0.01 y del grupo STD-EPA/DHA (1:1)+GSE: $P<0.05. No se observaron diferencias significativas en la prueba de tolerancia a la glucosa a las semanas 3 y 22 entre los grupos (Figura 52). 110 0 50 100 50 75 100 125 150 STD-EPA/DHA (1:1)+GSE STD-soja STD-EPA/DHA (1:1) STD-GSE a) Tiempo, minutos G lu co sa pl a sm ?t ic a, m g/ dL 0 50 100 50 75 100 125 150 STD-EPA/DHA (1:1)+GSE STD-soja STD-EPA/DHA (1:1) STD-GSE b) Tiempo, minutos G lu co sa pl as m ?t ic a, m g/ dL 3 22 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 STD-soja STD-EPA/DHA (1:1) STD-GSE STD-EPA/DHA (1:1)+GSE c) Periodo experimental, semanas A U C gl u co sa , m g x 12 0 m in /d L Figura 52. a) Prueba de tolerancia a la glucosa a la semana 3 del estudio, b) prueba de tolerancia a la glucosa a la semana 22 del estudio y c) ?rea bajo la curva (AUC) a las semanas 3 y 22 del estudio en ratas WKY suplementadas con EPA/DHA y GSE. Los valores son la media con el ESM. En la Figura 53 se muestran los niveles de isoprostanos 15-F2t-IsoP, 2,3-dinor- 15-F2t-IsoP, 5-F2t-IsoP, 5-F2c-IsoP y 8-F2t-IsoP. No se observaron diferencias significativas antes de iniciar el estudio. A las semanas 12 y 23 de tratamiento en general, se observ? que los niveles de los isoprostanos fueron menores en el grupo suplementado con EPA/DHA y GSE que en los grupos suplementados solamente con uno de los dos componentes funcionales; el grupo suplementado solamente con polifenoles de uva presenta mayor nivel de isoprostanos, similar al grupo control (STD-soja). 111 - Iso P 2t 15 - F - Iso P 2t 2,3 - din or - 15 - F - Iso P 2t 5-F - Iso P 2c 5-F - Iso P 2t 8-F 0 10000 20000 30000 STD-soja STD-EPA/DHA (1:1) STD-GSE STD-EPA/DHA (1:1)+GSE a) Iso P to ta l, pg /m g cr ea tin in a - Iso P 2t 15 - F - Iso P 2t 2,3 - din or - 15 - F - Iso P 2t 5-F - Iso P 2c 5-F - Iso P 2t 8-F 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 STD-soja STD-EPA/DHA (1:1) STD-GSE STD-EPA/DHA (1:1)+GSE b) * $$$ $ ** **** * ***** Iso P to ta l, pg /m g cr ea tin in a - Iso P 2t 15 - F - Iso P 2t 2,3 - din or - 15 - F - Iso P 2t 5-F - Iso P 2c 5-F - Iso P 2t 8-F 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 STD-soja STD-EPA/DHA (1:1) STD-GSE STD-EPA/DHA (1:1)+GSE c) $$ * $$ ** $$ ** *** $$$Iso P to ta l, pg /m g cr ea tin in a Figura 53. a) Isoprostanos antes de la intervenci?n nutricional, b) isoprostanos a la semana 12 del estudio y c) isoprostanos a la semana 23 del estudio en ratas WKY suplementadas con EPA/DHA y GSE. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo STD-soja: *P<0.05, **P<0.01,***P<0.001 y del grupo STD-EPA/DHA (1:1)+GSE: $P<0.05, $$P<0.01, $$$P<0.001. 112 3.2.3. Par?metros relacionados con el SM en ratas WKY alimentadas con una dieta HFHS suplementada con EPA/DHA (1:1) y/o polifenoles de semilla de uva Ratas hembras WKY sanas fueron alimentadas con una dieta HFHS y suplementadas con EPA/DHA (1:1) (22.0 g/kg de pienso) y/o con un extracto polifen?lico de semilla de uva GSE (1.09 g/kg de pienso) (ver Secci?n Experimental Tabla 45, composici?n de dieta) durante 25 semanas. La evaluaci?n de la ingesta y el contenido cal?rico de la ingesta se muestra en la Figura 54. Si bien se observan diferencias significativas puntuales, la tendencia general es que la ingesta y el contenido cal?rico no difieren mucho entre grupos. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 268 10 12 14 16 18 20 HFHS-soja HFHS-EPA/DHA (1:1) HFHS-GSE HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE a) * * *** ** ** $ * *** $ *** ** $ *** $$$$$ $ $ $$ $$ ** $ $ ** * *** $$ * $ * Periodo experimental, semanas In ge st a, g/ d? a 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 2630 35 40 45 50 55 60 65 70 75 HFHS-soja HFHS-EPA/DHA (1:1) HFHS-GSE HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE b) *** $$ ** ** $ $$$ $$ $$ * **** * **** $ $ *** * ** $ ***$ * $ Periodo experimental, semanas In ge st a, kc al /g /d ?a /1 00 g pe so Figura 54. a) Ingesta y b) energ?a producto de la ingesta en ratas WKY suplementadas con EPA/DHA y GSE. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo HFHS-soja: *P<0.05, **P<0.01,***P<0.001 y del grupo HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE: $P<0.05, $$P<0.01, $$$P<0.001. En la Figura 55 se presenta la evaluaci?n del peso corporal, el incremento del peso corporal y el porcentaje de grasa abdominal. No se observaron diferencias significativas en el peso corporal y en el porcentaje de grasa abdominal entre los grupos, aunque el grupo HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE present? menor peso corporal y porcentaje de grasa abdominal con relaci?n a los dem?s grupos. En cuanto al incremento de peso corporal (Figura 55b) se observ? mayor incremento en el grupo 113 HFHS-EPA/DHA (1:1) a las semanas 12 y 18 que en el grupo HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE (P<0.05). Las tres suplementaciones resultaron en una disminuci?n no significativa del porcentaje de grasa abdominal con respecto al grupo HFHS-soja, la mayor disminuci?n fue del grupo HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE. 0 6 12 18 23 50 150 250 350 HFHS-soja HFHS-EPA/DHA (1:1) HFHS-GSE HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE a) Periodo experimental, semanas Pe so co rp or al , g 6 12 18 23 40 60 80 100 120 140 HFHS-soja HFHS-EPA/DHA (1:1) HFHS-GSE HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE b) $ $ Periodo experimental, semanas In cr em en to de pe so co rp or al , % 0 2 4 6 8 10 HFHS-soja HFHS-EPA/DHA (1:1) HFHS-GSE HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE c) Periodo experimental, semana 25 Pe so de gr as a ab do m in al , % Figura 55. a) Peso corporal, b) incremento de peso corporal y c) porcentaje de grasa abdominal en ratas WKY suplementadas con EPA/DHA y GSE. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE: $P<0.05, $$P<0.01, $$$P<0.001. En la Figura 56 se muestra los niveles de grelina y leptina en plasma. A las semanas 12 y 23 se observ? mayor nivel de grelina en el grupo HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE que en el grupo HFHS-soja (P<0.01) (P<0.05) respectivamente, mientras que a estas mismas semanas el grupo HFHS-EPA/DHA (1:1) present? menor nivel de grelina que el grupo HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE (P<0.05) y (P<0.01) respectivamente; el grupo HFHS-GSE present? tambi?n menor nivel de grelina que el grupo HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE (P<0.01). En cuanto a la leptina no se observaron diferencias significativas entre los grupos. 114 No se observaron diferencias significativas en la PD, PS y ?cido ?rico entre los grupos (Figura 57). En cuanto a la evaluaci?n del contenido de TG (Figura 58a) a la semana 12 se observaron menores niveles en los grupos HFHS-EPA/DHA (1:1) y HFHS- EPA/DHA (1:1)+GSE que en el grupo HFHS-soja (P<0.05) y (P<0.01) respectivamente; el grupo HFHS-GSE present? mayor nivel que el grupo HFHS- EPA/DHA (1:1)+GSE (P<0.05). A la semana 23 se observ? que el grupo HFHS- EPA/DHA (1:1)+GSE present? menor nivel de TG que el grupo HFHS-soja (P<0.01) mientras que el grupo HFHS-GSE present? mayor nivel que el grupo 0 12 23 0 50 100 150 200 250 HFHS-soja HFHS-EPA/DHA (1:1) HFHS-GSE HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE a) ** $ * $$ $$ Periodo experimental, semanas G re lin a pl as m ?t ic a, pg /m L 0 12 23 0 1000 2000 3000 HFHS-soja HFHS-EPA/DHA (1:1) HFHS-GSE HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE b) Periodo experimental, semanas Le pt in a pl as m ?t ic a, pg /m L Figura 56. a) Grelina plasm?tica y b) leptina plasm?tica en ratas WKY suplementadas con EPA/DHA y GSE. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo HFHS-soja: *P<0.05, **P<0.01 y del grupo HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE: $P<0.05, $$P<0.01. 0 12 23 40 60 80 100 120 140 HFHS-soja HFHS-EPA/DHA (1:1) HFHS-GSE HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE a) Periodo experimental, semanas Pr es i? n di as t? lic a, m m H g 0 12 23 40 60 80 100 120 140 160 HFHS-soja HFHS-EPA/DHA (1:1) HFHS-GSE HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE b) Periodo experimental, semanas Pr es i? n si st ?l ic a, m m H g 0 12 23 0 2 4 6 8 10 12 14 HFHS-soja HFHS-EPA/DHA (1:1) HFHS-GSE HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE ** c) Periodo experimental, semanas ?c id o ?r ic o, m g/ dL Figura 57. a) Presi?n diast?lica, b) presi?n sist?licos y c) ?cido ?rico en ratas WKY suplementadas con EPA/DHA y GSE. Los valores son la media con el ESM. 115 HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE (P<0.01). Por lo que respecta al contenido de colesterol total (Figura 58b) a la semana 12 se observ? que los grupos HFHS- EPA/DHA (1:1) y HFHS-GSE presentaron menores niveles que el grupo HFHS-soja (P<0.001) mientras que el grupo HFHS-GSE present? mayor nivel que el grupo HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE (P<0.001). A la semana 23 se observ? un mayor nivel de colesterol total en el grupo HFHS-GSE que en el grupo HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE (P<0.01). El grupo HFHS-GSE present? menor porcentaje de peso de h?gado que el grupo HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE (P<0.05) (Figura 58c). 0 12 23 0 1 2 3 4 5 6 HFHS-soja HFHS-EPA/DHA (1:1) HFHS-GSE HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE a) $$ $ * ** * Periodo experimental, semanas Tr ig lic ?r id os , m g/ dL 0 12 23 0 50 100 150 200 250 HFHS-soja HFHS-EPA/DHA (1:1) HFHS-GSE HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE b) $$$ $$ *** *** Periodo experimental, semanas C ol es te ro l t ot al , m g/ dL 0 1 2 3 HFHS-soja HFHS-GSE HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE HFHS-EPA/DHA (1:1) c) $ Periodo experimental, semana 25 Pe so de h? ga do , % Figura 58. a) Triglic?ridos, b) colesterol total y c) porcentaje de h?gado en ratas WKY suplementadas con EPA/DHA y GSE. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo HFHS-soja: *P<0.05, **P<0.01,***P<0.001 y del grupo HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE: $P<0.05, $$P<0.01, $$$P<0.001. En la Figura 59 se muestran los resultados de la evaluaci?n de la insulina, glucag?n, p?ptido C y glucosa. No se observaron diferencias significativas en el glucag?n y la glucosa entre los grupos. A la semana 12 el grupo HFHS-GSE present? mayores niveles de insulina que los grupos HFHS-soja y HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE (P<0.001, respectivamente). A la semana 12 se observ? que los grupos HFHS-EPA/DHA (1:1) y HFHS-GSE presentaron mayor nivel del p?ptido C que el grupo soja (P<0.05) y (P<0.001); mientras que el grupo HFHS-GSE present? tambi?n mayor nivel que el grupo HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE (P<0.01). A la semana 23 la tendencia fue la misma, aunque no significativa. 116 0 12 23 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 HFHS-soja HFHS-EPA/DHA (1:1) HFHS-GSE HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE a) *** $$$ Periodo experimental, semanas In su lin a pl as m ?t ic a, n g/ m L 0 12 23 0 10 20 30 40 50 60 70 HFHS-soja HFHS-EPA/DHA (1:1) HFHS-GSE HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE b) Periodo experimental, semanas G lu ca g? n pl as m ?t ic o, pg /m L 0 12 23 0 250 500 750 1000 HFHS-soja HFHS-EPA/DHA (1:1) HFHS-GSE HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE c) * *** $ $ Peri odo experimental , semanas P? pt id o C pl a sm ?t ic o , pg /m L 0 12 23 50 60 70 80 HFHS-soja HFHS-EPA/DHA (1:1) HFHS-GSE HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE d) P eriodo experimental , semanas G lu co sa pl as m ?t ic a, m g/ dL Figura 59. a) Insulina plasm?tica, b) glucag?n plasm?tico, c) p?ptido C plasm?tico y d) glucosa plasm?tica en ratas WKY suplementadas con EPA/DHA y GSE. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo HFHS-soja: *P<0.05, ***P<0.001 y del grupo HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE: $$P<0.01, $$$P<0.001. No se observaron diferencias significativas en la prueba de tolerancia a la glucosa a las semanas 3 y 22 entre los grupos (Figura 60). 117 En cuanto a los niveles de isoprostanos (Figura 61), se observaron en general pocas diferencias significativas entre los grupos. A la semana 12 se observ? un mayor contenido de 5-F2t-IsoP en el grupo HFHS-GSE que en el grupo HFHS- EPA/DHA (1:1)+GSE (P<0.05) (Figura 61b). 0 50 100 50 75 100 125 150 HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE HFHS-soja HFHS-EPA/DHA (1:1) HFHS-GSE a) Tiempo, minutos G lu co sa pl as m ?t ic a, m g/ dL 0 50 100 50 75 100 125 150 HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE HFHS-soja HFHS-EPA/DHA (1:1) HFHS-GSE b) Tiempo, minutos G lu co sa pl as m ?t ic a, m g/ dL 3 22 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 HFHS-soja HFHS-EPA/DHA (1:1) HFHS-GSE HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE c) Periodo experimental, semanas A U C gl u co sa , m g x 12 0 m in /d L Figura 60. a) Prueba de tolerancia a la glucosa a la semana 3 del estudio, b) Prueba de tolerancia a la glucosa a la semana 22 del estudio y c) ?rea bajo la curva (AUC) a las semanas 3 y 22 del estudio en ratas WKY suplementadas con EPA/DHA y GSE. Los valores son la media con el ESM. 118 - Iso P 2t 15 - F - Iso P 2t 2,3 - din or - 15 - F - Iso P 2t 5-F - Iso P 2c 5-F - Iso P 2t 8-F 0 10000 20000 30000 HFHS-soja HFHS-EPA/DHA (1:1) HFHS-GSE HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE a) Is oP to ta l, pg /m g cr ea tin in a - Iso P 2t 15 - F - Iso P 2t 2,3 - din or - 15 - F - Iso P 2t 5-F - Iso P 2c 5-F - Iso P 2t 8-F 0 1000 2000 3000 HFHS-soja HFHS-EPA/DHA (1:1) HFHS-GSE HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE b) $ Iso P to ta l, pg /m g cr ea tin in a - Iso P 2t 15 - F - Iso P 2t 2,3 - din or - 15 - F - Iso P 2t 5-F - Iso P 2c 5-F - Iso P 2t 8-F 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 HFHS-soja HFHS-EPA/DHA (1:1) HFHS-GSE HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE c) Iso P to ta l, pg /m g cr ea tin in a Figura 61. a) Isoprostanos antes de la intervenci?n nutricional, b) isoprostanos a la semana 12 del estudio, c) isoprostanos a la semana 23 del estudio en ratas WKY suplementadas con EPA/DHA y GSE. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE: $$P<0.01. 119 3.2.4. Metabolizaci?n, bioaccesibilidad y biodisponibilidad de polifenoles de semilla de uva Como los polifenoles sufren una extensa metabolizaci?n en el organismo y teniendo en cuenta que esos metabolitos podr?an explicar en parte las actividades del extracto GSE, se han identificado y cuantificado los metabolitos polifen?licos generados en el estudio 2. La identificaci?n y confirmaci?n de los metabolitos conjugados de (?)-epicatequina (EC) y (?)-epigalocatequina (EGC), adem?s de los diferentes derivados de familia de metabolitos microbianos tales como las hidroxifenilvalerolactonas, ?cidos fenilval?ricos, ?cidos fenilpropi?nicos, ?cidos fenilac?ticos, ?cidos benzoicos, ?cidos cin?micos, ?cidos hip?ricos y lignanos se ha llevado a cabo mediante espectrometr?a de masas acoplada a cromatograf?a l?quida (HPLC?ESI?MS/MS) en muestras de orina y heces de 24 h de las ratas hembras WKY que consumieron una dieta STD o HFHS suplementadas o no suplementadas con EPA/DHA (1:1) y/o con GSE durante 14 semanas. Los detalles sobre el proceso y criterios de identificaci?n se muestran en el Anexo 7.4. Se investig? la presencia de metabolitos usando HPLC?ESI?MS/MS en modo negativo, las transiciones MRM (multiple reaction monitoring) y comparaciones con la literatura.[164, 347-349] En las Tablas 29 y 30 se muestra el ion molecular (m/z) de los metabolitos evaluados, adem?s de las transiciones MRM detectadas y los l?mites de detecci?n y cuantificaci?n. Tabla 29. Metabolitos conjugados de (?)-epicatequina (EC) y (?)-epigalocatequina (EGC) evaluados en orina y heces (24 h) de ratas WKY despu?s de consumir durante 14 semanas una dieta STD y HFHS suplementada o no suplementada con EPA/DHA (1:1) y GSE. Metabolitos [M?H]? Transici?n MRM Patr?n de cuantificaci?n LD (?M) LC (?M) Epicatequina Epicatequina (EC) 289 289?245 EC 0.02 0.06 Monoconjugados de EC Gluc-EC 465 465?289 EC 0.02 0.06 Sulf-EC 369 369?289 EC 0.02 0.06 GHS-EC 594 594?289 EC 0.02 0.06 Me-EC 303 303?289 EC 0.02 0.06 Diconjugados de EC Me2-EC 318 318?289 EC 0.02 0.06 Gluc-sulf-EC 545 545?369 EC 0.02 0.06 Gluc2-EC 641 641?465 EC 0.02 0.06 Me-gluc-EC 479 479?303 EC 0.02 0.06 Me-sulf-EC 383 383?303 EC 0.02 0.06 120 Gluc: glucuronido; Sulf: sulfato; Me: metilo; LD: l?mite de detecci?n; LC: l?mite de cuantificaci?n. Sulf2-EC 449 449?369 EC 0.02 0.06 Triconjugados de EC Me3-EC 331 331?303 EC 0.02 0.06 Me2-gluc-EC 493 493?303 EC 0.02 0.06 Me2-sulf-EC 397 397?303 EC 0.02 0.06 Sulf3-EC 529 529?289 EC 0.02 0.06 Me-gluc-sulf-EC 559 559?303 EC 0.02 0.06 Gluc-sulf2-EC 625 625?369 EC 0.02 0.06 Gluc2-me-EC 655 655?303 EC 0.02 0.06 Gluc2-sulf-EC 721 721?369 EC 0.02 0.06 Epigalocatequina (EGC) Epigalocatequina (EGC) 305 305?261 EGC 0.2 0.7 Monoconjugados de EGC Sulf-EGC 385 385?305 EGC 0.2 0.7 Gluc-EGC 481 481?319 EGC 0.2 0.7 Me-EGC 319 319?305 EGC 0.2 0.7 GHS-EGC 610 610?305 EGC 0.2 0.7 Diconjugados de EGC Sulf2-EGC 465 465?385 EGC 0.2 0.7 Gluc2-EGC 657 657?319 EGC 0.2 0.7 Me2-EGC 333 333?319 EGC 0.2 0.7 Me-sulf-EGC 399 399?319 EGC 0.2 0.7 Gluc-sulf-EGC 561 561?385 EGC 0.2 0.7 Me-gluc-EGC 497 497?319 EGC 0.2 0.7 Triconjugados de EGC Me3-EGC 347 347?319 EGC 0.2 0.7 Me2-sulf-EGC 413 413?319 EGC 0.2 0.7 Sulf2-me-EGC 479 479?319 EGC 0.2 0.7 Me2-gluc-EGC 509 509?319 EGC 0.2 0.7 Sulf3-EGC 545 545?385 EGC 0.2 0.7 Gluc-sulf2-EGC 641 641?385 EGC 0.2 0.7 Me-gluc-sulf-EGC 575 575?319 EGC 0.2 0.7 Gluc3-EGC 833 833?481 EGC 0.2 0.7 Gluc2-sulf-EGC 737 737?385 EGC 0.2 0.7 Gluc2-me-EGC 671 671?319 EGC 0.2 0.7 Me-sulf2-EGC 479 479?399 EGC 0.2 0.7 121 Tabla 30. Metabolitos microbianos conjugados y no conjugados en orina y heces (24 h) de ratas WKY despu?s de consumir durante 14 semanas una dieta STD y HFHS suplementada o no suplementada con EPA/DHA (1:1) y GSE. Metabolitos [M?H]? Transici?n MRM Patr?n de cuantificaci?n LD (?M) LC (?M) Hidroxifenilvalerolactonas 3- ? 4- Hidroxifenilvalerolactona 191 191?147 ?cido 4- hidroxifenilpropi?nico 0.3 1.0 Sulf-3- ? 4- hidroxifenilvalerolactona 271 271?191 ?cido 4- hidroxifenilpropi?nico 0.3 1.0 3,4- Dihidroxifenilvalerolactona 207 207?163 ?cido 4- hidroxifenilpropi?nico 0.3 1.0 Gluc-3,4- dihidroxifenilvalerolactona 383 383?207 ?cido 4- hidroxifenilpropi?nico 0.3 1.0 Sulf-3,4- dihidroxifenilvalerolactona 287 287?207 ?cido 4- hidroxifenilpropi?nico 0.3 1.0 3- Hidroxifenilmetilvalerolactona 221 221?177 ?cido 4- hidroxifenilpropi?nico 0.3 1.0 4- Hidroxifenilmetilvalerolactona 221 221?177 ?cido 4- hidroxifenilpropi?nico 0.3 1.0 Gluc-3- hidroximetilfenilvalerolactona 397 397?221 ?cido 4- hidroxifenilpropi?nico 0.3 1.0 Gluc-4- hidroximetilfenilvalerolactona 397 397?221 ?cido 4- hidroxifenilpropi?nico 0.3 1.0 Sulf-3- ? 4- hidroximetilfenilvalerolactona 301 301?221 ?cido 4- hidroxifenilpropi?nico 0.3 1.0 ?cidos hidroxifenilval?ricos ?cido 3-hidroxifenilval?rico 193 193?175 ?cido 4- hidroxifenilpropi?nico 0.3 1.0 ?cido 4-hidroxifenilval?rico 193 193?175 ?cido 4- hidroxifenilpropi?nico 0.3 1.0 ?cido 3,4- hihidroxifenilval?rico 209 209?137 ?cido 4- hidroxifenilpropi?nico 0.3 1.0 ?cido sulf-3,4- hihidroxifenilval?rico 289 289?209 ?cido 4- hidroxifenilpropi?nico 0.3 1.0 ?cidos hidroxifenilpropi?nicos ?cido 3-hidroxifenilpropi?nico 165 165?121 ?cido 4- hidroxifenilpropi?nico 0.3 1.0 ?cido 4-hidroxifenilpropi?nico 165 165?121 ?cido 4- hidroxifenilpropi?nico 0.3 1.0 ?cido me-3 ? 4- hidroxifenilpropi?nico 179 179?165 ?cido 4- hidroxifenilpropi?nico 0.3 1.0 ?cido gluc-3 ? -4- hidroxifenilpropi?nico 341 341?165 ?cido 4- hidroxifenilpropi?nico 0.3 1.0 ?cido sulf-3 ? 4- hidroxifenilpropi?nico 245 245?165 ?cido 4- hidroxifenilpropi?nico 0.3 1.0 ?cido 3,4- dihidroxifenilpropi?nico 181 181?137 ?cido 3,4- dihidrocafeico 0.05 0.2 ?cido gluc-3,4-dihidrocafeico 357 357?181 ?cido 3,4- dihidrocafeico 0.05 0.2 ?cido sulf-3,4-dihidrocafeico 261 261?181 ?cido 3,4- dihidrocafeico 0.05 0.2 ?cidos hidroxifenilac?ticos 122 ?cido fenilac?tico 135 135?91 ?cido fenilac?tico 5.8 19.2 ?cido 3-hidroxifenilac?tico 151 151?107 ?cido 3- hidroxifenilac?tico 0.04 0.1 ?cido 4-hidroxifenilac?tico 151 151?107 ?cido 4- hidroxifenilac?tico 3.1 10.3 ?cido me-3 ? 4- hidroxifenilac?tico 165 165?151 ?cido 4- hidroxifenilac?tico 3.1 10.3 ?cido gluc-3 ? 4- hidroxifenilac?tico 327 327?151 ?cido 3- hidroxifenilac?tico 0.04 0.1 ?cido sulf-3? 4- hidroxifenilac?tico 231 231?151 ?cido 3- hidroxifenilac?tico 0.04 0.1 ?cido 3,4-dihidroxifenilac?tico 167 167?123 ?cido 3,4- dihidroxifenilac?tico 0.01 0.03 ?cido sulf-3,4- dihidroxifenilac?tico 247 247?167 ?cido 3,4- dihidroxifenilac?tico 0.01 0.03 ?cido homovan?lico 181 181?137 ?cido homovan?lico 1.1 3.7 ?cidos hidroxibenzoicos ?cido benzoico 121 121?77 ?cido benzoico 3.7 12.4 ?cido 3-hidroxibenzoico 137 137?93 ?cido 3- hidroxibenzoico 0.05 0.2 ?cido 4-hidroxibenzoico 137 137?93 ?cido 4- hidroxibenzoico 0.02 0.06 ?cido 3,4-dihidroxibenzoico 153 153?109 ?cido 3,4- dihidroxibenzoico 0.01 0.02 ?cido gluc-3-hidroxibenzoico 313 313?137 ?cido 3- hidroxibenzoico 0.05 0.2 ?cido gluc-4-hidroxibenzoico 313 313?137 ?cido 4- hidroxibenzoico 0.02 0.06 ?cido sulf-3 ? 4- hidroxibenzoico 217 217?137 ?cido 3- hidroxibenzoico 0.05 0.2 ?cido sulf-3,4- dihidroxibenzoico 233 233?153 ?cido 3,4- dihidroxibenzoico 0.01 0.02 ?cido vainill?nico 167 167?152 ?cido vainill?nico 0.6 2.1 ?cido sulf-vainill?nico 247 247?167 ?cido vainill?nico 0.6 2.1 ?cido g?lico 169 169?125 ?cido g?lico 0.001 0.01 ?cidos cin?micos ?cido cafeico 179 179?135 ?cido cafeico 0.02 0.05 ?cido m-cum?rico 163 163?119 ?cido m-cum?rico 0.01 0.03 ?cido p-cum?rico 163 163?119 ?cido p-cum?rico 0.01 0.02 ?cido sulf-cum?rico 243 243?163 ?cido m-cum?rico 0.01 0.03 ?cido fer?lico 193 193?134 ?cido fer?lico 0.01 0.04 ?cido isofer?lico 193 193?134 ?cido isofer?lico 0.01 0.05 ?cidos hidroxihip?ricos ?cido hip?rico 178 178?134 ?cido hip?rico 0.003 0.01 ?cido hidroxihip?rico 194 194?100 ?cido hip?rico 0.003 0.01 ?cido me-hip?rico 193 193?178 ?cido hip?rico 0.003 0.01 Lignanos Enterodiol 301 301?107 Enterodiol 0.37 1.22 Enterolactona 297 297?253 Enterodiol 0.37 1.22 Sulf-enterolactona 377 377?297 Enterodiol 0.37 1.22 Gluc: glucuronido; Sulf: sulfato; Me: metilo; LD: l?mite de detecci?n; LC: l?mite de cuantificaci?n. 123 Metabolitos conjugados de EC y EGC en orina de ratas WKY despu?s de consumir durante 14 semanas una dieta STD o HFHS En la Tabla 31 se muestran las concentraciones de los metabolitos conjugados de EC y EGC derivada de reacciones de biotransformaci?n de fase II detectados en orina.[348] Se observ? que el grupo HFHS-soja present? mayor cantidad de metabolitos monoconjugados de EC que el grupo STD-soja (P<0.01). En cuanto al contenido de metabolitos diconjugados y triconjugados de EC no se observaron diferencias significativas. No se detectaron metabolitos monoconjugados de EGC, mientras que se observ? que el grupo HFHS-soja present? mayor cantidad de metabolitos diconjugados de EGC que el grupo STD-soja (P<0.05). En general, se observ? que la excreci?n total de metabolitos conjugados fue mayor en el grupo HFHS-soja que en el grupo STD-soja (P<0.01). No se detectaron metabolitos conjugados de EC y EGC en heces. Tabla 31. Excreci?n urinaria (24 h) de metabolitos conjugados de EC y EGC de ratas WKY despu?s de consumir durante 14 semanas una dieta STD o HFHS. Metabolitos Transici?n MRM Concentraci?n (?M) ORINA STD-soja HFHS-soja Monoconjugados de EC Gluc-EC-1 465?289 0.06?0.03 0.9?0.3 Gluc-EC-2 465?289 < LC 0.1?0.02 Gluc-EC-3 465?289 0.06?0.02 0.2?0.06 TOTAL 0.1?0.04 1.2?0.3** Diconjugados de EC Gluc-sulf-EC 545?369 0.07?0.02 < LC Me-sulf-EC 383?303 0.1?0.05 0.1?0.06 TOTAL 0.2?0.06 0.1?0.06 Triconjugados de EC Me3-EC 331?303 0.06?0.01 0.1?0.03 Me2-gluc-EC 493?303 < LC < LC TOTAL 0.06?0.01 0.1?0.03 Diconjugados de EGC Sulf2-EGC 465?385 0.8?0.1 1.3?0.5 Gluc-sulf-EGC 561?385 ND 7.0?2.4 TOTAL 0.8?0.1 8.3?2.4* Triconjugados de EGC Me-gluc-sulf-EGC 575?319 < LC < LC TOTAL - - EXCRECI?N TOTAL DE METABOLITOS CONJUGADOS 1.2?0.2 9.8?2.4** Gluc: glucur?nido; Sulf: sulfato; Me: metilo; EC: epicatequina; EGC: epigalocatequina; ND: no detectado; LC: l?mite de cuantificaci?n. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo STD-soja: *P<0.05 y **P<0.01. 124 Metabolitos microbianos en orina de ratas WKY despu?s de consumir durante 14 semanas una dieta STD o HFHS En la Tabla 32 se muestra la evaluaci?n cuantitativa de los metabolitos microbianos detectados en orina de ratas WKY. Se observ? que el grupo HFHS-soja present? mayor cantidad de metabolitos derivados de la hidroxifenilvalerolactona que el grupo STD-soja (P<0.001). El grupo HFHS-soja present? mayor cantidad de metabolitos derivados de los ?cidos hidroxifenilval?rico, hidroxifenilac?tico e hip?rico que el grupo STD-soja (P<0.05). Por otra parte, no se observaron diferencias significativas en los metabolitos derivados de los ?cidos hidroxifenilpropi?nico, hidroxibenzoico y cin?mico. Tambi?n se observ? que la glucoronidaci?n de derivados microbianos fue mayor en la dieta HFHS que en la dieta STD mientras que no se observaron grandes diferencias entre dietas en sulfataci?n y metilaci?n, con excepci?n de la sulf-enterolactona en la dieta STD. En general, se observ? que la excreci?n total de metabolitos microbianos en orina fue menor en el grupo HFHS-soja que en el grupo STD-soja (P<0.01). Las diferencias fueron m?s significativas en el caso de los metabolitos derivados de lignanos (P<0.001). Tabla 32. Excreci?n urinaria (24 h) de metabolitos microbianos de ratas WKY despu?s de consumir durante 14 semanas una dieta STD o HFHS. Metabolitos Transici?n MRM Concentraci?n (?M) ORINA STD-soja HFHS-soja Hidroxifenilvalerolactonas 3- ? 4-Hidroxifenilvalerolactona 191?147 2.1?0.7 1.6?0.6 3,4-Dihidroxifenilvalerolactona 207?163 < LC ND Gluc-3,4-dihidroxifenilvalerolactona-1 383?207 3.8?1.2 15.5?5.0 Gluc-3,4-dihidroxifenilvalerolactona-2 383?207 ND 14.5?4.5 Sulf-3,4-dihidroxifenilvalerolactona 287?207 2.3?0.1 ND 3-Hidroxifenilmetilvalerolactona 221?177 1.7?0.5 11.8?1.1 4-Hidroxifenilmetilvalerolactona 221?177 14.6?2.0 44.9?12.1 Gluc-3- ? 4-hidroximetilfenilvalerolactona 397?221 7.3?2.5 17.3?5.9 Sulf-3- ? 4-hidroximetilfenilvalerolactona 301?221 4.7?1.6 29.9?9.5 TOTAL 36.5?3.7 137.4?17.1*** ?cidos hidroxifenilval?ricos ?cido 3-hidroxifenilval?rico 193?175 1.7?1.2 ND ?cido 4-hidroxifenilval?rico 193?175 < LC < LC ?cido 3,4-dihidroxifenilval?rico 209?137 < LC 8.3?1.9 ?cido sulf-3,4-dihidroxifenilval?rico 289?209 3.3?0.7 3.3?1.1 TOTAL 5.0?1.4 11.6?2.2* ?cidos hidroxifenilpropi?nicos 125 ?cido 3-hidroxifenilpropi?nico 165?121 393.7?162.9 13.4?7.1 ?cido 4-hidroxifenilpropi?nico 165?121 >361.4 >259.4?62.5 ?cido gluc-3 ? -4-hidroxifenilpropi?nico 341?165 1.5?1.3 28.7?7.8* ?cido 3,4-dihidroxifenilpropi?nico 181?137 0.3?0.1 0.7?0.2 ?cido sulf-3,4-dihidroxifenilpropi?nico 261?181 2.2?0.9 2.9?1.0 TOTAL 759.0?18.1 305.0?81.6** ?cidos hidroxifenilac?ticos ?cido 3-hidroxifenilac?tico 151?107 3.7?1.4 4.7?1.6 ?cido 4-hidroxifenilac?tico 151?107 < LC 80.5?20.1 ?cido 3,4-dihidroxifenilac?tico 167?123 3.0?0.5 20.5?8.5 ?cido sulf-3,4-dihidroxifenilac?tico 247?167 22.6?11.9 29.3?11.8 TOTAL 29.4?12.0 135.0?24.9* ?cidos hidroxibenzoicos ?cido 4-hidroxibenzoico 137?93 0.8?0.3 4.4?1.1* ?cido 3,4-dihidroxibenzoico 153?109 0.05?0.01 0.1?0.03 ?cido gluc-3-hidroxibenzoico 313?137 < LC < LC ?cido gluc-4-hidroxibenzoico 313?137 ND < LC ?cido sulf-3,4-dihidroxibenzoico 233?153 0.5?0.1 2.4?0.7* ?cido sulf-vainill?nico 247?167 19.4?3.8 12.0?3.9 TOTAL 20.8?3.8 19.0?4.1 ?cidos cin?micos ?cido cafeico 179?135 0.07?0.03 ND ?cido m-cum?rico 163?119 6.9?3.3 0.4?0.1 ?cido p-cum?rico 163?119 1.4?0.5 < LC ?cido sulf-cum?rico-1 243?163 ND 0.5?0.2 ?cido sulf-cum?rico-2 243?163 < LC 0.4?0.2 ?cido fer?lico 193?134 0.9?0.4 ND TOTAL 9.3?3.3 1.3?0.3 ?cidos hip?ricos ?cido hip?rico 178?134 2.9?1.1 151.9?52.8* ?cido hidroxihip?rico 194?100 < LC 0.1?0.04 ?cido me-hip?rico-1 193?178 ND ND ?cido me-hip?rico-2 193?178 0.2?0.09 ND ?cido me-hip?rico-3 193?178 < LC 0.2?0.1 TOTAL 3.1?1.1 152.2?68.1* EXCRECI?N TOTAL DE METABOLITOS MICROBIANOS 864.2?25.6 761.6?98.0** Lignanos Enterolactona 297?253 >201.1 103.8?40.4 Sulf-enterolactona 377?297 >158.7 5.8?2.2*** EXCRECI?N TOTAL DE LIGNANOS >359.8 109.6?40.5*** Gluc: glucuronido; Sulf: sulfato; Me: metilo; ND: no detectado; LC: l?mite de cuantificaci?n. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo STD-soja: *P<0.05, **P<0.01 y ***P<0.001. 126 Metabolitos microbianos en heces de ratas WKY despu?s de consumir durante 14 semanas una dieta STD o HFHS En la Tabla 33 se muestra la evaluaci?n cuantitativa de los metabolitos microbianos detectados en heces de ratas WKY. Se observ? que el grupo HFHS-soja present? menor contenido de metabolitos derivados del ?cido hidroxifenilpropi?nico en especial el 4-hidroxifenilpropi?nico y enterolactona (derivado de lignanos) que el grupo STD-soja. En general, se observ? menor excreci?n de metabolitos microbianos en el grupo HFHS-soja que en el grupo STD-soja. No se detectaron metabolitos microbianos conjugados en heces. Tabla 33. Excreci?n fecal (24 h) de metabolitos microbianos de ratas WKY despu?s de consumir durante 14 semanas una dieta STD y HFHS. Metabolitos Transici?n MRM Concentraci?n (?M) HECES STD-soja HFHS-soja ?cidos hidroxifenilval?ricos ?cido 3-hidroxifenilval?rico 193?175 < LC ND TOTAL - - ?cidos hidroxifenilpropi?nicos ?cido 3-hidroxifenilpropi?nico 165?121 2.7?2.3 ND ?cido 4-hidroxifenilpropi?nico 165?121 >217.3?88.3 < LC TOTAL >219.9?88.3 - ?cidso hidroxibenzoicos ?cido 4-hidroxibenzoico 137?93 < LC ND ?cido 3,4-dihidroxibenzoico 153?109 < LC ND TOTAL - - ?cidos cin?micos ?cido cafeico 179?135 < LC ND ?cido p-cum?rico 163?119 < LC < LC TOTAL - - ?cidos hip?ricos ?cido hip?rico 178?134 < LC < LC ?cido me-hip?rico-1 193?178 ND ND ?cido me-hip?rico-2 193?178 0.5?0.2 ND ?cido me-hip?rico-3 193?178 ND ND TOTAL 0.5?0.2 - EXCRECI?N TOTAL DE METABOLITOS MICROBIANOS >219.9?88.3 - Lignanos Enterolactona 297?253 >201.1 >80.7?49.2 EXCRECI?N TOTAL DE LIGNANOS >201.1 >80.7?49.2 Gluc: glucuronido; Sulf: sulfato; Me: metilo; ND: no detectado; LC: l?mite de cuantificaci?n. Los valores son la media con el ESM. 127 Metabolitos conjugados de EC y EGC en orina de ratas WKY despu?s de consumir durante 14 semanas una dieta STD suplementada con EPA/DHA (1:1) y/o GSE En la Tabla 34 se muestran las concentraciones de metabolitos conjugados de EC y EGC en orina de ratas WKY que ingirieron la dieta STD suplementada con EPA/DHA (1:1) y/o GSE. El grupo STD-EPA/DHA (1:1)+GSE present? mayor cantidad de metabolitos monoconjugados de EC que el grupo STD-soja (P<0.05). El grupo STD-GSE present? mayor contenido de metabolitos diconjugados que el grupo STD-soja (P<0.05). No se detectaron metabolitos monoconjugados de EGC, mientras que se cuantific? un metabolito diconjugado de EGC que no presentaba diferencias significativas entre los grupos; el metabolito triconjugado identificado se encontr? por debajo del l?mite de cuantificaci?n en todos los grupos. La excreci?n total de metabolitos conjugados fue mayor en los grupos STD- GSE y STD-EPA/DHA (1:1)+GSE que en el grupo STD-soja (P<0.05). Tabla 34. Excreci?n urinaria (24 h) de metabolitos conjugados de EC y EGC de ratas WKY despu?s de consumir durante 14 semanas una dieta STD suplementada con EPA/DHA (1:1) y GSE. Metabolitos Transici?n MRM Concentraci?n (?M) ORINA STD-soja STD- EPA/DHA (1:1) STD-GSE STD- EPA/DHA (1:1)+GSE Monoconjugado de EC Gluc-EC-1 465?289 0.06?0.03 0.2?0.03 0.1?0.06 0.3?0.07 Gluc-EC-2 465?289 < LC 0.1?0.03 < LC 0.2?0.06 Gluc-EC-3 465?289 0.06?0.02 0.3?0.06 0.2?0.07 0.6?0.2 Gluc-EC-4 465?289 ND ND 0.3?0.1 0.3?0.3 Gluc-EC-5 465?289 ND ND 0.3?0.2 0.2?0.2 TOTAL 0.1?0.04 0.6?0.08 0.9?0.2 1.7?0.5* Diconjugado de EC Gluc-sulf-EC 545?369 0.07?0.02 < LC 0.2?0.09 0.1?0.05 Me-gluc-EC-1 479?303 ND ND 0.3?0.1 0.2?0.2 Me-gluc-EC-2 479?303 ND ND 0.9?0.3 0.6?0.4 Me-gluc-EC-3 479?303 ND ND < LC < LC Me-sulf-EC 383?303 0.1?0.05 0.08?0.01 0.2?0.03 0.2?0.05 TOTAL 0.2?0.06 0.08?0.01 1.5?0.3* 1.1?0.4 Triconjugado de EC Me3-EC 331?303 0.06?0.01 < LC 0.06?0.01 0.06?0.02 Me2-gluc-EC 493?303 < LC < LC 0.08?0.02 0.06?0.03 TOTAL 0.06?0.01 - 0.1?0.02 0.1?0.03 Diconjugado de EGC 128 Gluc: glucuronido; Sulf: sulfato; Me: metilo; EC: epicatequina; EGC: epigalocatequina; ND: no detectado; LC: l?mite de cuantificaci?n. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo STD-soja: *P<0.05. Metabolitos microbianos en orina de ratas WKY despu?s de consumir durante 14 semanas una dieta STD suplementada con EPA/DHA (1:1) y/o GSE En la Tabla 35 se muestran las concentraciones de metabolitos microbianos conjugados y no conjugados evaluados en orina de ratas WKY que ingirieron la dieta STD suplementada con EPA/DHA (1:1) y/o GSE. Los grupos STD-GSE y STD-EPA/DHA (1:1)+GSE presentaron mayor cantidad de metabolitos derivados de la hidroxifenilvalerolactona que el grupo STD- soja (P<0.001), mientras que el grupo STD-EPA/DHA (1:1) present? menor cantidad de metabolitos derivados de la hidroxifenilvalerolactona que el grupo STD- EPA/DHA (1:1)+GSE (P<0.05). Los tres grupos STD-EPA/DHA (1:1), STD-GSE y STD-EPA/DHA (1:1)+GSE presentaron mayor cantidad de los metabolitos derivados de los ?cidos hidroxifenilval?rico e hip?rico que el grupo STD-soja (P<0.05). Tambi?n, se observ? que los grupos STD-GSE y STD-EPA/DHA (1:1)+GSE presentaron mayor cantidad de metabolitos derivados del ?cido hidroxifenilac?tico que el grupo STD-soja (P<0.001), mientras que el grupo STD- EPA/DHA (1:1) present? menor cantidad de metabolitos derivados del ?cido hidroxifenilac?tico que el grupo STD-EPA/DHA (1:1)+GSE (P<0.01). En general, se observ? que la excreci?n total de metabolitos microbianos en orina fue mayor en los grupos STD-GSE y STD-EPA/DHA (1:1)+GSE que en el grupo STD-soja (P<0.001). Los niveles de metabolitos derivados de lignanos presentaron en todos los grupos concentraciones superiores a 201.1 ?M (60 ppm, patr?n m?s concentrado). Sulf2-EGC 465?385 0.8?0.1 < LC 1.1?0.3 1.1?0.3 TOTAL 0.8?0.1 - 1.1?0.3 1.1?0.3 Triconjugado de EGC Me-gluc-sulf-EGC 575?319 < LC < LC < LC < LC TOTAL - - - - EXCRECI?N TOTAL DE METABOLITOS CONJUGADOS 1.2?0.2 0.7?0.1 3.6?0.5* 3.9?0.7* 129 Tabla 35. Excreci?n urinaria (24 h) de metabolitos microbianos de ratas WKY despu?s de consumir durante 14 semanas una dieta STD suplementada con EPA/DHA (1:1) y/o GSE. Metabolitos Transici?n MRM Concentraci?n (?M) ORINA STD- soja STD- EPA/DHA (1:1) STD- GSE STD- EPA/DHA (1:1)+GSE Hidroxifenilvalerolactonas 3- ? 4- hidroxifenilvalerolactona 191?147 2.1?0.7 9.1?4.0 22.3?6.2 24.3?9.9 3,4- Dihidroxifenilvalerolactona 207?163 < LC 4.5?1.5 15.8?5.6 31.9?15.2 Gluc-3,4- dihidroxifenilvalerolactona 383?207 3.8?1.2 6.4?1.5 10.1?1.3 12.6?4.2 Sulf-3,4- dihidroxifenilvalerolactona 287?207 2.3?0.1 21.0?5.1$$$ 74.7?10. 9**$$$ >208.3*** 3- Hidroxifenilmetilvalerolactona 221?177 1.7?0.5 1.3?0.2 6.0?1.9 2.1?0.6 4- Hidroxifenilmetilvalerolactona 221?177 14.6?2.0 14.3?2.2 35.3?9.4 20.0?5.5 Gluc-3- ? 4- hidroximetilfenilvalerolactona 397?221 7.3?2.5 5.6?2.3 11.4?1.5 8.6?3.1 Sulf-3- ? 4- hidroximetilfenilvalerolactona 301?221 4.7?1.6 1.8?0.4 6.2?1.3 3.6?1.0 TOTAL 36.5?3.7 64.0?7.5$ 181.8?16 .9*** 311.5?19.7*** ?cidos hidroxifenilval?ricos ?cido 3-hidroxifenilval?rico 193?175 1.7?1.2 < LC 6.5?1.2 7.6?3.7 ?cido 4-hidroxifenilval?rico 193?175 < LC < LC 3.0?1.4 < LC ?cido 3,4- dihidroxifenilval?rico 209?137 < LC 3.4?0.9 3.1?0.7 3.8?1.0 ?cido sulf-3,4- dihidroxifenilval?rico 289?209 3.3?0.7 17.1?4.2 53.3?18. 5 56.5?22.6 TOTAL 5.0?1.4 20.5?4.3* 65.9?18. 6* 68.6?23.0* ?cidos hidroxifenilpropi?nicos ?cido 3-hidroxifenilpropi?nico 165?121 393.7?16 2.9 169.7?24.7 337.8?66 .0 358.3?92.3 ?cido 4-hidroxifenilpropi?nico 165?121 >361.4 >361.4 >361.4 >361.4 ?cido gluc-3 ? -4- hidroxifenilpropi?nico 341?165 1.5?1.3 < LC < LC < LC ?cido 3,4- dihidroxifenilpropi?nico 181?137 0.3?0.1 0.4?0.1 0.5?0.2 0.8?0.2 ?cido sulf-3,4- dihidroxifenilpropi?nico 261?181 2.2?0.9 1.7?0.4 3.1?0.9 2.4?0.6 TOTAL 759.0?18 .1 533.2?7.0 702.8?11 .5 723.0?13.6 ?cidos hidroxifenilac?ticos ?cido 3-hidroxifenilac?tico 151?107 3.7?1.4 13.4?2.8 24.1?3.8 33.6?11.4* ?cido 4-hidroxifenilac?tico 151?107 < LC 22.0?5.9 102.4?17 .6 74.4?23.4 130 ?cido 3,4-dihidroxifenilac?tico 167?123 3.0?0.5 4.3?0.9 22.0?11. 6 25.7?7.6 ?cido sulf-3,4- dihidroxifenilac?tico 247?167 22.6?11. 9 14.5?2.4 18.3?4.3 22.2?6.6 TOTAL 29.4?12. 0 54.3?7.0$$ 166.9?21 .9*** 155.9?27.9*** ?cidos hidroxibenzoicos ?cido 4-hidroxibenzoico 137?93 0.8?0.3 3.2?1.0 3.6?1.1 2.1?0.5 ?cido 3,4-dihidroxibenzoico 153?109 0.05?0.0 1 0.3?0.1 0.7?0.2 0.8?0.5 ?cido gluc-3-hidroxibenzoico 313?137 < LC < LC < LC < LC ?cido gluc-4-hidroxibenzoico 313?137 ND < LC < LC < LC ?cido sulf-3,4- dihidroxibenzoico 233?153 0.5?0.1 0.8?0.1 2.0?0.5* 1.4?0.4 ?cido sulf-vainill?nico 247?167 19.4?3.8 28.2?8.3 25.9?4.4 57.3?20.3 TOTAL 20.8?3.8 32.6?8.3 32.2?4.5 61.6?20.3 ?cidos cin?micos ?cido cafeico 179?135 0.07?0.0 3 0.06?0.04 0.1?0.05 0.06?0.02 ?cido m-cum?rico 163?119 6.9?3.3 4.3?1.2 14.0?1.7 5.6?1.9 ?cido p-cum?rico 163?119 1.4?0.5 0.8?0.5 1.9?0.5 1.9?1.3 ?cido sulf-cum?rico-1 243?163 ND 0.3?0.2 0.8?0.3 0.3?0.2 ?cido sulf-cum?rico-2 243?163 < LC 0.3?0.2 0.8?0.2 0.3?0.2 ?cido fer?lico 193?134 0.9?0.4 1.0?0.8 1.2?0.5 1.2?0.7 TOTAL 9.3?3.3 6.7?1.6 18.7?1.9 9.4?2.4 ?cidos hip?ricos ?cido hip?rico 178?134 2.9?1.1 64.3?19.0* 44.9?20.6* 65.5?16.6* ?cido hidroxihip?rico 194?100 < LC 0.6?0.2 0.8?0.2 0.6?0.14 ?cido me-hip?rico-1 193?178 < LC 2.8?2.4 5.3?2.1 2.9?2.4 ?cido me-hip?rico-2 193?178 0.2?0.09 0.5?0.5 0.7?0.5 0.5?0.4 ?cido me-hip?rico-3 193?178 ND ND ND ND TOTAL 3.1?1.1 68.2?19.2* 51.8?20.7* 69.6?16.8* EXCRECI?N TOTAL DE METABOLITOS MICROBIANOS 864.2?25 .6 780.7?32.2 1264.1?57. 1*** 1401.2?66.5* ** Lignanos Enterolactona 297?253 >201.1 >201.1 >201.1 >201.1 Sulf-enterolactona 377?297 >158.7 >158.7 >158.7 >158.7 EXCRECI?N TOTAL DE LIGNANOS >359.8 >359.8 >359.8 >359.8 Gluc: glucuronido; Sulf: sulfato; Me: metilo; ND: no detectado; LC: l?mite de cuantificaci?n. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo STD-soja: *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 y del grupo STD-EPA/DHA (1:1)+GSE: $P<0.05, $$P<0.01, $$$P<0.001. 131 Metabolitos microbianos en heces de ratas WKY despu?s de consumir durante 14 semanas una dieta STD suplementada con EPA/DHA (1:1) y/o GSE En la Tabla 36 se muestran las concentraciones de metabolitos microbianos no conjugados evaluados en heces de ratas WKY que ingirieron la dieta STD suplementada con EPA/DHA (1:1) y/o GSE. Se observ? que los grupos STD-EPA/DHA (1:1) y STD-GSE presentaron mayor cantidad de metabolitos derivados del ?cido hidroxifenilval?rico que el grupo STD-EPA/DHA (1:1)+GSE (P<0.05). El grupo STD-GSE present? menor cantidad de metabolitos derivados del ?cido hidroxibenzoico que el grupo STD-EPA/DHA (1:1)+GSE (P<0.05). En general, no se observaron en los grupos diferencias significativas en la excreci?n total de metabolitos microbianos en heces. Por otro lado, en los metabolitos derivados de lignanos todos los grupos presentaron concentraciones superiores a 201.1 ?M (60 ppm, patr?n m?s concentrado). 132 Tabla 36. Excreci?n fecal (24 h) de metabolitos microbianos de ratas WKY despu?s de consumir durante 14 semanas una dieta STD suplementada con EPA/DHA (1:1) y/o GSE. Me: metilo; ND: no detectado; LC: l?mite de cuantificaci?n. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo STD-soja: *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 y del grupo STD-EPA/DHA (1:1)+GSE: $P<0.05, $$P<0.01, $$$P<0.001. Metabolitos Transici?n MRM Concentraci?n (?M) HECES STD-soja STD- EPA/DHA (1:1) STD-GSE STD- EPA/DHA (1:1)+GSE ?cidos hidroxifenilval?ricos ?cido 3-hidroxifenilval?rico 193?175 < LC 4.3?1.9 8.0?2.8 51.6?22.7 TOTAL - 4.3?1.9$ 8.0?2.8$ 51.6?22.7 ?cidos hidroxifenilpropi?nicos ?cido 3- hidroxifenilpropi?nico 165?121 2.7?2.3 < LC < LC < LC ?cido 4- hidroxifenilpropi?nico 165?121 >217.3?88.3 >199.6?9 4.4 >291.5?69. 9 >199.0?96.6 TOTAL >219.9?88.3 >199.6?9 4.4 >291.5?69. 9 >199.0?96.6 ?cidos hidroxibenzoicos ?cido 4-hidroxibenzoico 137?93 < LC < LC 0.1?0.05$ 0.3?0.04 ?cido 3,4-dihidroxibenzoico 153?109 < LC ND < LC < LC TOTAL - - 0.1?0.05$ 0.3?0.04 ?cidos cin?micos ?cido cafeico 179?135 < LC < LC < LC 0.08?0.03 ?cido p-cum?rico 163?119 < LC 0.04?0.0 3 0.05?0.04 < LC TOTAL - 0.04?0.0 3 0.05?0.04 0.08?0.03 ?cidos hip?ricos ?cido hip?rico 178?134 < LC < LC < LC < LC ?cido me-hip?rico-1 193?178 ND 39.4?16. 2 13.0?4.3 < LC ?cido me-hip?rico-2 193?178 0.5?0.2 5.3?1.3 39.7?7.3**$ $ 2.8?0.6 ?cido me-hip?rico-3 193?178 ND ND ND ND TOTAL 0.5?0.2 44.7?16. 2 52.7?8.1 2.8?0.6 EXCRECI?N TOTAL DE METABOLITOS MICROBIANOS 220.7?88.3 248.7?95 .8 352.4?70.4 253.8?99.3 Lignanos Enterolactona 297?253 >201.1 >201.1 >201.1 >201.1 EXCRECI?N TOTAL DE LIGNANOS >201.13 >201.13 >201.13 >201.13 133 Metabolitos conjugados de EC y EGC en orina de ratas WKY despu?s de consumir durante 14 semanas una dieta HFHS suplementada con EPA/DHA (1:1) y/o GSE En la Tabla 37 se muestran las concentraciones de metabolitos conjugados de EC y EGC evaluados en orina de ratas WKY que ingirieron la dieta HFHS suplementada con EPA/DHA (1:1) y/o GSE. El grupo HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE present? mayor cantidad de metabolitos monoconjugados de EC que el grupo HFHS-soja (P<0.001). No se detectaron metabolitos monoconjugados de EGC, mientras que los metabolitos diconjugados de EGC identificados no presentaron diferencias significativas entre grupos. En general, se observ? que la excreci?n total de metabolitos conjugados fue mayor en el grupo HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE, aunque no se observaron diferencias significativas con el grupo HFHS-soja. 134 Tabla 37. Excreci?n urinaria (24 h) de metabolitos conjugados de EC y EGC de ratas WKY despu?s de consumir durante 14 semanas una dieta HFHS suplementada con EPA/DHA (1:1) y/o GSE. Transici?n MRM Concentraci?n (?M) ORINA Metabolitos HFHS- soja HFHS- EPA/DHA (1:1) HFHS-GSE HFHS- EPA/DHA (1:1)+GSE Monoconjugados de EC Gluc-EC-1 465?289 0.9?0.3 0.2?0.04 0.6?0.3 0.8?0.3 Gluc-EC-2 465?289 0.1?0.02 0.1?0.02$ < LC 0.3?0.07* Gluc-EC-3 465?289 0.2?0.06 0.6?0.2$$ 0.2?0.1$$$ 2.1?0.5*** Gluc-EC-4 465?289 ND ND 0.4?0.2 0.4?0.2 Gluc-EC-5 465?289 ND ND 0.3?0.1 0.3?0.09 TOTAL 1.2?0.3 0.9?0.2 1.5?0.3 4.0?0.3*** Diconjugados de EC Gluc-sulf-EC 545?369 < LC < LC < LC 0.06?0.01 Me-gluc-EC-1 479?303 ND ND 1.0?0.4 0.9?0.3 Me-gluc-EC-2 479?303 ND ND 1.7?0.5 1.1?0.3 Me-gluc-EC-3 479?303 ND ND < LC 0.06?0.02 Me-sulf-EC 383?303 0.1?0.06 0.09?0.02 0.1?0.04 0.2?0.06 TOTAL 0.1?0.06 0.1?0.02 2.9?0.6 2.3?0.3 Triconjugados deEC Me3-EC 331?303 0.1?0.03 < LC < LC 0.1?0.03 Me2-gluc-EC 493?303 < LC < LC < LC < LC TOTAL 0.1?0.04 - - 0.1?0.03 Diconjugados de EGC Sulf2-EGC 465?385 1.3?0.5 < LC 0.8?0.2 1.5?0.4 Gluc-sulf-EGC 561?385 7.0?2.4 1.7?0.5 3.8?1.1 5.9?2.0 TOTAL 8.3?2.4 1.7?0.5 4.6?1.1 7.4?2.0 Triconjugados de EGC Me-gluc-sulf-EGC 575?319 < LC < LC < LC < LC TOTAL - - - - EXCRECI?N TOTAL DE METABOLITOS CONJUGADOS 9.8?2.4 2.6?0.5$ 8.9?1.3 13.8?2.0 Gluc: glucur?nido; Sulf: sulfato; Me: metilo; EC: epicatequina; EGC: epigalocatequina; ND: no detectado y LC: l?mite de cuantificaci?n. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo HFHS-soja: *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 y del grupo HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE: $P<0.05, $$P<0.01, $$$P<0.001. 135 Metabolitos microbianos en orina de ratas WKY despu?s de consumir durante 14 semanas una dieta HFHS suplementada con EPA/DHA (1:1) y/o GSE En la Tabla 38 se muestran las concentraciones de metabolitos microbianos conjugados y no conjugados evaluados en orina de ratas WKY que ingirieron la dieta HFHS suplementada con EPA/DHA (1:1) y/o GSE. El grupo HFHS-EPA/DHA (1:1) present? menor cantidad de metabolitos derivados de la hidroxifenilvalerolactona que el grupo HFHS-soja y que el grupo HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE (P<0.001), mientras que los grupos HFHS-EPA/DHA (1:1) y HFHS-GSE presentaron menor cantidad de metabolitos derivados del ?cido hidroxifenilval?rico que el grupo HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE (P<0.01) y (P<0.05), respectivamente. El grupo HFHS-EPA/DHA (1:1) present? menor cantidad de metabolitos derivados de los ?cido hidroxifenilpropi?nico, hidroxibenzoico e hip?rico que el grupo HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE (P<0.05). El grupo HFHS- EPA/DHA (1:1) present? menor cantidad de metabolitos derivados del ?cido hidroxifenilac?tico que el grupo HFHS-soja (P<0.05), mientras que los grupos HFHS-EPA/DHA (1:1) y HFHS-GSE presentaron menor cantidad de metabolitos derivados del ?cido hidroxifenilac?tico que el grupo HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE (P<0.001) y (P<0.05), respectivamente. El grupo HFHS-EPA/DHA (1:1) present? menor cantidad de metabolitos derivados del ?cido cin?mico que el grupo HFHS- soja (P<0.001) y tambi?n present? menor cantidad que el grupo HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE (P<0.05). En general, se observ? que la excreci?n total de metabolitos microbianos en orina fue menor en el grupo HFHS-EPA/DHA (1:1) que en el grupo HFHS-soja (P<0.001). Los grupos HFHS-EPA/DHA (1:1) y HFHS-GSE presentaron menores niveles de metabolitos que el grupo HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE (P<0.001) y (P<0.05), respectivamente. Por otro lado, se observ? menor cantidad de metabolitos derivados de lignanos en el grupo HFHS-EPA/DHA (1:1) (P<0.05) que en los grupos HFHS-soja y HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE. 136 Tabla 38. Excreci?n urinaria (24 h) de metabolitos microbianos de ratas WKY despu?s de consumir durante 14 semanas una dieta HFHS suplementada con EPA/DHA (1:1) y/o GSE. Metabolitos Transici?n MRM Concentraci?n (?M) ORINA HFHS- soja HFHS- EPA/DHA (1:1) HFHS- GSE HFHS- EPA/DHA (1:1)+GSE Hidroxifenilvalerolactonas Gluc-3,4- dihidroxifenilvalerolactona-1 383?207 15.5?5.0 6.4?2.3 10.7?4.0 18.6?4.1 Gluc-3,4- dihidroxifenilvalerolactona-2 383?207 14.5?4.5 4.4?1.2 8.1?2.6 10.6?3.6 Sulf-3,4- dihidroxifenilvalerolactona 287?207 ND ND 49.0?34.0 42.7?14.3 3- Hidroxifenilmetilvalerolactona 221?177 11.8?1.1 2.4?0.60* 6.0?3.1 6.5?1.4 4- Hidroxifenilmetilvalerolactona 221?177 44.9?12. 1 14.0?2.9 35.3?13.8 35.6?7.7 Gluc-3- ? 4- hidroximetilfenilvalerolactona 397?221 17.3?5.9 3.8?1.1 7.3?2.3 14.7?3.9 Sulf-3- ? 4- hidroximetilfenilvalerolactona 301?221 29.9?9.5 4.0?1.1 20.9?5.4 21.2?7.3 TOTAL 135.6?17 .1 35.9?4.3*** $$$ 138.4?37.6 150.0?19.1 ?cidos hidroxifenilval?ricos ?cido 3-hidroxifenilval?rico 193?175 ND ND 3.1?1.4 4.2?0.7 ?cido 4-hidroxifenilval?rico 193?175 < LC < LC 2.1?0.9 < LC ?cido 3,4- dihidroxifenilval?rico 209?137 8.3?1.9 4.6?1.3 6.0?1.0 11.7?3.7 ?cido sulf-3,4- dihidroxifenilval?rico 289?209 3.3?1.1 < LC 1.3?0.5 8.3?5.3 TOTAL 11.6?2.2 4.6?1.3$$ 12.6?2.0$ 24.1?6.5 ?cidos hidroxifenilpropi?nicos ?cido 3- hidroxifenilpropi?nico 165?121 13.4?7.1 4.3?1.3$ 24.1?8.7 54.1?19.7 ?cido 4- hidroxifenilpropi?nico 165?121 259.4?62 .5 290.6?70.8 >361.4 >361.4 ?cido gluc-3 ? -4- hidroxifenilpropi?nico 341?165 28.7?7.8 5.4?2.3* 14.2?5.9 23.4?5.5 ?cido 3,4- dihidroxifenilpropi?nico 181?137 0.7?0.2 0.3?0.03 0.4?0.2 0.6?0.1 ?cido sulf-3,4- dihidroxifenilpropi?nico 261?181 2.9?1.0 1.5?0.5 2.9?1.0 5.2?1.3 TOTAL 305.0?81 .6 302.0?70.9 $ 403.1?10.6 444.9?20.5 ?cidos hidroxifenilac?ticos ?cido 3-hidroxifenilac?tico 151?107 4.7?1.6 1.5?0.6$ 7.2?3.1 10.3?1.7 ?cido 4-hidroxifenilac?tico 151?107 80.5?20. 1 28.9?9.6 47.5?16.6 100.4?18.7 ?cido 3,4- dihidroxifenilac?tico 167?123 20.5?8.5 6.7?3.0$$ 12.8?6.3$$ 60.9?15.7* 137 Gluc: glucur?nido; Sulf: sulfato; Me: metilo; ND: no detectado y LC: l?mite de cuantificaci?n. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo HFHS-soja: *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 y con respecto al HFHS+EPA/DHA (1:1)+GSE $P<0.05, $$P<0.01, $$$P<0.001. ?cido sulf-3,4- dihidroxifenilac?tico 247?167 29.3?11. 8 10.2?2.8 20.8?6.9 27.7?6.4 TOTAL 135.0?24 .9 47.4?9.5*$$ $ 88.4?19.3$ 199.4?25.3 ?cidos hidroxibenzoicos ?cido 4-hidroxibenzoico 137?93 4.4?1.1 2.0?0.6 2.1?0.6 3.4?0.7 ?cido 3,4-dihidroxibenzoico 153?109 0.1?0.03 0.03?0.01 0.04?0.02 0.2?0.1 ?cido gluc-3- hidroxibenzoico 313?137 < LC < LC < LC < LC ?cido gluc-4- hidroxibenzoico 313?137 < LC < LC < LC < LC ?cido sulf-3,4- dihidroxibenzoico 233?153 2.4?0.7 0.8?0.3 1.8?0.7 2.9?0.7 ?cido sulf-vainill?nico 247?167 12.0?3.9 23.0?8.1$ 12.5?3.4$$ 88.4?22.1** TOTAL 19.0?4.1 25.8?8.1$ 16.4?3.5 94.9?22.1 ?cidos cin?micos ?cido m-cum?rico 163?119 0.4?0.1 0.06?0.02$$ 3.7?1.1** 3.5?0.7* ?cido p-cum?rico 163?119 < LC < LC 0.1?0.04 0.3?0.1 ?cido sulf-cum?rico-1 243?163 0.5?0.2 0.2?0.07 0.2?0.2 0.3?0.1 ?cido sulf-cum?rico-2 243?163 0.4?0.2 0.2?0.07 < LC 0.2?0.1 TOTAL 1.3?0.3 0.4?0.1***$ 4.1?1.1 4.3?0.7 ?cidos hip?ricos ?cido hip?rico 178?134 151.9?52 .8 43.9?19.8$ 96.1?63.7 276.0?59.2 ?cido hidroxihip?rico 194?100 0.1?0.04 0.2?0.03 0.1?0.05 0.3?0.1 ?cido me-hip?rico-1 193?178 ND ND ND ND ?cido me-hip?rico-2 193?178 ND ND ND < LC ?cido me-hip?rico-3 193?178 0.2?0.1 0.04?0.03 < LC 1.6?1.5 TOTAL 152.2?68 .1 44.1?19.8$ 96.2?63.7 278.0?59.2 EXCRECI?N TOTAL DE METABOLITOS MICROBIANOS 761.6?98 .0 460.7?75.8 ***$$$ 760.1?85.7 $ 1198.8?80.6* Lignanos Enterolactona 297?253 103.8?40 .4 6.5?1.6 153.6?33.2 63.3?19.6 Sulf-enterolactona 377?297 5.8?2.2 1.4?0.2 7.0?1.5 9.0?5.4 EXCRECI?N TOTAL DE LIGNANOS 109.6?40 .5 7.9?1.6*$ 160.6?33.3 71.2?20.3 138 Metabolitos microbianos en heces de ratas WKY despu?s de consumir durante 14 semanas una dieta HFHS suplementada con EPA/DHA (1:1) y/o GSE En la Tabla 39 se muestran las concentraciones de metabolitos microbianos no conjugados evaluados en heces de ratas WKY que ingirieron la dieta HFHS suplementada con EPA/DHA (1:1) y/o GSE. Solamente se cuantificaron algunos derivados de los ?cidos hidroxifenilval?rico e hidroxifenilpropi?nico, sin diferencias significativas entre grupos. Por otro lado, se detect? el derivado de lignano enterolactona en algunos animales a concentraciones superiores a 201.1 ?M (60 ppm, patr?n m?s concentrado). Se observ? que los grupos HFHS-GSE y HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE presentaron mayores niveles de enterolactona que los grupos HFHS-soja y HFHS-EPA/DHA (1:1). Tabla 39. Excreci?n fecal (24 h) de metabolitos microbianos de ratas WKY despu?s de consumir durante 14 semanas una dieta HFHS suplementada con EPA/DHA (1:1) y/o GSE. Metabolitos Transici?n MRM Concentraci?n (?M) HECES HFHS- soja HFHS- EPA/DHA (1:1) HFHS-GSE HFHS- EPA/DHA (1:1)+GSE ?cidos hidroxifenilval?ricos ?cido 3-hidroxifenilval?rico 193?175 ND ND 1.2?0.3 < LC TOTAL - - 1.2?0.3 - ?cidos hidroxifenilpropi?nicos ?cido 3- hidroxifenilpropi?nico 165?121 ND ND < LC < LC ?cido 4- hidroxifenilpropi?nico 165?121 < LQ 3.1?1.7 1.8?0.6 1.7?0.9 TOTAL - 3.1?1.7 1.8?0.6 1.7?0.9 ?cidos hidroxibenzoicos ?cido 4-hidroxibenzoico 137?93 ND < LC < LC < LC TOTAL - - - - ?cidos cin?micos ?cido p-cum?rico 163?119 < LC < LC < LC < LC TOTAL - - - - ?cidos hidroxihip?ricos ?cido hip?rico 178?134 < LC < LC < LC < LC TOTAL - - - - EXCRECI?N TOTAL DE METABOLITOS MICROBIANOS - 3.1?1.7 3.0?0.9 1.7?0.9 Lignanos Enterolactona 297?253 >80.7?49.2 >81.0?49.0 >161.0?40.1 >160.9?40.2 EXCRECI?N TOTAL DE LIGNANOS >80.7?49.2 >81.0?49.0 >161.0?40.1 >160.9?40.2 ND: no detectado y LC: l?mite de cuantificaci?n. Los valores son la media con el ESM. 139 3.2.5 Discusi?n de los resultados del estudio 2 La ingesta de una dieta alta en grasa y sacarosa como la HFHS, est? relacionada con la aparici?n de factores del SM, sobre todo con la obesidad.[91, 350] El objetivo en la primera etapa del estudio 2, fue la adecuaci?n del modelo de SM inducido por una dieta HFHS por comparaci?n entre ratas sanas WKY que siguieron una dieta est?ndar o una dieta HFHS, mediante la evaluaci?n de par?metros relacionados con la funci?n cardiovascular, la inflamaci?n y el EO. Los resultados de peso corporal, grasa abdominal, TG, colesterol total, insulina, glucosa en ayunas y tolerancia a la glucosa, fueron descritos en un estudio previo[350] y comparados con la misma cepa WKY que recibieron una dieta alta en grasa y sacarosa. Las ratas WKY con dieta HFHS mostraron aumentos significativos con respecto a las ratas alimentadas con dieta STD en su ingesta y contenido cal?rico (Figura 38), en el peso corporal (Figura 39a, b), en el porcentaje de grasa abdominal (Figura 39c), en la leptina (Figura 40b), en la insulina (Figura 43a), en el p?ptido C (Figura 43c), en los niveles de isoprostanos (Figura 45) y en la excreci?n de metabolitos conjugados (Tabla 31) y microbianos (Tabla 32 y 33) derivados de residuos de polifenoles (flavonoides y lignanos). Se observ?, en promedio, menor ingesta y mayor contenido cal?rico en el grupo HFHS-soja que en el grupo STD-soja. Se observ? tambi?n un menor consumo de la dieta con mayor aporte cal?rico, lo cual indica una auto-regulaci?n de la ingesta en compensaci?n con el contenido cal?rico, esto es consistente con otros estudios.[351] La leptina tiene un papel importante en la regulaci?n del apetito[352] por lo cual podr?a estar relacionada con esta auto-regulaci?n observada en el grupo HFHS-soja (Figura 40b). Por otro lado, se observ? que el consumo a largo plazo de una dieta HFHS indujo mayor peso (Figura 39a), grasa abdominal (Figura 39c), insulina (Figura 43a) y p?ptido C (Figura 43c). La grasa abdominal y la RI est?n estrechamente relacionadas en humanos y en modelos animales,[353, 354] en los cuales se ha observado que la RI est? relacionada con la acumulaci?n de grasa e inflamaci?n.[23, 28] Sin embargo, los valores de glucosa en plasma no cambiaron entre las dietas (Figura 43d). Esta normoglucemia es consistente con la prueba de tolerancia a la glucosa (Figura 44). Estos resultados ponen de manifiesto el nivel de insulina m?s alto requerido en el grupo HFHS para mantener normal a los niveles de glucosa en comparaci?n con las ratas alimentadas con dieta STD; esto es la primera se?al de la aparici?n de DM2 en ratas que consumen dieta HFHS.[355] Nuestros resultados tambi?n muestran que la dieta HFHS no eleva los niveles de TG ni los niveles de colesterol en plasma (Figura 42a, b), lo que est? en concordancia con el 140 peso del h?gado (Figura 42c) e incluso, varios estudios han informado una disminuci?n de los niveles de TG y los niveles de colesterol en plasma en dietas similares.[350, 356] Aunque es bien conocido que una dieta con alto contenido de az?car refinado (hasta el 60% de las calor?as) puede elevar los niveles de TG en plasma,[357, 358] el nivel de sacarosa en nuestra dieta HFHS era posiblemente bajo (37.2% de las calor?as) para producir un estado hipertrigliceridemia (Tabla 45). El alto nivel de grasa en la dieta HFHS podr?a estar relacionado con la inhibici?n de la s?ntesis de ?cidos grasos,[350] este hecho junto con el nivel de colesterol en la dieta HFHS (0.05%, de grasa l?ctea), pueden explicar que los niveles de colesterol en plasma no aumenten en el modelo empleado.[359] En las intervenciones diet?ticas encaminadas a lograr hipercolesterolemia se utilizan dietas con m?s de un 0.2% de colesterol.[360-362] En cualquier caso, no estaba en los objetivos de la tesis conseguir hipercolesterolemia. La cadena respiratoria mitocondrial y el sistema NADPH oxidasa se consideran dos de las principales fuentes de producci?n de ani?n super?xido (O2.-) en tejidos. As?, pueden contribuir al EO observado en la obesidad inducida por la dieta.[363] El EO causado por la dieta HFHS se midi? en productos de oxidaci?n lip?dica denominados F2-isoprostanos como productos oxidados del ?cido araquid?nico (AA),[364] que son excretados en orina libres o conjugados con el ?cido glucur?nico.[365] Es interesante remarcar que para todos los isoprostanos evaluados en orina (15-F2t-Isop, 2,3-dinor-15-F2t-Isop, 5-F2t-Isop, 5-F2c-Isop y 8-F2t-Isop) los niveles fueron significativamente bajos en el grupo que sigui? la dieta HSHF comparados con el grupo de la dieta STD (Figura 45). Esto indica un bajo nivel de EO a nivel sist?mico, ya que la cantidad de especies reactivas radicalarias (p.e. radical hidroxilo, ani?n super?xido) disponible para oxidar mol?culas de l?pido del AA es baja. Estos resultados planteados as?, estar?an en contradicci?n a los planteados por otros autores donde se confirma un alto grado de EO producto de una dieta HFHS.[360, 366, 367] Otros autores han descrito que el contenido de l?pidos de la dieta no influye en la excreci?n de isoprostanos en orina.[368] Nuestra explicaci?n de los resultados es que la dieta en este modelo de inducci?n de obesidad podr?a estar activando el sistema antioxidante end?geno y por tanto reduciendo el EO sist?mico, lo cual se refleja en una reducci?n de la peroxidaci?n lip?dica. El estudio ha mostrado como la dieta influye en la metabolizaci?n de los flavanoles, componentes no nutricionales considerados importantes por sus posibles propiedades funcionales (antioxidantes, anticarcinog?nicos) y que se encuentran en cualquier dieta que contenga fibra y vegetales (p.e. las dietas STD y HFHS). 141 Los flavanoles monom?ricos (p.e. EC, ECG, entre otros) son directamente absorbidos en el intestino delgado y metabolizados en el h?gado como derivados de metilo, glucur?nido y sulfato (metabolizaci?n de fase II).[179, 348, 369] Estas formas pasan a la bilis a trav?s de la circulaci?n enterohep?tica y puede llegar al colon, junto con las procianidinas (flavanoles polim?ricos) que no son absorbidas en el intestino delgado; en el colon todas estas especies son degradadas por la microbiota intestinal. Los metabolitos formados por la microbiota intestinal son, principalmente, derivados de la hidroxifenilvalerolactona; de los ?cidos hidroxifenilval?rico, hidroxifenilpropi?nico, hidroxifenilac?tico, hidroxibenzoico, cin?mico, hip?rico; y lignanos (Tabla 30), y a su vez pueden ser conjugados con metilo, glucur?nido y sulfato. Se observ? una mayor excreci?n total de metabolitos conjugados de EC y EGC en orina, en la dieta HFHS-soja que en la dieta STD-soja, (Tabla 31). En cuanto a los metabolitos microbianos en orina, se observ? mayor concentraci?n en los derivados de hidroxifenilvalerolactona, ?cido hidroxifenilval?rico, hidroxifenilac?tico e hip?rico en la dieta HFHS-soja que en la dieta STD-soja, mientras que la concentraci?n de los derivados del ?cido hidroxifenilpropi?nico fue menor en el grupo HFHS-soja que en el grupo STD-soja. Estos resultados indican una metabolizaci?n desigual por parte de la microbiota intestinal del grupo que consumi? la dieta STD y del grupo con la dieta HFHS, que podr?a estar relacionada directamente con el cambio de la microbiota intestinal, con p?rdida de diversidad, que se observa en individuos obesos (p.e. incremento en las bacteroidetes y reducci?n en las firmicutes).[370, 371] Como consecuencia de la p?rdida de especies capaces de metabolizar polifenoles la excreci?n total de metabolitos microbianos en orina y heces fue menor en el grupo HFHS-soja que en el grupo STD-soja (Tabla 32 y 33). Por otro lado, en el grupo HFHS no se detectaron los ?cidos cafeico y fer?lico (Tabla 32). Esto corrobora una baja metabolizaci?n de los animales alimentados con dieta HFHS. Los resultados descritos podr?an explicarse tambi?n por un efecto de emulsionante o secuestrante de los flavanoles por parte de las grasas de la dieta. ?ste no parece ser el caso como se deduce de la observaci?n de una mayor concentraci?n de metabolitos conjugados de EC y EGC en los animales alimentados con la dieta alta en grasas. Todos estos resultados est?n en consonancia con estudios recientes en humanos.[372] En conclusi?n, la dieta alta en grasa y az?car tiene efectos significativos en la ingesta, el peso corporal, la insulina, en los niveles de isoprostanos y en la biodisponibilidad de metabolitos polifen?licos conjugados de EC, ECG y microbianos. Los resultados muestran que las ratas hembras WKY sanas 142 suplementadas con una dieta HFHS podr?an ser un modelo adecuado para el estudio del SM en sus primeras etapas. Los niveles de insulina, p?ptido C, isoprostanos y ciertos metabolitos polifen?licos podr?an ser marcadores tempranos de la aparici?n de los factores de riesgo del SM. La segunda parte del estudio 2, consisti? en una intervenci?n nutricional con una mezcla de ?cidos grasos poliinsaturados omega-3 (AGPIs n-3) (EPA/DHA, 1:1), un extracto polifen?lico de semilla de uva (GSE) y de los dos componentes a la vez. A ambos productos naturales se les atribuyen un rol en la prevenci?n de factores de riesgo del SM por separado.[110, 115, 373] El objetivo en esta etapa, fue evaluar los efectos de la proporci?n de los dos suplementos en ratas WKY sanas que siguieron una dieta sana (STD), y en el modelo de SM generado por una alimentaci?n con una dieta alta en grasa y sacarosa (HFHS). Los par?metros de peso corporal (Figura 47a), presi?n arterial (Figura 49), ?cido ?rico (Figura 49c), insulina (Figura 51a), glucag?n (Figura 51b), glucosa (Figura 51d), tolerancia a la glucosa (Figura 52), no se vieron alterados por la suplementaci?n de la dieta STD con AGPIs n-3 y el extracto de polifenoles de semilla de uva. Se observ? que la ingesta y el contenido cal?rico fueron similares en todos los grupos, no se observ? una auto-regulaci?n en la ingesta, debido a que las dietas eran isocal?ricas (Figura 46).[351] Aunque, en el peso corporal no se observaron diferencias significativas, se observ? que el grupo suplementado con GSE (STD-GSE) present? menor incremento de peso corporal, y a su vez present? mayor porcentaje de grasa abdominal que el grupo STD-soja, hecho que parece contradictorio con los resultados de otros autores ya que se ha informado que los polifenoles de uva reducen la diferenciaci?n de adipocitos in vitro.[374, 375] El grupo STD-EPA/DHA (1:1)+GSE tambi?n present? mayor porcentaje de grasa abdominal que el grupo STD-soja (Figura 47c). En cuanto al perfil lip?dico (Figura 50a, b), se observ? que la suplementaci?n con GSE reduce los niveles de TG y colesterol total. Estudios previos han informado que los polifenoles mejoran el perfil lip?dico,[376] hecho que est? de acuerdo con nuestros resultados cuando se compara con el grupo control (STD-soja). La administraci?n conjunta de EPA/DHA (1:1) y GSE, fue a?n m?s efectiva. Con respecto a la evaluaci?n del EO (Figura 53), se observaron algunas diferencias en los niveles de ciertos isoprostanos. Por ejemplo, el 2,3-dinor-15-F2t- IsoP, derivado del 15-F2t-IsoP se encontr? en menor concentraci?n en el grupo STD- EPA/DHA (1:1) que en el grupo STD-EPA/DHA (1:1)+GSE. Es interesante, remarcar que el metabolito 15-F2t-IsoP el cual es el isoprostano m?s estudiado y relacionado con el EO en diversas patolog?as,[377] y con efecto vasocontrictor a nivel 143 pulmonar y coronario[378] no present? diferencias en los grupos suplementados con respecto a la dieta control (STD-soja). En cuanto a las diferencias detectadas en otros isoprostanos, es posible que tengan relaci?n con el lugar donde se realice la peroxidaci?n y donde est?n actuando los AGPIs n-3 y los polifenoles.[379, 380] En general, la suplementaci?n con EPA/DHA+GSE reduce la peroxidaci?n lip?dica en animales alimentados con una dieta est?ndar mientras que los polifenoles por si solos no producen ninguna variaci?n. Como se ha comentado anteriormente, este resultado podr?a explicarse por un efecto horm?tico atribuible al aumento de ?cidos grasos poliinsaturados susceptibles de sufrir peroxidaci?n. En cuanto a la metabolizaci?n de flavanoles, l?gicamente, los grupos suplementados con GSE presentaron un aumento en los metabolitos conjugados de EC, EGC y metabolitos microbianos con respecto al control (Tablas 34 y 35). Es interesante resaltar que los derivados de la hidroxifenilvalerolactona aumentaron significativamente en la suplementaci?n conjunta con EPA/DHA. Los derivados de la hidroxifenilvalerolactona son los precursores de toda la serie de metabolitos microbianos formados con excepci?n de los lignanos. La biotransformaci?n microbiana se inicia por la apertura del anillo C de los flavanoles por la acci?n de la microbiota del colon seguido de una lactonizaci?n,[381, 382] la fisi?n posterior del anillo de la valerolactona conduce a la formaci?n de los derivados del ?cido hidroxifenilvalerico,[381] que seguir?n siendo degradados para dar lugar a la serie de ?cidos fenolicos (p.e. hidroxifenilpropi?nico, hidroxifenilac?tico, y hidroxibenzoico). En el caso de flavan-3-oles presentes en la semilla de uva, los derivados de los ?cidos hidroxifenilpropi?nico y benzoico se originan de la ?- oxidaci?n de la cadena lateral de los derivados del ?cido hydroxyphenylvalerico,[383] Los derivados del ?cido hidroxifenilac?tico podr?an provenir de la ?-oxidaci?n de los derivados del ?cido hidroxifenilpropi?nico,[384] aunque tambi?n se ha reportado que podr?an surgir de la degradaci?n microbiana de procianidinas dim?ricas.[197] Otros metabolitos microbianos evaluados en el presente estudio se derivan del metabolismo en el h?gado y en el ri??n despu?s de que sus precursores sean absorbidos en del colon.[385, 386] As?, el ?cido hidroxihip?rico, procede de la conjugaci?n del ?cido hidroxibenzoico con glicina;[385] los ?cidos cin?micos como el m-cum?rico y p-cum?rico, provienen de la deshidrogenaci?n del ?cido 3- ? 4- hidroxipropi?nico, respectivamente; el ?cido fer?lico por la para hidroxilaci?n y metilaci?n del ?cido m-cum?rico;[384, 386] y el ?cido van?lico por la metilaci?n del ?cido 3,4-dihidroxibenzoico.[386] Los derivados de lignanos son formados a partir de lignanos vegetales por la actividad de la microbiota intestinal.[387] Adem?s del esperado aumento de todos los metabolitos derivados de la hidroxifenilvalerolactona, 144 el resultado m?s significativo es un aumento de la concentraci?n de derivados de lignanos en orina (enterolactona, sulf-enterolactona), por encima de 200 ?M (Tabla 35) y en heces (enterolactona). Este resultado es especialmente interesante por cuanto los lignanos se han asociado con un menor riesgo de sufrir DM2,[372] adem?s de otros factores de riesgo del SM, como la obesidad, grasa abdominal, PCR, TG y colesterol.[388] Tanto es as?, que se est? poniendo apunto t?cnicas anal?ticas que permitan su pronta evaluaci?n en estudios epidemiol?gicos.[389-391] En s?ntesis, se observ? que la suplementaci?n con EPA/DHA (1:1) y GSE en una dieta equilibrada (STD-soja) mejora el perfil lip?dico, el estr?s oxidativo y la biodisponibilidad de polifenoles microbianos. La tercera etapa del estudio 2, consisti? en evaluar los efectos de la suplementaci?n con EPA/DHA en la proporci?n 1:1 y el extracto de polifenol de semilla de uva en ratas WKY sanas alimentadas con una dieta HFHS. Nuestros resultados indican que la suplementaci?n con EPA/DHA (1:1) y GSE reduce claramente el incremento del peso corporal (Figura 55a) los dep?sitos de grasa abdominal (Figura 55c), el nivel de triglic?ridos plasm?ticos (Figura 58a), el colesterol total (Figura 58b), los niveles de insulina (Figura 59a) y la excreci?n en orina de metabolitos conjugados de EC y EGC (Tabla 37), y metabolitos microbianos (Tabla 38) en animales alimentados con una dieta HFHS con respecto al grupo de animales sometidos a la misma dieta y no suplementados. La presi?n arterial (Figura 57a, b), ?cido ?rico (Figura 57c), leptina (Figura 56b), glucag?n (Figura 59b), glucosa (Figura 59d), tolerancia a la glucosa (Figura 60) y los niveles de isoprostanos (Figura 61), no se vieron alterados por la suplementaci?n con EPA/DHA (1:1)+GSE. La ingesta y el contenido cal?rico fueron similares en todos los grupos; no se observ? auto-regulaci?n en la ingesta, como es de esperar en dietas isocal?ricas. Tampoco se observaron diferencias entre los grupos en los niveles de leptina como era de esperar por el papel de esta hormona en la regulaci?n de la ingesta.[360] [352, 392] Por otro lado, a la semana 12 de la intervenci?n nutricional, se observ? mayor nivel de insulina (Figura 59a) en el grupo HFHS-GSE que en el grupo HFHS-soja, que se relaciona con el aumento de los niveles del p?ptido C (Figura 58c) que no se observ? en la suplementaci?n EPA/DHA+GSE. Dado que los polifenoles no se relacionan con la resistencia a la insulina, es posible que este efecto a medio plazo (12 semanas) sea debido a la estimulaci?n de la secreci?n de insulina, como se ha descrito para los flavanoles del t?, para los que se ha sugerido el mecanismo de la inhibici?n del enzima glutamato deshidrogenasa.[393] Ser? interesante investigar por qu? este efecto no se observa en la suplementaci?n conjunta con AGPIs n-3. 145 En cuanto al perfil lip?dico aunque se ha informado en otros estudios que la suplementaci?n con polifenoles mejora el perfil lip?dico[224, 394, 395] los resultados de este estudio muestran que la suplementaci?n con GSE no ha contribuido a reducir los efectos de la dieta sobre los TG y el colesterol total, mientras que la suplementaci?n conjunta de EPA/DHA (1:1) result? en una reducci?n significativa (Figura 58a, b). Como los niveles fueron similares para la suplementaci?n con EPA/DHA (1:1) podemos afirmar que la reducci?n observada se podr?a atribuir a los AGPIs n-3.[115, 327] En la obesidad el aumento de la carga mec?nica y el metabolismo del miocardio incrementan el consumo de ox?geno y la producci?n de especies reactivas de ox?geno (ERO) como super?xido, radical hidroxilo y per?xido de hidr?geno derivado del incremento en la respiraci?n mitocondrial.[396, 397] Adem?s, el consumo de dietas con alto contenido de grasa o az?car puede alterar el metabolismo del ox?geno,[360, 361] y activar los mecanismo de formaci?n de ERO. Por otro lado, los dep?sitos de grasa (tejido adiposo, h?gado graso) formados por el consumo de una dieta HFHS son f?cilmente oxidables. En nuestro caso, al evaluar los niveles de EO en orina mediante la determinaci?n de isoprostanos (Figura 61) no se observaron diferencias significativas en los grupos HFHS ni entre ellos y el grupo STD-soja descrito anteriormente, lo que indica que no hay un acusado nivel de EO, o que si se est? induciendo un EO por la dieta tambi?n se est? activando el sistema antioxidante end?geno, para reducir las especies reactivas formadas. A pesar, de que en otros estudios se informe de un aumento de EO debido a la dieta HFHS.[358] Tambi?n, es posible que la cepa o el g?nero de rata empleada (ratas hembra, Wistar Kyoto) sea m?s resistente a la obesidad inducida por la dieta HFHS. En efecto, se ha descrito que roedores machos son m?s susceptibles a desarrollar obesidad cuando son alimentados con una dieta alta en grasa y alta en carbohidratos.[358] Tambi?n se ha reportado que ratas machos Wistar alimentadas con una dieta HFHS durante 12 semanas presentaron EO (oxidaci?n lip?dica y proteica) y un aumento de los sistemas antioxidantes end?genos.[350, 360] Ratas machos Sprague Dawley (SD) tambi?n han experimentado EO y obesidad al ser alimentadas con una dieta HFHS.[398-400] Adicionalmente, se ha observado que en ratones la dieta HFHS induce obesidad y factores de riesgo del SM r?pidamente.[361] La acumulaci?n de grasa en el h?gado observada en otro modelos que utilizan una dieta HFHS, no se observ? en nuestro estudio.[401-403] Nuestros resultados muestran que la alimentaci?n con dieta HFHS y la suplementaci?n conjunta con EPA/DHA (1:1) y GSE indujeron un cambio dr?stico en el aumento de la excreci?n urinaria de metabolitos conjugados de EC, EGC y 146 microbianos, al compararla con las suplementaciones individuales de EPA/DHA (1:1) y GSE (Tabla 37). Con respecto a la excreci?n de metabolitos microbianos, se observ? que la excreci?n total en orina (Tabla 38), se increment? por la suplementaci?n conjunta de EPA/DHA (1:1)+GSE. Es interesante resaltar que el total de los diferentes grupos de derivados evaluados, presentaron mayor concentraci?n en el grupo HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE que en el grupo HFHS- GSE. Llama la atenci?n de que la suplementaci?n conjunta con EPA/DHA (1:1) y GSE incremente la excreci?n de metabolitos conjugados y microbianos en comparaci?n con la suplementaci?n con polifenoles. Estos resultados podr?an confirmar la hip?tesis de que los metabolitos tanto conjugados como microbianos tengan efecto antioxidante hecho que es confirmado por diversos estudios donde la suplementaci?n con polifenoles reduce el EO.[165, 373] Como los AGPIs n-3 tambi?n contribuyen a la reducci?n del EO,[115] posiblemente, la mayor excreci?n de los metabolitos se deba a que, a diferencia de los polifenoles, el EPA/DHA no son metabolizados y est?n actuando primero en la reducci?n del EO que los polifenoles y sus metabolitos. De esta manera, los polifenoles no estar?an siendo consumidos en la misma proporci?n que en el caso de suplementaci?n ?nica con GSE y por tanto se excretar?an en mayor proporci?n. Estos resultados ponen de manifiesto un posible efecto colaborativo de los AGPIs n-3 y polifenoles. En cuanto a la excreci?n de metabolitos de lignanos hemos observado que la dieta HFHS afecta muy significativamente su biodisponibilidad, como se desprende de la comparaci?n con los resultados de la dieta STD-soja. Las suplementaci?n con GSE aumenta la excreci?n de lignanos (Tabla 38) sin llegar a los niveles de las dietas STD. En resumen, hemos observado que la suplementaci?n con EPA/DHA (1:1) y GSE muestra una tendencia a reducir el incremento de peso corporal, la acumulaci?n de grasa abdominal, el aumento de TG, colesterol total e insulina provocados por la dieta HFHS. Se detecta una posible acci?n colaborativa entre las dos suplementaciones. Adem?s, se ha observado un aumento muy significativo en la excreci?n de metabolitos conjugados de EC y EGC y metabolitos microbianos. 147 3.3. Estudio 3. Efecto a corto plazo de D-fagomina y determinaci?n de dosis efectiva 3.3.1. Efecto de D-fagomina sobre la glucosa postprandial in vivo D-Fagomina (60) redujo la glucemia postprandial en ratas Sprague-Dawley (SD) despu?s de la ingesta de sacarosa y almid?n (Figura 62). D-Fagomina (60) modul? eficazmente la glucemia postprandial de manera dependiente de la dosis (Figura 63) que result? en una reducci?n del ?rea bajo la curva a los 120 min de un 17% (1 mg de D-fagomina/kg de peso corporal) (P<0.01) y 43% (4 mg D-fagomina/kg peso corporal) (P<0.001) despu?s de la ingesta de 1 g de sacarosa/kg de peso corporal. No se observaron diferencias estad?sticamente significativas (P<0.05) entre las dosis de 1 y 2 mg de D-fagomina/kg peso corporal, bajo estas condiciones experimentales. D-Fagomina baj? el m?ximo de concentraci?n de glucosa en sangre de 5.8 mM a 5.4, 4.8 y 4.4 mM a dosis de 1, 2 y 4 mg/kg de peso corporal, respectivamente, y desplaz? el tiempo de la concentraci?n m?xima de glucosa en sangre (Tmax) de 15 a 30 min (dosis de 1 y 2 mg D- fagomina/kg de peso corporal) y 45 min (4mg D-fagomina/kg peso corporal) (Figura 63). Figura 62. a) Efecto de D-fagomina sobre la respuesta glic?mica en ratas sanas SD despu?s de la administraci?n de sacarosa, sacarosa+D-fagomina y agua como control (veh?culo). b) Efecto de D-fagomina sobre la respuesta glic?mica en ratas sanas SD despu?s de la administraci?n de almid?n, almid?n+D-fagomina y agua como control (veh?culo). Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferente del grupo control: *P<0.05, **P<0.01 y ***P<0.001. 148 La eficiencia de D-fagomina (60), DNJ (51), miglitol (14) sobre la concentraci?n de glucosa en sangre de ratas sanas SD que recibieron una dosis ?nica de sacarosa fue del mismo orden de magnitud de acarbosa (13), la cual no es un iminoaz?car, que present? mayor eficacia en comparaci?n con los otros compuestos probados. Estos resultados comparativos se incluyen en la secci?n de Anexo 7.5 (Figura suplementaria S1, art?culo: D-Fagomine lowers postprandial blood glucose and modulates bacterial adhesion). D-Fagomina no mostr? ning?n efecto sobre la glucemia postprandial tras la ingesta de glucosa (curvas dosis-respuesta incluido en la secci?n de Anexo 7.5 (Figura suplementaria S2, art?culo: D- Fagomine lowers postprandial blood glucose and modulates bacterial adhesion), lo que sugiere que D-fagomina no afecta significativamente al transporte de glucosa a trav?s del intestino delgado. Se ha comprobado que D-fagomina no tienen efecto sobre el transporte de D-glucosa (61) (5 mM) en cultivos de c?lulas intestinales Caco-2 (trabajo paraleo efectuado por Mart?n-Venegas, R. & Ferrer, R., Facultat de Farm?cia, Universitat de Barcelona). La evaluaci?n de la concentraci?n postprandial de insulina en sangre disminuy? de acuerdo con la disminuci?n de la concentraci?n de glucosa en sangre (Figura 64), lo que indica que D-fagomina no estimula la secreci?n de insulina. Veh?culo (agua) Sacarosa (1 g/kg) Sacarosa+ D-fagom ina (1 m g/kg) Sacarosa+ D-fagom ina (4 m g/kg) Sacarosa+ D-fagom ina (2 m g/kg) Ve h?c ulo (agua) Sac aro sa (1 g/kg) Sac aro sa+ D - fago m ina (1 m g/kg) Sac aro sa+ D - fago m ina (4 m g/kg) Sac aro sa+ D - fago m ina (2 m g/kg) Figura 63. a) Efecto dosis-dependiente de D-fagomina sobre la respuesta glic?mica de ratas sanas SD despu?s de la administraci?n de sacarosa, sacarosa+D-fagomina a diferentes concentraciones y agua como control (veh?culo). b) ?rea bajo la curva AUC a 30, 60 y 120 min despu?s de la administraci?n de sacarosa, sacarosa+D-fagomina a diferentes concentraciones y agua como control (veh?culo). Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo control: *P<0.05, **P<0.01 y ***P<0.001. a) b) 149 3.3.2. Actividad inhibitoria de D-fagomina sobre sacarasa intestinal in vitro La actividad inhibidora in vitro de sacarasa por D-fagomina, DNJ, miglitol y acarbosa se midi? en preparaciones de homogeneizado de mucosa intestinal y en peque?as secciones de intestino revertidos (sacos revertidos) (Tabla 40). Los resultados de los dos ensayos in vitro fueron claramente diferentes. Los resultados para D-fagomina fueron los ?nicos con valores de IC50 similares en ambos ensayos. En la mucosa homogeneizada se observ? que D-fagomina fue el inhibidor m?s d?bil (entre dos y tres ?rdenes de magnitud) en comparaci?n con los otros compuestos evaluados. En contraste al utilizar los sacos revertidos, que presentan la membrana intestinal intacta se observ? que D-fagomina y acarbosa presentaron similar potencia inhibitoria, mientras que los otros dos compuestos (DNJ y miglitol) fueron m?s efectivos. Tabla 40. Actividad inhibidora? de mim?ticos de az?car sobre la sacarasa intestinal de rata in vitro (Valores de IC50 con los errores est?ndar de la media) Ensayo Homogeneizado de mucosa intestinal Secci?n de intestino al rev?s? Compuesto IC50 (?M) SEM IC50 (?M) SEM D-Fagomina 42.0 5.9 59.0 8.1 Acarbosa 1.10* 0.13 53.0 8.9 Miglitol 0.150* 0.017 5.20* 0.80 DNJ 0.0270* 0.0030 0.77* 0.10 DNJ: 1-desoxinojirimicina. * Valores medios significativamente diferentes de los de D- fagomina dentro de cada ensayo, P<0.001. ? La actividad se da en forma de sacarosa hidrolizada en ?mol/h. ? La actividad se normaliz? por los mg de peso h?medo de la secci?n de intestino revertido. Figura 64. Efecto de D-fagomina sobre la respuesta insulinemica en ratas sanas SD despu?s de la administraci?n de sacarosa, sacarosa+D-fagomina y agua como control (veh?culo). Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo control: *P<0.05 y ***P<0.001. 150 3.3.3. Actividad aglutinante y antiadhesiva de D-fagomina en bacterias fimbriadas Se observ? que D-fagomina modul? la adhesi?n bacteriana sin afectar la viabilidad celular. D-Fagomina fue virtualmente inactiva como agente antimicrobiano contra una gama de diferentes cepas hasta una concentraci?n de 2000 mg/L. Los resultados de los ensayos de inhibici?n se incluyen en la secci?n de Anexo 7.5 (Tabla suplementario S2, art?culo: D-Fagomine lowers postprandial blood glucose and modulates bacterial adhesion). D-Fagomina aglutin? c?lulas de Escherichia coli y Salmonella ent?rica serovar typhimurium a concentraciones de 20 y 200 mg/L con aglutinaciones de 60 y 70% en los cultivos control, respectivamente (P<0.001). En la Figura 65 se puede observar este efecto de aglutinaci?n. Por otra parte, D-fagomina inhibe eficazmente la adhesi?n de las cepas bacterianas fimbriadas sobre la mucosa intestinal porcina en concentraciones de 10 y 20 mg/L (P<0.001) (Tabla 41). M?s del 95% de las enterobacterias se recuperaron en el sobrenadante. El efecto era equivalente a la de una soluci?n de D-manosa 0.05 M (9000 mg/L). A 20 mg/L la D-fagomina no afect? la adhesi?n de Bifidobacterium sp. a la mucosa intestinal y promovi? la adhesi?n de Lactobacillus acidophilus (P<0.001) (Tabla 41). Figura 65. Agregaci?n de Salmonella enterica serovar typhimurium en una soluci?n de D- fagomina en PBS (200 mg/L). 151 Tabla 41. Influencia de D-fagomina en la adhesi?n de las bacterias a la mucosa intestinal de cerdo*. Los valores son la media de los logaritmos de unidades formadoras de colonias (UFC, total y sobrenadante) y de porcentaje de UFC en el sobrenadante. Total Sobrenadante Sobrenadante Log UFC/mL SEM Log UFC/mL SEM % UFC SEM Control (PBS) Salmonella ent?rica serovar typhimurium FVB7654 8.59 0.01 6.07 0.00 0.30 0.01 S. ent?rica serovar Typhimurium FVB5643 8.60 0.00 6.14 0.00 0.35 0.01 Escherichia coli FVB2453 8.60 0.00 6.16 0.00 0.36 0.01 E. coli FVB3478 8.60 0.00 6.18 0.00 0.38 0.02 Lactobacillus acidophilus FVB1467 6.69 0.00 6.65 0.00 91.84 0.01 Bifidobacterium sp. FVB4278 7.08 0.00 7.08 0.00 99.15 0.01 D-Fagomina 10 mg/L (0.07 mM) S. ent?rica serovar Typhimurium FVB7654 8.56 0.01 8.53 0.00 91.80 0.06 S. ent?rica serovar Typhimurium FVB5643 8.32 0.00 8.22 0.00 78.40 0.12 E. coli FVB2453 8.09 0.00 8.07 0.00 94.50 0.01 E. coli FVB3478 8.27 0.00 8.24 0.00 95.10 0.01 L. acidophilus FVB1467 6.69 0.00 6.43 0.00 54.60 0.06 Bifidobacterium sp. FVB4278 7.08 0.00 7.08 0.00 99.17 0.00 D-Fagomina 20 mg/L (0.14 mM) S. ent?rica serovar Typhimurium FVB7654 8.07 0.01 8.04 0.00 98.20 0.00 S. ent?rica serovar Typhimurium FVB5643 8.47 0.00 8.45 0.00 95.50 0.00 E. coli FVB2453 8.04 0.00 8.02 0.01 96.30 0.06 E. coli FVB3478 8.00 0.00 8.00 0.00 99.00 0.00 L. acidophilus FVB1467 6.71 0.01 6.46 0.00 56.27 0.01 Bifidobacterium sp. FVB4278 8.08 0.00 8.08 0.00 99.17 0.01 FVB: Facultat Veterin?ria Barcelona. * Los pocillos recubiertos con la mucosa de cerdo se dejaron toda la noche a 4?C, luego se cargaron con las suspensiones bacterianas en presencia de D-fagomina y se incubaron a 37?C durante 90 min. Se contaron las UFC tanto en el material adherido como en el sobrenadante. 152 3.3.4. Discusi?n de los resultados del estudio 3 Los iminoaz?cares naturales al tener estructuras an?logas a los azucares, presentan la capacidad de unirse a los mismos loci en los sistemas biol?gicos. Particularmente, D-fagomina (60) est? estructuralmente relacionada con D-glucosa (61) y D-manosa (62) (Figura 18), lo cual sugiere que podr?a presentar una capacidad de mimetizar glucosa. En primer lugar se evalu? D-fagomina como modulador de la glucosa en sangre postprandial para potenciales aplicaciones en la reducci?n del riesgo de desarrollar RI y el exceso de peso. En estudios previos se ha descrito que D-fagomina es un inhibidor d?bil de ?-glucosidasas mediante ensayos in vitro que utilizan enzimas purificadas[404] o homogeneizados de mucosa intestinal.[405] Al evaluar el efecto de D- fagomina in vivo, se observ? que disminuy? la concentraci?n postprandial de glucosa en sangre en ratas sanas a las cuales se les administr? una ?nica dosis de sacarosa. D-Fagomina result? algo menos eficiente que acarbosa (13), la cual es un inhibidor no-absorbible de ?-glicosidasas y ?-amilasa, y de similar eficiencia que DNJ (51), uno de los iminoaz?cares m?s potentes in vitro,[405] y su derivado miglitol (14) (N-hidroxietil-DNJ). En contraste con estos resultados D-fagomina fue el inhibidor de sacarasa in vitro mucho m?s d?bil que DNJ, miglitol y acarbosa (Tabla 40, primera columna). Como los resultados tanto in vitro como in vivo fueron diferentes, se decidi? evaluar estos mismos compuestos en sacos intestinales revertidos (ex vivo), una aproximaci?n experimental que se asemeja m?s a la situaci?n in vivo. Este m?todo no se utiliza com?nmente porque es m?s complejo que el m?todo de mucosa homogeneizada y se ha demostrado que ambas preparaciones dan actividad sacarasa similares.[406] En contraste con el ensayo en homogeneizados, la eficiencia de D-fagomina y acarbosa fue similar en los sacos revertidos, mientras que DNJ y miglitol presentaron valores aproximadamente de entre 10 y 70 veces mayores (Tabla 40), es decir, las diferencias fueron menores que las detectadas por el m?todo de los homogeneizados. Estos resultados indican que la evaluaci?n in vivo, in vitro y ex vivo puede dar lugar a grandes diferencias con los resultados de los ensayos de inhibici?n de sacarasa intestinal. Los ensayos in vitro pueden proporcionar informaci?n comparativa sobre eficiencias y los ex vivo, una puesta a punto m?s cercana de la situaci?n in vivo, puede ser una mejor opci?n que trabajar con enzimas purificadas u homogeneizadas. Sea cual sea la elecci?n, hay que prestar especial atenci?n al extrapolar los resultados a la modulaci?n postprandial de la glucosa en sangre. Para asegurarse de que posibles compuestos ?tiles no se pasan por alto, los ensayos directos in vivo parece ser la mejor opci?n. 153 Como la administraci?n de D-fagomina por v?a intraperitoneal induce la liberaci?n de insulina y en consecuencia reduce la glucemia en ratones diab?ticos,[407] se evalu? la estimulaci?n de la secreci?n de insulina en el ensayo de actividad in vivo de este estudio (v?a oral). Para aplicaciones nutricionales no es deseable que un posible aditivo tenga un efecto estimulador de la secreci?n de insulina. D-Fagomina no elev? los niveles de insulina en sangre (Figura. 64); por el contrario, como se redujo la glucosa en sangre, tambi?n disminuy? la respuesta insulin?mica postprandial en un periodo de 2 h. Por otra parte, D-fagomina no mostr? ning?n efecto sobre la glucemia postprandial despu?s de la ingesta de glucosa, (Anexo 7.5, Figura suplementaria S2, art?culo: D-Fagomine lowers postprandial blood glucose and modulates bacterial adhesion). Estos resultados implican que D-fagomina no estimula la r?pida secreci?n de insulina ni afecta significativamente el transporte de glucosa en todo el intestino delgado. Durante el per?odo postprandial, la acci?n de D-fagomina parece ser la de ralentizar la liberaci?n de glucosa a partir de hidratos de carbono oligom?ricos y polim?ricos por la inhibici?n de las glicosidasas localizadas en el borde en cepillo de las c?lulas intestinales. As? D-fagomina puede reducir la llamada carga gluc?mica (CG) de una comida. La CG de correspondiente a un alimento se calcula como la cantidad de hidratos de carbono multiplicado por el ?ndice gluc?mico (IG) del alimento, que es el ?rea bajo la curva de glucosa en sangre entre 0 y 2 h despu?s de la ingesti?n de 50 g de hidratos de carbono.[408, 409] La CG es por lo tanto una medida de c?mo se incorporan sist?micamente los hidratos de carbono y qu? tan r?pido ocurre este proceso.[408, 409] Dietas bajas en el IG y la CG han sido asociadas con un menor riesgo de tener sobrepeso, por retrasar la aparici?n de la sensaci?n de hambre y limitar el almacenamiento de los nutrientes en forma de grasa.[410] Si bien se acepta que la reducci?n de la respuesta gluc?mica de los inhibidores de glucosidasa y los alimentos con IG bajo retrasan la aparici?n de RI,[411, 412] la cuesti?n de si dietas con bajo IG y CG son efectivos para controlar el exceso de peso es controvertido.[413] Un reciente meta-an?lisis de ensayos controlados al azar y m?s recientemente un ensayo publicado, sugiri? que las dietas bajas en hidratos de carbono s?lo se pueden asociar con una p?rdida modesta de peso a corto plazo.[414, 415] Cabe se?alar sin embargo, que estos ensayos se llevaron a cabo en poblaciones genot?picamente y fenot?picamente de gran heterogeneidad. Efectos m?s marcados se podr?an obtener con subpoblaciones son sensibles al aumento de peso por carbohidratos. Este punto de vista se apoya en la observaci?n de que a tiempos cortos (30 min) la insulinemia postprandial reduce un aumento de peso en humanos y que existe una subpoblaci?n caracterizada por una temprana secreci?n alta de insulina que produce un aumento 154 de peso, mientras consume de una dieta baja en grasa.[416] Ensayos controlados aleatorios con D-fagomina y subpoblaciones adecuadas pueden ayudar a aclarar el papel de las dietas de baja carga gluc?mica en el aumento de peso y confirmar la reducci?n del riesgo de desarrollar la diabetes tipo 2 asociada a la reducci?n de la glucemia postprandial. Otro punto controvertido es que ciertos alimentos de bajo IG incluyen ingredientes poco definidos qu?micamente y su mecanismo de acci?n no est? claro. Adem?s, la mayor?a de estos ingredientes pueden alterar las caracter?sticas organol?pticas y las propiedades reol?gicas del producto original. Nuestros resultados indican que D-fagomina pura es eficaz a una concentraci?n de 0.1% con respecto al peso de alimento, de manera que podr?a ayudar al dise?o de productos alimenticios m?nimamente modificados en la composici?n u otras propiedades. Tambi?n se reporta aqu? para D-fagomina una actividad que nunca antes se hab?a descrito: la inhibici?n de la adhesi?n a ciertos tipos de bacterias. Hemos observado que D-fagomina aglutina selectivamente bacterias (Escherichia coli y Salmonella ent?rica serovar typhimurium) potencialmente perjudiciales e inhibe su adhesi?n a mucosa intestinal de cerdo. Por el contrario, D-fagomina promovi? la adhesi?n de Lactobacillus spp. mientras que la de Bifidobacterium spp. no se vio afectada (Tabla 41). Cepas de bacterias como E. coli y S. ent?rica serovar Typhimurium expresan lectinas espec?ficas de manosa en la punta de su fimbrias las cuales se unen a los carbohidratos de membrana como un primer paso en la colonizaci?n de otros organismos.[417] Como D-fagomina (60) es estructuralmente similar a D-manosa (62) (Figura 18), el efecto antiadhesivo es probablemente debido a la afinidad por las lectinas. Probi?ticos con cepas no fimbriadas expresan otras glicoprote?nas de adhesi?n (adhesinas) que mantienen a las bacterias d?bilmente unidas a la pared intestinal.[418] Estas interacciones no parecen ser afectadas por D- fagomina. Cabe remarcar que D-fagomina no mostr? ning?n efecto antibi?tico en ninguna de las cepas ensayadas. Esto es importante ya que otras cepas supuestamente beneficiosas mantendr?an su plena viabilidad en presencia de D- fagomina. Por lo tanto, la aglutinaci?n de enterobacterias es muy probable que favorezca la colonizaci?n intestinal por cepas no pat?genas, tales como Bifidobacterium spp. y Lactobacillus spp. y podr?a ayudar a evitar enfermedades inflamatorias infecciosas del intestino. Como la microbiota intestinal influye claramente en el estado fisiol?gico del intestino e incluso en la salud de todo el organismo,[354] estudios posteriores explorar?n si esta actividad de D-fagomina se relaciona a largo plazo con la reducci?n de estos factores de riesgo para la salud. En conclusi?n, a corto plazo, D-fagomina contribuye de forma efectiva a la disminuci?n de la concentraci?n de glucosa en sangre postprandial y la aglutinaci?n 155 selectiva de enterobacterias y otras bacterias fimbriadas. D-Fagomina modul? efectivamente la respuesta gluc?mica en sangre de forma dosis-dependiente despu?s de la ingesta de sacarosa o almid?n, probablemente al retrasar la hidr?lisis de los carbohidratos por parte de las glicosidadas localizadas en el borde en cepillo en las c?lulas intestinales. Tambi?n, se ha puesto de manifiesto que los resultados de inhibici?n de sacarasa in vitro dependen mucho del experimento llevado a cabo para su evaluaci?n y no se puede extrapolar a la actividad inhibitoria in vivo. D-Fagomina tambi?n inhibe la adhesi?n a la mucosa intestinal de bacterias potencialmente perjudiciales. Por lo tanto, D-fagomina podr?a ser utilizada como un ingrediente diet?tico o componente alimentario funcional para reducir los riesgos asociados a una ingesta excesiva de carbohidratos de digesti?n r?pida (refinados), o un exceso de bacterias potencialmente pat?genas. 156 3.4. Estudio 4. Efectos de D-fagomina en el modelo de SM inducido por una dieta HFHS 3.4.1. Evaluaci?n de la cepa de rata Sprague-Dawley (SD) como modelo animal de SM inducido por una dieta HFHS Se utilizaron ratas machos SD sanos a los que se les suministr? una dieta STD o una dieta HFHS durante 9 semanas. La ingesta y el contenido cal?rico de la ingesta se muestra en la Figura 66, se observ? a lo largo del estudio (Figura 66a) un menor consumo (P<0.01) y (P<0.001) en el grupo HFHS que en el grupo STD. A las semanas 1, 2 y 9 el grupo HFHS present? una mayor ingesta energ?tica que el grupo STD (P<0.001) (Figura 66b). 0 5 10 2 3 3 4 4 5 5 6 STD HFHS a) *** *** *** ** *** *** *** *** *** Periodo experimental, semanas In ge st a, g/ d? a/ 10 0 g pe so 0 5 1010 13 15 18 20 STD HFHS b) *** *** *** Periodo experimental , semanas En er g? a, kc al g/ d? a/ 10 0 g pe so Figura 66. a) Ingesta y b) energ?a producto de la ingesta en ratas SD alimentadas con una dieta STD y con una dieta HFHS. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo STD: **P<0.01 y ***P<0.001. Se observ? mayor incremento de peso en el grupo HFHS que en el grupo STD (Figura 67). 0 5 9 500 600 700 800 900 STD HFHS a) * ** Periodo experimental, semanas Pe so co rp or al , g 5 9 0 10 20 30 STD HFHS b) *** *** Periodo experimental, semanas In cr em en to de pe so co rp or al , % Figura 67. a) Peso corporal y b) incremento de peso corporal en ratas alimentadas SD con una dieta STD y con una dieta HFHS. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo STD: *P<0.05, **P<0.01 y ***P<0.001. 157 En cuanto a la grelina plasm?tica (Figura 68a), se observ? que el grupo HFHS present? menores niveles que el grupo STD a las semanas 5 y 9. Los niveles de leptina en el grupo HFHS aumentaron progresivamente durante el experimento (Figura 68b). 0 5 9 0 100 200 300 400 500 STD HFHS a) *** ** Periodo experimental, semanas G re lin a pl a sm ?t ic a, pg /m L 0 5 9 0 1000 2000 3000 STD HFHS b) * * Periodo experimental, semanas Le pt in a pl a sm ?t ic a, pg /m L Figura 68. a) Grelina plasm?tica y b) leptina plasm?tica en ratas SD alimentadas con una dieta STD y con una dieta HFHS. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo STD: *P<0.05, **P<0.01 y ***P<0.001. El grupo HFHS present? mayores niveles de TG que el grupo STD (P<0.01) (Figura 69a). Por otra parte, se observ? un descenso (menos pronunciado) en el colesterol total en el grupo HFHS con respecto al grupo STD (Figura 69b). 0 5 9 0 100 200 300 400 STD HFHS a) ** ** Periodo experimental, semanas Tr ig lic ?r id os , m g/ dL 0 5 9 0 50 100 150 STD HFHS b) * * Periodo experimental, semanas C ol es te ro l t ot al , m g/ dL Figura 69. a) Triglic?ridos y b) colesterol total en ratas SD alimentadas con una dieta STD y con una dieta HFHS. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo STD: *P<0.05 y **P<0.01. En cuanto al contenido de isoprostanos, a la semana 5 el isoprostano 5-F2c-IsoP present? mayor nivel en el grupo HFHS que en el grupo STD (P<0.01) (Figura 70b). A la semana 9 (Figura 70c), no se observaron diferencias en el contenido de isoprostanos entre los grupos. 158 A las semanas 5 y 9 el grupo HFHS present? mayores niveles de insulina plasm?tica que el grupo STD (P<0.001) (Figura 71a). El grupo HFHS present? menores niveles de glucag?n plasm?tico que el grupo STD (P<0.01) (Figura 71b). En cuanto a la glucosa plasm?tica, se observ? a la semana 5 mayor nivel en el grupo HFHS que en el grupo STD (P<0.01) (Figura 71c). - iso P 2t 15 - F - iso P 2t 2,3 - din or -15 - F - iso P 2t 5-F - iso P 2c 5-F - iso P 2t 8-F 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 STD HFHS a) To ta l i so P, pg /m g cr ea tin in a - iso P 2t 15 - F - iso P 2t 2,3 - din or -15 - F - iso P 2t 5-F - iso P 2c 5-F - iso P 2t 8-F 0 500 1000 1500 STD HFHS b) ** $ To ta l i so P, pg /m g cr ea tin in a - iso P 2t 15 - F - iso P 2t 2,3 - din or - 15 - F - iso P 2t 5-F - iso P 2c 5-F - iso P 2t 8-F 0 500 1000 1500 2000 STD HFHS c) To ta l i so P, pg /m g cr ea tin in a Figura 70. a) Isoprostanos al inicio del estudio, b) isoprostanos a la semana 5 del estudio y c) isoprostanos a la semana 9 del estudio en ratas SD alimentadas con una dieta STD y con una dieta HFHS. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo STD: **P<0.01. 159 0 5 9 0.0 2.5 5.0 7.5 STD HFHS a) *** *** Periodo experimental, semanas In su lin a pl a sm ?t ic a , n g/ m L 0 5 9 0 100 200 300 400 500 600 STD HFHS b) ** ** Periodo experimental, semanas G lu ca g? n pl as m ?t ic o , pg /m L 0 5 9 0 25 50 75 100 STD HFHS c) ** Periodo experimental, semanas G lu co sa pl a sm ?t ic a , m g/ dL Figura 71. a) Insulina plasm?tica, b) glucag?n plasm?tico y c) glucosa plasm?tica en ratas alimentadas SD con una dieta STD y con una dieta HFHS. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo STD: **P<0.01 y ***P<0.001. 3.4.2. Par?metros relacionados con el SM en ratas SD alimentadas con una dieta HFHS y suplementadas con D-fagomina Se utilizaron ratas machos SD sanos a los que se les suministr? una dieta STD o una dieta HFHS suplementada con D-fagomina durante 9 semanas. Se observ? que los grupos HFHS y HFHS+D-fagomina consumieron menos alimento (P<0.001) que el grupo STD y una cantidad similar de kilocalor?as con las excepciones puntuales mencionadas en el apartado anterior (semanas 1, 2 y 9) (Figura 72b). La suplementaci?n con D-fagomina no modific? la ingesta en ning?n caso. 0 5 102 3 3 4 4 5 5 6 STD HFHS HFHS+D-fagomina a) *** *** *** *** ** *** *** *** *** *** ****** *** *** *** *** *** *** Periodo experimental, semanas In ge st a, g/ d? a/ 10 0 g pe so 0 5 1010 13 15 18 20 STD HFHS HFHS+D-fagomina b) ** $ ** *** *** *** Periodo experimental , semanas En er g? a, kc al g/ d? a/ 10 0 g pe so Figura 72. a) Ingesta y b) energ?a producto de la ingesta en ratas SD suplementadas con D- fagomina. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo STD: **P<0.01, ***P<0.001 y del grupo HFHS: $P<0.05. 160 El grupo HFHS present? mayor peso corporal a las semanas 5 y 9 que el grupo STD (P<0.05) y (P<0.01, respectivamente) (Figura 73a), mientras que el grupo HFHS+D-fagomina present? menor incremento de peso que el grupo HFHS (Figura 73b). 0 5 9 500 600 700 800 900 STD HFHS HFHS+D-fagomina a) ** * * * Periodo experimental, semanas Pe so co rp or al , g 5 9 0 10 20 30 STD HFHS HFHS+D-fagomina b) *** *** ** ** $ Periodo experimental, semanas In cr em en to de pe so co rp or al , % Figura 73. a) Peso corporal y b) incremento de peso corporal en ratas SD suplementadas con D-fagomina. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo STD: *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 y del grupo HFHS: $P<0.05. La suplementaci?n con D-fagomina supuso un aumento de los niveles de grelina con respecto al grupo HFHS (Figura 74a) y una disminuci?n de los niveles de leptina hasta valores similares a los del grupo STD (Figura 74b). 0 5 9 0 100 200 300 400 500 STD HFHS HFHS+D-fagomina a) *** * $$ *** Periodo experimental , semanas G re lin a pl as m ?t ic a, pg /m L 0 5 9 0 1000 2000 3000 STD HFHS HFHS+D-fagomina b) * * Periodo experimental, semanas Le pt in a pl as m ?t ic a, pg /m L Figura 74. a) Grelina plasm?tica y b) leptina plasm?tica en ratas SD suplementadas con D- fagomina. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo STD: *P<0.05, ***P<0.001 y del grupo HFHS: $$P<0.01. La concentraci?n de TG en el grupo suplementado fue tambi?n menor que en el grupo HFHS mientras que las diferencias en los niveles de colesterol total entre los grupos HFHS y HFHS+D-fagomina no fueron significativas. (Figura 75). 161 La suplementaci?n de la dieta HFHS con D-fagomina redujo los niveles de algunos isoprostanos a la semana 5 (Figura 76b), en particular el isoprostano 5-F2c- IsoP, y en menor grado, 5-F2t-IsoP. A la semana 9 (Figura 76c), no se observaron diferencias significativas evaluados entre los grupos. - iso P 2t 15 - F - iso P 2t 2,3 - din or - 15 - F - iso P 2t 5-F - iso P 2c 5-F - iso P 2t 8-F 0 1000 2000 3000 4000 STD HFHS HFHS+D-fagomina a) To ta l i so P, pg /m g cr ea tin in a - iso P 2t 15 - F - iso P 2t 2,3 - din or - 15 - F - iso P 2t 5-F - iso P 2c 5-F - iso P 2t 8-F 0 500 1000 1500 STD HFHS HFHS+D-fagomina b) ** $ To ta l i so P, pg /m g cr ea tin in a 0 5 9 0 100 200 300 400 STD HFHS HFHS+D-fagomina a) ** ** $$ Periodo experimental, semanas Tr ig lic ?r id os , m g/ dL 0 5 9 0 50 100 150 STD HFHS HFHS+D-fagomina b) * * Periodo experimental, semanas C ol es te ro l t ot al , m g/ dL Figura 75. a) Triglic?ridos y b) colesterol total en ratas SD suplementadas con D-fagomina. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo STD: *P<0.05, **P<0.01 y del grupo HFHS: $$P<0.01. 162 - iso P 2t 15 - F - iso P 2t 2,3 - din or - 15 - F - iso P 2t 5-F - iso P 2c 5-F - iso P 2t 8-F 0 500 1000 1500 2000 STD HFHS HFHS+D-fagomina c) To ta l i so P, pg /m g cr ea tin in a Figura 76. a) Isoprostanos antes de la suplementaci?n, b) isoprostanos a la semana 5 del estudio y c) isoprostanos a la semana 9 del estudio en ratas SD suplementadas con D- fagomina. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo STD: **P<0.01 y del grupo HFHS: $P<0.05. Los niveles de insulina plasm?tica en el grupo HFHS+D-fagomina fueron significativamente menores que en el grupo HFHS a las semanas 5 y 9 hasta valores similares al grupo STD (Figura 77a). Los niveles de glucag?n plasm?tico en el grupo HFHS+D-fagomina fueron superiores a los del grupo HFHS (Figura 77b). 0 5 9 0.0 2.5 5.0 7.5 STD HFHS HFHS+D-fagomina a) *** *** $$$ $$ Periodo experimental, semanas In su lin a pl as m ?t ic a, n g/ m L 0 5 9 0 100 200 300 400 500 600 STD HFHS HFHS+D-fagomina b) ** ** Periodo experimental, semanas G lu ca g? n pl as m ?t ic o, pg /m L 0 5 9 0 25 50 75 100 STD HFHS HFHS+D-fagomina c) ** Periodo experimental, semanas G lu co sa pl as m ?t ic a, m g/ dL Figura 77. a) Insulina plasm?tica, b) glucag?n plasm?tico y c) glucosa plasm?tica en ratas SD suplementadas con D-fagomina. Los valores son la media con el ESM. Valores de la media significativamente diferentes del grupo STD: *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 y del grupo HFHS: $P<0.05, $$P<0.01, $$$P<0.001. 163 3.4.3 Discusi?n de los resultados del estudio 4 Como consecuencia de los resultados obtenidos en el estudio 3, sobre los efectos de D-fagomina a lo largo del tracto intestinal (disminuci?n de la concentraci?n de glucosa en sangre postprandial e inhibici?n de la adhesi?n de enterobacterias) se plante? evaluar los efectos de D-fagomina in vivo a m?s largo plazo a la dosis efectiva determinada previamente (0.2% con respecto a sacarosa). El modelo de SM utilizado fue animales tratados con una dieta hipercal?rica rica en grasa y sacarosa (HFHS).[419] La dieta HFHS, que imita en cierta medida las dietas de alta energ?a de consumo frecuente por muchas personas, se ha utilizado previamente por nosotros en el estudio 2 y por otros.[420] En una primera etapa, se evalu? el modelo de SM inducido por la dieta HFHS durante 9 semanas y se compar? con la misma cepa de ratas que ingirieron una dieta sana (STD). Las ratas que ingirieron la dieta HFHS consumieron menos pienso que las que siguieron una dieta STD (Figura 66). Por otro lado, se observaron pocas diferencias en la cantidad de kilocalor?as ingeridas (Figura 66b). Estos resultados coinciden con lo observado generalmente en la literatura.[421] Aunque la ingesta cal?rica fue similar, se observaron diferencias significativas en la evoluci?n del peso (Figura 67b), cosa que se explica por la acumulaci?n de grasa en animales sometidos a la dieta HFHS.[358, 361] La grelina y la leptina tambi?n fueron evaluadas en el modelo de SM inducido por dieta (Figura 68), como era de esperar las diferencias encontradas concuerdan con las diversas publicaciones de factores de riesgo de SM. En concordancia con los resultados de otros autores[352, 422-424] se observ? un aumento de grelina en el grupo HFHS (Figura 68a). El mecanismo exacto de la disminuci?n de la secreci?n de grelina no est? totalmente claro hoy d?a. Hay muchas hip?tesis de su relaci?n con el SM. La primera, es que la insulina es un inhibidor directo de la secreci?n de grelina.[425] Se ha sugerido que el tracto gastrointestinal es un ?rgano sensible a la insulina la cual inhibe la liberaci?n de la grelina en las c?lulas del est?mago.[426] aunque todav?a no est? claro cu?l es el mecanismo de inhibici?n. La segunda hip?tesis, se basa en evidencias sustanciales de que la leptina puede ejercer un efecto inhibitorio indirecto sobre la liberaci?n g?strica de la grelina.[427] La leptina induce mecanismos de saciedad que, a su vez, provocan la supresi?n de se?ales orexig?nicas g?stricas.[392] La tercera hip?tesis es la que relaciona la reducci?n de los niveles de grelina con un mayor ?ndice de masa corporal,[428] tambi?n en personas diagnosticadas con SM.[429, 430] Esta hip?tesis tambi?n concuerda con nuestra observaci?n de que el nivel de la grelina fue significativamente menor en el grupo HFHS que en el grupo control STD. Por otro lado, como hemos mencionado antes, 164 los niveles de leptina fueron altos en el grupo HFHS (Figura 68b). Los niveles de leptina correlacionaron positivamente con los niveles de insulina y es reconocido que la insulina regula la expresi?n de leptina. Adem?s, la resistencia a la leptina se ha relacionado con la resistencia a la insulina.[431, 432] En cuanto a la lipidemia (Figura 69a), se observ? un mayor nivel de TG y menor nivel de colesterol total en el grupo HFHS (Figura 69). En la literatura se ha descrito que una dieta rica en grasa saturada y en sacarosa (como HFHS) puede aumentar los TG y el colesterol total plasm?tico en forma importante en algunos modelos murinos.[421] Una revisi?n m?s exhaustiva revela que el tipo de grasa ingerida determina directamente los niveles de triglic?ridos,[88] es decir elevaci?n de los triglic?ridos observada se debe posiblemente a que la grasa l?ctea se compone principalmente de triglic?ridos cuyos principales ?cidos grasos son palmitato, estearato, oleato, linoleato y linolenato[433] y no debido a un aumento significativo del metabolismo de TG y de los dep?sitos grasos en el h?gado, que se han relacionado con la inflamaci?n, EO y RI.[434, 435] Nuestros resultados muestran un cierto aumento del EO (p.e. el isoprostano 5-F2c-IsoP a la semana 5) y alteraciones en los niveles de leptina, grelina, glucag?n e insulina compatibles con los primeros estadios de la aparici?n de RI. El aumento de 5-F2c-IsoP a la semana 5 en el grupo HFHS (Figura 70) podr?a estar relacionado con el aumento en los niveles de insulina (Figura 71a), ya que es conocido que la RI induce una respuesta inflamatoria[23, 29] de baja intensidad, tambi?n conocida como metainflamaci?n (inflamaci?n metab?lica);[436] para algunos autores la aparici?n de este estado inflamatorio podr?a deberse a una anomal?a del sistema inmunol?gico producto de la dieta[437] que puede llegar desembocar en el desarrollo de la obesidad, diabetes y arterioesclerosis.[438, 439] Estos observaciones son compatibles con el bajo nivel de glucag?n en el grupo HFHS (Figura 71b). Adem?s, se observaron a la semana 5 diferencias significativas en los niveles de glucosa (Figura 71c) tambi?n compatible con la aparici?n de RI. En s?ntesis, la intervenci?n con la dieta HFHS fue efectiva para inducir la aparici?n de factores de riesgo relacionados con el SM: sobrepeso, hipertrigliceridemia, hiperinsulinemia, e incipiente EO. La suplementaci?n de la dieta HFHS con D-fagomina atenu?, y en algunos casos contrarrest?, las alteraciones metab?licas inducidas por el exceso de grasas y carbohidratos. La acci?n de D-fagomina fue significativa en los siguientes par?metros: aumento de peso, leptina, grelina, TG, insulina, glucag?n e isoprostano 5-F2c-IsoP. D-Fagomina fue capaz de reducir el aumento del peso corporal en el grupo HFHS en comparaci?n con el grupo STD (25.7% vs 8.6%), de manera tal que las ratas que consumieron la dieta HFHS+D-fagomina presentaron una ganancia de 165 peso de 18.3% (Figura 73). Como la ingesta fue parecida en todos los grupos (Figura 72), no parece que la acci?n del iminociclitol est? relacionada con los mecanismos de saciedad ni, probablemente, con el efecto sobre la glucosa plasm?tica postprandial (estudio 3). Una posible explicaci?n de los resultados podr?a estar en la actividad antiadhesiva frente a ciertos tipos de bacterias descrita tambi?n en el estudio 3. En un experimento paralelo (Anexo 7.1.3, art?culo: Efecto of D-fagomine on excreted Enterobacteria and weight gain in rats fed a high-fat high-sucrose diet), que no se ha incluido en el cuerpo central de esta tesis, se evalu? el efecto de D- fagomina sobre los niveles de enterobacterias en animales sometidos a dietas STD y HFHS. Mediante la t?cnica de real-time PCR cuantitativa se midieron la poblaci?n total de bacterias y las de enterobacteriales y E. coli en muestras fecales a la semana 5. Se observ? que el grupo alimentado con la dieta HFHS (sin D-fagomina) excret? mayor proporci?n de enterobacterias y E. coli (P<0.05) que el grupo alimentado con la dieta sana (STD). Los niveles de enterobacterias y E coli de las ratas que recibieron la dieta HFHS+D-fagomina fueron estad?sticamente similares al grupo alimentado con la dieta STD. Se ha descrito que una dieta HFHS induce obesidad a la vez que un incremento de enterobacteriales.[440] El efecto de la D-fagomina podr?a explicarse por su actividad antiadhesiva selectiva frente a enterobacterias fimbriadas tales como E. coli (estudio 3). Como se ha comentado, una parte de las enterobacterias tienen lectinas selectivas para D-manosa (62) en sus fimbrias, que facilitan la r?pida colonizaci?n en el hu?sped. Nuestra hip?tesis es que debido a que la D-fagomina (60) es un an?logo de D-manosa (62) (Figura 18), podr?a competir por las lectinas. La reducci?n selectiva de bacterias potencialmente perjudiciales para el organismo hu?sped implica la disminuci?n de los llamados patrones moleculares asociados a pat?genos (PMAPs), que son productos bacterianos esencial potencialmente t?xicos.[441, 442] Dos de los PMAPs m?s comunes son los polisac?ridos (LPS) de las bacterias Gran negativas y el peptidoglicano (PGN) de las bacterias Gran positivas. Estos PMAP son reconocidos por receptores del sistema inmune, (p.e. toll-like receptor-4, TLR-4), que desencadenan una respuesta inflamatoria.[443] Todos estos fen?menos terminan influyendo en las funciones metab?licas, principalmente a trav?s de la acumulaci?n de ciertos l?pidos en ?rganos cruciales como el h?gado y el m?sculo esquel?tico.[314] As?, la hip?tesis de la regulaci?n de la microbiota podr?a explicar otros resultados del estudio 4. Los niveles de grelina para el grupo HFHS+D-fagomina fueron intermedios entre los de los grupos STD y el HFHS (Figura 74a). Por otro lado, los niveles de leptina fueron significativamente menores en el grupo HFHS+D-fagomina que en el 166 grupo HFHS (Figura 74b). Este resultado tambi?n podr?a explicarse por la reducci?n de la acumulaci?n de l?pidos debida a la acci?n de D-fagomina sobre la composici?n de la microbiota intestinal. En general los niveles de todos los isoprostanos (15-F2t-IsoP, 2,3-dinor-15-F2t- IsoP, 5-F2t-IsoP, 5-F2c-IsoP y 8-F2t-IsoP) en el grupo HFHS+D-fagomina fueron similares a los niveles del grupo STD a las 5 semanas de intervenci?n aunque las diferencias con el grupo HFHS no son estad?sticamente significativas (Figura 76). El isoprostano 5-F2c-IsoP fue el derivado lip?dico m?s sensible a la suplementaci?n. Los resultados son consistentes con un EO incipiente y una acci?n de D-fagomina moderada. Los resultados correspondientes a la insulina (Figura 77a) tambi?n son consistentes con la disminuci?n de la acumulaci?n de l?pidos mediada por D- fagomina, que redujo la respuesta insulin?mica significativamente con respecto al grupo HFHS. La liberaci?n paracrina de insulina por las c?lulas ? del p?ncreas regula la producci?n de glucag?n en las c?lulas ? del p?ncreas y la homeostasis de la glucosa,[28] fen?menos que concuerdan con lo observado en los grupos HFHS+D- fagomina y HFHS (Figura 77b, c). En conclusi?n, D-fagomina ayuda a paliar los efectos metab?licos inducidos por una dieta alta en grasa y alta en sacarosa sobre la ganancia de peso corporal; el metabolismo lip?dico; la home?stasis de la glucosa; la sensibilidad a la grelina, leptina, glucag?n e insulina; y el EO. A la vista de los indicios de la acci?n de D- fagomina sobre la microbiota intestinal, es posible que una disminuci?n en ciertas poblaciones bacterianas (p.e. enterobacterias) mediada por D-fagomina reduzca la acumulaci?n de l?pidos y la respuesta inflamatoria asociada a dietas de alta densidad energ?tica y explique los subsiguientes efectos metab?licos observados en el presente estudio. 167 4. CONCLUSIONES 168 169 Las conclusiones parciales de cada estudio se pueden encontrar al final de las correspondientes discusiones. A continuaci?n se exponen las conclusiones globales m?s significativas. 1. El modelo SHROB presenta alteraciones significativas en par?metros relacionados con la inflamaci?n, disfunci?n endotelial, actividad tromb?tica, RI, EO y una estimulaci?n de las defensas antioxidantes en ?rganos vitales que podr?an ser utilizadas como marcadores de SM y ECV en intervenciones nutricionales. 2. Mezclas de EPA y DHA con cantidades de EPA iguales o superiores a DHA son m?s efectivas que un exceso de DHA para el control de la dislipidemia en el SM y los factores de riesgo de las ECV en el modelo de ratas SHROB. 3. En el modelo de ratas alimentadas con dieta HFHS, la suplementaci?n conjunta de EPA/DHA (1:1) y polifenoles es m?s efectiva que la suplementaci?n por separado para la reducci?n de factores de riesgo del SM. Sugerimos que EPA/DHA presenta un efecto protector frente al EO m?s r?pido que el de los polifenoles, posiblemente porque ?stos son objeto de una extensa metabolizaci?n. Sugerimos un efecto horm?tico como explicaci?n a la acci?n atenuante sobre el EO. 4. La dieta HFHS reduce la metabolizaci?n microbiana de polifenoles, efecto probablemente asociado a la disminuci?n de la diversidad microbiana inducida por el exceso de grasa. La suplementaci?n con EPA/DHA y polifenoles increment? la excreci?n de metabolitos conjugados de EC, EGC y de metabolitos microbianos de forma m?s efectiva que la suplementaci?n con polifenoles. 5. D-Fagomina modul? efectivamente, en ratas, la respuesta gluc?mica en sangre de forma dosis-dependiente despu?s de la ingesta de sacarosa o almid?n, en contraste con los resultados in vitro. Por ello, D-fagomina podr?a emplearse para el control de la glucemia en individuos pre-diab?ticos o como adyuvante en el tratamiento de la diabetes tipo 2. Adem?s, D-fagomina presenta una actividad inhibitoria hasta ahora desconocida sobre la adhesi?n de bacterias potencialmente perjudiciales a la mucosa intestinal, sin efecto antibi?tico. 170 6. La suplementaci?n con D-fagomina a la dosis efectiva determinada previamente (0.2% con respecto a la sacarosa) aten?a eficazmente las alteraciones metab?licas inducidas por una dieta alta en grasa y alta en sacarosa en ratas. Los efectos son: reducci?n de la ganancia de peso corporal, mejora en el perfil lip?dico, mejora de la sensibilidad a la grelina, leptina, glucag?n, insulina y reducci?n del estr?s oxidativo. Como la acumulaci?n de l?pidos y sus efectos protectores se ha relacionado con la perdida de diversidad en la microbiota intestinal, sugerimos la actividad sobre la microbiota intestinal como un posible mecanismo de acci?n que explica los efectos descritos. 171 5. SECCI?N EXPERIMENTAL 172 173 5.1. EQUIPOS, REACTIVOS Y M?TODOS GENERALES 5.1.1. Equipos Para la realizaci?n de este proyecto de tesis se utilizaron materiales y equipos de los Laboratorios de Nutrac?uticos y Biotransformaci?n del Instituto de Qu?mica Avanzada de Catalu?a (IQAC) y del estabulario del Centro de Investigaci?n y Desarrollo, pertenecientes al Consejo Superior de Investigaciones Cient?ficas (CSIC) y de la Unidad de Espectrometr?a de masas, Servicios Cient?fico-T?cnicos de la Universidad de Barcelona. Se emple? una balanza EB-2800M de Shimadzu (Kyoto, Jap?n), con capacidad de 280g a 2800g para medir el peso corporal de los animales. Las pesadas que requirieron mayor precisi?n se realizaron en una balanza CP225D de Sartorius (Goettingen, Alemania). Se utiliz? una liofilizadora Alpha 1-2 LDPus de Christ? (D?sseldorf, Alemania), para liofilizar los diferentes piensos. Los piensos liofilizados, se empacaron en bolsas Magic Vac? de 30 x 20 cm, se sellaron al vac?o en un sellador Xana 7667 de Alfa Hogar (Guip?zcoa, Espa?a) y se almacenaron a 4?C en la c?mara fr?a del IQAC, hasta su uso. Para la determinaci?n de la presi?n diast?lica (PD) y presi?n sist?lica (PS) se emple? un medidor de presi?n LE-5001 de PanLab Harvard Apparatus (Cornell?, Barcelona), acoplado a un manguito transductor para rata LE-5160R de PanLab Harvard Apparatus (Cornell?, Barcelona), un calentador con placa de cer?mica LE- 5610 de PanLab Harvard Apparatus (Cornell?, Barcelona) y contenedores de rata (cepos) LE-5022, LE-5022, LE-5024, LE-5025 de PanLab Harvard Apparatus, con capacidades de 150 g, 250 g, 400 g y 500 g, respectivamente. Adem?s se fabric? un cepo con capacidad de aproximadamente 1000 g, para ratas con mayor peso. Se emple? una m?quina Golden A4? de Oster (McMinnville, TN, USA), para rasurar las extremidades inferiores de las ratas, durante la determinaci?n de glucosa y extracci?n de sangre. Para la obtenci?n de plasma durante los experimentos, se extrajo sangre de la vena safena utilizando agujas Icogamma est?riles de 23 G de 0.6 x 25 mm y 25 G de 0.5 x 16 mm de Novico M?dica (Barcelona, Espa?a), tubos capilares Microvette? CB con EDTA dic?lcico de Sarstedt (N?mbrecht, Alemania), con capacidad de 300 ?L. Tambi?n, se emple? una centrifuga MicroSpin 12P? de Dupont Sorvall Instruments (Wilmington, CA, USA) operada a 4?C y equipada con un rotor con capacidad m?xima de 12 tubos de 1.5/2.0 mL, de 5.1 cm de radio, con velocidad m?xima (13,100g ? 15,000 rpm), micropipetas Eppendorf (Hamburg, Germany) para dispensar las muestras de plasma y tubos Eppendorf de 0.5 mL. 174 Para determinar ?cido ?rico se utiliz? el kit de BioSystems (Barcelona, Espa?a), tubos Eppendorf de 1.5 mL, pipeta Eppendorf de 1 mL, dos pipetas Eppendorf multicanal graduadas, placas de 96 pocillos de LabClinics NUNC (Barcelona, Espa?a) y un espectrofot?metro de placa SpectraMax M5 de Molecular Devices (Sunnyvale, CA, USA) en modo de absorbancia. Para las determinaciones del perfil lip?dico de ?cidos grasos (AGs) en plasma y en la membrana de los eritrocitos por cromatograf?a de gases (GC), se utilizaron cartuchos de extracci?n de fase s?lida de aminopropil (500 mg de NH2) de Biotage (Hertford, Reino Unido), ba?o con agitaci?n orbital de Certomat WR de Braun- Biotech (Alcobendas, Madrid, Espa?a) operado a 50?C, un cromat?grafo de gases Clarus 500 de Perkin Elmer (Beaconsfield, Reino Unido) equipado con un inyector en modo split/splitless y un detector de ionizaci?n de llama. La separaci?n de los ?steres met?licos de ?cidos grasos (EMAG) se realiz? en una columna capilar SP- 2330 de s?lice fundida (30 m x 0.25 mm de di?metro), con un tama?o de part?cula de 0.20 ?m de Supelco Inc., (Bellefonte, PA, USA), micropipetas Eppendorf (Hamburg, Germany) para dispensar las muestras y tubos Eppendorf de 1.5 mL. Para las determinaciones de triglic?ridos (TG), colesterol total, colesterol de lipoprote?nas de baja densidad (LDL-c), colesterol de lipoprote?nas de alta densidad (HDL-c) y hemoglobina glicosilada (HbA1c) se utilizaron kits de Spinreact (Girona, Barcelona, Espa?a) y se determinaron en un autoanalizador Cobas Mira (Basilea, Suiza) a una longitud de onda seg?n las especificaciones del proveedor. Las determinaciones de las lipoprote?nas de baja densidad oxidada (LDL-ox), prote?na C reactiva (PCR), mol?culas de adhesi?n celular vascular-1 (VCAM-1), mol?cula de adhesi?n intracelular-1 (ICAM-1) e inhibidor del activador del plasmin?geno-1 (PAI-1) se determinaron mediante kits Elisa de Cusabio Biotech Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, China) y un autoanalizador Biotek Power Wave XS2 (Rengstorff, CA, USA). Se utilizaron dos pipetas Eppendorf multicanal graduadas, un generador de ultrasonidos 3001208 de J.P. Selecta, S. A. (Barcelona, Espa?a) y un agitador de placas Titramax-101 de Heidolph (Schwabach, Alemania). Para determinar los niveles de insulina por ELISA se utilizaron kits con n?mero de cat?logo EZRMI-13K de Millipore Corporation (Billerica, MA, USA) y para determinar los niveles de glucag?n, leptina y grelina por MilliPlex MAP se utilizaron kits con n?mero de cat?logo RMHMAG-84K de Millipore Corporation (Billerica, MA, USA). Se utilizaron dos pipetas Eppendorf multicanal, un generador de ultrasonidos 3001208 de J.P. Selecta, S. A., un agitador de placas Titramax-101 de Heidolph, un espectrofot?metro de placa SpectraMax M5 de Molecular Devices para las medidas de insulina, y para las determinaciones de glucag?n, leptina, p?ptido C y 175 grelina un espectrofluor?metro de placas Magpix? de Luminex xMAP (Austin, TX, USA). Se utiliz? un software MilliPlex analyst versi?n 5.1 de Vigenetech Inc (Carlisle, PA, USA) para el an?lisis de los datos del Luminex. Para la determinaci?n de glucosa y en la prueba de tolerancia a la glucosa, se emple? un gluc?metro Ascensia Elite? de Bayer (Basilea, Suiza) y tiras reactivas desechables Ascensia Elite de Bayer. Se utilizaron c?nulas IMS 18 G 50 mm de Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA), adem?s de Jeringas ICO+3 de 1 mL y 3 mL de Novico M?dica (Barcelona, Espa?a) para las administraciones orales en la prueba de tolerancia a la glucosa, para la administraci?n de los diferentes aceites en el Estudio 1 y para la administraci?n de los diferentes inhibidores de disacaridasas in vivo del estudio 3. Para determinar los niveles de creatinina se utilizaron kits de Cromatest de Linear Chemicals (Barcelona, Espa?a), tubos Eppendorf de 1.5 mL, pipeta Eppendorf de 1 mL, dos micropipetas Eppendorf multicanal, placas de 96 pocillos de LabClinics NUNC (Barcelona, Espa?a) y un espectrofot?metro de placa SpectraMax M5 de Molecular Devices en modo cin?tico. Para la preparaci?n de muetras destinadas a la determinaci?n de isoprostanos se utiliz? un ba?o Certomat WR de Braun-Biotech a 37?C, un pH metro Basic 20 de Crison (Alella, Barcelona, Espa?a), micropipetas Eppendorf, tubos Eppendorf de 2 mL, matraces aforados de 1 mL, un vortex Genius 3de IKA? (Staufen, Alemania), una centrifuga 5424 de Eppendorf (Hamburg, Alemania), equipada con un rotor con capacidad m?xima de 24 tubos de 1.5/2.0 mL, de 6.3 cm de radio, con velocidad m?xima (20,238g ? 14,680 rpm), c?mara de extracci?n de fase s?lida Visiprep? Supelco-57044 de Sigma-Aldrich (Bellefonte, PA, USA) cartuchos de extracci?n de fase s?lida de C18 (500 mg de C18) y cartuchos de extracci?n de fase s?lida de gel de s?lice (500 mg de s?lice) de Waters Corporation (Milford, MA, USA), placas de cromatograf?a de capa fina de gel de s?lice de LK6D 60 ? de Whatman International Ltd (Maidstone, Inglaterra), viales insertos de 250 ?L, viales ?mbar de 1 mL con septum y tapa rosca de Agilent (Santa Clara, CA, USA). La determinaci?n de isoprostanos por cromatograf?a de gases con ionizaci?n qu?mica negativa acoplado a espectrometr?a de masas (GC?NCI?MS) se hizo en un cromatografo de gases QP201 de Shimadzu (Tokio, Jap?n) en modo de ionizaci?n qu?mica negativa (NCI), equipado con una columna capilar de s?lice fundida (DB1701, 15 m x 0.25 mm de di?metro interno) con un tama?o de part?cula de 0.25 ?m de Agilent J & W Scientific (Folsom, CA, USA). Se utiliz? el software XcaliburTM de Thermo Scientific, para el procesamiento de los datos. Para la determinaci?n de isoprostanos por cromatograf?a l?quida de alta eficiencia acoplada a espectrometr?a de masas en 176 t?ndem con ionizaci?n por electroespray (HPLC?ESI?MS/MS) se utiliz? un aparato de cromatograf?a l?quida de alta eficacia de Agilent (Waldbronn, Germany) con automuestreador Agilent 1100, una columna Luna C18 (50 x 2.0 mm d.i.; 3.0 ?m part?culas) de Phenomenex (Torrance, CA, USA) y una precolumna C18 (4 x 2.0 mm d.i.; 3.0 ?m part?cula) de Phenomenex, todo esto acoplado a un espectr?metro de masas API 3000 triple quadrupolo de Applied Biosystems (Foster City, CA, USA). Se utiliz? el software Analyst versi?n 1.4.2 de Applied Biosystems, para el procesamiento de los datos. Para la preparaci?n de muestras destinadas al estudio de biodisponibilidad de polifenoles se utiliz? una liofilizadora Alpha 1-2 LDPus de Christ? para liofilizar la orina y el sobrenadante de las heces reconstituidas en agua, micro pipetas graduadas Eppendorf, tubos Falcon de 15 mL, matraces aforados de 1 mL, un vortex Genius 3 de IKA?, una centrifuga 5810R de Eppendorf, operada a 4?C y equipada con un rotor con capacidad m?xima de 6 tubos de 50 mL con adaptadores para Falcon de 15 mL, de 8.5 cm de radio, con velocidad m?xima (20,130g ? 12,000 rpm), c?mara de extracci?n de fase s?lida Visiprep? Supelco-57044 de Sigma-Aldrich, cartuchos Oasis HLB sorbente (60 mg de fase reversa polim?rica universal) de Waters Corporation, filtro de politetrafluoroetileno (PTFE) de 0.45 mm membrana de Waters Corporation, tubos Eppendorf de 1.5 mL, viales insertos de 250 ?L, viales ?mbar de 1 mL con septum y tapa rosca de Agilent. Para la determinaci?n de los metabolitos microbianos y conjugados de polifenoles por HPLC?ESI?MS/MS se utiliz? el mismo equipo y software empleados para la determinaci?n de isoprostanos por HPLC?ESI?MS/MS. Se utiliz? una columna Luna C18 nueva (50 x 2.0 mm d.i.; 3.0 ?m part?culas) de Phenomenex y una precolumna nueva C18 (4 x 2.0 mm d.i.; 3.0 ?m part?cula) de Phenomenex, todo esto acoplado al espectr?metro de masas API 3000 triple quadrupolo de Applied Biosystems. Para la determinaci?n de la hemoglobina se utilizaron kits de Qu?mica Cl?nica Aplicada con referencia QCA-994933 (Amposta, Tarragona, Espa?a) y un espectrofot?metro Lambda 25 de Perkin Elmer (Waltham, MA, USA). Para determinar el hematocrito se utiliz? tubos capilares de vidrio con referencia 9100270 de Hirschmann Laborger?te (Eberstadt, Alemania) y una microcentr?fuga MPW-55 para capilares de MPW Med. Instruments (Varsovia, Polonia), equipada con un rotor con capacidad m?xima de 24 capilares de 50 mm, de 6.2 cm de radio, con velocidad m?xima (13,586g ? 14,000 rpm). Para determinar la actividad antioxidante enzim?tica se utiliz? un espectrofot?metro Lambda 25 de Perkin Elmer (Waltham, MA, USA), un autoanalizador Cobas Mira, un espectr?metro de emisi?n de Perkin Elmer LS50B (Waltham, MA, USA), cubetas de metacrilato semimicro de 1.5 mL 177 para longitudes de onda entre 275 nm y 700 nm de Util-Plas, S.A., (Polinya, Barcelona, Espa?a), micropipetas de vol?menes variado para dispensar reactivos y muestras, y tubos Eppendorf de 1.5 mL. Para la determinaci?n de la actividad de la sacarasa en homogeneizados y sacos de intestino revertidos, se utiliz? jeringas est?riles de B-Braun Injekt? de 5 mL de polipropileno, portaobjetos, ultra-Turrax T10 b?sico de IKA (Staufen, Alemania), incubador mini-sheker de VWR International (Matsonford, PA, USA), tubos de ensayo de 10 mL de polipropileno de VWR International Eurolab S.L. (Barcelona, Espa?a), placas de 96 pocillos de LabClinics NUNC (Barcelona, Espa?a), material quir?rgico (pinzas, tijeras, bistur?), placas de Petri de 55 mm x 14,2 mm de VWR International Eurolab S.L., (Barcelona, Espa?a), hilo de lino N? 10 (Harlander, Alemania), cubetas de metacrilato semi-micro de 1.5 mL para longitudes de onda entre 275 nm y 700 nm de Util-Plas, S.A. (Polinya, Barcelona, Espa?a), micropipetas de vol?menes variado para dispensar reactivos y muestras, tubos Eppendorf de 1.5 mL y lector de placa SpectraMax M5. Para la determinaci?n de la aglutinaci?n bacteriana y la evaluaci?n de la adhesi?n bacteriana a la mucosa intestinal se utilizaron diferentes cepas bacterianas de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Aut?noma de Barcelona medio de cultivo Luria (Luria Bertani, LB) en polvo de Scharlau (Barcelona, Espa?a), placas de agar Luria de Liofilchem? (Roseto degli Abruzzi, Italia), placas multipocillos de Nuncw; Nunc A/S, (Roskilde, Dinamarca), incubador mini-sheker de VWR International, micropipetas Eppendorf de diferentes graduaciones y un microscopio ?ptico de Olympus? (Mannheim, Alemania). Finalmente todas las muestras orina, heces, plasma, ?rganos y tejidos de los estudios realizados, se conservaron a ?80?C en un congelador marca Nuaire? (Plymouth, MN, USA), hasta el momento del an?lisis. 178 5.1.2. Reactivos Las mezclas de aceites con diferente proporci?n de EPA/DHA fueron obtenidas a partir de aceites de pescado comerciales de Afampes 121 EPA (Vigo, Espa?a); EnerZona Omega 3 RX (Mil?n, Italia) y Oligen liquid DHA 80 % de Ifigen-equip 98 S-L. (Barcelona, Espa?a). El aceite de soja org?nica sin refinar (primera presi?n en fr?o), fue obtenido de Clearspring Ltd. (Londres, Reino Unido); D-fagomina de BioGlane (Barcelona, Espa?a); gelatina porcina tipo A 240/260 de Junc? (Girona, Barcelona, Espa?a); lecitina de soja Topcithin 50 de Cargill (Barcelona, Espa?a); dieta est?ndar A04 de PanLab (Barcelona, Espa?a); metanol (MeOH) (grado anal?tico), etanol (EtOH) (grado anal?tico), ?cido clorh?drico (HCl) (?85%), Na2HPO4, NaH2PO4 2H2O, NaCl, KH2PO4, K2HPO4, NaOH, y ?cido tricloroac?tico (TCA) de Panreac (Castellar del Vall?s, Barcelona, Espa?a); sacarosa, diclorometano (CH2Cl2), bromuro de pentafluorobencilo (PFBB), N,N- diisopropiletilamina (DIPE), sulfato de sodio anhidro (Na2SO4), ?-glucuronidasa (90 U/ ?L), peroxidasa Tipo II de r?bano, sacarosa, D-manosa, dihidrato de floridzina, reactivo de Bradford, epinefrina, ?-nicotinamida adenina dinucle?tido 2?-fosfato reducido (NADPH), glutati?n reductasa a partir de levadura de panader?a (G- reductasa), L-glutati?n reducido 99% (GSH), alb?mina, tert-butil hidroperoxido (t- BuOOH), L-glutati?n oxidado (GSSG), N-etilmaleimida (NEM) y 4-aminoantipirina de Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA); ?ter et?lico, n-hexano, acetato de etilo (AcOEt) y cloroformo (estabilizado con 0,6-1,0% de etanol) de Merck KGaA (Darmstadt, Alemania); ?cido ac?tico, ?cido sulf?rico, 2-propanol y tolueno de VWR International (Fountenai Sous Bois, Francia); ?cido fosfomol?bdico de Sigma- Aldrich Laborchemikalien GmbH (Seelze, Alemania); N,O-bis-(trimetilsilil)- trifluoro-acetamida (BSTFA) con 1% de trimetil-clorosilano (TMCS) y mezcla de patrones comerciales ya esterificados a EMAG de Supelco Inc. (Bellefonte, PA, USA); [2H4]-15-F2t-IsoP, 15-F2t-IsoP, 5-F2t-IsoP, 5-F2c-IsoP, 8-F2t-IsoP, 15-F3t-IsoP, 2,3-dinor-15-F2t-IsoP y metil ester de 15-F2t-isoP de Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA) y fueron utilizados como patrones sin purificaci?n previa. Otros disolventes y reactivos fueron: 1-deoxinojirimicina (DNJ) de Carbosynth Limited (Compton, Berkshire, Reino Unido); miglitol de Medicina Zhejiang Company Limited Xinchang Pharma (Chengguan Town, China); acarbosa de Serva Electroforesis GmbH (Heidelberg, Alemania); almid?n de ma?z C-TEX 06 201 (Cargill-Cerestar, Martorell, Espa?a); ?cido 4-hidroxibenzoico y glucosa oxidasa tipo II-S de Aspergillus niger de Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemania); Tris(hidroximetil)aminometano de Tris Roche Diagnostics (Meinheim, Alemania); metanol (MeOH), heptano, acetonitrilo (ACN) (todos de calidad HPLC), ?cido 179 f?rmico (AF) (calidad anal?tica), Na2CO3, NaHCO3, ?cido etitendiaminotetraac?tico (EDTA), H2O2 al 17 % y o-ftalaldeh?do (OPT) de Merck (Darmstadt, Alemania); ?cido nonadecanoico de Larodan Fine Chemicals (Malm?, Suecia); Grajfnol? polvo fino marr?n rojo obtenido a partir de semillas de uva por extracci?n con etanol/agua como disolvente, fue proporcionado por JF-Natural Producto (Tianjin, China) y la composici?n porcentual de Grajfnol? seg?n el fabricante fue la siguiente: proantocianidinas (UV, ?95 %), proantocianidinas oligom?ricas (?60 %), proantocianidinas B2 (HPLC) (?1.8 %), ceniza (?1.5 %), humedad (?5.0 %), metales pesados (?10 mg/kg), ars?nico (?0.3 mg/kg) y plomo (?0.1 mg/kg). (?)- epicatequina (EC) (?98 %), (?)-epigalocatequina (EGC) (?95 %), ?cido 3- hidroxifenilac?tico (?99%), ?cido 4-hidroxifenilac?tico (?98 %), ?cido 3,4- dihidroxifenil ac?tico (?98 %), ?cido 3-hidroxibenzoico (?99 %), ?cido 4- hidroxibenzoico (?99 %), ?cido homovan?lico (?98 %), ?cido van?lico (?97 %), ?cido cafeico (?98 %), ?cido 3,4-dihidroxifenilpropi?nico (?98 %), ?cido 4- hidroxifenilpropi?nico (?98 %), ?cido 3,4-dihidroxibenzoico (?97 %), ?cido benzoico (?99 %), ?cido hip?rico (?98 %), ?cido fer?lico (?99 %), ?cido isoferulico (?97 %), ?cido p-cum?rico (?98 %), ?cido m-cum?rico (?98 %), ?cido g?lico (?97 %), enterodiol (?95 %), ?cido fenilac?tico (?99 %) y taxifolina (?85 %) se obtuvieron de Sigma Chemical (St. Louis, MO, USA). Vaselina 100% pura se obtuvo de Cus? (Barcelona, Espa?a), ketamina Imalgene 1000 de Material de Laboratorios, S.A., (Barcelona, Espa?a), xilacina Rompun 2% de Qu?mica Farmac?utica, S.A., (Barcelona, Espa?a). El agua empleada en los an?lisis de muestras de los diferentes estudios, se obtuvo usando un purificador de agua sistema Milli-Q de Millipore Corporation (Billerica, MA, USA). 5.1.3. M?todos 5.1.3.1. Manipulaci?n, estabulaci?n y sacrificio de los animales La manipulaci?n, estabulaci?n y el sacrificio de los animales empleados, se realizaron de acuerdo con las directrices de la Uni?n Europea para el cuidado y manejo de animales de laboratorio y el permiso pertinente se obtuvo de la Subcomisi?n de Asuntos Bio?ticos del CSIC (ref. AGL2009-12 374-C03-03). Una vez que llegaron los animales al estabulario, fueron distribuidos en grupos de dos o tres animales por jaula, y alojados en jaulas Makrolon de (265 x 425 mm) x 180 mm de alto, con rejas de acero inoxidable, bajo condiciones ambientales de temperatura 22 ? 2?C, humedad relativa de 50 ? 10% y con un r?gimen de 12 h de luz (08:00 a 20:00 h) y 12 h de oscuridad. En las jaulas se coloc? viruta de madera 180 esterilizada por autoclave. Diariamente se control? el agua y el pienso, y cada dos d?as se procedi? al cambio de la viruta y la limpieza de las jaulas. Los animales dispusieron en todo momento de agua y pienso ?ad libitum?, y el tipo de dieta suministrada dependi? del estudio a realizar, y cuando no se especifique la dieta en los estudios, se entender? que la dieta suministrada fue la A04 de PanLab (Barcelona, Espa?a). Los animales se aclimataron 8 d?as antes de iniciar cualquier estudio, y la dieta suministrada durante este per?odo en todos los estudios fue la A04. Todas las manipulaciones, se llevaron a cabo por la ma?ana para minimizar los efectos de los ritmos circadianos y se mantuvieron las ratas hembras de los estudios en una habitaci?n sin ratas machos para minimizar la influencia de las alteraciones hormonales. Al final de cada estudio, las ratas se mantuvieron en ayunas durante 18 h y se anestesiaron mediante inyecci?n intraperitoneal de 80 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilacina. El sacrificio se realiz? mediante exsanguinaci?n por punci?n a?rtica. Esta t?cnica permite la obtenci?n del mayor volumen de sangre. La extracci?n se efectu? con jeringuillas de 5 mL impregnadas de heparina o EDTA (1%) seg?n el tipo de muestra, para evitar la coagulaci?n sangu?nea. Se extrajo tambi?n, diferentes ?rganos y tejidos y se almacenaron a ?80?C hasta su an?lisis. 5.1.3.2. Obtenci?n, procesamiento y conservaci?n de las muestras durante los estudios ? Colecta de muestras de plasma. Para la obtenci?n de plasma, se extrajo sangre de la vena safena en ayunas, utilizando agujas Icogamma est?riles de 23G y se recogi? por capilaridad en tubos Microvette? con EDTA entre dos a tres capilares de sangre de 300 ?L por rata. Las muestras de sangre se centrifugaron durante 15 min a 850g y a una temperatura de 4?C. El plasma se colect? con micropipeta y se deposit? en tubos Eppendorf de 0.5 mL, seg?n la cantidad requerida para cada ensayo. Finalmente, las muestras de plasma se conservaron a ?80?C, hasta el momento del an?lisis. La frecuencia con la que se obtuvieron las muestras se indica en cada protocolo de estudio. ? Colecta de muestras de orina y heces. Para tal fin, las ratas se colocaron en jaulas metab?licas de PanLab (Barcelona, Espa?a) y se privaron de alimento durante 18 h o 24 h, seg?n el experimento a realizar. Las muestras de orina se colectaron en tubos Eppendorf de 1.5 mL, 2 mL, o en tubos Falcon de 15 mL, seg?n el an?lisis a realizar, y las heces se colectaron en criotubos de 2 mL de Greiner Bio-one (Frickenhausen, Alemania) o en tubos Falcon de 15 mL. Se congelaron con nitr?geno l?quido y se mantuvieron a ?80?C hasta su an?lisis. 181 5.1.3.3. Obtenci?n, procesamiento y conservaci?n de las muestras al final los estudios (sacrificio) ? Colecta de muestras de sangre, eritrocitos, plasma y suero. Se realizaron en varios pasos de acuerdo con el tipo de muestras a extraer, las muestras de sangre de todos los animales se recogieron en diferentes tubos: tubos de EDTA, de suero y de heparina-litio de BD Vacutainer? (Plymouth, Reino Unido). Antes de separar los eritrocitos, se recogieron dos al?cuotas de sangre, una del tubo de EDTA para determinar HbA1c y otra del tubo de heparina-litio para determinar la hemoglobina y el hematocrito. Los eritrocitos se separaron del plasma centrifugando durante 15 min a 850g y a 4?C. Despu?s de la centrifugaci?n se observaron tres capas en el tubo: plasma, leucocitos (fina capa intermedia) y eritrocitos. Se separaron las capas sin aspirar los leucocitos. Los eritrocitos se lavaron con suero fisiol?gico, precipit?ndolos mediante centrifugaciones de 5 min a 1,300g a de 4?C, se colocaron en tubos Eppendorf de 1.5 mL, para los an?lisis del perfil lip?dico de ?cidos grasos en la membrana de los eritrocitos y para la determinaci?n de las enzimas antioxidantes superoxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT), glutati?n peroxidasa (Gpx) y glutati?n reductasa (GR). Para la conservaci?n de las muestras que se utilizaron para determinar la SOD se requiri? la realizaci?n de un procesamiento especial: los eritrocitos se congelaron a ?20?C y descongelaron. Se deposit? agua destilada fr?a para su lisis. Se a?adi? una mezcla de EtOH/CHCl3 (6.25:3.75) para la extracci?n de la hemoglobina. Posteriormente, las muestras se centrifugaron 5 min a 1,900g a de 4?C. La SOD se encontr? contenida en el sobrenadante y esta fase se guard? a ?20?C. Para la conservaci?n de las muestras para determinar CAT, Gpx y GR se realiz? un proceso distinto: se realiz? una diluci?n 1:10 de eritrocitos con agua destilada, para obtener el hemolizado correspondiente. Se conserv? todo a ?20?C. El plasma obtenido se separ? en al?cuotas y se congel? a ?20?C para las determinaciones de LDL-ox, PCR, VCAM-1, ICAM-1, PAI-1, perfil lip?dico de ?cidos grasos en plasma, ?cidos grasos totales en plasma. Durante todo el proceso las muestras permanecieron en hielo. Para la obtenci?n del suero se centrifugo la sangre durante 15 min a 850g a temperatura ambiente. Se separaron al?cuotas que se conservaron a ?20?C. Para las determinaciones de LDL-c y HDL-c. ? Colecta de muestras de ?rganos y tejidos. Se realizaron extracciones de ?rganos (h?gado, ri??n, coraz?n, aorta, cerebro, intestino delgado, tejido 182 adiposo y tejido muscular) de todos los animales de los diferentes estudios. Se pes? el h?gado y tejido adiposo abdominal. Para el estudio histopatol?gico se almacen? una parte del tejido adiposo, h?gado, aorta, cerebro y ri??n, previamente lavados con suero fisiol?gico, en formaldeh?do al 10 % a pH 7.4; estos estudios no se incluyen en esta memoria. El resto se coloc? en doble bolsas con autocierre zip de 4 x 6.7 cm, se congelaron con nitr?geno l?quido y se almacenaron a ?80?C, hasta el momento del an?lisis. Para el an?lisis de los par?metros relacionados con el sistema antioxidante end?geno, parte de los tejidos se descongelaron y se homogeneizaron con 200 mM de tamp?n fosfato a pH 6.25 a las siguientes diluciones: h?gado 1:20; ri??n 1:5 y tejido adiposo 1:2. Las fracciones solubles de estos ?rganos se obtuvieron despu?s de ser centrifugados a 129,000g durante 1 h a 4?C en una ultracentrifugaci?n Centrikon T-1045 de Kontron Instruments y fueron congelados a ?20?C hasta su uso. 5.1.3.4. Determinaciones 5.1.3.4.1. Peso corporal Se determin? el peso corporal de todos los animales empleados en los diferentes estudios, de acuerdo a la frecuencia como se indica en el protocolo de cada estudio. 5.1.3.4.2. Presi?n sist?lica (PS) y presi?n diast?lica (PD) Para las medidas de PS y PD se utiliz? el m?todo del manguito en la cola, m?todo que permite determinar la presi?n en ratas no anestesiadas,[444] las determinaciones se realizaron con la frecuencia que se indica en cada estudio. Las medidas de PS y PD se realizaron entre las 10:00 h y las 15:00 h, en un ambiente lo m?s calmado posible. Se calent? el cuerpo y la cola de cada animal coloc?ndolos en un c?mara de metacrilato seg?n su tama?o, durante 20 min a una temperatura aproximada de 30-32?C y debido a que la cola quedaba fuera del calentador, se coloc? la cola bajo una l?mpara de infrarrojo durante 5-8 min, de esta manera se dilat? la vena caudal donde se midi? la presi?n. Luego, se coloc? el manguito y el transductor en la cola a una distancia de 3-4 cm de la base de la cola para evitar que los excrementos entraran en contacto con la goma del manguito. Despu?s de una serie de sesiones de entrenamiento de algunos d?as, se procedi? con las determinaciones de PS y PD y se calcularon los valores promedios de las presiones de las tres mejores medidas, expresadas en mmHg. 183 5.1.3.4.3. ?cido ?rico El ?cido ?rico presente en las muestras se midi? siguiendo el m?todo descrito en la literatura.[445] a) Ensayo Se diluyeron las muestras de orina 1:20 en agua Milli-Q. Se depositaron en tubos Eppendorf de 1.5 mL, 760 ?L de agua destilada + 40 ?L de orina. Se a?adieron a los tubos Eppendorf que conten?an el blanco, el patr?n, o la muestra, el reactivo de trabajo que conten?a (100 mM de tamp?n de fosfatos a pH 7.8, 4 mM de diclorofenolsulfonato, 0.12 U/mL < de uricasa, 5 U/mL < de ascorbato oxidasa, 1 U/mL < de peroxidasa, 0.5 mM de 4-aminoantipirina), en el siguiente orden: -En el blanco se mezclaron 25 ?L de agua Milli-Q y 1 mL del reactivo de trabajo. -En el patr?n se mezclaron 25 ?L de patr?n (6 mg/dL de ?cido ?rico) y 1 mL del reactivo de trabajo. -En las muestras se mezclaron 25 ?L de muestra y 1 mL del reactivo de trabajo. Todos los tubos Eppendorf se agitaron en vortex y se incubaron durante 10 min a temperatura ambiente (16-25?C). Se traspas? el blanco, el patr?n y las muestras de los tubos Eppendorf a la placa de 96 pocillos, se colocaron 300 ?L en cada pocillo. Se medi? la absorbancia (A) a 520 nm en un lector de placa SpectraMax M5. El color fue estable durante 30 min. b) C?lculos A todas las lecturas de patr?n y muestras se rest? el promedio del blanco. La concentraci?n de ?cido ?rico en la muestra se expres? en mg/dL y se calcul? a partir de la siguiente f?rmula general: AMuestra APatr?n x CPatr?n x Factor de diluci?nMuestra = CMuestra 184 5.1.3.4.4. Perfil lip?dico de ?cidos grasos (AGs) en plasma y en la membrana de los eritrocitos por cromatograf?a de gases (GC) La cuantificaci?n del perfil lip?dico de los AGs por GC fue realizada por el grupo del IIM-CSIC en Vigo, participante en el proyecto AGL2009-12374-C03. El m?todo consisti? en la extracci?n de los l?pidos de las muestra con solventes apolares. Luego, los l?pidos extra?dos se sometieron a una extracci?n en fase s?lida en cartuchos de aminopropil para eliminar impurezas. Se realiz? una derivatizaci?n para la formaci?n de los EMAG mediante una trans-esterificaci?n con metanol y ?cido sulf?rico, y se precedi? al an?lisis por GC. a) Procedimiento de extracci?n de los AGs en plasma Se utiliz? la extracci?n de Bligh y Dyer de acuerdo al procedimiento descrito en la literatura.[446] Las muestras de plasma (10-30 ?L) se trataron con 750 ?L de CH2Cl2/MeOH (1:2 v/v), que conten?a 2 g/L de AF y se agitaron durante 1 min. Luego se a?adieron 500 ?L de CH2Cl2/H2O (1:1 v/v), se agitaron durante 1 min y se dejaron reposar hasta observar la separaci?n de las fases. Las fases acuosas resultante se extrajeron nuevamente con porciones de 2 mL de CH2Cl2 dos veces, todas las fases org?nicas se combinaron y se secaron bajo una corriente de nitr?geno. Las mezclas de l?pidos resultantes se sometieron a una extracci?n en fase s?lida (SPE) en columnas de 500 mg de aminopropil de vidrio. Las muestras de l?pidos se eluyeron de acuerdo a la metodolog?a de SPE descrita previamente.[447] Finalmente, todas las fases org?nicas se combinaron y se separaron en dos porciones. La primera porci?n se evapor? con corriente de nitr?geno, se pesaron para determinar la cantidad de AGs totales en plasma por diferencia de masa, los resultados se expresaron en mg/mL; a la segunda porci?n, se le a?adi? ?cido nonadecanoico como est?ndar interno y se sometieron a an?lisis por GC (ver m?s abajo). b) Procedimiento de extracci?n de los AGs en la membrana de los eritrocitos Las muestras de eritrocitos recogidas en tubos de polipropileno, unos d?as antes de su an?lisis se liofilizaron para la extracci?n de los l?pidos de la membrana de los eritrocitos. Las muestras de eritrocitos liofilizadas (0.05 g) se trataron seg?n el procedimiento descrito por Bligh y Dyer.[448] Se a?adieron 6 mL de CH2Cl2/MeOH (1:2 v/v) y se agitaron las mezclas durante 1 min. Luego se a?adieron 4 mL de CH2Cl2/H2O (1:1 v/v), se agitaron durante 1 min y se dejaron en reposo hasta observar las fases separadas. Las fases acuosas resultante se extrajeron nuevamente con porciones de 2 mL de CH2Cl2 dos veces.[449] Finalmente, todas las fases org?nicas se combinaron y la soluci?n resultante se separaron en dos porciones la 185 primera porci?n se evapor? con corriente de nitr?geno y se pes?, la segunda porci?n se proces? de la misma forma, se a?adi? ?cido nonadecanoico como est?ndar interno y se sometieron a an?lisis por GC (ver m?s abajo). c) An?lisis por GC del perfil lip?dico de los AGs en plasma y en la membrana de eritrocitos Los extractos de los l?pidos obtenidos a partir del plasma y de la membrana de los eritrocitos se trans-esterificaron con una soluci?n metan?lica de ?cido sulf?rico al 1% por incubaci?n a 50?C durante 18 h. La reacci?n de trans-esterificaci?n se par? cuando se a?adi? una soluci?n acuosa de NaCl al 5%. Luego los EMAG se extrajeron con tolueno.[450] Los EMAG se analizaron por GC en un cromat?grafo de gases Clarus 500 de Perkin Elmer equipado con un inyector en modo split/splitless y un detector de ionizaci?n de llama. La separaci?n de los EMAG se realiz? en una columna capilar SP-2330 de s?lice fundida (30 m x 0.25 mm de di?metro), con un tama?o de part?cula de 0.20 ?m de Supelco. La temperatura del horno se ajust? a 140?C y se aplic? un gradiente de temperatura hasta 205?C a 1?C/min. Las temperaturas del inyector y del detector se mantuvieron a 275?C y 260?C, respectivamente. El gas portador fue nitr?geno de alta pureza. d) C?lculos La cuantificaci?n e identificaci?n se realizaron mediante una mezcla de patrones comerciales ya esterificados a EMAG de Supelco, que conten?a 37 EMAG con diferentes puntos de ebullici?n y grados de insaturaci?n, que fueron de C4 a C24. Los resultados se expresaron para cada AG como mol %. 5.1.3.4.5. Relaci?n de actividad de las enzimas esteroil-CoA desaturasa-1 (SCD- 1), esteroil-CoA desaturasa-2 (SCD-2), delta cinco desaturasa (?5) y delta seis desaturasa (?6) Las actividades de desaturasas de ?cidos grasos se calcularon a partir del perfil lip?dico en plasma y en eritrocitos como la relaci?n producto/precursor de estearoil- coenzima A desaturasa, SCD-1 = [16:01 n-7/16:0]; SCD-2 = [18:01 n-9/18:0]; ?6- desaturasa = [20:03 n-6/18:2n-6]; ?5-desaturasa = [20:04 n-6/20: 3n-6]), seg?n el m?todo descrito previamente.[451] 186 5.1.3.4.6. Triglic?ridos La concentraci?n de los triglic?ridos (TG) se determin? siguiendo el procedimiento descrito en la literatura.[452] El an?lisis fue realizado en el grupo de la Facultad de Medicina de la Universidad Rovira i Virgili, Reus, participante en el proyecto AGL2009-12374-C03. a) Ensayo Se utilizaron las muestras sin diluir. Se pipetearon en tubos Eppendorf de 1.5 mL el blanco, patr?n, muestra, controles de calidad y reactivo de trabajo (2 mM de p-clorofenol, 45 mM de tamp?n pipes a pH 7.0, 5 mM de cloruro magn?sico, 150000 U/L de lipasa lipoproteica (LPL), 500 U/L de glicerol quinasa (GK), 2500 U/L de glicerol-3-oxidasa (GPO), 440 U/L de peroxidasa (POD), 0.1 mM de 4- aminophenazone (4-AF) y 0.1 mM de ATP), en el siguiente orden: -En el blanco se mezclaron 10 ?L de agua Milli-Q y 1 mL del reactivo de trabajo. -En el patr?n se mezclaron 10 ?L del patr?n (200 mg/dL de TG) y 1 mL del reactivo de trabajo. -En las muestras se mezclaron 10 ?L de muestra y 1 mL del reactivo de trabajo. -En los controles de calidad se mezclaron 10 ?L de muestra y 1 mL del reactivo de trabajo. Todos los tubos Eppendorf se agitaron en vortex y se incubaron durante 10 min a temperatura ambiente (16-25?C). Se midi? la absorbancia (A) del patr?n, los controles y las muestras a 500 nm frente al blanco en un autoanalizador Cobas Mira. El color fue estable durante 30 min. b) C?lculos A todas las lecturas del patr?n y muestras se rest? el promedio del blanco. La concentraci?n de TG en la muestra se expres? en mg/dL y se calcul? a partir de la siguiente f?rmula general: AMuestra APatr?n x CPatr?n = CMuestra 187 5.1.3.4.7. Colesterol total La concentraci?n de colesterol presente en la muestra se determin? siguiendo el procedimiento descrito en la literatura.[453]. El an?lisis fue realizado en el grupo de la Facultad de Medicina de la Universidad Rovira i Virgili, Reus. a) Ensayo Las muestras se utilizaron sin diluir. Se pipetearon en tubos Eppendorf de 1.5 mL el blanco, patr?n, controles de calidad, muestras y reactivo de trabajo (90 mM de tamp?n pipes a pH 6.9, 26 mM de fenol, 300 U/mL de colesterol oxidasa, 650 U/mL de peroxidasa (POD), 0.4 mM de 4-aminofenazona), en el siguiente orden: -En el blanco se mezclaron 10 ?L de agua Milli-Q y 1 mL del reactivo de trabajo. -En el patr?n se mezclaron 10 ?L del patr?n (200 mg/dL de colesterol) y 1 mL del reactivo de trabajo. -En las muestras se mezclaron 10 ?L de muestra y 1 mL del reactivo de trabajo. -En los controles de calidad se mezclaron 10 ?L de muestra y 1 mL del reactivo de trabajo. Todos los tubos Eppendorf se agitaron en el vortex y se incubaron durante 10 min a temperatura ambiente (16-25?C). Se midi? la absorbancia (A) del patr?n, los controles y las muestras a 500 nm frente al blanco en un autoanalizador Cobas Mira. El color fue estable durante 30 min. b) C?lculos A todas las lecturas de patr?n, controles de calidad y muestras se rest? el promedio del blanco. La concentraci?n de colesterol en las muestras se expres? en mg/dL y se calcul? a partir de la siguiente f?rmula general: AMuestra APatr?n x CPatr?n = CMuestra 5.1.3.4.8. Colesterol de lipoprote?nas de baja densidad (LDL-c) La concentraci?n de LDL-c se midi? seg?n el procedimiento descrito en la literatura.[336, 454, 455] El an?lisis fue realizado en el grupo de la Facultad de Medicina de la Universidad Rovira i Virgili, Reus. a) Ensayo Las muestras se utilizaron sin diluir. Se pipetearon en tubos Eppendorf de 1.5 mL el blanco, patr?n, controles de calidad, muestras y reactivo A (50 mM de tamp?n 188 pipes a pH 7.0, 600 U/L ? de colesterol esterasa (CHE), 500 U/L ? de colesterol oxidasa (CHOD), 600 KU/L ? de catalasa, 2 mM de N-etil-N-(2-hidroxi-3- sulfopropil)-3-metilanilina (TOOS) y detergente), en el siguiente orden: -En el blanco se mezclaron 4 ?L de agua Milli-Q y 300 ?L del reactivo A. -En el patr?n se mezclaron 4 ?L del patr?n (200 mg/dL de LDL-c) y 300 ?L del reactivo A. -En las muestras se mezclaron 4 ?L de muestra y 300 ?L del reactivo A. -En los controles de calidad se mezclaron 4 ?L de muestra y 300 ?L del reactivo A. Todos los tubos Eppendorf se agitaron en el vortex y se incubaron durante 5 min a 37?C. Se a?adieron 100 ?L del reactivo B (50 mM de tamp?n pipes a pH 7.0, 4 mM de 4-Aminoantipirina (4-AA), 4 KU/L ? de peroxidasa (POD), y detergente) al blanco, patr?n, muestra y controles de calidad, respectivamente. Nuevamente, todos los tubos Eppendorf se agitaron en el vortex y se incubaron durante 5 min a 37?C. Se midi? la absorbancia (A) del patr?n, los controles y las muestras a 600 nm frente al blanco en un autoanalizador Cobas Mira. b) C?lculos A todas las lecturas de patr?n, controles de calidad y muestras se rest? el promedio del blanco. La concentraci?n de LDL-c en las muestras se expres? en mg/dL y se calcul? a partir de la siguiente f?rmula general: AMuestra APatr?n x CPatr?n = CMuestra 5.1.3.4.9. Lipoprote?nas de baja densidad oxidada (LDL-ox) La determinaci?n de la concentraci?n del LDL-ox sigue el fundamento de los ensayos de ELISAs competitivos, donde existe competencia entre el ant?geno biotinilado y el no biotinilado por un n?mero fijo de sitios de uni?n. Todo el an?lisis se realiz? de acuerdo a las especificaciones del proveedor. El an?lisis fue realizado en el grupo de la Facultad de Medicina de la Universidad Rovira i Virgili, Reus. a) Ensayo En esta determinaci?n se utiliz? el kit Elisa de Cusabio Biotech, que conten?a una placa de 96 pocillos recubiertos con un anticuerpo primario espec?fico para detectar LDL-ox de rata. Se depositaron en los pocillos de la placa los est?ndares y las muestras de plasma junto con un anticuerpo espec?fico para LDL-ox de rata 189 conjugado con biotina. Despu?s se a?adi? a cada pocillo la enzima avidina-HRP y se incub? la placa a una temperatura de 37?C. Tras la incubaci?n se a?adi? una soluci?n de sustrato de TMB. De esta manera s?lo las muestras que conten?an LDL-ox, mostraron un cambio de color. La reacci?n enzima-sustrato finaliz? con la adici?n de una soluci?n de ?cido sulf?rico y el cambio de color se midi? por espectrofotometr?a a una longitud de onda de 450 nm en un lector de placas Biotek Power Wave XS2. b) C?lculos A todas las lecturas de patr?n, controles de calidad y muestras se rest? el promedio del blanco. La concentraci?n de LDL-ox se determin? comparando la densidad ?ptica de las muestras con la curva est?ndar. Los resultados se expresaron en ng/mL. 5.1.3.4.10. Colesterol de lipoprote?nas de alta densidad (HDL-c) La concentraci?n de HDL-c se midi? seg?n el procedimiento descrito en la literatura.[456, 457] El an?lisis fue realizado en el grupo de la Facultad de Medicina de la Universidad Rovira i Virgili, Reus. a) Ensayo Las muestras se utilizaron sin diluir. Se pipetearon en tubos Eppendorf de 1.5 mL; el blanco, patr?n, controles de calidad, muestras y reactivo A (100 mM de ?cido N,N-bis (2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfonico, 0.7 mM de N-(2-hidroxi-3- sulfopropil)-3,5-dimetoxianilina (HDAOS), 800 U/L ? de colesterol esterasa (CHE), 500U/L ? de colesterol oxidasa (CHOD), 3000 U/L ? de asc?rbico oxidasa y detergente a pH 6.6), en el siguiente orden: -En el blanco se mezclaron 3 ?L de agua Milli-Q y 300 ?L del reactivo de trabajo. -En el patr?n se mezclaron 3 ?L del patr?n (15 mg/dL de HDL-c) y 300 ?L del reactivo A. -En las muestras se mezclaron 3 ?L de muestra y 300 ?L del reactivo A. -En los controles de calidad se mezclaron 3 ?L de muestra y 300 ?L del reactivo A. Todos los tubos Eppendorf se agitaron en el vortex y se incubaron durante 5 min a 37?C. Se midi? la absorbancia (A1) del patr?n, los controles y las muestras a 600 nm frente al blanco en un autoanalizador Cobas Mira. Se a?adieron 100 ?L del reactivo B (100 mM de ?cido N,N-bis (2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfonico, 4 mM de 4?aminoantipirina, 3500 U/L ? de peroxidasa (POD) y detergente a pH 7.0) al 190 blanco, patr?n, muestra y controles de calidad, respectivamente. Nuevamente, todos los tubos Eppendorf se agitaron en vortex y se incubaron durante 5 min a 37?C. Se midi? la absorbancia (A2) del patr?n, los controles y las muestras a 600 nm frente al blanco en un autoanalizador Cobas Mira. b) C?lculos A todas las lecturas de patr?n, controles de calidad y muestras se rest? el promedio del blanco. Se calcul? la ?A = A2?A1. La concentraci?n del HDL-c en la muestra, se expres? en mg/dL y se calcul? a partir de la siguiente f?rmula general: AMuestra APatr?n x CPatr?n = CMuestra 5.1.3.4.11. Hemoglobina glicosilada (HbA1c) Se utiliz? un ensayo turbidim?trico para cuantificar la HbA1c en sangre total mediante kit de Spinreact.[458] El an?lisis fue realizado en el grupo de la Facultad de Medicina de la Universidad Rovira i Virgili, Reus. a) Ensayo Se atemperaron los reactivos del kit a 37?C y en el portacubeta del espectrofot?metro. En un tubo Eppendorf se deposit? 20 ?L de muestra de sangre recogida en tubo con EDTA m?s 1 mL del reactivo hemolizante. Se repos? 5 min hasta que se observ? la lisis completa. Se ajust? el espectrofot?metro a cero con agua destilada. Se deposit? en una cubeta 360 ?L el reactivo que contiene 0.13% de l?tex y 10 ?L de muestra. Se mezcl? e incub? 5 min a temperatura ambiente. En la misma cubeta se a?adi? 120 ?L del reactivo que contiene el anticuerpo monoclonal anti- HbA1c a 0.05 mg/mL. Se mezcl? y midi? la absorbancia (A) a los 5 min. Se procedi? de la misma manera con la curva de calibrado y las dem?s muestras. b) C?lculos Se represent? la absorbancia (A) obtenida frente a las concentraciones de HbA1c de la curva de calibrado. El porcentaje de HbA1c en la muestra se calcul? por interpolaci?n de su absorbancia (A) en la curva de calibraci?n. 5.1.3.4.12. Prote?na C reactiva (PCR), mol?cula de adhesi?n celular vascular-1 (VCAM-1), mol?cula de adhesi?n intracelular (ICAM-1) e inhibidor del activador del plasmin?geno-1 (PAI-1) 191 Los biomarcadores PCR, VCAM-1, ICAM-1 y PAI-1 se determinaron mediante kits Elisa de Cusabio Biotech. Cada uno de los kits de PCR, PAI-1, VCAM-1 y ICAM-1 conten?an una placa de 96 pocillos recubiertos con un anticuerpo primario espec?fico para detectar PCR, PAI-1, VCAM-1 y ICAM-1 de rata. El procedimiento de ensayo sigue el principio b?sico de los ELISAs competitivos, donde existe competencia entre el ant?geno biotinilado y el no biotinilado por un n?mero fijo de sitios de uni?n. Todo el an?lisis se realiz? de acuerdo a las especificaciones del proveedor. El an?lisis fue realizado en el grupo de la Facultad de Medicina de la Universidad Rovira i Virgili, Reus. a) Ensayo Se depositaron 100 ?L de muestra, est?ndar y controles de calidad en los pocillos designados para cada analito. Se cubri? la placa con la cinta adhesiva suministrada en el kit e incub? durante 2 h, en agitaci?n constante 450 rpm a 37?C. Se retir? el l?quido de cada pocillo, sin lavado. Se depositaron 100 ?L del anticuerpo biotinilado a cada pocillo. Se cubri? con la cinta adhesiva suministrada en el kit e incub? durante 1 h con agitaci?n constante 450 rpm a 37?C. Se retir? el l?quido de cada pocillo y se realizaron tres lavados de la placa con 200 ?L de tamp?n de ensayo. Se depositaron 100 ?L de HRP-avidina anticuerpo de detecci?n en cada pocillo. Se cubri? con la cinta adhesiva suministrada en el kit e incub? durante 1 h, en agitaci?n constante 450 rpm a 37?C. Se retir? el l?quido de cada pocillo y se realizaron tres lavados de la placa con 200 ?L de tamp?n de ensayo. Se depositaron 90 ?L del sustrato en cada pocillo. Se cubri? con la cinta adhesiva suministrada en el kit e incub? durante 20 min, en agitaci?n constante a 37?C. Se depositaron 50 ?L de la soluci?n de parada (?cido sulf?rico) en cada pocillo y se mezcl? bien. Se determin? la densidad ?ptica de cada pocillo, utilizando un lector de placa Biotek Power Wave XS2, se ajust? a 450 nm y a 570 nm. b) C?lculos De acuerdo a las especificaciones del fabricante, la curva de dosis-respuesta para estos ensayos se ajusta mejor a una curva sigmoidea de cuatro par?metros o en forma de S, para ello se utiliz? el programa Graph Pad Prism versi?n 4 (San Diego, CA, USA). Se represent? gr?ficamente la curva de cuantificaci?n para la interpolaci?n de la concentraci?n de las muestras mediante el trazado de la unidad de absorbancia de 450 nm, menos la de 570 nm, en el eje de las ordenadas frente a la concentraci?n de los est?ndares de los analitos a analizar (PCR, VCAM-1, ICAM-1 y PAI-1) en el eje de las abscisas. De esta manera la concentraci?n de cada uno de los biomarcadores se determin? comparando la densidad ?ptica de las muestras con 192 una curva est?ndar. Los resultados se expresaron en pg/mL para PCR; ?g/mL para PAI-1 y VCAM-1 y en ng/mL para la ICAM-1. 5.1.3.4.13. Insulina por ELISA Se utiliz? la prueba de Elisa para determinar insulina. El procedimiento de ensayo sigue el principio b?sico de los test ELISAs competitivos. Todo el an?lisis se realiz? de acuerdo a las especificaciones del proveedor. ? Preparaci?n del tamp?n de lavado Se diluy? la disoluci?n tamp?n de lavado 10 veces. Para ello, se junt? el contenido de 2 frascos (50 mL por frasco) y se diluy? con 900 mL de agua Milli-Q. a) Ensayo Se atemperaron los reactivos y muestras antes del ensayo a temperatura ambiente. Se lavaron los pocillos de la placa Millipore 3 veces con 300 ?L de la disoluci?n tamp?n de lavado (TBS). Se decant? el tamp?n de lavado de la placa, se eliminaron los restos del tamp?n y se invirti? la placa sobre papel absorbente. Se depositaron 10 ?L del tamp?n de ensayo (NSB) a los pocillos correspondientes blanco y muestras. Todas las adiciones se realizaron por duplicado. Se depositaron 10 ?L de la soluci?n matriz a los pocillos con NSB, pocillos de est?ndar y pocillos de controles de calidad. Se depositaron 10 ?L del est?ndar de insulina de rata, en orden ascendente de concentraci?n en los pocillos correspondientes. Se depositaron 10 ?L QC1 y 10 ?L QC2 (QC, controles de calidad), en los pocillos correspondientes. Se depositaron en los pocillos restantes 10 ?L de muestra de plasma. Se depositaron 80 ?L del detector de anticuerpo en todos los pocillos. Se cubri? la placa e incub? a temperatura ambiente durante 2 h con agitaci?n a 450 rpm. Transcurridas las 2 h, se retir? el sellador de placa y se decant? las disoluciones de la placa. Se lavaron los pocillos 3 veces con 300 ?L de tamp?n de lavado. Se decant? la disoluci?n. Se depositaron 100 ?L de la disoluci?n de enzima en cada pocillo. Se cubri? la placa con el sellador de placa e incub? con agitaci?n a 450 rpm a temperatura ambiente durante 30 min. Se retir? el sellador de la placa, se decant? la disoluci?n de la placa. Se lavaron los pocillos 6 veces con al?cuotas de 300 ?L de tamp?n de lavado y se decant? la disoluci?n. Se depositaron 100 ?L de disoluci?n de sustrato a cada pocillo, se cubri? la placa y se agit? a temperatura ambiente durante 45 min a 450 rpm. Se retir? el sellador de placa, se depositaron 100 ?L de la disoluci?n de parada (0.3 mol/L de HCl) y se agit? para asegurar que la disoluci?n se mezclara completamente. Se elimin? las posibles burbujas y se midi? la absorbancia a 450 nm y 590 nm en un lector de placa SpectraMax M5 en intervalos de 5 min. 193 b) C?lculos De acuerdo a las especificaciones del fabricante, la curva de dosis-respuesta para este ensayo se ajusta mejor a una curva sigmoidea de cinco par?metros o en forma de S, para ello se utiliz? el programa Graph Pad Prism versi?n 4 (San Diego, CA, USA). Se represent? gr?ficamente la curva de cuantificaci?n representando la absorbancia de 450 nm, menos la de 590 nm, en el eje Y frente a la concentraci?n de los est?ndares de insulina en el eje X. Los resultados se expresaron en ng/mL. 5.1.3.4.14. Glucag?n, p?ptido C, leptina y grelina por MilliPlex Se utiliz? la t?cnica de inmunoensayo de Milliplex MAP para determinar los niveles plasm?ticos de glucag?n, leptina y grelina. Todo el an?lisis se realiz? de acuerdo a las especificaciones del proveedor. ? Preparaci?n de las microesferas. Se sonic? el vial que conten?a las microesferas, se agit? en vortex durante 1 min. Se depositaron 150 ?L de suspensi?n de microesferas en un envase dispuesto para tal fin y se llev? a un volumen final de 3 mL con reactivo diluyente. ? Preparaci?n de los controles de calidad. Se reconstituy? cada uno con 250 ?L de agua destilada, se invirti? varias veces el vial hasta mezclar completamente. Despu?s de 5-10 min en reposo, se transfirieron a tubos Eppendorf de 1.5 mL. ? Preparaci?n del tamp?n de lavado. Se diluy? en una proporci?n de 30 mL en 270 mL de agua destilada. ? Preparaci?n de los est?ndares. Se a?adi? 250 ?L de agua destilada al est?ndar, se invirti? varias veces el vial, se dej? reposar por 5 min, despu?s se transfiri? a un tubo Eppendorf de 1.5 mL y se realizaron subsecuentes diluciones para obtener la curva est?ndar. a) Ensayo Se humedecieron los 96 pocillos de la placa con tamp?n de lavado. Se depositaron 25 ?L de muestra, est?ndar y controles de calidad en los pocillos designados para cada analito. Se a?adieron los anticuerpos (microesferas), e incubaron durante 16-18 h, en agitaron a 450 rpm a 4?C. Se realizaron dos lavados de la placa con tamp?n de ensayo. Se depositaron 25 ?L del anticuerpo de detecci?n en cada pocillo. Se incub? la placa durante 1 h, a temperatura ambiente con agitaci?n constante 450 rpm. Sin lavado, se agregaron en los pocillos, 25 ?L de la soluci?n que contiene ficoeritrina-estreptomicina. Se incub? la placa durante 30 min a temperatura ambiente, en agitaci?n constante 450 rpm y se protegi? de la luz, con papel de 194 aluminio. Se lav? la placa 3 veces con tamp?n de lavado. Se depositaron en los pocillos 100 ?L del l?quido del sistema (drive fluid). Inmediatamente, se medi? la placa en el aparato Luminex xMAP, seg?n especificaciones el proveedor. b) C?lculos De acuerdo a las especificaciones del proveedor, la curva de dosis-respuesta para este ensayo se ajusta mejor a una curva sigmoidea de cinco par?metros o en forma de S, para ello se utiliz? el software MilliPlex analyst versi?n 5.1 de Vigenetech. Las curvas de cuantificaci?n se generaron para cada analito, y el valor medio de intensidad de fluorescencia se expres? como concentraci?n. Los resultados se expresaron en pg/mL para todos los analitos determinados por MilliPlex. 5.1.3.4.15. Glucosa plasm?tica Se utiliz? el sistema de prueba de glucemia Ascensia ELITE? basado en la tecnolog?a de censor por electrodo, donde la glucosa de la muestra reacciona con la glucosa oxidasa, generando electrones que producen una corriente proporcional al contenido de glucosa en la muestra. La acci?n capilar en el extremo de la tira reactiva aspira una peque?a cantidad de sangre, a la c?mara de reacci?n y los resultados se visualizaron en 30 s. Se extrajo la sangre de la vena safena[459] utilizando agujas est?riles. El sistema Ascensia ELITE? proporciona resultados de glucemia comprendidos entre 20-600 mg/dL, los resultados se expresan en mg/dL. 5.1.3.4.16. Prueba de tolerancia a la glucosa Esta prueba se realiz? con los animales en ayunas. Se emple? una c?nula para administrar oralmente una dosis de 2 g glucosa /kg de peso corporal en un volumen total de 5 mL/kg de peso corporal. Se tomaron medidas de glucosa con el gluc?metro digital Ascensia ELITE? a una muestra de sangre basal (tiempo 0) de la vena safena y muestras adicionales a los 15, 30, 45, 60, 90 y 120 min de la administraci?n de glucosa. Las determinaciones se realizaron con la frecuencia que se indica en cada protocolo de estudio. 5.1.3.4.17. Creatinina La cantidad de creatinina se determin? siguiendo el m?todo descrito en la literatura.[460, 461] 195 a) Preparaci?n del reactivo de trabajo En un vial de 8 mL se depositaron 4 mL del reactivo A (25 mM de ?cido p?crico) + 4 mL del reactivo B (300 mM de tamp?n fosfato a pH 12.7). Se cerr? el vial y se protegi? de la luz con papel de aluminio. b) Ensayo Se diluyeron las muestras de orina 1:20 en soluci?n salina (0.9% de NaCl p/v), se colocaron en tubos Eppendorf de 1.5 mL, 760 ?L soluci?n salina + 40 ?L de orina. Se pre-incubaron el reactivo de trabajo, muestras y patr?n (2 mg/dL de creatinina) a la temperatura de reacci?n de 37?C. Se pipetearon en una placa de 96 pocillos por triplicado (blanco, muestra y patr?n), se identific? adecuadamente cada muestra, en el siguiente orden: -Primero, se deposit? el reactivo de trabajo 273 ?L en cada pocillo de la placa con la ayuda de una pipeta multicanal y se incub? la placa a 37?C x 5 min. -Segundo, se depositaron 27 ?L del blanco (agua Milli-Q), patr?n y muestras en los respectivos pocillos. Se program? el espectrofot?metro en modo cin?tico, de manera que se ley? la absorbancia cada 30 s durante 2 min a 37?C. Se insert? la placa en el compartimiento del equipo, se agit? con suavidad. Se midi? la absorbancia a 510 nm a los 30 s (A1), y a los 90 s (A2). c) C?lculos A todas las lecturas de patr?n y muestras se rest? el promedio del blanco. La concentraci?n de creatinina en las muestras se calcul? a partir de la siguiente f?rmula general: (A1 - A2)Muestra (A1 - A2)Patr?n x CPatr?n x Factor de diluci?nMuestra = CMuestra 5.1.3.4.18. Isoprostanos por cromatograf?a de gases con ionizaci?n qu?mica negativa acoplado a espectrometr?a de masas (GC?NCI?MS) La concentraci?n del isoprostano 15-F2t-IsoP se determin? por GC?NCI?MS, de acuerdo con el procedimiento descrito por Milne et al.,[364] (estudio 1). a) Preparaci?n de la muestra Se depositaron a un tubo Falcon de 15 mL 10 mL de agua Milli-Q a pH 3 (acidificada con HCl 1 M) y 250 ?L de orina. Se agit? el Falcon en el vortex. Se 196 a?adi? al Falcon 10 ?L del est?ndar interno deuterado [2H4]-15-F2t-IsoP, a una concentraci?n de 0.1 ng/mL. Se prepar? un blanco. Se ajust? el pH a 3 con 75 ?L de HCl 1 M. b) Extracci?n en cartuchos C18 Se lavaron los cartuchos C18 con 5 mL de MeOH. Se pre-acondicionaron los cartuchos con 7 mL de agua Milli-Q a pH 3. Se cargaron las muestras en los cartuchos. Se depositaron 10 mL de heptano. Se depositaron 10 mL de la mezcla AcOEt/Heptano 1:1 para eluir las muestras y se recogi? el eluato. Se a?adi? una punta de esp?tula de Na2SO4 al vial de 20 mL donde se recolect? el eluato. c) Extracci?n en cartuchos de gel de s?lice Se pre-acondicionaron los cartuchos de gel de s?lice con 5 mL de AcOEt. Se cargaron las muestras eluidas en los cartuchos. Se depositaron 4 mL de la mezcla AcOEt/MeOH 1:1, y se recogieron los eluatos en tubos de ensayo de 5 mL. d) Esterificaci?n Se concentraron bajo una corriente de nitr?geno a 37?C las muestras disueltas con AcOEt/MeOH 1:1, hasta 0.5 mL aproximadamente. Se traspasaron las muestras a tubos Eppendorf de 1.5 mL y se terminaron de evaporar. Se depositaron 40 ?L de la soluci?n del reactivo PFBB (Bromuro de pentafluoruro de bencilo) al 10% (v/v) en ACN. Se a?adieron 20 ?L de la disoluci?n del reactivo DIPEA (N,N-diisopropil- etilamina) al 10% (v/v) en ACN. Se agitaron en vortex. Se dejaron reaccionar 20 min en reposo a 37?C. Luego, se evaporaron bajo una corriente de nitr?geno a 37?C. Se resuspendieron las muestras en 50 ?L de CHCl3/MeOH 2:3 y se agitaron en vortex. e) Purificaci?n por TLC el pentafluorobencil ?ster del isoprostano Se prepar? una c?mara de TLC con 100 mL de la mezcla CHCl3/MeOH 9:1. Se colocaron dos placas de TLC y se eluyeron. Se sacaron las placas de la c?mara de cromatograf?a, se evaporaron los restos de solventes en la campana de extracci?n, se secaron en la estufa 30 min, y se enfriaron en un desecador al vac?o. Una vez secas las placas, se marc? dos l?neas de referencia, una a 13 cm por arriba de la parte m?s absorbente de la placa y otra a 0.5 cm por debajo de la parte m?s absorbente de la placa. Se aplic? en una de las placas el est?ndar indicador metil-?ster 15-F2t-isoP a una concentraci?n de 2-5 ?g y en la otra placa las muestras. Todas las aplicaciones se realizaron en la l?nea marcada a los 0.5 cm por debajo de la parte adsorbente. En otra c?mara de cromatograf?a previamente preparada con 100 mL de la mezcla CHCl3/EtOH (97:3) y equilibrada 20 min, se eluyeron las placas hasta la l?nea del 197 frente. Se sacaron las placas de la c?mara de cromatograf?a, se evaporaron los restos de solvente en la campana de extracci?n. Se roci? la placa que contiene el est?ndar indicador de TLC con ?cido fosfomol?bdico al 10% y se calent? a 100?C hasta que apareci? una mancha oscura. Se coloc? la placa revelada del est?ndar indicador y la placa que conten?a las muestras en paralelo y se marc? un cent?metro por arriba y un cent?metro por debajo de la mancha del est?ndar de TLC. Se rasp? el ?rea seleccionada en la placa que conten?a las muestras y se coloc? el raspado en tubos Eppendorf de 1.5 mL. f) Silanizaci?n de los grupos hidroxilo del pentafluorobencil ?ster de F2-isoP Se a?adieron a los tubos Eppendrof que conten?an la muestra m?s s?lice 1 mL de AcOEt, se agitaron en vortex. Se centrifugaron durante 3 min a 14,086g. Se extrajeron los sobrenadantes con una pipeta Pasteur y se colocaron en unos nuevos tubos Eppendorf de 1.5 mL. Se evaporaron a sequedad los sobrenadantes (muestras) con una corriente de nitr?geno a 37?C. Se depositaron 10 ?L de DMF (N,N- dimetilformamida) + 25 ?L de BSTFA (N,O-bis(trimethylsilil trifluoroacetamida). Se dejaron reaccionar 20 min en reposo a 37?C. Luego, se evaporaron a sequedad bajo una corriente de nitr?geno a 37?C. Se re-suspendieron en 30 ?L de undecano, se agitaron en vortex. Se transfirieron las muestras a viales de cromatograf?a de gases provistos de un inserto y se analizaron por GC?NCI?MS. Figura 78. Etapas del proceso de determinaci?n de isoprostanos por GC?NCI?MS. a) TLC eluida con la mezcla CHCl3/EtOH (97:3) y revelada con ?cido fosfomolibdico al 10 %, donde el metil-?ster del 15-F2t-IsoP se utiliz? como indicador (st) y muestras de orina derivatizada con el bromuro de pentafluoruro de bencilo (M), como ejemplo. b) Productos de la primera y segunda derivatizaci?n del 15-F2t-IsoP. 198 g) An?lisis por GC?NCI?MS del derivatizado de isoprostano Se utiliz? un cromat?grafo de gases QP201 de Shimadzu operado en modo de NCI, equipado con una columna capilar de s?lice fundida (DB1701, 15 m x 0.25 mm de di?metro interno) con un tama?o de part?cula de 0.25 ?m de Agilent J & W Scientific. La temperatura de la columna se program? desde los 190?C a los 300?C con un incremento de 20?C/min. El metano se utiliz? como gas reactivo y el helio se utiliz? como gas portador para la NCI. La temperatura de la fuente fue de 200?C. El ion carboxilato monitoreado para el isoprostano end?geno fue m/z 569 (M?181, p?rdida del CH2C6F5). El ion carboxilato correspondiente al patr?n interno deuterado fue m/z 573. h) C?lculos La concentraci?n del 15-F2t-isoP determinada por GC?NCI?MS, se calcul? mediante una relaci?n de ?rea entre, el ?rea de la se?al m/z 569 del derivado 15-F2t- isoP y el ?rea de la se?al a m/z 573 del [2H4]-15-F2t-isoP (est?ndar interno) con igual tiempo de retenci?n y se normaliz? por la concentraci?n de creatinina en la muestra. La concentraci?n del 15-F2t-IsoP en las muestras de orina, se expres? en ng de isoprostano/mg de creatinina. 5.1.3.4.19. Isoprostanos por cromatograf?a l?quida de alta eficiencia acoplada a espectrometr?a de masas en t?ndem con ionizaci?n por electroespray (HPLC? ESI?MS/MS) La concentraci?n de los isoprostanos 15-F2t-IsoP, 2,3-dinor-15-F2t-IsoP, 5-F2t- IsoP, 5-F2c-IsoP, 8-F2t-IsoP y 15-F3t-IsoP se determin? por HPLC?ESI?MS/MS, de acuerdo con el procedimiento descrito en la literatura.[462, 463] Los patrones utilizados para las cuantificaciones se presentan en la Tabla 42, junto a los diferentes par?metros de energ?a optimizados para cada uno de los patrones con el fin de obtener una sensibilidad ?ptima en el an?lisis; se utiliz? nitr?geno como gas de colisi?n. Se utiliz? el [2H4]-15-F2t-IsoP como patr?n interno (IS) para corregir las p?rdidas durante la preparaci?n de la muestra, variaciones en la inyecci?n, variaciones en el instrumento como la sensibilidad de la detecci?n y los efectos matriz. Para la optimizaci?n de las condiciones de MS y MS/MS, los patrones a una concentraci?n de 10 ng/?L se introdujeron individualmente en el espectr?metro por infusi?n directa con ayuda de una bomba de jeringa (velocidad de flujo 10 ?L/min). El voltaje capilar se fij? en 4,200 V y la temperatura de la fuente a 450?C. Los datos se obtuvieron y procesaron con el software Analyst versi?n 1.4.2 suministrado por Applied Biosystems. 199 Tabla 42. Condiciones optimizadas de los patrones utilizados para el an?lisis de los isoprostanos en orina. MRM: Monitorizaci?n de reacciones m?ltiples; DP: potencial de desagrupaci?n; FP: potencial de enfoque; EP: potencial de entrada; CE: energ?a de colisi?n; CXP: potencial de salida de la celda de colisi?n. ? Disoluciones de los patrones. Se prepar? una disoluci?n de trabajo de 1 ng/?L de los isoprostanos en EtOH. A partir de la disoluci?n de trabajo se prepararon disoluciones sucesivas de concentraci?n conocidas en un rango de 1 a 800 pg/?L. Cada punto de las curvas se prepar? por triplicado. Se prepararon tres rectas con diferentes objetivos que a continuaci?n se detallaran. ? Evaluaci?n del efecto matriz (EM), recuperaci?n (RE) y eficiencia del proceso (EP) de HPLC?ESI?MS/MS para isoprostanos. Se evalu? el EM, RE y EP de HPLC?ESI?MS/MS, debido a que el mayor inconveniente de los m?todos HPLC?MS/MS que utilizan como fuente de ionizaci?n la electroespray es su gran susceptibilidad a iones relacionados en la muestra que pueden producir un efecto matriz en el an?lisis,[464] y que estos efectos matriz pueden variar la concentraci?n en la muestra ya sea por supresi?n o por incremento de la se?al.[465] En general estos par?metros permiten evaluar el proceso de limpieza de la muestra en la extracci?n de fase s?lida (SPE). Los resultados se presentan en el Anexo 7.2. Se prepararon tres rectas o curvas de patrones a las concentraciones de 10, 50 y 100 pg/?L, para evaluar el m?todo. La recta 1 (R1), representa la recta ideal, ya que los patrones est?n en agua y no pasan por los cartuchos de extracci?n C18 y se prepar? como se indica a continuaci?n: en un tubo Eppendorf de 1.5 mL se deposit? 50 ?L del patr?n interno a una concentraci?n de 1 ng/?L, se a?adi? 100 ?L de la disoluci?n de la mezcla de patrones de concentraci?n conocida, se evapor? bajo una corriente de nitr?geno, se resuspendi? en 100 ?L de la mezcla de inicio del gradiente del Compuesto patr?n Transici?n MRM Tiempo de retenci?n (min) DP FP EP CE CXP [2H4]-15-F2t-IsoP 357?197 14.64 -55 -210 -10 -28 -15 15-F2t-IsoP 353?193 14.65 -55 -210 -10 -38 -15 2,3-dinor-15-F2t-IsoP 325?237 13.24 -50 -200 -10 -22 -15 5-F2t-IsoP 353?115 15.00 -55 -210 -10 -34 -15 5-F2c-IsoP 353?115 16.09 -55 -190 -10 -33 -15 8-F2t-IsoP 353?127 14.44 -55 -180 -10 -36 -15 15-F3t-IsoP 351?193 13.95 -55 -185 -10 -33 -15 200 HPLC y se analiz? por HPLC?ESI?MS/MS. La recta 2 (R2), representa el efecto matriz, ya que los patrones se a?aden una vez que la muestra de orina ha pasado por el cartucho de extracci?n C18 y se prepar? como se indica a continuaci?n: en un tubo Eppendorf de 2 mL se deposit? 50 ?L del patr?n interno a una concentraci?n de 1 ng/?L, se evapor? bajo una corriente de nitr?geno y se resuspendi? en 500 ?L de orina, se ajust? el volumen a 1.5 mL con agua acida a pH 3, se dej? reposar 15 min y se someti? la muestra a SPE. Finalmente, se evapor? con nitr?geno y se resuspendi? el residuo en 100 ?L de la disoluci?n de la mezcla de patrones de concentraci?n conocida, se evapor? bajo una corriente de nitr?geno, se resuspendi? en 100 ?L de la mezcla de inicio del gradiente del HPLC y se analiz? por HPLC?ESI? MS/MS. Recta 3 (R3), es la recta de cuantificaci?n ya que los patrones m?s orina se pasan por el cartucho de extracci?n C18 y se prepar? como se indica a continuaci?n: en un tubo Eppendorf de 2 mL se a?adi? 50 ?L del patr?n interno a una concentraci?n de 1 ng/?L y 100 ?L de las disoluciones de ls mezcla de patrones de concentraci?n conocida, se evapor? bajo una corriente de nitr?geno, se resuspendi? en 500 ?L de orina, se ajust? el volumen a 1.5 mL con agua acida a pH 3, se dej? reposar 15 min y se someti? la muestra a extracci?n en fase s?lida. Finalmente, se evapor? con nitr?geno, se resuspendi? el residuo en 100 ?L de la mezcla de inicio del gradiente del HPLC y se analiz? por HPLC?ESI?MS/MS. ? Curva de cuantificaci?n. La curva de cuantificaci?n para determinar la concentraci?n de isoprostanos en las muestras, se prepar? como se indic? en la R3, a concentraciones entre 1 a 800 pg/?L de los diferentes isoprostanos analizados. Durante los d?as de an?lisis la sensibilidad del espectr?metro de masas se comprob? mediante la inyecci?n de una mezcla de patrones a 40 pg/?L de todos los isoprostanos. a) Tratamiento de la muestra con ?-glucuronidasa Se deposit? a un tubo Eppendorf de 2 mL 500 ?L de orina, se ajust? el pH entre 4.5-5.0 con AF y se a?adi? 10 ?L de ?-glucuronidasa (90 U/?L). Se incub? a 37?C x 2 h con agitaci?n constante a 140 rpm. Se a?adi? 50 ?L del est?ndar interno deuterado [2H4]-15-F2t-IsoP, a una concentraci?n de 1 ng/?L. Se centrifug? a 14,086g durante 5 min. 201 b) Extracci?n en cartuchos C18 Se lavaron los cartuchos C18 con 5 mL de MeOH. Se preacondicionaron los cartuchos con 7 mL de agua Milli-Q a pH 3 acidificada con AF. Se cargaron las muestras y se lavaron con 10 mL de agua a pH 3 y 10 mL de agua/MeOH 90:10 v/v. Se continu? con el proceso de lavado, se a?adieron 10 mL de heptano. Se eluyeron los isoprostanos con 1 mL de MeOH y se evaporaron bajo una corriente de nitr?geno a 37?C. Se resuspendieron en 100 ?L de ACN/H2O 0.1% de AF (inicio del gradiente del HPLC), se agitaron en el vortex. Se transfirieron las muestras a viales de cromatograf?a de gases provistos de un inserto y se analizaron por HPLC?ESI? MS/MS. c) An?lisis por HPLC?ESI?MS/MS de los isoprostanos extra?dos Se utiliz? un espectr?metro de masas triple cuadrupolo API 3000 de Applied Biosystems, operado en modo negativo. El espectr?metro de masas se acopl? a un HPLC de la serie Agilent 1100 para la separaci?n de los isoprostanos en la muestra de orina, el HPLC se equip? con una columna Luna C18 de Phenomenex de (50 x 2.0 mm de di?metro interno) con un tama?o de part?cula de 3.0 ?m y una precolumna C18 de Phenomenex de (4 x 2.0 mm de di?metro interno) con un tama?o de part?cula de 3.0 ?m. Las muestras se mantuvieron durante el an?lisis a 8?C y se inyect? un volumen de 10 ?L. La columna se mantuvo a temperatura ambiente. Las condiciones de eluci?n fueron las siguientes: velocidad de flujo 0.2 mL/min y eluci?n con un sistema binario de gradiente que consiste en [A] de AF acuoso al 0.1% y [B] de AF al 0.1% en ACN. Se utiliz? un gradiente lineal creciente (v/v) de [B], [t (min), % B]: 0, 10; 5, 23; 12, 50; 20, 50; 21, 100; seguido de una etapa de reequilibrado. Los diferentes isoprostanos en las muestras se identificaron por comparaci?n de su tiempo de retenci?n con los patrones y por las transiciones de monitorizaci?n de reacciones m?ltiples (MRM) de 100 ms en ciclos de 2 s (Figura 79 y Figura 80). Se program? el equipo para que el eluato pasara por el detector 3 min antes y 3 min despu?s de la eluci?n del primero y el ?ltimo isoprostano respectivamente, para minimizar el uso del detector y la fuente de iones. 202 Figura 79. Cromatogramas MRM de los patrones de F2-isoprostanos y F3-isoprostanos a 20 pg/?L: a) Transici?n m/z 357?197 del 15-F2t-IsoP-d4, b) Transici?n m/z 353?193 del 15- F2t-IsoP, c) Transici?n m/z 325?237 del 2,3-dinor-15-F2t-IsoP, d) Transici?n m/z 353?115 del 5-F2t-IsoP y el 5-F2c-IsoP, e) Transici?n m/z 353?127 del 8-F2t-IsoP y f) m/z 351?193 del 15-F3t-IsoP. 203 Figura 80. Cromatogramas MRM de F2-isoprostanos en muestras de orina: a) Transici?n m/z 357?197 del 15-F2t-IsoP-d4, b) Transici?n m/z 353?193 del 15-F2t-IsoP, c) Transici?n m/z 325?237 del 2,3-dinor-15-F2t-IsoP, d) Transici?n m/z 353?115 del 5-F2t-IsoP y el 5-F2c- IsoP y e) Transici?n m/z 353?127 del 8-F2t-IsoP. d) C?lculos Para el c?lculo de la concentraci?n de isoprostanos en las muestras de orina, se construy? una recta de cuantificaci?n en la que se represent? la relaci?n entre la concentraci?n del analito y la concentraci?n de est?ndar interno (IS) frente a la relaci?n entre el ?rea del analito y el ?rea del IS (conc analito/conc IS vs ?rea analito/?rea IS). Debido a que la orina contienen una concentraci?n basal de isoprostano y las rectas de cuantificaci?n est?n hechas en orina, se obtiene una recta con la concentraci?n total (conc isoprostano basal + conc isoprostano patr?n) 204 (Figura 81a) de la que hay que restar la concentraci?n basal de isoprostano, de manera que se obtiene una nueva recta corregida (Figura 81b) que es la recta utilizada para la cuantificaci?n. En esta recta se interpolan las relaciones ?rea analito/?rea IS de las muestras para obtener las relaciones conc analito/conc IS de las muestras. Sustituyendo la concentraci?n del IS conocida, obtenemos la concentraci?n de isoprostano en la muestra. Lo resultados se expresaron con respecto a la concentraci?n de creatinina en la muestra. El l?mite de detecci?n (LD) se obtuvo aplicando el criterio de la relaci?n se?al/ruido (S/N) superior a 3. El l?mite de cuantificaci?n (LC) se obtuvo aplicando el criterio de relaci?n S/N superior a 10. Para ello se utiliz? el Script S/N del programa Analyst. La concentraci?n de los isoprostanos en las muestras de orina, se expres? en pg de isoprostano total/mg de creatinina. Figura 81. Rectas de cuantificaci?n para 15-F2t-IsoP. a) Recta de cuantificaci?n con la concentraci?n basal del isoprostano. b) Recta de cuantificaci?n recalculada sin la concentraci?n basal del isoprostano de la muestra. 5.1.3.4.20. Biodisponibilidad de polifenoles por HPLC?ESI?MS/MS La concentraci?n de los diferentes metabolitos microbianos y conjugados de polifenoles se determin? utilizando t?cnicas de MS/MS. En la Tabla 43 se presentan los patrones comerciales con que se dispon?a para este an?lisis, en base a ellos se optimiz? los diferentes par?metros de energ?a con el fin de obtener una sensibilidad ?ptima en el an?lisis y poder identificar otros metabolitos relacionados. y = 9.3135x + 0.2414 R? = 0.9864 0.0 1.0 2.0 0 0.1 0.2 0.3? re a a n a lit o /? re a IS Conc analito/Conc IS Recta de cuantificaci?n del 15-F2t-IsoP y = 9.3135x + 2E-16 R? = 1 0.0 1.0 2.0 0 0.1 0.2 0.3? re a a n a lit o /? re a IS Conc analito/Conc IS Recta de cuantificaci?n corregida del 15-F2t-IsoP a) b) 205 Tabla 43. Condiciones optimizadas de los patrones comerciales utilizados para el an?lisis de los metabolitos microbianos y conjugados de polifenoles en orina y heces. Compuesto patr?n Transici?n MRM Tiempo de retenci?n (min) DP FP EP CE CXP Taxifolina (pat?n interno, IS) 303?285 8.95 -45 -210 -10 -24 -15 (?)-Epicatequina (EC) 289?245 5.76 -45 -175 -10 -25 -15 (?)-Epigalocatequina (EGC) 305?261 2.72 -35 -160 -10 -25 -15 ?cido 3-hidroxifenilac?tico 151?107 4.68 -40 -165 -10 -20 -15 ?cido 4-hidroxifenilac?tico 151?107 3.52 -35 -160 -10 -23 -15 ?cido 3,4-dihidroxifenilac?tico 167?123 1.99 -33 -155 -10 -18 -15 ?cido fenilac?tico 135?91 4.36 -60 -250 -10 -20 -15 ?cido homovan?lico 181?137 4.46 -40 -180 -10 -25 -15 ?cido p-cum?rico 163?119 6.88 -40 -120 -10 -20 -15 ?cido m-cum?rico 163?119 8.70 -40 -155 -10 -22 -15 ?cido cafeico 179?135 4.50 -20 -180 -10 -25 -15 ?cido fer?lico 193?134 7.80 -44 -190 -10 -22 -15 ?cido isofer?lico 193?134 8.60 -30 -135 -10 -23 -15 ?cido 4-hidroxifenilpropi?nico 165?121 7.20 -35 -150 -10 -25 -15 ?cido 3,4-dihidroxifenilpropi?nico 181?137 3.64 -37 -150 -10 -22 -15 ?cido 3-hidroxibenzoico 137?93 4.57 -25 -110 -10 -25 -15 ?cido 4-hidroxibenzoico 137?93 2.85 -35 -175 -10 -25 -15 ?cido vainill?nico 167?152 3.93 -70 -290 -10 -23 -15 ?cido 3,4-dihidroxibenzoico 153?109 1.53 -20 -130 -10 -22 -15 ?cido benzoico 121?77 8.64 -40 -180 -10 -24 -15 ?cido hip?rico 178?134 3.45 -45 -185 -10 -18 -15 ?cido g?lico 169?125 0.85 -35 -105 -10 -25 -15 Enterodiol 301?107 13.7 -45 -175 -10 -25 -15 MRM: Monitorizaci?n de reacciones m?ltiples; DP: potencial de desagrupaci?n; FP: potencial de enfoque; EP: potencial de entrada; CE: energ?a de colisi?n; CXP: potencial de salida de la celda de colisi?n. A partir de estos patrones comerciales y haciendo uso de diferentes experimentos: transici?n MRM padre, segunda transici?n MRM y MS/MS se evaluaron diferentes derivados de (?)-epicatequina (EC) tales como, monoconjugados de EC, diconjugados de EC, triconjugados de EC y a partir de la (? )-epigalocatequina (EGC) se evaluaron monoconjugados de EGC, diconjugados de EGC, triconjugados de EGC. Por otro lado, tambi?n se evaluaron diferentes familias de metabolitos microbianos en orina y heces tales como: hidroxifenilvalerolactonas, ?cidos fenilval?ricos, ?cidos fenilpropi?nicos, ?cidos fenilac?ticos, ?cidos benzoicos, ?cidos cin?micos, ?cidos hip?rico y lignanos (Tabla 29 y 30). Los par?metros de energ?a necesarios para evaluar los diferentes metabolitos de los que no dispon?an de patr?n comercial fueron los correspondientes a un patr?n comercial relacionado; fue necesario realizar dos inyecciones en diferentes tiempo en el equipo (pase 1 y pase 2, curvas de patrones, Anexo 7.3) para asegurar la determinaci?n del metabolito mediante experimento de MS/MS y para ajustar el intervalo de concentraci?n de las diferentes rectas de cuantificaci?n. Se utiliz? 206 nitr?geno como gas de colisi?n. Para la optimizaci?n de las condiciones de MS y MS/MS, los patrones a una concentraci?n de 5 ppm se introdujeron individualmente en el espectr?metro por infusi?n directa (velocidad de flujo 10 ?L/min). El voltaje capilar se fij? en 4,200 V y la temperatura de la fuente a 300?C. ? Curva de patrones. Se prepararon soluciones madre de cada pat?n a 2,000 ppm en MeOH. Se prepararon disoluciones sucesivas de las soluciones madres de concentraci?n conocidas en H2O. Cada punto de la curvas se prepar? por duplicado. Las curvas se muestras en el Anexo 7.3. ? Colecta de las muestras. Las muestras fueron colectadas a la semana 14, 15, 16 y 17 del estudio 2, cinco ratas de cada grupo se colocaron en jaulas metab?licas de una en una para la colecta de orina y de heces, y se priv? de comida a los animales durante 24 h. A continuaci?n, las muestras de orina recogidas se acidificaron con HCl a pH ~ 5.l y la orina y las heces se congelaron inmediatamente en nitr?geno l?quido. Todas las muestras se almacenaron a ?80?C en espera de an?lisis. a) Ensayo Las muestras (orina y heces) se prepararon de acuerdo con procedimientos descritos anteriormente para la extracci?n de metabolitos fen?licos.[179, 347, 369] Las muestras de orina de 24 h se liofilizaron y se resuspendieron en 1 mL de H2O acidificada con AF a pH 3. A cada muestra se a?adi? taxifolina como patr?n interno (IS) para obtener una concentraci?n final de 5 ppm. Luego, se sometieron a SPE en cartuchos Oasis HLB de Waters. Los cartuchos se limpiaron con 1 mL MeOH y se activaron con 2 mL de H2O acidificada con AF y se cargaron las muestras en los cartuchos. Para eliminar la interferencia de otros componentes, las muestras se lavaron con 9 mL H2O acidificada y los compuestos fen?licos se eluyeron con 1 mL de MeOH. Los eluatos se evaporaron bajo corriente de nitr?geno en un concentrador de muestra a 37?C y los residuos se reconstituyeron con 500 ?L de la fase m?vil ([A], ver m?s abajo) del HPLC. Las muestras se filtraron a trav?s de un filtro de politetrafluoroetileno (PTFE) de 0.45 mm membrana de Waters, se colocaron en viales de color ?mbar para el an?lisis por HPLC?ESI?MS/MS y se conservaron a ? 20?C hasta el momento del an?lisis. Las muestras de materias fecales de 24 h, se resuspendieron en H2O ?cida, en proporci?n p/p y se homogeneizaron en vortex. Despu?s, se les a?adi? el IS (taxifolina, 5 ppm), se centrifugaron a 13,420g durante 10 min a 4?C, el sobrenadante se liofiliz? y se resuspendi? en 1 mL de H2O ?cida y se homogenizaron en vortex. Las heces fueron sometidas a extracci?n en fase s?lida de igual manera como se describi? para las muestras de orina. 207 b) An?lisis por HPLC?ESI?MS/MS Se utiliz? un espectr?metro de masas triple cuadrupolo API 3000 de Applied Biosystems, operado en modo negativo, para experimentos de MS y espectrometr?a de masas en t?ndem (MS/MS). El espectr?metro de masas se acopl? a un HPLC de la serie Agilent 1100 para las separaciones por cromatograf?a l?quida, equipado con una columna Luna C18 de Phenomenex de (50 x 2.0 mm de di?metro interno) con un tama?o de part?cula de 3.0 ?m y una precolumna C18 de Phenomenex de (4 x 2.0 mm de di?metro interno) con un tama?o de part?cula de 3.0 ?m. La eluci?n de los compuestos en el HPLC, se realiz? con un sistema binario [A] AF acuoso al 0.1% y [B] de AF al 0.1% en ACN. Se utiliz? un gradiente lineal creciente de [B] (v/v), [t (min), % B]: 0, 8; 10, 23; 15, 50; 20, 50; 21, 100; seguido de una etapa de reequilibrado. c) C?lculos Para el c?lculo de la concentraci?n de los diferentes metabolitos microbianos y conjugados de polifenoles en las muestras de orina y heces, se construyeron dos rectas de cuantificaci?n: una recta para la taxifolina, patr?n interno (IS) en la que se represent? el ?rea del IS en cuentas vs la concentraci?n del IS en ppm (Figura 82a). En esta recta se interpolaron las ?reas del IS en las muestras para obtener la concentraci?n de IS recuperada en las muestras. Sustituyendo la concentraci?n del IS conocida, obtenemos la concentraci?n de IS en la muestra, y al multiplicar por 100 % podemos saber el porcentaje de recuperaci?n; este porcentaje de recuperaci?n se tom? en cuenta a la hora del c?lculo de la concentraci?n del metabolito. La segunda recta (Figura 82b) es la recta del patr?n comercial de cuantificaci?n, en esta recta se interpolaron las ?reas del metabolito para obtener la concentraci?n del metabolito en la muestras la cual es normalizada por la cantidad total de orina (en litros) o la cantidad de heces (en kilogramos) excretada en 24 h. Finalmente, la concentraci?n del metabolito obtenida a las 24 h se relaciona con la concentraci?n de IS en la muestra, para obtener la concentraci?n final. El LD se obtuvo aplicando el criterio de la relaci?n se?al/ruido (S/N) superior a 3. El LC se obtuvo aplicando el criterio de relaci?n S/N superior a 10. Para ello se utiliz? el Script S/N del programa Analyst. Las concentraciones de los metabolitos microbianos y conjugados de polifenoles en las muestras de orina y heces, se expres? en ?M. 208 5.1.3.4.21. Evaluaci?n de los sistemas antioxidantes enzim?ticos en tejidos y ?rganos ? Determinaciones previas. Se evalu? previamente la hemoglobina, hematocrito y contenido proteico antes de evaluar el sistema antioxidante end?geno en los diferentes tejidos y ?rganos ya que se utiliz? para normalizar dichas determinaciones expresadas en mg de prote?na o g de hemoglobina. Todos estos an?lisis fueron realizados en el grupo de la Facultad de Medicina de la Universidad Rovira i Virgili, Reus. Hemoglobina (Hb). La cantidad de hemoglobina contenida en sangre total se determin? mediante la reacci?n de Drabkin a partir de sangre recogida en heparina- litio. HbFe(II) + Fe(III)(CN)63- HbFe(III) + Fe(III)(CN)64- HbFe(III) + CN - HbFe(III)CN pH 7.2 El Fe (II) de la hemoglobina, oxihemoglobina y carboxihemoglobina se oxida a Fe (III) por el ferrocianuro, dando lugar a la metahemoglobina que en presencia del ion cianuro, origina la cianometahemoglobina (HbFe(III)CN), compuesto de color rojo estable que se midi? en el espectrofot?metro Perkin Elmer Lambda 25 a 540 nm.[466] La concentraci?n se determin? mediante una recta patr?n, hecha con los patrones del kit de hemoglobina de Qu?mica Cl?nica Aplicada. Los resultados se expresaron en g hemoglobina por cada 100 mL de sangre y se utiliz? para normalizar las determinaciones de las diferentes enzimas antioxidantes. Figura 82. a) Recta de cuantificaci?n para la taxifolina. b) Rectas de cuantificaci?n para el ?cido 3-hidroxifenilac?tico. a) b) 209 Hematocrito (HTC). Esta t?cnica consiste en el c?lculo del porcentaje de gl?bulos rojos que tiene una muestra de sangre entera. Se introdujo un tubo capilar de vidrio de Hirschmann Laborger?te, en cada uno de los tubos de heparina-litio (unas ? partes de la longitud del capilar) y por capilaridad se llenaron de sangre. Se centrifugaron los capilares de cada una de las muestras de sangre entera a 8,064g durante 3 min en la microcentr?fuga MPW-55. Se calcul? el porcentaje de eritrocitos presentes en la muestra mediante la siguiente f?rmula: % eritrocitos = (cm eritrocitos/cm totales) * 100 Concentraci?n de prote?na. Se determinaron las prote?nas mediante el test Bradford que se basa en la formaci?n de un complejo entre el azul Brillante G y las prote?nas de la muestra a partir de la utilizaci?n del reactivo de Bradford. Las muestras en las que se determin? la concentraci?n proteica fueron de dos tipos, y se diluyeron con agua destilada de la siguiente manera: muestras de plasma (1:100) y muestras de fracci?n soluble de los ?rganos tejido adiposo (1:2), h?gado (1:40) y ri??n (1:50). Las lecturas se realizaron en el espectrofot?metro Perkin Elmer Lambda 25 a 595 nm. La absorbancia es proporcional a la presencia de prote?nas, la cual se compararon con una recta patr?n de alb?mina de concentraci?n conocida.[467] Los resultados se expresaron en g prote?nas por cada 100 mL de sangre. ? Sistemas antioxidantes enzim?ticos evaluados Superoxido dismutasa (SOD). La actividad enzim?tica de la SOD se midi? siguiendo el m?todo descrito en la literatura.[468] La epinefrina se oxid? a pH b?sico. En la oxidaci?n se form? radicales super?xidos que act?an sobre la propia epinefrina y formaron un adenocromo que se detect? por espectrofotometr?a. Como en la cubeta donde se produjo la oxidaci?n, se a?adi? una muestra que conten?a enzimas SOD, ?stas captaron el O2?- transform?ndolo hasta H2O2 y ox?geno, y se inhibi? la formaci?n del adenocromo. Se prepararon los reactivos (6 mM de epinefrina a la concentraci?n de 19.9 mg/10 mL de HCl 1 mM, 50 mM de tamp?n carbonado a pH 10.2, 0.1 mM de EDTA Na2+). Para la obtenci?n de la concentraci?n que inhibe el 50 % de la formaci?n del adenocromo (I50) se realiz? diluciones de los homogenizados de 1:100 hasta 2:25 seg?n la muestra a evaluar. Las lecturas se realizaron en el espectrofot?metro Perkin Elmer Lambda 25 a 480 nm. 210 Los resultados se expresaron en unidades (U)/g Hb para los hemolizados y en U/mg prote?nas para las muestras de tejido; donde una unidad es la cantidad de muestra que inhibe en un 50 % la transformaci?n de la epinefrina en adenocromo a pH alcalino. Catalasa (CAT). La actividad enzim?tica CAT se midi? siguiendo el m?todo descrito en la literatura.[469] La CAT interviene en la transformaci?n del H2O2 en ox?geno y agua. Una vez preparados los reactivos (100 mM de tamp?n fosfato pot?sico a pH 7.5 y tamp?n fosfato pot?sico + H2O2 al 17 %), se realizaron diluciones de los homogenizados de 1:10 y 1:20 seg?n la muestra a evaluar y se llev? a cabo la determinaci?n de la desaparici?n del H2O2 durante 1 min en el espectrofot?metro Perkin Elmer Lambda 25 a 240 nm. Los resultados se expresaron como mmol H2O2/min/g Hb en el caso de eritrocitos y mmol H2O2/min/mg prote?na en el caso de tejidos. Glutati?n peroxidasa (Gpx). La actividad Gpx se determin? siguiendo el m?todo descrito en la literatura.[470] Esta enzima utiliza el GSH para catalizar la reducci?n del H2O2 y de los hidroper?xidos formando GSSG. Su eficacia va ligada a la GR, la cual necesita NADPH para reducir el GSSG. Una vez preparados los reactivos (100 mM de tamp?n fosfato, 1 mM EDTA a pH 7.0, 2.25 mM de NADPH, 25 U/0.25 mL de GReductasa, 11.5 g/L de GSH, 15 mM de t-BuOOH y 100 mM de tamp?n fosfato +1 mM de EDTA a pH 7.0 + 1.5 mL de NADPH+ + 0.3 mL de GR + 0.6 mL de GSH), los hemolizados de eritrocitos congelados a ?20?C se volvieron a diluir 1:5 para la determinaci?n. En el caso de fracciones solubles de tejidos se realizaron diluciones entre 1:5 y 1:10 con tamp?n fosfato 100 mM + EDTA 1 mM. Se valor? el nivel de desaparici?n del NADPH o NADP+ en un autoanalizador Cobas Mira a 340 nm. Los resultados se expresaron en ?mol/min/g Hb en el caso de las muestras de eritrocitos o en ?mol/min/mg prote?na en el caso de fracciones solubles de tejidos. Glutati?n reductasa (GR). Para la determinaci?n de la GR se sigui? el m?todo descrito en la literatura.[470] La GR reduce el GSSG a GSH utilizando NADPH. Una vez preparados los reactivos (0.25 M de tamp?n fosfato +2 mM de EDTA a pH 7.4, 20 mM de GSSG, 2 mM de NADPH y 0.25 M de tamp?n fosfato +18.72 mL de H2O). 211 Se valor? el nivel de generaci?n del NADP + a partir del NADPH utilizando un autoanalizador Cobas Mira a 340 nm. Los resultados se expresaron en ?mol/min/g Hb en el caso de eritrocitos y en ?mol/min/mg prote?na en el caso de tejidos. Glutati?n oxidado y glutati?n reducido (GSSG/GSH). El equilibrio GSSG/GSH se mide por fluorimetr?a seg?n el m?todo descrito en la literatura.[471] El GSH reacciona con ?l o-ftalaldeh?do (OPT) a pH 8, el GSSG reacciona con el OPT a pH 12. Para determinar la concentraci?n de GSH y GSSG en las muestras de tejido, se hicieron al?cuotas de la fracci?n soluble y se a?adi? ?cido tricloroac?tico (TCA) al 70 %. Despu?s se centrifug? a 850g durante 10 min a 4?C. Por ?ltimo, el sobrenadante se guard? a ?20?C para la posterior realizaci?n de las determinaciones. La conservaci?n con TCA evita la oxidaci?n del glutati?n contenido en las muestras de tejido y precipita las prote?nas. Una vez realizado este proceso, todas las muestras se conservaron congeladas en medio ?cido hasta la posterior determinaci?n. Se prepararon los reactivos (1 mg/mL de OPT, 5 mg/mL de N-etilmaleimida (NEM), 100 mM de tamp?n fosfato s?dico a pH 8, 5 mM de EDTA y una disoluci?n 0.1 M de NaOH). Se prepararon dos rectas patr?n (GSH y GSSG) para la validaci?n de los resultados obtenidos, de concentraciones entre 1.5 ?g/100 ?L a 0.01 ?g/?L. Para realizar las lecturas se utiliz? un espectrofluor?metro Perkin Elmer LS50B a una longitud de onda de excitaci?n de 350 nm y 420 nm de emisi?n. Los resultados se expresaron en nmol/mg prote?na. 5.1.3.5. Tratamiento estad?stico de los datos Los datos se trataron estad?sticamente con el programa SPSS versi?n 21 (Statistical Package for the Social Sciences) para Windows. Se hicieron los siguientes an?lisis: ? Descriptivos: tama?o muestral (n), valores m?ximos y m?nimos, media de la poblaci?n, error est?ndar de la media (ESM) y desviaci?n est?ndar (DS) e intervalo de confianza al 95 %. ? Prueba de Kolmogorov-Smirnov. Se contrast? si cada una de las variables analizadas segu?a una distribuci?n normal. El nivel de significaci?n utilizado fue P<0.05. 212 ? Prueba t para muestras independientes. Para comparar las medias de los diferentes grupos de animales en cada estudio de intervenci?n. El nivel de significaci?n fue de P<0.05. ? ANOVA de un factor (an?lisis de la varianza). Para comparar medias de m?s de dos grupos. El nivel de significaci?n fue de P<0.05 y se aplic? test de Tukey con un nivel de significaci?n inferior al 5%. ? En los par?metros no normales se aplic? pruebas no param?tricas correspondientes: Kruskall-Wallis para comparar las medias de m?s de dos grupos y U de Mann-Whitney para comparar las medias de dos grupos. El nivel de significaci?n tambi?n fue de P<0.05. 213 5.2. ESTUDIO 1 5.2.1. Equipos y reactivos Todos los equipos y reactivos utilizados en este estudio est?n descritos en el apartado de m?todos generales, Secci?n 5.1. 5.2.2. M?todos 5.2.2.1. Animales y suplementaci?n Se utilizaron 35 ratas hembras espont?neamente hipertensas y obesas (SHROB) de Charles River Laboratories (Wilmington, MA, USA), de entre 11 y 14 semanas de vida y 35 ratas hembras Wistar Kyoto (WKY) de Janvier (Le Genest-St-Isle, Francia), de 11 semanas de vida. Los animales se distribuyeron, en cuatro grupos por cepa de forma que se minimizaran las diferencias de edad entre los grupos SHROB y se suplementaron cada uno con diferentes mezclas de aceites: grupo soja (n=7) suplementado con aceite de soja, grupo EPA/DHA (1:1) (n=7), grupo EPA/DHA (2:1) (n=7) y grupo EPA/DHA (1:2) (n=7), de manera tal que la suplementaci?n fuese isocal?rica para todos los grupos del estudio. En la Figura 83 se presenta el protocolo experimental del estudio 1. Manipulaci?n, sacrificio, colecta de muestras y procesamiento de las mismas se describe en el apartado de m?todos generales, Secci?n 5.1. 214 SEMANAS 1 3 5 7 9 11 13 15 Sacrificio Administraci?n de los diferentes aceites Peso corporal Extracci?n de sangre (an?lisis en plasma) Presi?n diast?lica y sist?lica Prueba de tolerancia a la glucosa Glucosa plasm?tica Triglic?ridos, colesterol total, LDL-c, LDL-ox, HDL-c (Universitat de Rovira i Virgili) Hemoglobina glicosilada (Universitat de Rovira i Virgili) PCR, PAI-1, VCAM-1 y ICAM-1 (Universitat de Rovira i Virgili) Perfil lip?dico de ?cidos grasos en membrana de eritrocitos (IICSIC) Ratas SHROB con SMRatas WKY sanas Administraci?n EPA/DHA (1:1), n=7 EPA/DHA (2:1), n=7 EPA/DHA (1:2), n=7 Recogida de orina para isoprostanos Soja, n=7 Dosis: 0.8 mL/kg Administraci?n EPA/DHA (1:1), n=7 EPA/DHA (2:1), n=7 EPA/DHA (1:2), n=7 Soja, n=7 Dosis: 0.8 mL/kg Perfil lip?dico de ?cidos grasos en plasma (IICSIC) Enzimas antioxidante en tejidos y ?rganos (Universitat de Rovira i Virgili) Figura 83. Esquema cronol?gico del dise?o experimental del estudio 1. Todos los grupos fueron alimentados ad libitum, con una dieta est?ndar A04 y se les proporcion? agua embotellada de Ribes (Barcelona, Espa?a) de mineralizaci?n baja. La suplementaci?n consisti? en administrar una dosis oral semanal ?nica de 0.8 mL/kg peso corporal de aceite de soja y la correspondiente mezcla de aceites de EPA/DHA durante 13 semanas. La composici?n y proporci?n de los aceites se muestra en la Tabla 44. A todos los grupos se les suplement? con un contenido de grasa similar. Debido a que los AGPI n-3 son extremadamente susceptibles a la oxidaci?n y que los productos generados por oxidaci?n son potencialmente t?xicos, el nivel de oxidaci?n de los l?pidos se comprob? durante todo el experimento (valores de per?xido <5 meq. de ox?geno por kg de aceite), los datos no se muestran. Tanto la composici?n como la estabilidad de los aceites suplementados fue analizada por el grupo del IIM-CSIC de Vigo. Despu?s de las 16 semanas de estudio las ratas se mantuvieron en ayunas durante la noche, se anestesiaron intraperitoneal, y se sacrificaron mediante exsanguinaci?n por punci?n a?rtica. 215 Tabla 44. Perfil lip?dico de los ?cidos del aceite de soja y de las mezclas de EPA/DHA (1:1), (2:1) y (1:2). Los resultados se expresan para cada AG como porcentaje molar. EPA: ?cido eicosapentaenoico; DHA: ?cido docosahexaenoico; AGs n-3: ?cidos grasos omega-3; AGSs: ?cidos grasos saturados; AGMIs: ?cidos grasos monoinsaturados; AGPIs: ?cidos grasos poliinsaturados; ND: no detectado. Los valores se expresan como media ? DS. STD-soja EPA/DHA (1:1) EPA/DHA (2:1) EPA/DHA (1:2) C14:0 0.96?0.02 4.37?0.05 3.97?0.01 4.73?0.02 C15:0 0.15?0.01 0.29?0.02 0.25?0.004 0.31?0.02 C16:0 17.78?0.10 10.15?0.16 9.09?0.03 10.98?0.13 C16:1n-7 0.90?0.03 4.99?0.04 4.57?0.02 5.39?0.03 C17:0 0.21?0.01 0.45?0.004 0.41?0.004 0.49?0.01 C18:0 2.07?0.01 2.94?0.03 2.95?0.005 2.97?0.01 C18:1n-9 18.75?0.03 6.41?0.06 6.18?0.003 6.61?0.04 C18:1n-7 1.52?0.02 1.91?0.03 1.93?0.02 1.95?0.02 C18:2n-6 47.55?0.01 0.65?0.01 0.61?0.004 0.65?0.02 C20:0 ND 0.32?0.01 0.39?0.01 0.20?0.002 C18:3n-3 4.00?0.04 0.36?0.01 0.32?0.004 0.33?0.02 C20:1n-9 1.43?0.09 0.98?0.03 1.39?0.01 0.63?0.02 C18:4n-3 0.15?0.004 1.51?0.02 1.56?0.02 1.64?0.002 C20:2n-6 0.20?0.05 0.21?0.003 0.28?0.01 0.17?0.01 C20:3n-6 ND 0.22?0.01 0.27?0.01 0.15?0.004 C20:4n-6 0.40?0.02 1.68?0.04 1.98?0.03 1.16?0.02 C22:1n-11 1.08?0.005 1.14?0.01 1.58?0.02 0.45?0.01 C22:1n-9 0.25?0.02 0.28?0.03 0.37?0.03 0.19?0.02 C20:4n-3 0.20?0.03 1.02?0.02 1.31?0.02 0.75?0.01 C20:5n-3 0.70?0.02 25.09?0.10 32.43?0.06 17.33?0.03 C24:1n-9 0.28?0.05 0.38?0.003 0.55?0.02 0.25?0.01 C22:5n-3 0.26?0.01 4.30?0.05 5.24?0.02 2.60?0.12 C22:6n-3 1.15?0.03 25.70?0.21 17.98?0.03 34.85?0.10 AGs n-3 6.47?0.14 58.84?0.16 57.51?0.27 57.97?0.40 AGSs 21.17?0.10 18.52?0.22 17.05?0.02 19.68?0.12 AGMIs 24.21?0.11 17.22?0.12 17.14?0.07 17.43?0.11 AGPIs 54.62?0.03 64.26?0.33 65.81?0.08 62.90?0.24 EPA+DHA 1.85?0.06 50.79?0.31 50.41?0.09 52.19?0.13 216 5.3. ESTUDIO 2 5.3.1. Equipos y reactivos Todos los equipos y reactivos utilizados en este estudio est?n descritos en el apartado de m?todos generales, Secci?n 5.1. 5.3.2. M?todos 5.3.2.1. Animales y suplementaci?n Se utilizaron 56 ratas hembras WKY de Charles River Laboratorios (Wilmington, MA, USA), de entre 4 a 6 semanas de vida. Los animales se distribuyeron al azar tomando en cuenta la diferencia de edades, en ocho grupos diet?ticos. Cuatro grupo recibieron una dieta est?ndar (STD) modificada, Teklad Global 2014 de Harlan Teklad Inc., (Indianapolis, IN, USA); grupo STD-soja (n=7); grupo STD-EPA/DHA (1:1) (n=7); grupo STD-GSE (n=7); y grupo STD-EPA/DHA (1:1)+GSE (n=7); y cuatro grupos recibieron una dieta alta en grasa y alta en sacarosa modificada (HFHS), TD 110497 de Harlan Teklad Inc., (Indianapolis, IN, USA); grupo HFHS-soja (n=7); grupo HFHS-EPA/DHA (1:1) (n=7); grupo HFHS- GSE (n=7); y grupo HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE (n=7). En la Figura 84 se muestra el protocolo experimental del estudio 2. La manipulaci?n, colecta de muestras, procesamiento de las muestras y sacrificio se describe en el apartado de m?todos generales, Secci?n 5.1. 217 SEMANAS0 4 8 12 16 20 24 Sacrificio Intervenci?n nutricional Peso corporal Extracci?n de sangre (an?lisis en plasma) Presi?n diast?lica y sist?lica Prueba de tolerancia a la glucosa Glucosa plasm?tica Recogida de orina y heces para biodisponibilidad de polifenoles Dieta: STD modificada HFHS-EPA/DHA (1:1), n=7 HFHS-GSE, n=7 HFHS-EPA/DHA (1:1)+GSE, n=7 Recogida de orina para isoprostanos HFHS-soja, n=7 Dieta: HFHS modificada STD-EPA/DHA (1:1), n=7 STD-GSE, n=7 STD-EPA/DHA (1:1)+GSE, n=7 STD-soja, n=7 Triglic?ridos y colesterol total (Universitat de Rovira i Virgili) Figura 84. Esquema cronol?gico del dise?o experimental del estudio 2. Las dietas modificadas se prepararon en el laboratorio en forma de pellets; en la Figura 85 se muestra la secuencia de la preparaci?n. Una vez mezclados todos los ingredientes s?lidos se agregaron los ingredientes l?quidos y la pasta formada, se coloc? en frascos pl?sticos de polipropileno de 7.0 x 3.5 cm, se congelaron y se liofilizaron. Los pellets liofilizados se desmoldaron, se envasaron al vac?o con el fin de evitar la oxidaci?n y la contaminaci?n por hongos y se almacenaron a 4?C hasta su uso. 218 La composici?n final de los pellets se muestra en la Tabla 45 y en la Tabla 46 se muestras la composici?n de los aceites de soja y de EPA/DHA utilizados para preparar las dietas. Dentro de cada grupo diet?tico, las dietas se elaboraron con igual contenido de grasa y energ?a. Debido a que los AGPIs n-3 son extremadamente susceptibles a la oxidaci?n y que los productos generados por oxidaci?n son potencialmente t?xicos, el nivel de oxidaci?n de los l?pidos se comprob? durante todo el experimento (valores de per?xido <5 meq. de ox?geno por kg de aceite, los datos no se muestran). Tanto la composici?n como la estabilidad de los aceites suplementados fue realizada por el grupo del IIM-CSIC en Vigo. Despu?s de 25 semanas de tratamiento las ratas se mantuvieron en ayunas durante la noche, fueron anestesiadas intraperitoneal, y se sacrificaron mediante exsanguinaci?n por punci?n a?rtica. Figura 85. Etapas del proceso de preparaci?n de las diferentes dietas en el laboratorio: a) se mezclaron los ingredientes s?lidos, b) se mezclaron los ingredientes s?lidos con los l?quidos, c) se form? una pasta con todos los ingredientes, d) se coloc? la pasta en recipientes pl?sticos para dar la forma de pellets al pienso, e) se liofilizaron y f) se empacaron al vac?o. 219 Tabla 45. Composici?n de las dietas del estudio 2. Dietas STD-soja STD- EPA/DHA (1:1) STD-polifenol STD-EPA/DHA (1:1)+polifenol HFHS-soja HFHS- EPA/DHA (1:1) HFHS-polifenol HFHS- EPA/DHA (1:1)+polifenol Ingredientes (g/kg) Harina 1000.01 1000.01 1000.01 1000.01 1000.02 1000.02 1000.02 1000.02 Antioxidante TBHQ 0.08 0.08 0.08 0.08 0.08 0.08 0.08 0.08 Gelatina porcina tipo 240/260 25.0 25.0 25.0 25.0 25.0 25.0 25.0 25.0 Lecitina de soja 6.0 6.0 6.0 6.0 22.0 22.0 22.0 22.0 Aceite de soja 17.4 17.4 22.0 22.0 Aceite de origen marino con EPA/DHA3 - 17.4 - 17.4 - 22.0 - 22.0 Grajfnol4 - - 0.88 0.88 - - 1.09 1.09 Composici?n (g/kg) Prote?na 136.4 136.4 136.3 136.3 188.0 188.0 187.8 187.8 L-cistina 2.9 2.9 2.9 2.9 2.9 2.9 2.9 2.9 Carbohidratos disponibles 457.8 457.8 457.5 457.5 440.4 440.4 439.8 439.8 Sacarosa NE NE NE NE 327.9 327.9 327.5 327.5 Almid?n de ma?z NE NE NE NE 54.6 54.6 54.5 54.5 Maltodextrina NE NE NE NE 57.9 57.9 57.8 57.8 Fibra cruda5 210.8 210.8 210.6 210.6 48.2 48.2 48.2 48.2 Grasa l?ctea anhidra - - - - 174.0 174.0 173.8 173.8 220 Aceite de soja 38.2 38.2 38.1 38.1 19.3 19.3 19.3 19.3 Minerales6 45.7 45.7 45.7 45.7 41.5 41.5 41.4 41.4 Vitaminas7 11.8 11.8 11.8 11.8 18.3 18.3 18.3 18.3 Ceniza 44.8 44.8 44.8 44.8 - - - - Bitartrato de colina 1.0 1.0 1.0 1.0 2.9 2.9 2.9 2.9 Macronutrientes Prote?na (% en peso) 16.4 16.4 16.4 16.4 21.7 21.7 21.7 21.7 Carbohidrato (% en peso) 46.6 46.6 46.5 46.5 45.0 45.0 44.9 44.9 Grasa (% en peso) 6.2 6.2 6.2 6.2 24.1 24.1 24.1 24.1 Energ?a a partir de prote?nas (%) 21.3 21.3 21.3 21.3 17.9 17.9 17.9 17.9 Energ?a a partir de carbohidratos (%) 60.5 60.5 60.5 60.5 37.2 37.2 37.2 37.2 Energ?a a partir de grasas (%) 18.2 18.2 18.2 18.2 44.9 44.9 44.9 44.9 Densidad total de energ?a (Kcal/g )8 3.1 3.1 3.1 3.1 4.8 4.8 4.8 4.8 1 Harina de la dieta est?ndar (STD) (Teklad Global 2014); 2 Harina de la dieta high-fat high-sucrose (HFHS) (TD 110497); 3 La cantidad de EPA/DHA fue de 25 mg/kg de peso corporal, de acuerdo con los valores de ingesta de referencia para los AGPIs n-3 y n-6 (The EFSA Journal 1176:1-11; 2009); 4 Grajfnol? polvo fino de semilla de uva extra?do con etano y agua, de color rojo marr?n, proporcionado por JF-Natural Product (Tianjin, China); 5 Fibra cruda; 6 AIN-93G-MX (94047); 7 De AIN-93-VX (94047); 8 Densidad de energ?a se estima como la energ?a metabolizada seg?n factores de Atwater, que asigna 4 kcal/g a las prote?nas, 9 kcal/g a las grasas y 4 kcal/g a los carbohidratos disponibles; NE: no especificado. 221 Tabla 46. Perfil lip?dico de los ?cidos grasos del aceite de soja (control) y de la mezcla de EPA/DHA (1:1). Los resultados se expresan para cada AG como porcentaje molar. Aceite de Soja EPA/DHA (1:1) C14:0 0.96?0.02 4.37?0.05 C15:0 0.15?0.01 0.29?0.02 C16:0 17.78?0.10 10.15?0.16 C16:1n-7 0.90?0.03 4.99?0.04 C17:0 0.21?0.01 0.45?0.004 C18:0 2.07?0.01 2.94?0.03 C18:1n-9 18.75?0.03 6.41?0.06 C18:1n-7 1.52?0.02 1.91?0.03 C18:2n-6 47.55?0.01 0.65?0.01 C20:0 ND 0.32?0.01 C18:3n-3 4.00?0.04 0.36?0.01 C20:1n-9 1.43?0.09 0.98?0.03 C18:4n-3 0.15?0.004 1.51?0.02 C20:2n-6 0.20?0.05 0.21?0.003 C20:3n-6 ND 0.22?0.01 C20:4n-6 0.40?0.02 1.68?0.04 C22:1n-11 1.08?0.005 1.14?0.01 C22:1n-9 0.25?0.02 0.28?0.03 C20:4n-3 0.20?0.03 1.02?0.02 C20:5n-3 0.70?0.02 25.09?0.10 C24:1n-9 0.28?0.05 0.38?0.003 C22:5n-3 0.26?0.01 4.30?0.05 C22:6n-3 1.15?0.03 25.70?0.21 AGs n-3 6.47?0.14 58.84?0.16 AGSs 21.17?0.10 18.52?0.22 AGMIs 24.21?0.11 17.22?0.12 AGPIs 54.62?0.03 64.26?0.33 EPA+DHA 1.85?0.06 50.79?0.31 EPA: ?cido eicosapentaenoico; DHA: ?cido docosahexaenoico; AGs n-3: ?cidos grasos omega-3; AGSs: ?cidos grasos saturados; AGMIs: ?cidos grasos monoinsaturados; AGPIs: ?cidos grasos poliinsaturados; ND: no detectado. Los valores se expresan como media ? DS. 222 5.4. ESTUDIO 3 5.4.1. Equipos y reactivos Todos los equipos y reactivos utilizados en este estudio est?n descritos en el apartado de m?todos generales, Secci?n 5.1. 5.4.2. M?todos 5.4.2.1. Animales y tratamiento Un total de 77 ratas machos adultos Sprague-Dawley (SD) de entre 175-250 g de peso corporal de Janvier (Le Genest-St-Isle, Francia), se manipularon y se mantuvieron bajo las mismas condiciones de estabulaci?n de los otros estudios tal como se describe en el aparatado de m?todos generales, Secci?n 5.1. 5.4.2.2. Administraci?n de sacarosa/almid?n mediante sonda g?strica La administraci?n de sacarosa o almid?n se realiz? despu?s de un per?odo de 12 h de privaci?n de alimento. Se administr? a cada rata una disoluci?n de sacarosa o almid?n a dosis de (1 ? 2 g/kg de peso corporal) junto con las diferentes dosis de los compuestos a evaluar (D-fagomina DNJ, miglitol y acarbosa). Se realizaron experimentos de control negativo y positivo, mediante la administraci?n de s?lo agua y disoluciones de los carbohidratos sacarosa o almid?n, respectivamente. Las dosis ensayadas para D-fagomina fueron 1, 2 y 4 mg/kg de peso corporal mientras que para DNJ, miglitol y acarbosa la dosis ensayada fue de 2 mg/kg de peso corporal. Los diferentes compuestos se administraron como disoluciones en agua (5 mL/kg de peso corporal) mediante sonda g?strica. Se utiliz? de 4 a 5 animales para cada condici?n probada. La muestra de sangre se obtuvo de la vena safena a los 0, 15, 30, 45, 60, 90 y 120 min despu?s de la administraci?n, y se procedi? a la determinaci?n de la glucosa y la insulina como se detalla en el apartado de m?todos generales, Secci?n 5.1. 5.4.2.3. Determinaci?n de la actividad de la sacarasa en homogeneizados y sacos de intestino revertidos La actividad de la sacarasa de la membrana intestinal de borde en cepillo (glucosidasa EC 3.2.1.48) se evalu? en la mucosa de yeyuno y en peque?os sacos revertidos de la misma zona del intestino, de acuerdo al procedimiento descrito.[472] Para la preparaci?n de los homogeneizados de la mucosa intestinal, las ratas se mantuvieron en ayunas durante la noche y se anestesiaron con ketamina (90 mg/kg de peso corporal) y xilacina (10 mg/kg de peso corporal) por v?a intraperitoneal. 223 Las ratas anestesiadas fueron sacrificadas por dislocaci?n cervical. El intestino delgado se retir? cuidadosamente y se dividi? en, ?leon, yeyuno y duodeno. El yeyuno se lav? con 5 mL de soluci?n salina isot?nica fr?a con hielo, se abri? longitudinalmente y la mucosa se rasp? con un portaobjetos. Luego, se a?adi? a la mucosa soluci?n salina isot?nica helada para conseguir una concentraci?n de 50 mg/mL de mucosa, y se homogeniz? con un Ultra-Turrax T10 b?sico de IKA. La actividad sucrasa se determin? mediante mediciones colorim?tricas de la liberaci?n de glucosa por la acci?n de la sacarasa sobre la sacarosa, mediante un procedimiento descrito.[472] Cada uno de los compuesto (D-fagomina, DNJ, miglitol y acarbosa) se probaron en la mucosa de cinco ratas en concentraciones que oscilaron entre 0.2 nM a 1 mM en presencia de 0.1 M de sacarosa como sustrato. Se preincubaron durante 30 min a 37?C con 5 ?L de inhibidor (compuestos a probar) y 95 ?L de mucosa homogeneizada diluida adecuadamente, luego la reacci?n se llev? a cabo en 300 ?L de tamp?n fosfato a pH 6.8 por la adici?n de 0.1 ?L del sustrato. Substrato, m?s inhibidor, m?s mucosa homogeneizada y diluida, se incubaron juntos durante 30 min a 37?C y 250 rpm, por triplicado. La reacci?n se par? mediante la adici?n de 2 mL de disoluci?n de Glucostat compuesta por: 0.5 M de tamp?n Tris-HCl; 10 mM de ?cido 4-hidroxibenzoico; 0.4 mM de 4-aminoantipirina; 1480 UI/L (24.672 ?katal/L) de glucosa oxidasa y 250 UI/L (4.167 ?katal/L) de peroxidasa a pH 7.3. Despu?s de una incubaci?n adicional de 2.5 h a 37?C, se midi? la cantidad de glucosa en placa de 96 pocillos en el lector de placa SpectraMax M5 a 505 nm. La actividad enzim?tica (?mol de sustrato hidrolizado/h) se normaliz? por la cantidad de prote?na determinada por el m?todo de Bradford.[467] Para revertir los sacos intestinales, el yeyuno obtenido como se describi? anteriormente, se limpi? con 5 mL con disoluci?n salina isot?nica fr?a y se cort? en segmentos de 3 cm de largo. Para poner cada segmento de intestino al rev?s, se us? una punta pl?stica de pipeta marca Eppendorf con capacidad de 100 ?L, luego los dos extremos se aseguraron por medio de nudos con hilos para suturar, de manera tal que la membrana de borde en cepillo de cara al lumen in vivo ahora permanec?a de cara al exterior (Figura 86). Debido a que la glucosa liberada por la acci?n de la sacarasa podr?a ser utilizada por el tejido con la ayuda de GLUT, este se inhibi? mediante una pre-incubaci?n de los sacos durante 30 min a 37?C y 250 rpm en soluci?n de Ringer que conten?a 0.5 mM del inhibidor GLUT floridzina.[406] A continuaci?n los sacos, se incubaron durante 16 min a 37?C a pH 7.3 y 250 rpm en 5 mL de disoluci?n de Ringer que conten?a 50 mM de sacarosa, as? como 0.5 mM de floridzina y concentraci?n de entre 0.2 nM a 1 mM de los diferentes inhibidores. 224 Despu?s de la incubaci?n, se eliminaron los sacos y se prepararon al?cuotas de 500 mL de la disoluci?n incubada en tubos de ensayos que conten?an 2 mL de disoluci?n de Glucostat, por triplicado. Despu?s de una incubaci?n adicional de 2 h a 37?C y 250 rpm, se midi? la cantidad de glucosa en placa de 96 pocillos en el lector de placa SpectraMax M5 a 505 nm. La actividad de la sacarasa (?mol de sustrato hidrolizado/h) se normaliz? por los mg de peso h?medo del trozo de intestino. Figura 86. Etapas del proceso de preparaci?n de los sacos intestinales revertidos: a) se separ? el yeyuno del ?leon y duodeno, b) se cort? en segmentos de 3 cm de largo el yeyuno, c) se insert? el trozo de intestino en la punta de pipeta, d) se vir? al rev?s el trozo de intestino y e) se anudaron los extremos del trozo de intestino con hilo de sutura. Foto: Dr. Jes?s Joglar Tamaro. 5.4.2.4. Aglutinaci?n bacteriana Las cepas de bacterias utilizadas para estos ensayos se obtuvieron de la colecci?n de cepas bacteriana de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Aut?noma de Barcelona, donde se hicieron los ensayos microbiol?gicos. Cultivo de una noche de cada cepa bacteriana se inocularon en matraces de 100 mL en un medio de cultivo Luria. Las cepas se incubaron durante 24 h a 37?C. Las colonias se cultivaron en placas de agar Luria de Liofilchem? y despu?s de 24 h de incubaci?n, se prepararon varias diluciones en tamp?n fosfato salino (PBS) para cada cepa, a una concentraci?n de 108 unidades formadoras de colonias (UFC)/mL. Las suspensiones bacterianas con D-fagomina a concentraciones de 20 y 200 mg/L (0.14 y 1.4 mM) se incubaron durante 90 min a temperatura ambiente. Las suspensiones se colocaron sobre portaobjetos, se observaron bajo un microscopio ?ptico y se compararon con los controles positivos (0.05 M de D-manosa). Un m?nimo de veinte campos se evaluaron para las agregaciones. Los resultados se expresaron como porcentaje de agregaci?n relacionado con el n?mero de agregaciones obtenidas con 0.05 M de D-manosa. 225 5.4.2.5. Evaluaci?n de la adhesi?n bacteriana a la mucosa intestinal La mucosa se obtuvo a partir de segmentos intestinales de cerdo, justo despu?s de que fueran sacrificados en un matadero local y se mantuvo congelada hasta el momento de su uso. La preparaci?n de la mucosa de 1 mL se descongel?, se centrifug? y se mezcl? con 99 mL de PBS. Antes de cada prueba, la concentraci?n de mucina en la suspensi?n se calcul? por el m?todo de Bradford.[467] Placas multipocillos de Nunc, se recubrieron para la incubaci?n de una noche a 4?C, con 2.5 mL de la suspensi?n de la mucosa. A continuaci?n, la mucosa no unida se elimin? cuidadosamente y se a?adi? suavemente a los diferentes pocillos de la placa suspensiones bacterianas de 107 UCF/mL, seguido muy r?pidamente de la adici?n de diferentes concentraciones de D-fagomina de entre 10 y 20 mg/L; 0.07 y 0.14 mM, en un volumen total de 1.5 mL. Las mezclas se incubaron a 37?C durante 90 min. El experimento se realiz? por triplicado y se utiliz? D-manosa a 0.05 M como control positivo. Por ?ltimo, las unidades formadoras de colonias del sobrenadante y la mucosa se contaron bajo un microscopio ?ptico, despu?s de cultivar ambas fracciones durante toda la noche. 5.4.2.6. Estad?stica Los resultados de las pruebas de inhibici?n de sacarasa se expresan como los valores medios, con sus errores est?ndar. La prueba t de Student (distribuci?n de dos colas) se llev? a cabo para analizar las diferencias entre los dos ensayos. Se utiliz? una curva sigmoidea no lineal de dosis-respuesta para determinar los IC50 de la inhibici?n enzim?tica. Las ?reas bajo la curva de las pruebas con sacarasa/almid?n administradas se calcularon utilizando la regla trapezoidal. Las diferencias estad?sticas fueron evaluadas mediante an?lisis de varianza (ANOVA) de dos v?as y post test de Bonferroni. Los valores con P<0.05 se tomaron como significativos. Toda la manipulaci?n de los datos y el an?lisis estad?sticos se realizaron utilizando GraphPad Prisma versi?n 4 de Graph Pad Software, Inc. 226 5.5. ESTUDIO 4 5.5.1. Equipos y reactivos Todos los equipos y reactivos utilizados en este estudio est?n descritos en el apartado de m?todos generales, Secci?n 5.1. 5.5.2. M?todos 5.5.2.1. Animales y suplementaci?n Un total de 15 ratas machos adultos SD de 22 semanas de vida de Janvier (Le Genest-St-Isle, Francia), se manipularon, se mantuvieron en estabulaci?n y se sacrificaron bajo las condiciones que se describe en el apartado de m?todos generales, Secci?n 5.1. Las 15 ratas se dividieron aleatoriamente en tres grupos: el grupo STD (STD, n=5) alimentado con una dieta est?ndar modificada Teklad Global 2014 de Harlan Teklad Inc., el grupo HFHS (HFHS, n=5) que recibi? una dieta con alto contenido de grasas y sacarosa modificada TD 08811 de Harlan Teklad Inc., y un grupo (HFHS+D-fagomina, n=5) que recibi? una dieta alta en grasa y sacarosa que se suplement? con D-fagomina (0.65 g/kg de alimento, 0.2% con respecto a la sacarosa), de acuerdo a los resultados obtenidos en el estudio 3.[473] Las dietas modificadas se prepararon en el laboratorio en forma de pellets como se describe en el estudio 2. Las composiciones de las dietas STD, HFHS y HFHS+D-fagomina est?n resumidas en la Tabla 47. 227 Tabla 47. Composici?n de las dietas del estudio 4. Dietas STD HFHS HFHS+D-fagomina Ingredientes (g) Harina 1000.01 1000.02 1000.02 Antioxidante TBHQ - 0.04 0.04 Gelatina porcina tipo A 240/260 25.0 25.0 25.0 Lecitina de soja 4.0 25.0 25.0 D-Fagomina - - 0.653 Composici?n (g/Kg) Prote?na 139.0 185.6 185.6 L-cistina 2.9 2.9 2.9 Carbohidratos disponibles 466.6 434.9 434.9 Sacarosa NE 323.7 323.7 Almid?n de ma?z NE 54.1 54.1 Maltodextrina NE 57.1 57.1 Fibra cruda4 214.8 47.6 47.6 Grasa l?ctea anhidra - 199.9 199.9 Aceite de soja 38.9 19.0 19.0 Minerales5 45.7 40.9 40.9 Vitaminas6 11.8 18.1 18.1 Ceniza 45.7 - - Bitartrato de colina 1.0 2.9 2.9 Macronutrientes Prote?na (% en peso) 16.3 20.9 20.9 Carbohidrato (% en peso) 46.7 43.5 43.5 Grasa (% en peso) 4.3 24.3 24.3 Energ?a a partir de prote?nas (%) 22.5 17.6 17.6 Energ?a a partir de carbohidratos (%) 64.3 36.5 36.5 Energ?a a partir de grasas (%) 13.3 45.9 45.9 Densidad total de energ?a (kcal/g )7 2.9 4.7 4.7 1Harina de la dieta est?ndar (STD) (Teklad Global 2014); 2Harina de la dieta high-fat high-sucrose (HFHS) (TD 08811); 3La cantidad de D-fagomina fue de 0.2 % con respecto a la sacarosa, de acuerdo con estudio previo sobre su efecto postprandial;[473] 4De celulosa; 5De AIN-93G-MX (94047); 6De AIN-93-VX (94047); 7La densidad de energ?a se estima como la energ?a metabolizada basada en los factores de Atwater, que asigna 4 kcal/g a las prote?nas, 9 kcal/g a las grasas y 4 kcal/g a los carbohidratos disponibles; NE: no especificado. 228 En la Figura 87 se muestra el protocolo experimental del estudio 4. La manipulaci?n, sacrificio, colecta de muestras y procesamiento de las mismas se describe en el apartado de m?todos generales, Secci?n 5.1. Los animales tuvieron en todo momento libre acceso a agua y pienso y el consumo de pienso se monitoriz? a lo largo del estudio. SEMANAS 1 3 5 7 9 Sacrificio Intervenci?n nutricional Peso corporal Extracci?n de sangre (an?lisis en plasma) Glucosa plasm?tica HFHS, n=5 HFHS+D-fagomina, n=5 Recogida de orina para isoprostanos STD, n=5 0 2 4 6 8 Dieta: STD modificada Dieta: HFHS modificada Triglic?ridos y colesterol total (Universitat de Rovira i Virgili) Figura 87. Esquema cronol?gico del dise?o experimental del estudio 4. 229 6. REFERENCIAS 230 231 1. Despr?s JP, Lemieux I: Abdominal obesity and metabolic syndrome. Nature. 2006, 444:881- 887. 2. Eckel RH, Grundy SM, Zimmet PZ: The metabolic syndrome. Lancet. 2005, 365:1415-1428. 3. DP, Schuster: Changes in physiology with increasing fat mass. Semin Pediatr Surg. 2009, 18:126-135. 4. 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Cardiovascular disease-related parameters and oxidative stress in SHROB rats, a model for metabolic syndrome: Molinar-Toribio E, P?rez-Jim?nez J, Ramos-Romero S, Llu?s L, S?nchez-Martos V, Taltavull N, Romeu M, Pazos M, M?ndez L, Miranda A, Cascante M, Medina I & Torres JL. 2014. PLOS One, 9:e104637. ? Effect of omega-3 PUFA supplementation at different EPA/DHA ratios on Spontaneously Hypertensive Obese Rat (SHROB) model of metabolic syndrome: Molinar-Toribio E, P?rez-Jim?nez J, Ramos-Romero S, Romeu M, Montserrat G, Taltavull N, Mu?oz-Cortes M, J?uregui O, M?ndez L, Medina I & Torres JL. 2014. Br J Nutr, SUBMITTED. ? D-Fagomine lowers postprandial blood glucose and modulates bacterial adhesion: G?mez L*, Molinar-Toribio E*, Calvo-Torras MA, Adelantado C, Juan E, Planas J, Ca?as X, Lozano C, Pumarola S, Clap?s P & Torres JL. 2012. Br J Nutr, 107:1739-1746. * Autoras con igual contribuci?n. Cardiovascular Disease-Related Parameters and Oxidative Stress in SHROB Rats, a Model for Metabolic Syndrome Eunice Molinar-Toribio1, Jara Pe?rez-Jime?nez1*?, Sara Ramos-Romero1,2, Laura Llu??s3, Vanessa Sa?nchez- Martos3, Nu?ria Taltavull3, Marta Romeu3, Manuel Pazos4, Luc??a Me?ndez4, An??bal Miranda5,6, Marta Cascante5,6, Isabel Medina4, Josep Llu??s Torres1 1 Institute of Advanced Chemistry of Catalonia (IQAC-CSIC), Barcelona, Spain, 2 Biomedical Research Networking Center in Bioengineering, Biomaterials, and Nanomedicine (CIBER-BBN), Zaragoza, Spain, 3Unidad de Farmacolog??a, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad Rovira i Virgili, Reus, Spain, 4 Instituto de Investigaciones Marinas (IIM-CSIC), Vigo, Spain, 5Department of Biochemistry and Molecular Biology, IBUB and unit associated with CSIC, Faculty of Biology, Universitat de Barcelona, Barcelona, Spain, 6 Institut d?Investigacions Biome`diques August Pi i Sunyer (IDIBAPS), Barcelona, Spain Abstract SHROB rats have been suggested as a model for metabolic syndrome (MetS) as a situation prior to the onset of CVD or type- 2 diabetes, but information on descriptive biochemical parameters for this model is limited. Here, we extensively evaluate parameters related to CVD and oxidative stress (OS) in SHROB rats. SHROB rats were monitored for 15 weeks and compared to a control group of Wistar rats. Body weight was recorded weekly. At the end of the study, parameters related to CVD and OS were evaluated in plasma, urine and different organs. SHROB rats presented statistically significant differences from Wistar rats in CVD risk factors: total cholesterol, LDL-cholesterol, triglycerides, apoA1, apoB100, abdominal fat, insulin, blood pressure, C-reactive protein, ICAM-1 and PAI-1. In adipose tissue, liver and brain, the endogenous antioxidant systems were activated, yet there was no significant oxidative damage to lipids (MDA) or proteins (carbonylation). We conclude that SHROB rats present significant alterations in parameters related to inflammation, endothelial dysfunction, thrombotic activity, insulin resistance and OS measured in plasma as well as enhanced redox defence systems in vital organs that will be useful as markers of MetS and CVD for nutrition interventions. Citation: Molinar-Toribio E, Pe?rez-Jime?nez J, Ramos-Romero S, Llu??s L, Sa?nchez-Martos V, et al. (2014) Cardiovascular Disease-Related Parameters and Oxidative Stress in SHROB Rats, a Model for Metabolic Syndrome. PLoS ONE 9(8): e104637. doi:10.1371/journal.pone.0104637 Editor: Christopher Torrens, University of Southampton, United Kingdom Received February 17, 2014; Accepted July 10, 2014; Published August 12, 2014 Copyright: ? 2014 Molinar-Toribio et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited. Funding: This research was supported by the Spanish Ministries of Science and Innovation and of Economy and Competitiveness (Grants AGL2009-12374-C03- 01, -02 and -03; AGL2013-49079-C2-1,2-R; respectively) and in part by the Generalitat de Catalunya regional authorities (2009SGR-1308). M.C. acknowledges ETHERPATHS (FP7-KBBE-222639) funded by the European Union and ??ICREA Academia?? award for excellence in research, funded by the ICREA Foundation of the Generalitat de Catalunya. The Panamanian Government (SENACYT/IFRHU) and the Spanish Ministry of Science and Innovation awarded graduate fellowships to E.M.-T. and L.M., respectively. The ISCIII and the Xunta de Galicia are also acknowledged for ??Sara Borrell?? and ??Isidro Parga Pondal?? postdoctoral contracts to J.P.- J. (CD09/00068) and M.P., respectively. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript. Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist. * Email: jara.perez@ictan.csic.es ? Current address: Department of Metabolism and Nutrition, Institute of Food Science, Technology and Nutrition (ICTAN-CSIC), Madrid, Spain Introduction The combination of CVD risk factors known as metabolic syndrome (MetS) is becoming a major public health problem which now affects 20%?30% of the adult population in developed countries [1]. The risk factors include abdominal obesity, hyperglycaemia, hypertension and/or hypertriglicerydaemia asso- ciated with a sedentary lifestyle [2]. The main underlying disorder in MetS appears to be insulin resistance, i.e., an impairment of insulin action within tissues (mainly muscle, liver and adipose tissues) that has been related to chronic low-level inflammation as well as oxidative stress (OS), as second-order underlying mecha- nisms for this pathological condition [3,4]. The factors defining MetS may lead to the onset of type-2 diabetes and CVD. This is the main reason why the study of the factors underlying MetS can be clinically useful. There is wide interest in the development of strategies for the prevention of MetS, mainly via two different approaches: a) pharmacology ? based on the use of drugs such as certain statins or AMPK (59 adenosine monophosphate-activated protein kinase) activating agents [5,6]; and b) nutrition?based on diet supple- mentation with functional compounds, e.g., proanthocyanidins [7] or iminosugars [8]. To test the efficacy of the different approaches, several animal models of MetS have been suggested, in which MetS is either induced by the diet [9,10] or results from some genetic alteration. Most of the genetically modified animals present mutations in the gene that codes for the leptin receptor [11], which impairs the capacity of leptin to regulate food intake and eventually leads to the development of insulin resistance. One such model is SHROB (spontaneously hypertensive obese) rats, also called Koletsky rats [12,13]. SHROB rats were generated by crossing a female spontaneously hypertensive rat (SHR), obtained by breeding high- blood-pressure Wistar-Kyoto rats, with a normotensive Sprague Dawley male, from which a single homozygous recessive trait PLOS ONE | www.plosone.org 1 August 2014 | Volume 9 | Issue 8 | e104637 256 appeared. That trait is a nonsense mutation in the leptin receptor, designated fak, which results in a premature stop codon in the extracellular domain of the leptin receptor that circumvents the process of transduction and thereby truncates all the leptin receptors [14,15]. SHROB rats, homozygous for this mutation, are therefore characterized by monogenetic obesity combined with a hypertensive background for which several phenotype aspects have been described, including hyperinsulinaemia, hyperlipidae- mia and nephropathy [15]. SHROB rats are thus a model for MetS, in accordance with some of its currently accepted defining factors, i.e., insulin resistance, hypertension, increased plasma triglyceride levels and obesity [16]. It has also been suggested that in SHROB rats hyperinsulinaemia is not accompanied by hyperglycaemia, this model would be especially useful for the study of the prediabetic state [17], in contrast to other animal models (e.g. Zucker rats) which develop type-2 diabetes. Despite its use as a model of MetS, a complete description of the SHROB rat phenotype, in relation to markers related to CVD and particularly OS, is lacking. Moreover, studies with SHROB rats have compared them with SHR, spontaneously hypertensive rats [15,18], a rat that is already mutated and in which several parameters are altered, and not with either of the original rat strains from which these rats were derived, i.e., Sprague-Dawley or Wistar Kyoto (WKY) rats. The aim of this work is to complete a phenotypic description of SHROB rats using previously unexplored parameters related to CVD, and compare it with that of non-mutated WKY rats. We obtained new data of relevance for the use of SHROB rats in nutrition studies. Materials and Methods Materials and reagents The A04 diet was from Harlan Iberica (Panlab S.L., Barcelona, Spain). Soybean oil, obtained from unrefined organic soy oil (first cold pressing), was from Clearspring Ltd. (London, UK). Ketamine chlorhydrate was from Merial Laboratorios (Barce- lona, Spain). Xylacine was from Quimica Farmaceutica (Barce- lona, Spain). [2H4]-15-F2t-IsoP, 15-F2t-IsoP and 15-F2t-IsoP methyl ester were obtained from Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA). 2,3,4,5,6-Pentafluorobenzyl (PFB) bromide, N,N- diisopropylethylamine (DIPE), acetonitrile, anhydrous sodium sulphate, heptane, phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF), di- thiothreitol (DTT), iodoacetamide, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Tris-HCl, 3,3-cholaminopropyl-dimethylammonio- 1-propanesulphonate (CHAPS), anhydrous magnesium chloride, bicinchoninic acid (BCA), 2,29-Azobis(2-amidinopropane) dihy- drochloride (AAPH), 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2- carboxylic acid (Trolox), fluorescein (sodium salt), acetone, phosphomolybdic acid, Bradford reagent, NADPH (b- Nicotin- amide adenine dinucleotide 29-phosphate reduced tetrasodium salt hydrate), glutathione reductase (GR from baker?s yeast), L- glutathione reduced (GSH minimum 99%), t- tert-butyl hydro- peroxide (t-BuOOH)) and L-glutathione oxidized (GSSG) were all obtained from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). N,O- bis(trimethylsilyl)trifluoro-acetamide (BSTFA) was from Supelco (Bellefonte, PA, USA). Hydrochloric acid fuming 37%, ethanol absolute, ethyl acetate, methanol, chloroform, Na2CO3, NaHCO3, EDTA Na 2+, o-phthalaldehyde (OPT), N-ethylmalei- mide (NEM) and thiobarbituric acid were purchased from Merck KGaA (Darmstadt, Germany). Fluorescein-5-thiosemicarbazide (FTSC) was purchased from Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). ProteoBlock protease inhibitor cocktail was purchased from Thermo Fisher Scientific Inc. (Rockford, IL, USA). Urea, thiourea, SDS, glycine and glycerol were obtained from USB (Cleveland, OH, USA). Ammonium persulphate (APS), IPG buffer, pharmalyte 3-10; bromophenol blue and 1,2-bis(dimethy- lamino)-ethane (TEMED) were purchased from GE Healthcare Bio-Sciences AB (Uppsala, Sweden). Acrylamide, bis (N,N9- methylene-bis-acrylamide) and the Bio-Rad protein assay were obtained from Bio-rad (Hercules, CA, USA). Drabkin Reagent and albumin were purchased from Qu??mica Clinica Aplicada (Tarragona, Spain). Na2HPO4, NaH2PO4, NaCl, epinefrine, KH2PO4, K2HPO4, trichloroacetic acid (TCA) and NaOH were purchased from Panreac Qu??mica (Barcelona, Spain). Water for the assay solutions was obtained using a Milli-Q water purification system from Millipore Corporation (Billerica, MA, USA). Animals Seven female, 11- to 14-week-old, spontaneously hypertensive obese rats (SHROB) (Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA) and seven female, 11-week-old WKY rats (control group) (Janvier, Le Genest-St-Isle, France) were used. They were kept away from male rats to minimize hormonal alterations. Experimental design The rats were kept in Macrolon cages (n=2?3/cage, 42562656180 mm) under controlled conditions of stable humid- ity (50610%), and temperature (2262uC) with a 12:12-h light/ dark cycle. All the groups were fed a standard pelleted A04 diet, given water (Ribes, Barcelona, Spain) ad libitum and administered a weekly oral dose of 0.8 mL/kg of soybean oil for 13-weeks-fatty acid composition provided as Table S1. The additional dose of fat (weekly excess of 5?10% of fat intake) was intended to accelerate the appearance of alterations in CV risk factors and OS related parameters. At week 15, one week after the last intragastric dose of soybean oil and oral glucose tolerance test (OGTT)?see below? the rats were fasted overnight, anesthetized intraperitoneally with ketamine and xylacine (80 mg/kg and 10 mg/kg body weight respectively), and then killed by exsanguination. All the procedures follow the European Union guidelines for the care and manage- ment of laboratory animals and all efforts were made to minimize suffering. The pertinent permission for this specific study was obtained from the CSIC (Spanish Research Council) Subcommit- tee of Bioethical Issues (ref. AGL2009-12 374-C03-03). Sample collection For urine collection, at week 12 of the experiment, the rats were placed in metabolic cages and deprived of food for 18 h; the animals had previously been acclimated to the metabolic cages. At the end of the experimental period, after one week of recuperation since the final intragastric dose of soybean oil, blood was collected by cardiac puncture under anaesthesia. Plasma, serum and erythrocytes were collected. Tissue samples collected from heart, brain, liver, and kidney were washed with 0.9% NaCl solution and immediately frozen in liquid nitrogen. Abdominal fat was weighed and immediately frozen. All the samples were stored at 280uC pending analysis. Before analysis, tissue samples were homoge- nized with sodium phosphate buffer and ultra-centrifuged. Cardiovascular disease risk factors Body weight was monitored weekly throughout the experiment. Determination of plasma lipid profile. Total plasma cholesterol (CHOL), LDL-cholesterol (LDLc), HDL-cholesterol (HDLc) and triglycerides (TG) were measured by spectrophoto- metric methods using the corresponding kits from Spinreact Cardiovascular Disease Parameters and Oxidative Stress in SHROB Rats PLOS ONE | www.plosone.org 2 August 2014 | Volume 9 | Issue 8 | e104637 257 (Girona, Spain). ApoA1 and ApoB100 were measured using ELISA kits purchased from Cusabio Biotech (Hubei, China) Determination of glycaemia. Blood glucose levels were measured by the enzyme electrode method using an Ascensia ELITE XL blood glucose meter from (Bayer Consumer Care (Basel, Switzerland). Plasma insulin was measured using ELISA kits from Millipore (Billerica, MA, USA). Homeostasis model assessments (HOMA) were calculated by applying the formula: fasting plasma glucose (mg/dL) times fasting insulin (mU/L) divided by 405 [19]. Glycated Hb was measured using a spectrophotometric kit from Spinreact. All these measurements were carried out at the end of the study. An OGTT was conducted at week 14 of the experiment after 18 h of food deprivation. Rats were administered a glucose dose of 2 g/kg body weight by gastric probe using a 29% glucose solution. The glucose concentration was measured by the enzyme electrode method, using single drops of blood taken from the saphenous vein at 0, 15, 30, 45, 60, 90 and 120 min after glucose administration. The AUC for serum glucose was calculated over the 2 h period. This test was carried out 1 week after the last intragastric dose of soybean oil. Blood pressure. Systolic and diastolic blood pressure were measured at week 13 of the experiment. In a quiet place, at an established time to reduce circadian rhythm interference, the rats were restrained in a rat pocket and maintained at 32uC. Systolic and diastolic blood pressure were measured three times by the tail- cuff method, using a non-invasive automatic blood pressure analyser (Panlab, Barcelona, Spain) as previously described [20]. Data are presented as the mean of three measurements. Markers of endothelial function, inflammation and thrombotic activity. The corresponding ELISA kits from Cusabio Biotech (Hubei, China) were used to measure the following parameters in plasma: vascular cell adhesion molecule- 1 (VCAM-1) and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) as markers of endothelial function; C-reactive protein (CRP) as an inflammation marker.; plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) as a marker of thrombotic activity. Endogenous antioxidant systems Activity of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT). SOD and CAT activities were measured using standard spectrophotometric methods [21,22] in the following samples: erithrocytes (0.23?1.84 mL and 0.5 mL, respectively), liver (167? 417 mg and 1.25 mg, respectively), abdominal fat (1.6?4 mg and 12 mg, respectively), kidney (667?1667 mg and 10 mg, respective- ly), heart (333?833 mg and 5 mg, respectively) and brain (833? 417 mg and 5 mg, respectively). Glutathione system. Glutathione peroxidase (GPx) and glutathione reductase (GR) activities were measured by spectro- photometric methods [23,24]. Glutathione (GSH) and glutathione disulphide (GSSG) were determined using fluorometric methods [25]. GR and GPx analysis were measured in the following samples: erythrocytes (8?48 mL ), liver (40?240 mg), abdominal fat (2? 12 mg), kidney (80?480 mg), heart (80?480 mg) and brain (500? 3000 mg). GSH and GSSG were measured in erythrocytes (149 mL), liver (75 mg), abdominal fat (372 mg), kidney (298 mg), heart (149 mg) and brain (372 mg). The standard curves used for the quantification of GSH and GSSG are provided as Figures S1 and S2. In both cases, the activities of the enzymes were normalized to the amount of protein by the Bradford method [26] and to the amount of Hb in erythrocytes by the Drabkin method [27]. Oxidative stress Determination of oxygen radical absorbance capacity. Total plasma antioxidant capacity was measured as the oxygen radical absorbance capacity (ORAC) [28], which measures the level of protection from the loss of intensity of the fluorescent molecules fluorescein, due to the action of peroxyl radicals generated from an azo-initiator. A standard curve for Trolox (reference compound for antioxidant capacity determina- tion) was prepared in the range 12.5?100 mM. Protein carbonylation. Protein concentrations in the ho- mogenates were determined according to the method of Bradford [26], using a standard curve between 0.125 and 0.975 mg protein/mL standard. Preparation of homogenates from liver aliquots, determination of the protein concentration in the homogenates and protein separation by 10% SDS-PAGE proteins from 250 mg liver were fractionated according to hydrophobicity, into proteins soluble at low ionic strength, mostly water-soluble proteins, and proteins soluble at high ionic strength, mostly hydrophobic proteins. After homogenization, each liver fraction (300 mL) and plasma (25 mL) were independently incubated with 1 mM fluorescein-5-thiosemicarbazide (FTSC) in the dark as previously described [29,30]. After incubation, the proteins were precipitated with an equal volume of 20% TCA (v/v), centrifuged and finally, re-dissolved in urea buffer (7 M urea, 2 M thiourea, 2% CHAPS, 0.5% Pharmalyte 3?10, 0.5% IPG 3?10 buffer and 0.4% DTT). To evaluate the protein carbonyl levels, 30 mg of each sample were subjected to one-dimensional (1-DE) 10% SDS- PAGE [31] and run in a Mini-protean 3 cell (Bio-Rad). After electrophoresis, FTSC-tagged proteins were visualized by exposing the gel to a UV transilluminator Molecular Imager Gel Doc XR System (Bio-Rad) equipped with a 520 nm band-pass filter (520DF30 62 mm) and the scanned one-dimensional gels were analysed with the 1-D gel analysis software LabImage 1D from Kapelan Bio-Imaging Solutions (Halle, Germany). Finally, the scanned analysed gels were stained overnight with the Coomassie dye PhastGel Blue R-350 (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) to visualize the total amount of protein in each sample. The global protein carbonylation level for each sample was quantified based on the overall optical volume of each lane in the FTSC-stained 1- D electrophoresis gel, whereas the oxidation level of a specific protein band was estimated by its optical intensity (peak height). Oxidized albumin (1 to 14 mg) was used as a positive control. Oxidized LDL. Plasma oxidized LDL (LDL-ox) was deter- mined with an ELISA kit from Cusabio Biotech, by measuring the absorbance at 450 nm on a PowerWave XS2 spectrophotometer from BioTec Instruments, Inc., (Winooski, VT, USA). Malondialdehyde (MDA). MDA concentrations were mea- sured in homogenized liver (80 mg of sample), kidney (80 mg), abdominal fat (80 mg), heart (10 mg) and brain (400 mg) with fluorescence detection [32]. The fluorescence at 515 nm excitation wavelength and 548 nm emission wavelength was determined on an LS50B spectrofluorimeter (Perkin Elmer, Alabama, USA). Determination of isoprostane 15-F2t-IsoP. Urine 15-F2t- IsoP was determined by GC/negative ion chemical ionization/MS (GC-NICI-MS) following the method of Milne et al. [33]. Briefly, after addition of the deuterated internal standard [2H4]-15-F2t- IsoP to 250 mL of urine, the samples were subjected to solid phase extraction (SPE) purification, with a C18 Sep-Pak column and a silica Sep-Pak column (both from Waters Associates, Milford, MA, USA). The F2-Isoprostanes were derivatized to pentafluorobenzyl (PFB) esters and further purified by thin layer chromatography (TLC) using 15-F2t-IsoP methyl ester as the reference compound with an RF value identical to the analyte. Finally, the pure derivatized analytes were converted to trimethylsilyl ether Cardiovascular Disease Parameters and Oxidative Stress in SHROB Rats PLOS ONE | www.plosone.org 3 August 2014 | Volume 9 | Issue 8 | e104637 258 derivatives and analysed by GC-NICI-MS using a Shimadzu QP201 instrument (Tokyo, Japan), fitted with a DB1701 fused silica capillary column (15 m60.25 mm i.d., 0.25 mM film thickness) from Agilent (J & W Scientific, Folsom, CA, USA). The 15-F2t-IsoP ion monitored was the carboxylate anion at m/z 569. Representative chromatograms used for the determination of 15-F2t-IsoP are provided as Figure S3. The final results are expressed in ng/mg creatinine. Creatinine levels from the urine samples were determined by a colorimetric method using a commercial kit from C-cromatest Linear Chemicals (Barcelona, Spain) by measuring absorbance at 510 nm on a SpectraMax M5 spectrophotometer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Statistical analysis The different analytical determinations in the biological samples were carried out in duplicate or triplicate, depending on the method. Results are expressed as the mean + SEM. The non- parametric Mann-Whitney U?s test was applied to analyse the significant differences (P,0.05) between groups. The SPSS IBM19 package for Windows was used throughout. The weight distribution between the groups of rats at each of the 15 time points was compared using the Wilcoxon Rank Sum test. Due to the large number of comparisons, a multi-test procedure that applies multiple comparisons as is known as the false discovery rate (FDR) [34] correction, with Simes? method [35] was used. With this procedure a comparison was considered statistically significant if the corresponding p-value was lower than or equal to the specific a-corrected value for the comparison. This analysis was performed using the statistical software STATA 12.0. Results Cardiovascular disease risk factors The SHROB rats were already obese at week 16, with a body weight twice that of the WKY rats (48369 g versus 22164 g). Moreover, while the WKY rats maintained a constant body weight up to week 27, the SHROB rats showed an increase from 476.8615.9 g at week 16 to 605.6619.5 g at week 27. Figure S4 shows the evolution of body weight of the SHROB and WKY rats during the study. Abdominal fat at the end of the study, expressed as percentage of body weight was 50% higher in the SHROB than in the WKY rats (Table 1). Plasma lipid profile. The SHROB rats presented signifi- cantly higher (P,0.01) levels of plasma total cholesterol, LDL- cholesterol, HDL-cholesterol and triglycerides than the WKY rats (Table 1). In particular, the SHROB rats showed a ninefold increase in total cholesterol and more than a tenfold increase in triglycerides, compared to the WKY rats. Plasma levels of both the anti-atherogenic ApoA1 and the pro-atherogenic Apo B100 were also significantly higher (P,0.01) in the SHROB rats than in the WKY rats (+33% and +62%, respectively). Glycaemia. No significant differences were observed in fasting plasma glucose, OGTT or in glycated Hb between the SHROB and WKY rats. In contrast, plasma insulin was significantly higher (P,0.01) in the SHROB rats than in the WKY rats (1.060.3 nM versus 0.360.1 nM, respectively), and consequently, the HOMA index was also higher in the SHROB rats (Table 1). Blood pressure. Both systolic and diastolic blood pressure were significantly higher (P,0.001) in the SHROB rats (193612 mmHg and 13565 mmHg, respectively) than in the WKY rats (12162 mmHg and 10662 mmHg) (Table 1). Endothelial dysfunction. ICAM-1 and VCAM-1 were measured as markers of endothelial dysfunction; considered the earliest stage in the atherosclerosis process. ICAM-1 showed an 84% increase in plasma levels in the SHROB rats compared to the WKY rats (P,0.001). No significant differences were found in plasma VCAM-1 between the SHROB and WKY rats (Table 1). Inflammation. Plasma C-reactive protein, determined as a marker of inflammation, was 65% higher in the SHROB rats than in the WKY rats (P,0.001) (Table 1). Thrombotic activity. The SHROB rats presented signifi- cantly higher (P,0.001) plasma levels of PAI-1 than the WKY rats (6.460.3 mg/mL versus 11.660.5 mg/mL, respectively) (Ta- ble 1). Endogenous antioxidant systems Endogenous antioxidant systems were evaluated in erythrocytes, tissues and organs of the SHROB and WKY rats at the end of the study (Table 2). SOD and CAT activity. The activity of the endogenous antioxidant enzymes was measured in erythrocytes, liver, abdom- inal fat, kidney and heart. No significant differences in SOD activity between SHROB and WKY rats were observed in any of the samples analysed. As regards CAT activity, brain was the only organ where significant differences (P,0.01) were found between the SHROB and WKY rats. Glutathione system. The status of the glutathione system was evaluated by quantifying the two forms of glutathione (GSH and GSSG) to calculate the GSH/GSSG ratio; and by measuring the activity of the associated enzymes (GR, which regenerates reduced glutathione; and GPx, which catalyses the oxidation of GSH to GSSG). Higher concentrations of GSH in liver (P,0.01), abdominal fat (P,0.05) and brain (P,0.01) were found in the SHROB rats than the WKY rats. GSH/GSSG was significantly (P,0.05) higher in the adipose tissue of the SHROB rats. GPx activity was also higher in the abdominal fat tissue (P,0.001) and brain (P,0.01) of the SHROB rats. In contrast, higher concentration of GSSG were found in the heart of the SHROB rats than in the WKY rats (P,0.01) and the SHROB rats showed lower GPx activity in erythrocytes and in liver (P,0.05) and lower GR activity in liver (P,0.05). Oxidative stress Several biomarkers of OS were measured in blood, urine and different organs in the SHROB and WKY rats (Table 3). Plasma antioxidant capacity, as determined by ORAC assay, was significantly (P,0.05) higher in the SHROB than in the WKY rats. Lipid oxidation was evaluated by determining oxidized LDL in plasma, MDA in liver, kidney, abdominal fat, heart and brain, and 15-F2t-IsoP in urine. Oxidized LDL in plasma was 50% higher in the SHROB rats than in the WKY rats, although this increase did not reach significance, due to the high interindividual variability of this parameter. Similarly, isoprostane 15-F2t-IsoP in urine was non-significantly higher in the urine of SHROB rats. Creatinine was higher in SHROB rats than in WKY rats (68 mg/ dL SEM 9 vs 58 mg/dL SEM 7); since 15-F2t-IsoP is expressed per mg of creatinine, the higher values of this isoprostane in the SHROB rats is not an artefact resulting from increased creatinine values. In contrast, MDA in abdominal fat was significantly lower (P,0.05) in SHROB rats than in WKY rats and overall protein oxidation-measured as total carbonyls-was lower in the SHROB than in the WKY rats in both the low and high ionic strength fractions of liver proteins (P,0.05) as well as in plasma (P=0.0571). Cardiovascular Disease Parameters and Oxidative Stress in SHROB Rats PLOS ONE | www.plosone.org 4 August 2014 | Volume 9 | Issue 8 | e104637 259 Discussion SHROB rats represent a particularly interesting animal model for MetS, a situation prior to the onset of type-2 diabetes or CVD, in which the different metabolic alterations may be addressed without the use of drugs. The aim of the present study was to contribute to the description of this animal model, by examining parameters related to cardiovascular function, inflammation and oxidative stress not previously reported. Total cholesterol, triglycerides, fasting glucose, insulin, glycated haemoglobin and blood pressure, have been examined before in SHROB rats [15,17] and in the related SHRSP (stroke-prone spontaneously hypertensive rat) model, after supplementation with soybean oil [36]. Our results concord with previous reports except for glycaemia; some authors found hyperglycaemia [15,37,38] while others reported normoglycaemia, [17,39], as we do. Anti- atherogenic ApoA1 and pro-atherogenic Apo B100 are now included in the lipid profile. Certain markers of endothelial dysfunction (ICAM-1 and VCAM-1), inflammation (C-reactive protein) and thrombotic activity (PAI-1) are also reported here for the first time. The SHROB rats exhibited significant alterations in abdominal fat, plasma lipid profile (total cholesterol, LDL-cholesterol, HDL- cholesterol, triglycerides, apoA1, apoB100), insulin, blood pres- sure, ICAM-1, C-reactive protein and PAI-1 (Table 1). In many of these parameters (lipid profile, markers of endothelial dysfunc- tion, inflammation and thrombotic activity), the values in the SHROB rats were at least 50% higher than in the WKY rats. Impairment of endothelial function in SHROB rats has previously been related to alterations in the nitric oxide pathway and the presence of visceral prostaglandins derived from perivisceral adipose tissue [36,37] All these results are consistent with high circulating fat, visceral fat accumulation and the state of low-level inflammation that precedes insulin resistance [40]. Inflammation appears to be the link between obesity and the development of insulin resistance in MetS [41]. The mutation (fak) in the leptin receptor of SHROB rats that impairs the ability of leptin to regulate fat intake would explain these effects with a direct relation to an excess of fat. Since OS is a complex process, where there are different interactions between endogenous antioxidants systems, progress of oxidation in biomolecules and levels of circulating exogenous antioxidants [42], we decided to measure markers corresponding to each one of these components of OS. The picture that emerges from our results is of a marked difference between systemic OS (as measured via the endogenous antioxidant system in erythrocytes and oxidized LDL in plasma) and OS in organs (as measured via the endogenous antioxidant system in tissues and organs, and via final lipid and protein oxidation products in organs and in urine). Both SOD and GPx activities in erythrocytes were significantly reduced in the SHROB rats, and this attenuation of the endogenous defence system was concomitant with a 50% increase in LDL oxidation. This is consistent with the preceding observations related to CVD biomarkers, since OS, particularly low SOD activity, has been shown to be present in subjects with MetS who also show high C-reactive protein levels [4]. However, this systemic OS was not immediately translated to the different organs, since the levels of MDA in liver and kidney and of 15-F2t- IsoP in urine were not significantly modified in the SHROB rats. Indeed, compared to the WKY rats, the SHROB strain presented a significant increase in GSH in liver, abdominal fat and brain as well as a significant decrease in overall protein carbonylation and lipid oxidation in abdominal fat. We found that, in SHROB rats, OS may present later than other reported organ disturbances such Table 1. CVD risk factors evaluated in the plasma of SHROB and WKY rats (mean value and SEM)1. Category Parameter SHROB WKY SEM SEM Physical measurements Abdominal fat (% bw) 6?7** 0?4 4?3 0?2 Plasma lipid profile Total cholesterol (mM) 8?3** 1?2 3?3 0?2 LDL-cholesterol (mM) 0?4* 0?1 0?1 0?004 HDL-cholesterol (mM) 2?9* 0?2 1?9 0?1 Total triglycerides (mM) 40?0** 0?0 5?6 1?1 Apo A1 (mg/dL) 68?3* 1?9 51?4 5?0 Apo B100 (mg/dL) 205?4* 18?7 126?8 5?3 Glycaemia Glucose (mM) 3.4 0.1 3.5 0.1 Insulin (nM) 1?0** 0?2?9 0?3 0?1 HOMA index 15?6** 2?4 5?6 1?1 OGTT (AUC) 5016?3 177?4 4494?0 122?8 Glycated Hb (%) 6?8 0?4 6?4 0?4 Blood pressure Systolic blood pressure (mmHg) 193?2** 12?5 121?0 2?2 Diastolic blood pressure (mmHg) 134?8** 5?2 106?5 1?7 Endothelial dysfunction VCAM-1 (mg/mL) 2?7 0?3 3?4 0?6 ICAM-1 (ng/mL) 1?0** 0?1 0?5 0?03 Inflammation C reactive protein (pg/mL) 285?9** 22?0 172?8 14?4 Thrombotic activity PAI-1 (mg/mL) 11?6** 0?5 6?4 0?3 1SHROB, Spontaneously Hypertensive Obese; WKY, Wistar Kyoto; OGTT, oral glucose tolerance test; VCAM-1, vascular cell adhesion molecule-1; ICAM-1, intercellular adhesion molecule-1; PAI-1, plasminogen activator inhibitor-1. Statistically significant differences between the samples are indicated by * (P,0.05), ** (P,0.01) and *** (P,0.001). doi:10.1371/journal.pone.0104637.t001 Cardiovascular Disease Parameters and Oxidative Stress in SHROB Rats PLOS ONE | www.plosone.org 5 August 2014 | Volume 9 | Issue 8 | e104637 260 as increased renal macrophage infiltration [43]. Also, it should be noted that even if total protein carbonylation in SHROB rats is shown to be lower than in WKY rats, we recently reported that key proteins involved in redox homeostasis, such as aldehyde dehydrogenase mitochondrial, protein disulphide-isomerase A3 or protein disulphide-isomerase, suffer higher oxidation in SHROB rats than in WKY rats [44]. Finally, the higher plasma antioxidant capacity in the SHROB rats, concordant with the lower protein carbonylation found in SHROB plasma may be the result of the activation of defence mechanisms that are not observed to have been overwhelmed in most organs. The observed differences between the different markers of OS, corresponding to different stages and elements of this process, emphasize the need to carry Table 2. Endogenous antioxidant systems in SHROB and WKY rats (mean value and SEM)1. Organ Parameter SHROB WKY SEM SEM Erythrocytes SOD (U/g Hb) 768?0 224?0 1444?0 161?0 CAT (mmol/min/g Hb) 51?9 4?1 41?5 13?1 GR (U/g Hb) 0?9 0?1 0?9 0?1 GPx (U/g Hb) 51?5* 10?3 101?5 14?4 Liver SOD (U/g mg prot) 8?3 0?5 8?7 0?6 CAT (mmol/min/mg prot) 70?8 9?8 81?1 10?9 GR (mU/mg prot) 66?7* 3?1 88?8 8?3 GPx (mU/mg prot) 245?4* 31?0 383?8 37?1 GSH (nmol/mg prot) 61?2** 9?6 29?9 2?6 GSSG (nmol/mg prot) 133?7 12?1 61?2 9?6 GSH/GSSG 0?5* 0?1 0?5 0?1 Abdominal fat SOD (U/g mg prot) 4?2 0?7 6?5 1?4 CAT (mmol/min/mg prot) 27?8 4?9 28?3 2?5 GR (mU/mg prot) 31?2 7?3 28?3 2?1 GPx (mU/mg prot) 38?7** 2?6 15?8 4?0 GSH (nmol/mg prot) 110?4* 24?9 41?7 6?4 GSSG (nmol/mg prot) 49?8 4?8 47?7 3?0 GSH/GSSG 2?2* 0?5 0?9 0?1 Kidney SOD (U/g mg prot) 2?2 0?3 2?8 0?4 CAT (mmol/min/mg prot) 24?1 3?1 33?5 7?6 GR (mU/mg prot) 47?1 11?72 41?64 3?93 GPx (mU/mg prot) 57?2 9?07 48?0 3?82 GSH (nmol/mg prot) 33?4 7?4 36?7 3?7 GSSG (nmol/mg prot) 0?5 0?1 0?6 0?1 GSH/GSSG 71?0 18?1 64?5 8?6 Heart SOD (U/g mg prot) 6?0 0?5 5?6 0?7 CAT (mmol/min/mg prot) 15?1 0?6 13?4 1?1 GR (mU/mg prot) 23?6 1?4 27?4 2?3 GPx (mU/mg prot) 146?6 9?9 159?6 9?0 GSH (nmol/mg prot) 21?5 2?8 18?1 2?1 GSSG (nmol/mg prot) 6?4** 0?6 4?5 0?3 GSH/GSSG 3?4 0?5 4?0 0?5 Brain SOD (U/g mg prot) 8?0 0?2 7?4 1?5 CAT (mmol/min/mg prot) 6?4** 0?9 2?2 0?7 GR (mU/mg prot) 67?4 7?3 49?8 3?7 GPx (mU/mg prot) 49?0** 5?3 30?9 1?5 GSH (nmol/mg prot) 87?2** 16?5 24?2 7?3 GSSG (nmol/mg prot) 5?2 0?4 3?0 1?0 GSH/GSSG 16?8 3?4 8?0 3?5 1SHROB, Spontaneously Hypertensive Obese; WKY, Wistar Kyoto; SOD, superoxide dismutase; CAT, catalase; GR, glutathione reductase; GPx, glutathione peroxidase; GSH, glutathione; GSSG, glutathione disulphide; Hb, haemoglobin. Statistically significant differences between the samples are indicated by * (P,0.05), ** (P,0.01) and *** (P,0.001). doi:10.1371/journal.pone.0104637.t002 Cardiovascular Disease Parameters and Oxidative Stress in SHROB Rats PLOS ONE | www.plosone.org 6 August 2014 | Volume 9 | Issue 8 | e104637 261 out this kind of integrated evaluations of OS in in vivo studies on metabolic syndrome. The results presented here provide an updated picture of CVD- related markers in SHROB rats. In blood, the animals show elevated levels of markers related to inflammation, endothelial dysfunction, thrombotic activity, insulin resistance and oxidative stress (C-reactive protein, total cholesterol, LDL-cholesterol, triglycerides, apoA1, apoB100, abdominal fat, blood pressure, ICAM-1 and PAI-1, insulin and oxidized LDL). In other organs (abdominal fat, liver and brain) the glutathione system is activated and oxidative stress remains low, according to the observed concentrations of final lipid and protein oxidation products. All these observations are consistent with a pre-diabetic obese status of SHROB rats with a high risk of developing CVD that may be used to evaluate the effects of nutritional interventions on the metabolic alterations present in MetS. Supporting Information Figure S1 Standard curve used to quantify GSH (gluta- thione). (DOC) Figure S2 Standard curve used to quantify GSSG (glutathione disulphide). (DOC) Figure S3 Representative chromatogram of endogenous 15-F2t-IsoP in rat urine. A) The m/z 573 ion current chromatogram represents the [2H4]-15-F2t-IsoP internal standard; the signal used to quantify 15-F2t-IsoP. B) The m/z 569 ion current chromatogram represents endogenous 15-F2t-IsoP. The injection volume was 1 mL. (DOC) Figure S4 Evolution of the body weight of SHROB and WKY rats from week 13 to week 27 of life. (DOC) Table S1 Fatty acid composition of the soybean oil provided weekly. Values are given as mean 6 SD. (DOC) Acknowledgments We thank Lorena Barros and Ma Jesus Gonzalez for technical support, as well as Mar??a Jose? Bleda Herna?ndez for support with the statistical analysis. Language revision by Christopher Evans is appreciated. Author Contributions Conceived and designed the experiments: IM JLT. Performed the experiments: EMT JPJ LL VSM NT MR MP LM AM. Analyzed the data: EMT JPJ SRR MC JLT. Wrote the paper: EMT JPJ SRR. References 1. Grundy SM (2008) Metabolic syndrome pandemic. Arteriosc Thormb Vasc Biol 28: 629?36. 2. Eckel RH, Alberti KGMM, Grundy SM, Zimmet PZ (2010) The metabolic syndrome. The Lancet 375: 2010, 181?83. 3. Festa A, D?Agostino R, Howard G, Mykka?nnen L, Tracy RP, et al. 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Organ Parameter SHROB WKY SEM SEM Plasma ORAC (mmol Trolox/mL) 44?8* 3?2 30?3 3?6 LDL-ox (ng/mL) 154?6 21?4 109?0 10?2 Overall protein oxidation (FTSC intensity) 78?9 12?0 136?0 2?4 Liver MDA (nmol/mg prot) 9?9 0?8 8?1 1?0 Overall low ionic strength protein oxidation (FTSC intensity) 51?3* 2?7 74?7 0?7 Overall high ionic strength protein oxidation (FTSC intensity) 81?4* 6?9 295?7 23?6 Abdominal fat MDA (nmol/mg prot) 5?6* 1?2 16?0 3?1 Kidney MDA (nmol/mg prot) 0?7 0?1 0?8 0?1 Heart MDA (nmol/mg prot) 4?8 0?8 4?3 0?9 Brain MDA (nmol/mg prot) 28?7 10?0 18?2 1?2 Urine 15-F2t-IsoP (ng/mg creatinine) 2?9 0?2 1?9 0?1 1SHROB, Spontaneously Hypertensive Obese; WKY, Wistar Kyoto; ORAC, oxygen radical absorbance capacity; MDA, malondialdehyde. Statistically significant differences between the samples are indicated by * (P,0.05), ** (P,0.01) and *** (P,0.001). doi:10.1371/journal.pone.0104637.t003 Cardiovascular Disease Parameters and Oxidative Stress in SHROB Rats PLOS ONE | www.plosone.org 7 August 2014 | Volume 9 | Issue 8 | e104637 262 13. Koletsky S (1975) Animal model of human disease: hypertension, obesity, type 4 hyperlipidemia, vascular disease. Am J Pathol 81: 463?66. 14. Takaya K, Ogawa Y, Hiraoka J, Hosoda K, Yamori Y, et al. (1996) Nonsense mutation of leptin receptor in the obese spontaneously hypertensive Koletsky rat. Nature Genetics 14: 130?31. 15. Ernsberger P, Koletsky RJ, Friedman JE (1999) Molecular pathology in the obese spontaneous hypertensive Koletsky rats: a model of syndrome X. Annals New York Acad Sci 892: 315?18. 16. Alberti KGMM, Eckel RH, Grundy SM, Zimmet PZ, Cleeman JI, et al. 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Cardiovascular Disease Parameters and Oxidative Stress in SHROB Rats PLOS ONE | www.plosone.org 8 August 2014 | Volume 9 | Issue 8 | e104637 263 1 EFFECT OF OMEGA-3 PUFA SUPPLEMENTATION AT DIFFERENT 1 EPA/DHA RATIOS ON THE SPONTANEOUSLY HYPERTENSIVE OBESE RAT 2 (SHROB) MODEL OF METABOLIC SYNDROME 3 Eunice Molinar-Toribio1, Jara P?rez-Jim?nez1,*, Sara Ramos-Romero1,2, Marta Romeu3, 4 Montserrat Giralt3, N?ria Taltavull3, M?nica Mu?oz-Cortes3, Olga J?uregui4, Luc?a 5 M?ndez5, Isabel Medina5 and Josep Llu?s Torres1 6 7 1 Institute of Advanced Chemistry of Catalonia (IQAC-CSIC), Barcelona, Spain 8 2 Biomedical Research Networking Center in Bioengineering, Biomaterials, and 9 Nanomedicine (CIBER-BBN), Zaragoza, Spain 10 3 Unidad de Farmacolog?a. Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud. Universidad 11 Rovira i Virgili, Reus, Spain 12 4 Scientific and Technological Centers of the University of Barcelona (CCIT-UB), 13 Barcelona, Spain 14 5 Instituto de Investigaciones Marinas (IIM-CSIC), Vigo, Spain. 15 16 * Corresponding author: 17 Jara P?rez-Jim?nez 18 Present address: Department of Metabolism and Nutrition, Institute of Food Science, 19 Technology and Nutrition (ICTAN-CSIC), Jos? Antonio Novais 10, 28040, Madrid, 20 Spain 21 E-mail: jara.perez@ictan.csic.es 22 Phone number: (+34) 91 549 23 00 23 24 264 2 2 Abstract 25 The increasing incidence of metabolic syndrome (MetS), a combination of risk factors 26 prior to the onset of CVD and type 2 diabetes, encourages studies of the role of 27 functional food components such as long-chain -3 PUFA as preventive agents. Here 28 we explore the effect of EPA and DHA on spontaneously hypertensive obese (SHROB) 29 rats, a model for MetS in a prediabetic state with mild oxidative stress, when these two 30 PUFA are administered in different proportions. Four groups (n = 7) of SHROB rats 31 were supplemented with EPA/DHA (1:1, 2:1 and 1:2) or soya bean oil as a control, for 32 13 weeks. The results show that, in all the proportions tested, EPA/DHA significantly 33 lowered total and LDL cholesterol compared to the control group. EPA/DHA (1:1, 2:1) 34 significantly decreased inflammation (C-reactive protein levels) and lowered oxidative 35 stress (decreased excretion of urinary isoprostanes) mainly at a proportion of 1:2. The 36 activity of antioxidant enzymes increased in erythrocytes, abdominal fat and kidney, 37 with magnitudes that depended on the EPA/DHA proportion. PUFA mixtures from fish 38 affect different MetS markers of CVD risk factors in SHROB rats depending on the 39 proportions of EPA/DHA. The activation of endogenous defence systems may be 40 related to the reduction of inflammation and oxidative stress. 41 42 43 44 45 265 3 3 Introduction 46 Metabolic syndrome (MetS) is a combination of features such as insulin resistance (IR) 47 hypercholesterolaemia, hypertriglyceridaemia, hypertension or obesity(1) that makes 48 subjects with MetS highly prone to developing type 2 diabetes mellitus (T2DM) and 49 CVD. MetS is also accompanied by low-grade chronic inflammation(2) and increased 50 oxidative stress (OS)(3). 51 The increasing incidence of MetS has encouraged the search for preventive strategies, 52 based either on drugs or on dietary approaches, including diet supplementation with 53 bioactive compounds from food sources. Long-chain -3 PUFA of marine origin are 54 key components of cell membranes that may be used as a functional food and dietary 55 supplement. The two most common -3 PUFA in fish oils are eicosapentaenoic acid 56 (EPA, 20:5) and docosahexaenoic acid (DHA, 22:6). Studies using different animal 57 models, such as rats with sucrose-induced or fructose-induced MetS, have shown that 58 regular supplementation with -3 PUFA decreases blood pressure and levels of insulin, 59 triglycerides, cholesterol, free fatty acids or total lipids(4,5). Due to the role -3 PUFA 60 play as mediators of nuclear events, they modulate these parameters via different 61 mechanisms, including interactions with other nutrients and effects on the expression of 62 genes involved in lipid and glucose metabolism(6). 63 In humans, -3 PUFA have been shown to modulate certain characteristic MetS features 64 such as IR, hypertension and dyslipidaemia, although their effects on other aspects of 65 CVD, such as the incidence of myocardial infarction or arrhythmia remain 66 controversial(7). However, it should be noted that to date, most trials have not considered 67 that the relative proportion of EPA and DHA may influence the results and this might 68 explain some of these controversies. Indeed, it has been observed that different 69 proportions of -3 and -6 PUFA have different effects on health(8), so different 70 proportions within the -3 series may also differentially affect MetS risk factors. We 71 recently compared the effects of supplementation with EPA/DHA at different ratios on 72 markers of CVD and OS in healthy Wistar (WKY) rats, and found that the proportion 73 1:1 was especially favourable for the improvement of some T2DM risk factors, such as 74 glycated Hb levels, as well as for a reduction of OS, as shown by increased plasma 75 antioxidant capacity and decreased protein oxidation(9,10). 76 266 4 4 Spontaneously hypertensive obese (SHROB, or Koletsky) rats are an animal model of 77 MetS. The strain exhibits a mutation which introduces a premature stop codon in the 78 extracellular leptin receptor domain, which results in truncated receptors that are 79 insensitive to leptin(11,12). The rats are obese, hypertensive and hyperinsulinaemic, 80 although they are not hyperglycaemic. They have been suggested as an appropriate 81 model for MetS in a prediabetic state(13,14). The aim of the current work is to evaluate 82 the effect of supplementation with EPA/DHA mixtures at the different proportions 83 found in fish and fish oil-based supplements (1:1, 2:1 and 1:2) on markers of CVD and 84 OS in SHROB rats, as an animal model for MetS. To the best of our knowledge, this is 85 the first study of the effect of -3 PUFA on SHROB rats. 86 MATERIALS AND METHODS 87 Materials and reagents. The standard A04 diet was obtained from Harlan Iberica 88 (Panlab S.L., Barcelona, Spain). Oils with different EPA/DHA ratios were obtained by 89 mixing appropriate amounts of the commercial fish oils AFAMPES 121 EPA 90 (AFAMSA, Vigo, Pontevedra, Spain), EnerZona Omega 3 RX (Milan, Italy) and Oligen 91 liquid DHA 80% (IFIGEN-EQUIP 98, S.L., Barcelona). Soya bean oil, obtained from 92 unrefined organic soya beans (first cold pressing), was from Clearspring Ltd. (London, 93 UK). Other reagents and chemicals were: ketamine chlorhydrate from Merial 94 Laboratorios (Barcelona, Spain). Xylacine from Quimica Farmaceutica (Barcelona, 95 Spain). b-glucuronidase (90 U/mL) was obtained from Sigma (St. Louis, MO, USA). 15-96 F2t-IsoP, [2H4]-15-F2t-IsoP, 5-F2t-IsoP, 5-F2c-IsoP, 8-F2t-IsoP, 15-F3t-IsoP and 2,3-dinor-97 15-F2t-IsoP were obtained from Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA) and were 98 used without further purification. Ethanol (analytical grade) was purchased from Carlo 99 Erba (Sabadell, Barcelona, Spain). Methanol, heptane, acetonitrile (all HPLC grade) and 100 formic acid (analytical grade), hydrochloric acid fuming 37%, ethanol absolute, ethyl 101 acetate, chloroform, Na2CO3, NaHCO3, EDTA, o-ftalaldehyde (OPT), N-102 ethylmaleimide (NEM) and albumin were obtained from Merck (Darmstadt, Germany). 103 Iodoacetamide, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Tris-HCl, acetone, 104 phosphomolybdic acid, Bradford reagent, NADPH (!-nicotinamide adenine 105 dinucleotide 2?-phosphate reduced tetrasodium salt hydrate), GReductase (glutathione 106 reductase from baker?s yeast), GSH (L-glutathione reduced minimum 99%), t-BuOOH 107 (tert-butyl hydroperoxide solution), GSSG (L-glutathione oxidized) and fluorescein-5-108 267 5 5 thiosemicarbazide were all obtained from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). N,O-109 bis(trimethylsilyl)trifluoro-acetamide (BSTFA) was from Supelco (Bellefonte, PA, 110 USA). Drabkin reagent was purchased from Qu?mica Cl?nica Aplicada (Tarragona, 111 Spain). Na2HPO4, NaH2PO4, NaCl, epinephrine, KH2PO4, K2HPO4, TCA and NaOH 112 were purchased from Panreac Qu?mica (Barcelona, Spain). Water for the assay solutions 113 was obtained using a Milli-Q water purification system from Millipore Corporation 114 (Billerica, MA, USA). 115 Animals. Twenty-eight female, 11- to 14-week-old, spontaneously hypertensive obese 116 (SHROB) rats (Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA) were used. They 117 were kept in a room containing no male animals to minimize the influence of hormonal 118 alterations. All the procedures strictly adhered to the European Union guidelines for the 119 care and management of laboratory animals and the pertinent permission was obtained 120 from the CSIC Subcommittee of Bioethical Issues (ref. AGL2009-12 374-C03-03). 121 Experimental design. The rats were kept in Makrolon cages (n = 2?3/cage) under 122 controlled conditions of stable humidity (50% SD 10%), and temperature (22?C SD 123 2?C) with a 12 h light?12 h dark cycle. The rats were randomly divided into four groups 124 (n = 7) each supplemented with a different oil mixture: EPA/DHA (1:1), EPA/DHA 125 (2:1), EPA/DHA (1:2) or soya bean oil as a control (isocaloric without -3 long chain 126 PUFA). All the groups were fed a standard pelleted A04 diet, given water (Ribes, 127 Barcelona, Spain) ad libitum and each group was orally administered a weekly dose of 128 0?8 mL/kg body weight of the corresponding oil mixture or soya bean oil for 13 weeks, 129 after one week of adaptation. All the diets had similar fat and energy content (Table S1). 130 Moreover, the weekly dose of oil orally administered did not alter the overall intake of 131 the animals in terms of macronutrients, compared to a standard diet, with 20% of the 132 weekly energy derived from proteins, 67% from carbohydrates and 13% from fat (Table 133 S1). The fatty acid composition of the supplements is also provided as Supplementary 134 Material (Table S2). Because PUFA are extremely susceptible to oxidation and the by-135 products are potentially toxic, the lipid oxidation levels were checked throughout the 136 experiment (peroxide values < 5 meq oxygen per kg of oil). Intragastric administration 137 was selected because PUFA have a strong tendency to oxidize when incorporated into 138 the animal feed, as demonstrated by our previous experience (data not shown). Oxidized 139 PUFA may seriously alter the results, as described for commercial pills(15). After week 140 268 6 6 16, the rats were fasted overnight, anesthetized intraperitoneally with ketamine and 141 xylacine (80 and 10 mg/kg body weight respectively), and then killed by 142 exsanguination. 143 Sample collection. For urine collection, at week 14/15 of the experiment, the rats were 144 placed in metabolic cages and deprived of food for 18 h after which time the samples 145 were collected. One week after this collection, the blood was collected by cardiac 146 puncture under anaesthesia; plasma, serum and erythrocytes were collected. Abdominal 147 fat was weighed and immediately frozen. Tissue samples collected from heart, brain, 148 liver, and kidney were washed with 0?9% NaCl solution, dried, weighed and 149 immediately frozen in liquid nitrogen. All the samples were stored at 80?C until 150 analysis. Before analysis, the tissue samples were homogenized with sodium phosphate 151 buffer and ultra-centrifuged. 152 Cardiovascular disease risk factors 153 Physical measurements. Body weight was monitored weekly throughout the experiment. 154 Abdominal fat was collected post mortem, weighed and expressed as the percentage of 155 body weight. 156 Determination of plasma lipid profile. Total plasma cholesterol (CHOL), LDL 157 cholesterol (LDLc), HDL cholesterol (HDLc) and triglycerides (TG) as well as ApoA1 158 and ApoB100 were measured by spectrophotometric methods using the corresponding 159 kits from Cusabio Biotech Co. (Wuhan, Hubei, China). Plasma oxidized LDL (LDL-160 ox,) was determined using an ELISA kit from Cusabio Biotech (Wuhan, Hubei, China), 161 by measuring the absorbance at 450 nm with a PowerWave XS2 spectrophotometer 162 from Biotek Instruments Inc., (Winooski, VT, USA). 163 Determination of glycaemia. Blood glucose levels were measured by the enzyme 164 electrode method using an Ascensia ELITE XL blood glucose meter from Bayer 165 Consumer Care (Basel, Switzerland). Plasma insulin was measured using an ELISA kit 166 from Millipore (Billerica, MA, USA). Blood glycated Hb was measured using a 167 spectrophotometric kit from Spinreact (Girona, Spain). 168 Markers of endothelial function, inflammation and thrombotic activity. The 169 corresponding ELISA kits from Cusabio Biotech (Wuhan, Hubei, China) were used to 170 269 7 7 measure the following parameters in plasma: vascular cell adhesion molecule-1 171 (VCAM-1) and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) as markers of endothelial 172 function; C-reactive protein (CRP, detection range 0?16-10 ng/mL) as an inflammation 173 marker; and plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) as a marker of thrombotic 174 activity. 175 Endogenous antioxidant systems 176 The activities of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) were measured in 177 erythrocytes, kidney, abdominal fat, heart and brain using standard spectrophotometric 178 methods(16,17). 179 Glutathione reductase (GR) and glutathione peroxidase (GPx) were determined in 180 erythrocytes and kidney by spectrophotometric methods(18,19). Glutathione (GSH) and 181 glutathione disulphide (GSSG) were determined in kidney using fluorometric methods, 182 at wavelengths of 350 nm (excitation) and 420 nm (emission)(20). Measurements in 183 erythrocytes were normalized to the amount of haemoglobin by the Drabkin method(21), 184 while those in tissues were normalized to the amount of protein estimated by the 185 Bradford method(22). 186 Isoprostanes 187 Isoprostanes (IsoPs) of the F2- and F3-series, were determined in urine samples by liquid 188 chromatography coupled to tandem mass spectrometry after electrospray ionization 189 (LC?ESI?QqQ?MS/MS) according to a procedure described previously(23,24), with some 190 modifications. Briefly, stock standard solutions of all isoprostanes were prepared in 191 ethanol (1 ng/?L) and stored at ?20?C under nitrogen. The mixture of standards was 192 prepared by mixing and diluting the appropriate stock solutions to the final 193 concentrations between 0?5 and 400 pg/?L. The internal standard [2H4]-15-F2t-IsoP was 194 prepared in ethanol (1 ng/?L) and added to the mixture of standards and samples at a 195 final concentration of 0?5 ng/?L. Urine samples (500 ?L) were acidified with formic 196 acid to pH 4?5-5?0. Then, 10 mL of b-glucuronidase (90 U/mL) was added to each 197 sample and incubated at 37?C for 2 h. Following incubation, the samples were cooled to 198 room temperature, then the pH was adjusted again to pH ~2?5 with formic acid. After 199 addition of the deuterated internal standard [2H4]-15-F2t-IsoP, the samples were 200 270 8 8 subjected to solid-phase extraction (SPE) on a C18 Sep-Pak cartridge from Waters 201 Associates (Milford, MA, USA). The cartridges were preconditioned with 5 mL 202 methanol followed by 7 mL of acid water (water acidified to pH 3 with formic acid) 203 prior to loading the samples. To remove interfering components, the cartridges were 204 washed with 10 mL acid water, 10 mL 9:1 (v/v) acid water/methanol, and 10 mL 205 heptane in succession. Then the IsoPs were eluted with 1 mL methanol, the eluate was 206 evaporated under nitrogen and the residues reconstituted with 100 L of the liquid 207 chromatography starting mobile phase ([A], see below). The IsoPs were analysed by 208 LC?ESI?QqQ?MS/MS using an Agilent 1100 HPLC series system (Agilent, 209 Waldbronn, Germany) equipped with an autosampler with the temperature set to 8?C, 210 fitted with a Luna C18 column (50 x 2?0 mm i.d.; 3?0 m packing) from Phenomenex 211 (Torrance, CA, USA) and coupled to an AB Sciex (Concord, Ontario, Canada) API 212 3000 triple quadrupole mass spectrometer. The instrument was operated in the negative 213 ion mode with a TurboIon spray source to obtain MS and MS/MS data and the source 214 temperature at 450?C. In the separation step, elution was accomplished with a binary 215 system consisting of [A] 0?1% aqueous formic acid and [B] 0?1% formic acid in 216 CH3CN, under an increasing linear gradient (v/v) of [B], [t(min), % B]: 0,10; 5,23; 217 12,50; 20,50; 21,100 at a flow rate of 0?2 mL/min. The IsoPs were detected in multiple 218 reaction monitoring (MRM) experiments, and their identity was confirmed using the 219 corresponding standard. Concentrations were interpolated in the calibration curves of 220 each standard (R2> 0?99 in all cases). Sample concentrations were calculated from the 221 equation y = mx + b, as determined by weighted (1/x2) linear regression of the standard 222 curve. The limit of detection (LoD) was established at a signal-to-noise (S/N) ratio of 3, 223 and the values were between 0?5 and 3?0 pg/?L depending on the standard. The limit of 224 quantitation (LoQ) was established at an S/N ratio of 10, and the values were between 225 1?0 and 10?0 pg/?L, depending on the standard. Peak integrations and S/N calculations 226 were performed using 1.4.2 Analyst software supplied by Applied Biosystems (Foster 227 City, CA, USA). The dwell time for the MRM experiments was 100 ms and the cycle 228 time was 2 s. The declustering potential and collision energy in MRM mode were 229 optimized for each standard in infusion experiments: 55 V and 28 eV for [2H4]-15-F2t-230 IsoP (357?197), 55 V and 38 eV for 15-F2t-IsoP (353?193), 50 V and 22 eV for 2,3-231 dinor-15-F2t-IsoP (325?237), 55 V and 34 eV for 5-F2t-IsoP (353?115), 55 V and 33 232 eV for 5-F2c-IsoP (353?115), 55 V and 36 eV for 8-F2t-IsoP (353?127), and 55 V and 233 271 9 9 33 eV for 15-F3t-IsoP (351?193). The results were expressed as pg IsoPs per mg 234 creatinine to correct for urine concentration. Creatinine levels from the urine samples 235 was determined by a colorimetric method using a commercial kit from C-cromatest 236 Linear Chemicals (Barcelona, Spain) by measuring absorbance at 510 nm on a 237 SpectraMax M5 spectrophotometer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). 238 Examples of the detection of IsoPs in the standards mixture and in a sample are shown 239 as Supplementary material (Figure S1 and Figure S2). 240 Statistical analysis 241 The results from the fatty acid composition (Table S1) are expressed as mean (SD) and 242 the results from the measurements in rat samples are expressed as mean (SEM). 243 Levene?s test and the Kolmogorov-Smirnov test were applied to assess variance equality 244 and normal distribution, respectively. One-way analysis of variance followed by Tukey's 245 post-hoc significance test was used when the assumptions of normality and equal 246 variance were met. Otherwise, non-parametric tests (Kruskal?Wallis and Mann?247 Whitney U rank-sum) were used to assess significance. Differences were considered to 248 show a tendency for P <0?1 and to be statistically significant for P <0?05. The SPSS 249 IBM19 for Windows was used throughout. 250 RESULTS 251 Physical measurements. Supplementation with EPA/DHA in different proportions did 252 not modify either the animal body weight time course or the percentage of abdominal 253 fat as compared to the control group (data not shown). 254 Measurements in plasma 255 Plasma lipid profile. EPA/DHA significantly (P < 0?05) lowered LDLc at all the 256 proportions tested, compared to the soya bean oil control group (Table 1). EPA/DHA 257 (2:1 and 1:2 groups) also decreased CHOL (P < 0?05), while EPA/DHA (1:1) had a non-258 significant lowering effect (P < 0?1). Triglycerides were significantly (P < 0?05) 259 decreased in the EPA/DHA (1:1 and 2:1) groups. LDL-ox in plasma was significantly (P 260 < 0?05) higher in all the EPA/DHA supplemented SHROB rats compared to the control 261 group. No significant differences were found in HDLc. 262 272 10 10 Glycaemia. Plasma glucose levels were not affected by EPA/DHA supplementation, 263 while insulin levels were significantly higher in the EPA/DHA (1:1 and 2:1) group (P < 264 0?05). Glycated Hb was significantly lower in all animals supplemented with EPA/DHA 265 compared to the control group (Table 1). 266 Inflammation. Levels of plasma CRP were significantly decreased by EPA/DHA 267 supplementation at 1:1 and 2:1 ratios (P < 0?05) (Table 1). 268 Endothelial dysfunction. EPA/DHA (1:2) increased VCAM-1 concentration in plasma 269 (P < 0?001); whereas ICAM-1 levels were not modified by supplementation (Table 1). 270 Thrombotic activity. None of the EPA/DHA supplementation ratios had any influence 271 on plasma levels of PAI-1 (Table 1). 272 Endogenous antioxidant systems 273 SOD and CAT activities. The activities of these antioxidant enzymes were evaluated in 274 erythrocytes, kidney, abdominal fat, heart, brain and liver of the EPA/DHA 275 supplemented SHROB rats after the 14 weeks of the experiment (Figures 1 and 2). No 276 differences were found in any of these enzymes in liver. 277 Compared to the soya bean oil control group, SOD activity was significantly higher in 278 erythrocytes, kidney, abdominal fat, heart and brain of the EPA/DHA (1:1) group; in 279 kidney and heart of the EPA/DHA (2:1) group (P < 0?05); and in heart of the EPA/DHA 280 (1:2) group (P < 0?05) (Figure 1). 281 CAT activity was significantly higher (P < 0?001) in erythrocytes and kidney of the 282 EPA/DHA (2:1) group, and lower in the brain of the of the EPA/DHA (1:1) group (P < 283 0?001) (Figure 1). 284 Glutathione system. The activity of the glutathione-associated enzymes GR and GPx 285 was measured in erythrocytes and kidney; the compartments where SOD and catalase 286 were most affected with respect to control rats (Figure 2). While in erythrocytes, only 287 activations in GPx activity were detected (P < 0?01) in the EPA/DHA (1:1 and 2:1) 288 supplemented rats, in kidney both enzymes were significantly activated (P < 0?01) in 289 the EPA/DHA (1:1 and 2:1) group (Figure 2). The ratio of the reduced to the oxidized 290 273 11 11 form of glutathione (GSH/GSSG) was lower (P < 0?05) in kidney of the EPA/DHA (1:1 291 and 2:1) groups (30?94, SEM=3?09 and 36?73, SEM=3?77, respectively) than in both 292 the control group (70?96, SEM=18?02) and the EPA/DHA (1:2) group (76?70, 293 SEM=7?58). 294 Urine isoprostanes. 295 Total urine IsoPs (including both free and glucuronidated forms) were determined by 296 LC?ESI?QqQ?MS/MS (Figure 3). 15-F3t-IsoP that would be derived directly from 297 supplemented EPA/DHA, was not detected in any of the samples, while 15-F2t-IsoP, 5-298 F2t-IsoP, 5-F2c-IsoP and 8-F2t-IsoP, endogenously derived from arachidonic acid, and 299 2,3-dinor-15-F2t-IsoP (a metabolite derived of 15-F2t-IsoP) were detected in all the 300 samples. Compared to the control group, the EPA/DHA (1:2) group showed a tendency 301 (P < 0?1) towards a decrease in the levels of all IsoPs tested, while the EPA/DHA (2:1) 302 group showed a tendency towards significantly lower levels of 2,3-dinor-15-F2t-IsoP (P 303 < 0?1). 304 DISCUSSION 305 The present study focuses on aspects of the action of !-3 PUFA in SHROB rats that 306 have not been addressed before, specifically their role in modulating OS and the 307 influence of the relative proportions of EPA and DHA on both OS and significant 308 markers of MetS. Our results indicate that EPA/DHA mixtures at different proportions 309 clearly improve the altered lipid profile in SHROB rats; the three proportions tested 310 (1:1, 2:1 and 1:2) decreased LDLc and EPA/DHA (1:1 and 2:1) decreased plasma 311 triglycerides. It has been reported that the effects of !-3 PUFA on the lipid profile are 312 derived from their capacity to up-regulate the expression of genes encoding proteins 313 involved in fatty acid oxidation while simultaneously down-regulating genes codifying 314 for proteins involved in lipid synthesis(25). According to our data, mixtures of EPA and 315 DHA that include more or equal amounts of the shorter EPA may be a better option than 316 an excess of DHA for the control of dyslipidaemia in MetS. Meta-analysis of clinical 317 studies revealed that both PUFA were similarly effective at decreasing triglycerides(26); 318 in this case the results with the SHROB model appear to differ from the outcome of 319 human studies. 320 274 12 12 Chronic inflammation is closely linked to obesity(27) and it is another relevant risk factor 321 for CVD(28). In the present study, we found a significant improvement in CRP plasma 322 concentration in obese SHROB rats fed EPA/DHA, indicative of an amelioration of the 323 systemic inflammation. It has been suggested that -3 PUFA show anti-inflammatory 324 effects because they cause a partial displacement of the pro-inflammatory -6 PUFA 325 pathway and, at the same time, they generate anti-inflammatory resolvins (from EPA 326 and DHA) and protectins (from DHA)(29,30). Also, recent results have shown that -3 327 PUFA inhibit NLRP3 inflammasome activation(31). Again, in our results, those mixtures 328 with more or equal amounts of EPA appear to be more effective than the DHA-rich (1:2) 329 mixture. Indeed, the 1:2 mixture increased the concentration of the adhesion molecule 330 VCAM-1, a marker of further inflammation, as previously reported in healthy WKY 331 rats(9). None of the mixtures had any effect on either ICAM-1 or the marker of 332 thrombotic activity PAI-1. The effects of -3 PUFA on adhesion molecules appears to 333 be a controversial point(32). 334 Regarding glucose metabolism, while none of the EPA/DHA mixtures modified 335 postprandial glycaemia, all of them significantly decreased plasma glycated Hb. This is 336 a beneficial effect of -3 PUFA that has also been observed in normal WKY rats(9). At 337 the same time, we observed that only the mixture with a higher proportion of EPA 338 tended to increase insulin secretion. This seems to agree with a previous study in which 339 DHA, but not EPA, prevented the increase in circulating insulin induced by conjugated 340 linoleic acid(33). In contrast, other authors reported that PUFA do not affect insulin 341 secretion in healthy pigs(34). Whereas the overall effect of PUFA on glucose metabolism 342 is still controversial, there is evidence that EPA and DHA may act at different sites and 343 involve different mechanisms related to insulin resistance(35). Consequently, mixtures at 344 different proportions yield different results. 345 As OS is another factor that has been closely related to MetS(3) we examined the effect 346 of EPA/DHA supplementation on endogenous antioxidant systems and IsoPs as the 347 gold-standard marker of OS(36,37). We found that EPA/DHA 1:1 increases SOD activity 348 in adipose tissue, erythrocytes, heart and brain of SHROB rats. In a previous study we 349 described that fat and erythrocytes of SHROB rats presented decreased SOD activity 350 compared to WKY rats(14). Now we show that EPA/DHA (1:1) supplementation can 351 increase SOD activities to values close to those found in healthy WKY rats. We also 352 275 13 13 previously reported that antioxidant enzyme activities in heart and brain of SHROB and 353 normal WKY rats were similar(14). In those organs, -3 PUFA appear to activate this 354 protective system in SHROB rats. This activation has also been observed in 355 erythrocytes of healthy WKY rats given EPA/DHA (1:1)(9). Moreover, EPA/DHA 356 mixtures also increase the activity of other enzymes, such as CAT and GPx in 357 erythrocytes, with this effect being more marked in rats supplemented with EPA/DHA 358 (2:1). In kidney, an organ particularly affected in this rat model(12) EPA/DHA (2:1) was 359 more effective than (1:1). We have also previously reported that endogenous antioxidant 360 systems in kidney were not altered in SHROB rats compared to WKY rats(14). In the 361 present study, EPA/DHA (2:1) caused an increase in the activity of different antioxidant 362 enzymes (SOD, CAT, GR and GPx) and a displacement of the glutathione system 363 towards accumulation of GSSG (a decreased GSH/GSSG ratio). All these results 364 suggest that EPA/DHA supplementation triggers some oxidative stress with subsequent 365 activation of defence mechanisms. The changes in markers of oxidative stress (plasma 366 LDL-ox and urine IsoPs) examined in this study are compatible with this. EPA/DHA 367 mixtures at all three ratios significantly increased plasma LDL-ox in SHROB rats. A 368 similar increase in LDL-ox in an animal model of MetS after supplementation with -3 369 PUFA has previously been described(38). These authors hypothesized that, because -3 370 PUFA are incorporated into cell membranes, they cause an increase in the peroxidability 371 index, i.e., the number of sites susceptible to lipid peroxidation. At this point it should 372 be noted, however, that in our present study the supplemented PUFA did not directly 373 contribute to the circulating lipid peroxides as demonstrated by the absence of 15-F3t-374 IsoP, which would have been derived from EPA and DHA. In apparent contradiction of 375 the results for plasma LDL-ox, the supplemented rats presented lower levels of urine 376 isoprostanes (Figure 3), particularly the EPA/DHA (1:2) group. This means that the 377 overall effect of EPA and DHA in the organism, as evidenced by the levels of 378 endogenous lipid oxidation, appears to be antioxidant. This overall antioxidant effect 379 may be caused by the activation of defence systems, which would also agree with our 380 previous observation that plasma antioxidant capacity increases after supplementation 381 of WKY rats with -3 PUFA(9). 382 It seems that taken together, our results indicate that EPA is especially relevant in the 383 activation of endogenous antioxidant systems and the decrease of circulating 384 triglycerides and CRP, while DHA is more effective at lowering IsoPs. These 385 276 14 14 differential effects may be due to different effects of EPA and DHA on signalling 386 pathways or on the expression of certain genes, particularly on those related to the 387 activation of antioxidant enzymes. It has been reported that EPA and DHA differently 388 influence transduction pathways related to cell growth, thereby affecting different 389 biological processes (39), the release of inflammatory cytokines by peripheral blood 390 mononuclear cells(40) and the expression of genes involved in lipid metabolism(41). Also, 391 the incorporation of either EPA or DHA into cell membranes has different effects on 392 their structure, as shown for endothelial cells, lymphocytes and in ion channel effects, as 393 observed in several cellular models(32). Another relevant factor is that EPA and DHA 394 may exhibit specific interactions with other food components such as vitamin E that 395 influence oxidative status, and act together with DHA in the expression of certain 396 genes(42). It is certainly the case that our observations indicate that the proportions of 397 EPA and DHA should be carefully considered when carrying out studies with -3 PUFA 398 or when comparing results from different studies. 399 In short, supplementation of SHROB rats, a model of MetS, with EPA/DHA mixtures at 400 different proportions significantly lowered CHOL and LDLc, compared to a control 401 group given a standard diet. Specific mixtures significantly decreased inflammation (C-402 reactive protein levels, 1:1 and 2:1 ratios), increased the activity of antioxidant enzymes 403 (SOD in erythrocytes and abdominal fat, 1:1 ratio; SOD, CAT, GR, GPx in kidney, 1:2 404 ratio) and showed a tendency towards decreasing excretion of urinary isoprostanes 405 (mainly 1:2 ratio). More LDL-ox was observed in all the supplemented groups. These 406 results are compatible with the stimulation of antioxidant defences by EPA/DHA 407 mixtures leading to lower oxidative stress together with a reduction of CVD risk factors 408 such as LDLc and inflammation in SHROB rats. 409 ACKNOWLEDGEMENTS 410 We thank technical support by Lorena Barros and M? Jesus Gonzalez. Language 411 revision by Christopher Evans is appreciated. The authors would like to thank AFAMSA 412 (Vigo, Spain) for the provision of the commercial fish oil AFAMPES 121 EPA. 413 FINANCIAL SUPPORT 414 This work was supported by the Spanish Ministry of Science and Innovation and of 415 277 15 15 Economy and Competitiveness (Grants AGL2009-12374-C03-01, -02 and -03; 416 AGL2013-49079-C2-1,2-R; respectively). The Panamanian Government 417 (SENACYT/IFARHU) and the Spanish Ministry of Science and Innovation are 418 acknowledged for their predoctoral fellowships to E.M.-T. and L.M., respectively. 419 ISCIII is also acknowledged for the postdoctoral contract ?Sara Borrell? to J. P.-J. 420 (CD09/00068). None of the funders had any role in the design, analysis of writing of 421 this article 422 CONFLICT OF INTEREST 423 None. 424 AUTHORSHIP 425 I.M. and J.L.T. designed the research. E.M.-T., J.P.-J., M.R., M.G., N.T., M.M.-C, O.J. 426 and L.M. carried out the experimental work. E.M.T., J.P.-J., S.R.-R. and J.L.T. analysed 427 the data. E.M.-T., J.P.-J. and S.R.R. wrote the first draft of the manuscript. J.P.-J. and 428 J.L.T. had primary responsibility for final content. All the authors have read and 429 approved the final version of this manuscript. 430 431 REFERENCES 432 [1] Eckel RH, Alberti KGMM, Grundy SM et al. (2010) The metabolic syndrome. 433 Lancet 375, 181-83. 434 [2] Festa A, D?Agostino R, Howard G et al. (2000). Chronic subclinical inflammation 435 as part of the insulin resistance syndrome: the Insulin Resistance Atherosclerosis Study 436 (IRAS). Circulation 402, 42-47. 437 [3] Armutcu F, Ataymen M, Atmaca H et al. (2008) Oxidative stress markers, C-438 reactive proteins and heat shock protein 70 levels in subjects with metabolic syndrome. 439 Clin Chem Lab Med 46, 785-90. 440 [4] Aguilera AA, D?az GH, Barcelata ML et al. (2004) Effects of fish oil on 441 hypertension, plasma lipids and tumor necrosis factor-! in rats with sucrose-induced 442 278 16 16 metabolic syndrome. 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J 545 Cell Physiol 215, 765-70. 546 282 20 20 FIGURE LEGENDS 547 Figure 1. SOD and CAT activities in different organs and tissues of SHROB rats 548 supplemented with EPA/DHA at different proportions (1:1, 2:1, 1:2) and soya bean oil 549 as control diet (mean value and SEM). * P < 0?05, ** P < 0?01, and *** P < 0?001 vs 550 Control; $ P < 0?05 vs EPA/DHA (1:1). Comparisons were performed using Kruskal-551 Wallis and Mann-Whitney U tests 552 Figure 2. GR and GPx activities in different organs and tissues of SHROB rats 553 supplemented with EPA/DHA at different proportions (1:1, 2:1, 1:2) and soya bean oil 554 as control diet (mean value and SEM). ** P < 0?01, and *** P < 0?001 vs Control; $ P < 555 0?05 vs EPA/DHA (1:1). Comparisons were performed using Kruskal-Wallis and Mann-556 Whitney U tests 557 Figure 3. Urine isoprostanes in SHROB rats supplemented with EPA/DHA at different 558 proportions (1:1, 2:1, 1:2) and soya bean oil as control diet (mean value and SEM).  P < 559 0?1 vs Control. The structures of the compounds are shown below. 15-F3t-IsoP was not 560 detected in any of the samples. Comparisons were performed using Kruskal-Wallis and 561 Mann-Whitney U tests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vs &RQWURO P ?vs &RQWURO P ?vs &RQWURO?P ?vs &RQWUROP ?YV  285 SHROB, spontaenously hypertensive obese; CHOL, cholesterol; LDLc, LDL-cholesterol; HDLc, HDL-cholesterol; VCAM-1, vascular cell adhesion molecule-1; ICAM-1, intercellular adhesion molecule-1; PAI-1, plasminogen activator inhibitor-1 a Comparisons were performed using one-way analysis of variance (ANOVA) and the Tukey's post hoc significance tests b Comparisons were performed using Kruskal-Wallis and Mann-Whitney U tests * P < 0?05 vs Control; ** P < 0?01 vs Control; *** P < 0?001 vs Control; ? P < 0?1 vs Control ; $ P < 0?05 vs 1:1 )LJXUH   Erythrocytes Kidney Brain Abdominal Fat Heart 286 )LJXUH Erythrocytes Kidney  287 )LJXUH   COOH HO HO OH HO HO COOH OHHO HO COOH OH HO HO COOH OH HO HO OH COOH HO HO OH COOH )W,VR3 GLQRU)W,VR3 )W,VR3 )W,VR3 )F,VR3 )W,VR3 288 D-Fagomine lowers postprandial blood glucose and modulates bacterial adhesion Livia Go?mez1?, Eunice Molinar-Toribio2?, Mar??a A?ngeles Calvo-Torras3, Carles Adelantado3, M. Em??lia Juan4, Joana M. Planas4, Xavier Can?as5, Carles Lozano1, Sergio Pumarola1, Pere Clape?s2 and Josep Llu??s Torres2* 1Bioglane SLNE, Tavern 17, 08006 Barcelona, Spain 2Institute for Advanced Chemistry of Catalonia (IQAC), CSIC, Jordi Girona 18-26, 08034 Barcelona, Spain 3Facultat de Veterina`ria, Universitat Auto`noma de Barcelona, Bellaterra, Spain 4Departament de Fisiologia and Institut de Recerca en Nutricio? i Segurat Alimenta`ria (INSA-UB), Universitat de Barcelona (UB), Avinguda Joan XXIII s/n, 08028 Barcelona, Spain 5Barcelona Science Park, Baldiri Reixac 4-6, 08028 Barcelona, Spain (Submitted 14 March 2011 ? Final revision received 3 August 2011 ? Accepted 8 August 2011 ? First published online 3 October 2011) Abstract D-Fagomine is an iminosugar originally isolated from seeds of buckwheat (Fagopyrum sculentum Moench), present in the human diet and now available as a pure crystalline product. We tested D-fagomine for activities connected to a reduction in the risk of developing insulin resistance, becoming overweight and suffering from an excess of potentially pathogenic bacteria. The activities were: intestinal sucrase inhibition in vitro (rat mucosa and everted intestine sleeves), modulation of postprandial blood glucose in rats, bacterial agglutination and bacterial adhesion to pig intestinal mucosa. When ingested together with sucrose or starch, D-fagomine lowered blood glucose in a dose-dependent manner without stimulating insulin secretion. D-Fagomine reduced the area under the curve (0?120min) by 20% (P,0?01) and shifted the time to maximum blood glucose concentration (Tmax) by 15min at doses of 1?2mg/kg body weight when admi- nistered together with 1 g sucrose/kg body weight. Moreover, D-fagomine (0?14mM) agglutinated 60% of Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Salmonella enterica serovar Typhimurium) populations (P,0?01), while it did not show this effect on Bifidobacterium spp. or Lactobacillus spp. At the same concentration, D-fagomine significantly (P,0?001) inhibited the adhesion of Enterobacteriaceae (95?99% cells in the supernatant) and promoted the adhesion of Lactobacillus acidophilus (56% cells in the supernatant) to intestinal mucosa. D-Fagomine did not show any effect on bacterial cell viability. Based on all this evidence, D-fagomine may be used as a dietary ingredient or functional food component to reduce the health risks associated with an excessive intake of fast-digestible carbohydrates, or an excess of potentially pathogenic bacteria. Key words: Fagomine: Iminosugars: Insulin resistance: Weight management: Microbiota D-Fagomine (1,2-dideoxynojirimycin) is a six-membered ring iminocyclitol that was first isolated from seeds of buckwheat (Fagopyrum sculentum Moench, Polygonaceae)(1) and is also present in other plant sources such as mulberry (Morus Alba, Moraceae) leaves(2) and gogi (Lycium chinense) roots(3). Iminocyclitols, also referred to as iminosugars, are carbohydrate analogues in which the endocyclic oxygen has been replaced by nitrogen (Fig. 1) and the spatial configur- ations of the hydroxyl groups are coincident with those of sugars (e.g. glucose, galactose, fucose and mannose). D-Fagomine was the first iminosugar found in plants and it is present in the human diet, since buckwheat flour is used in the elaboration of many traditional foods including Japanese soba noodles, French galletes de Bretagne and Italian polenta. Another common iminocyclitol is 1-deoxynojirimycin (DNJ), which is the most abundant iminosugar found in mulberry(4). D-Fagomine presents the molecular configuration of D-glucose and D-mannose on carbons 3, 4 and 5, while DNJ is a sugar mimetic of D-glucose. D-Fagomine and DNJ are particularly stable compounds, both chemically and metabolically(5). DNJ and other iminosugars are inhibitors of intestinal disac- charidases such as sucrase, lactase and maltase as well as other ? L. G. and E. M.-T. contributed equally to this work. *Corresponding author: J. L. Torres, fax ?34 93 204 5904, email joseplluis.torres@iqac.csic.es Abbreviations: DNJ, 1-deoxynojirimycin; GI, glycaemic index; GL, glycaemic load; IR, insulin resistance. British Journal of Nutrition (2012), 107, 1739?1746 doi:10.1017/S0007114511005009 q The Authors 2011 Br iti sh Jo ur na l of N ut ri tio n 289 glycosidases (i.e. exo- and endosaccharidases) that break down oligomeric and polymeric saccharides(2,6). This inhibitory effect has the potential to quench and delay the hyperglycaemic response to oral sucrose and starch. This is nutritionally relevant because persistent hyperglycaemia from carbohydrate abuse may lead to insulin resistance (IR), elevated fasting blood glucose and excess weight. IR, elevated fasting blood glucose, increased waist circumference, dyslipi- daemia and high blood pressure are factors in the so-called metabolic syndrome(7). IR may develop into type 2 diabetes which carries with it a major risk of CVD which are by far the leading cause of morbidity and mortality in many countries, including the USA(8). Obesity and type 2 diabetes are considered modern epidemics, and their incidence is par- ticularly alarming among children and adolescents(9). The pro- blem is far from being satisfactorily addressed, considering the high availability and low cost of energy-dense foods com- pared to low-energy-density healthier alternatives(10,11). As iminocyclitols are sugar mimetics, they may also have the capacity to inhibit the protein?carbohydrate-mediated adhesion of bacteria to epithelial surfaces. This may be an important activity because the virulence of potentially deleter- ious strains such as Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium is associated with their tight adhesion to mucosal surfaces, typically through lectins expressed in the tip of their fimbriae(12) while putatively beneficial bacteria, such as probiotic strains of Lactobacillus spp. and Bifidobacterium spp., are more loosely attached(13). This would again be a particularly important activity of iminosugars, as the composition of the intestinal microbiota is influenced by dietary habits and gut micro-organisms play a role in the regulation of the host?s energy homeostasis and fat storage(14). The activity of iminosugars as antiadhesive binding agents and their potential role as modulators of bacterial adhesion have not been extensively researched. A recent paper linked the iminosugar DNJ to the inhibition of Streptococcus mutans biofilm formation(15). Other authors(16) reported that the antiadhesive effect of hydrophobic N-alkylated-DNJ was due to the hydrophobic moiety, since DNJ itself was inactive. In the search for new nutritional tools to reduce the risk of developing IR and becoming overweight, we considered D-fagomine (Fig. 1), a mild glycosidase inhibitor(17), as a suit- able candidate for a dietary ingredient and functional food component. Nothing has yet been reported concerning the effects of orally administered D-fagomine, possibly because, as a weak inhibitor in vitro, it has always been assumed that its in vivo efficacy would be limited. The only in vivo effect claimed for D-fagomine was the stimulation of insulin release after intraperitoneal administration to streptozotocin-diabetic mice(18). We also considered that, due to its structural similarity with D-mannose, D-fagomine could have some effects on bacterial adhesion. There are no previous reports of any antiadhesive activity of D-fagomine. The lack of infor- mation on the activities of oral D-fagomine may also be due to low availability from both natural and synthetic sources. However, an elegant and expedient chemo-enzymatic method has now been developed which is opening up the possibility of obtaining pure crystalline D-fagomine in g to kg quantities for thorough testing(19,20). Using this preparation, we examine in the present study the modulation of both post- prandial blood glucose concentration and bacterial adhesion by D-fagomine. Materials and methods Reagents D-Fagomine, provided by Bioglane (Barcelona, Spain) was manufactured following the patented proprietary enzymatic catalysis procedure described in WO2008025826A1. We used the resulting crystalline pure (assay 98%) preparation of D-fagomine (Fagopurew) to evaluate the activity of D-fagomine along the intestinal tract as a modulator of both glycosidase activity and bacterial adhesion. Other reagents and chemicals were: DNJ (Carbosynth Limited, Compton, Berkshire, UK), miglitol (Zhejiang Medicine Company Limited, Xinchang Pharma, Chengguan Town, China), acarbose (Serva Electro- phoresis GmbH, Heidelberg, Germany), sucrose (Sigma- Aldrich, St Louis, MO, USA), starch (maize starch C-TEX 06 201; Cargill-Cerestar, Martorell, Spain), phloridzin dihydrate (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), ketamine chlorhydrate (Imalgene 1000; Merial Laboratorios S.A., Barcelona, Spain), xylacine (Rompun 2%; Qu??mica Farmace?utica S.A., Barcelona, Spain), 4-hydroxybenzoic acid (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany), 4-aminoantipyrine (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), Glucose oxidase type II-S from Aspergillus niger (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany), Peroxidase Type II from horseradish (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), Tris (hydroxymethyl)aminomethane (Tris; Roche Diagnostics, Meinheim, Germany). Water for the preparation of buffers and other assay solutions was obtained using a water purification Milli-Q system (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA). Rats and diets A total of seventy-seven adult male Sprague?Dawley rats of 175?250 g body weight (Janvier, Le Genest-St-Isle, France) were housed in cages (n 3?4/cage) under controlled con- ditions of stable humidity (40?77%), and temperature (238C) with a 12 h light?12 h dark cycle. The rats were fed ad libitum OH OH N H OH N H (a) (b) HO HO HO HO 3 3 4 6 5 2 2 5 64 11 OH OH OH O (d) HO HO 3 2 1 4 6 5 OH(c) HO HO OHOH O 3 12 4 6 5 Fig. 1. Chemical structures of iminocyclitols (a) 1-deoxynojirimycin and (b) D-fagomine) compared to configurationally similar monosaccharides ((c) D-glucose and (d) D-mannose). L. Go?mez et al.1740 Br iti sh Jo ur na l of N ut ri tio n 290 a standard diet (Panlab A04; Panlab, Barcelona, Spain) and given water. To minimise circadian rhythm effects, rat manip- ulations were carried out in the morning. Handling and killing of the animals were in full accordance with the European Union guidelines for the care and management of laboratory animals and the pertinent permission was obtained from the CSIC Subcommittee of Bioethical Issues (ref. AGL2009- 12 374-C03-03). The authors further attest that all efforts were made to minimise the number of animals used and their suffering. Sucrose/starch-loading test The sucrose/starch-loading test was performed after a 12 h food deprivation period. A solution of sucrose or starch (1 or 2 g/kg body weight) together with the appropriate amount of the compound being tested was administered to the rats. Negative and positive control experiments were performed by administration of only water and carbohydrate solutions, respectively. The appropriate doses of D-fagomine (1, 2, 4mg/kg body weight), DNJ, miglitol (N-hydroxyethyl- DNJ) and acarbose (2mg/kg body weight) were administered as water solutions (5ml/kg body weight) using a gastric probe. We used four or five animals for each condition tested. Blood samples were collected from the saphenous vein(21) at 0, 15, 30, 45, 60, 90 and 120min after administration. Blood glucose concentration was measured by the enzyme electrode method using a blood glucose meter Ascensia ELITE XL (Bayer Consumer Care AG, Basel, Switzerland). Insulin concentration was measured using the rat/mouse insu- lin ELISA kit from Millipore Corporation, in plasma obtained from blood samples (0?1ml) collected into tubes containing EDTA at 0, 8, 15, 30, 60 and 120min after administration. The plasma was kept at 2808C until analysis. Sucrase activity measurements on tissue homogenates and everted intestine sleeves The activity of brush-border sucrase (glycosidase EC 3.2.1.48) was assayed on jejunal mucosa and everted intestine sleeves following Dahlqvist(22) and Lee et al.(23). For the preparation of gut mucosal homogenates, the rats were fasted overnight and then anaesthetised with ketamine chlorhydrate (90mg/kg body weight intraperitoneally) and xylacine (10mg/kg body weight intraperitoneally). The anaesthetised rats were killed by cervical dislocation. The small intestine was removed, and carefully divided into duodenum, jejunum and ileum. The jejunum was washed with ice-cold isotonic saline (5ml), opened lengthwise and the mucosa scraped off with a micro- scope slide. The samples were added to ice-cold isotonic saline (50mg mucosa/ml) and homogenised using a T10 basic Ultra-Turrax (IKA, Staufen, Germany). Sucrase activity was determined by colorimetric measurement of the glucose release by the action of sucrase on sucrose, according to the classic procedure in Dahlqvist(22). Each product (D-fagomine, DNJ, miglitol, acarbose) was tested on the mucosa of five rats at concentrations ranging from 0?2 nM to 1mM in the presence of 0?1M-sucrose (substrate). Inhibitors (5ml) and suitably diluted homogenised mucosa (95ml) were pre-incubated (30min at 378C); then the reaction was carried out in phosphate buffer pH 6?8 (300ml) by the addition of the substrate (0?1ml). Substrate, inhibitor and homogenised mucosa were incubated together (30min at 378C and 250 rpm) in triplicate. The reaction was terminated by the addition of Glucostat solution (2ml) (Tris 0?5M; 4-hydroxybenzoic acid 10mM; 4-aminoantipyrine 0?4mM; glucose oxidase 1480 IU/l (24?672 mkatal/l), peroxidase 250 IU/l (4?167 mkatal/l), pH 7?3). After further incubation (2?5 h at 378C), the amount of glucose was measured at 505 nm using an ELISA reader and ninety-six-well plates. Enzyme activity (mmol of substrate hydrolysed/h) was normalised to protein content evaluated by the Bradford method(24). To prepare the everted intestine sleeves, the jejunum was obtained as described previously, flushed with ice-cold iso- tonic saline (5ml) and cut into 3-cm-long segments that were weighed. Each segment was everted using a plastic pip- ette tip (yellow) and both ends were secured by tying knots. The brush-border membrane facing the lumen in vivo now faced outwards. Because the glucose released by the action of sucrase would be taken up into the tissue by the GLUT, this was inhibited by pre-incubating the sleeves (30min at 378C and 250 rpm) in Ringer?s solution containing the GLUT inhibitor phloridzin (0?5mM)(23). The sleeves then were incu- bated (16min at 378C, pH 7?3 and 250 rpm) in Ringer?s solution (5ml) containing sucrose (50mM) as well as phloridzin (0?5mM) and the appropriate concentration of the inhibitor (0?2 nM to 1mM). After incubation, the sleeves were removed and aliquots (500ml) of the incubation solution were added to tubes containing Glucostat solution (2ml) in triplicate. These were then incubated (2 h at 378C and 250 rpm) and afterwards absorbance at 505 nm was read on a SpectraMax M5 spectrophotometer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Sucrase activity (mmol of substrate hydrolysed/h) was normalised to mg of wet weight of the intestinal sleeve. Bacterial agglutination The strains used were obtained from the Bacterial Strain Col- lection of the Faculty of Veterinary Science at the Universitat Auto`noma de Barcelona. Overnight cultures of each bacterial strain were inoculated into 100-ml flasks containing Luria medium to facilitate the production of fimbriae. The strains were incubated at 378C for 24 h. Colonies were grown on Luria medium Agar plates (Liofilchem, Roseto degli Abruzzi, Italy) and after 24 h of incubation, several dilutions were pre- pared in PBS for each strain, down to a concentration of 108 colony-forming units/ml. Bacterial suspensions in the pre- sence of D-fagomine at final concentrations of 20 and 200mg/l (0?14 and 1?4mM) were incubated for 90min at room temperature. The suspensions were spread onto slides, observed under an optical microscope and compared with negative control cultures and positive control suspensions obtained with mannose 0?05M. A minimum of twenty fields were evaluated for aggregations. The results were expressed as percentages of aggregation related to the number of aggre- gations obtained with mannose 0?05M (100%). Fagomine along the intestinal tract 1741 Br iti sh Jo ur na l of N ut ri tio n 291 Bacterial adhesion to intestinal mucosa The mucosa was obtained from intestinal segments of pigs, just after they were killed at a local slaughterhouse, and kept frozen until use. The mucosa preparation (1ml) was defrosted, centrifuged and mixed with PBS (99ml). Before each test, the concentration of mucin in the suspension was calculated by the Bradford method(24). Multiwell plates (Nuncw; Nunc A/S, Roskilde, Denmark) were coated by incu- bation with the mucosa suspension (2?5ml) overnight at 48C. Then the unbound mucosa was carefully sucked off and the wells gently loaded with bacterial suspensions (107 colony- forming units/ml) followed immediately by the addition of the appropriate amount of D-fagomine to reach the desired final concentrations (10 and 20mg/l, 0?07 and 0?14mM) in a total volume of 1?5ml. The mixtures were incubated at 378C for 90min. Mannose 0?05M was used as a positive control and the experiment was performed in triplicate. Finally, the colony-forming units from both the supernatant and mucosa were counted under an optical microscope after cultivating both fractions overnight. Statistics The results from the sucrase inhibition tests are expressed as mean values with their standard errors. Student?s t test (two- tailed distribution) was carried out to analyse the differences between the two assays. We applied a non-linear sigmoid dose?response inhibition approximation model to derive the IC50 values for enzyme inhibition. The areas under the curve from the sucrase/starch-loading tests were calculated using the trapezoidal rule. Statistical differences were evaluated by two-way ANOVA and Bonferroni?s post test. Results with P,0?05 were taken as significant. All data manipulation and statistical analysis were performed using Graph Pad Prism 4 (Graph Pad Software, Inc., San Diego, CA, USA). Results Effect of D-fagomine on postprandial blood glucose in vivo D-Fagomine lowered postprandial glycaemia in Sprague? Dawley rats following the intake of sucrose and starch (Fig. 2). D-Fagomine effectively modulated postprandial glycaemia in a dose-dependent manner (Fig. 3) that resulted in a reduction in area under the curve at 120min between 17% (1mg D-fago- mine/kg bodyweight) (P,0?01) and 43% (4mg D-fagomine/kg body weight) (P,0?001) after the intake of 1 g sucrose/kg body weight. No significant differences (P.0?05) between the doses of 1 and 2mg D-fagomine/kg body weight were recorded under our experimental conditions. D-Fagomine lowered the maxi- mum blood glucose concentration from 5?8mM to 5?4, 4?8 and 4?4mM at doses of 1, 2 and 4mg/kg body weight, respectively, and shifted the time to maximum blood glucose concentration (Tmax) from 15 to 30min (doses of 1 and 2mg D-fagomine/kg body weight) and to 45min (4mg D-fagomine/kg body weight) (Fig. 3). The efficiencies of D-fagomine, DNJ, miglitol (N-hydroxyethyl-DNJ) and acarbose on blood glucose concen- tration in healthy Sprague?Dawley rats given a single dose of sucrose were of the same order of magnitude. Acarbose, which is not an iminosugar, was the most effective agent tested. These comparative results are included as Supplemental Fig. S1 (available online at http://www.journals.cambridge.org/ bjn). D-Fagomine did not show any effect on postprandial glycaemia after the intake of glucose (dose?response curves included as Supplemental Fig. S2 available online at http:// www.journals.cambridge.org/bjn), which suggests that it did not affect glucose transport across the small intestine. In agree- ment with this, D-fagomine has been observed to have no effect on the transport of D-glucose (5mM) in cultures of intestinal Caco-2 cells (R Mart??n-Venegas and R Ferrer, personal com- munication). Postprandial blood insulin concentration decreased in accordance with the decrease in blood glucose concentration (Fig. 4), which indicates that D-fagomine did not stimulate fast insulin secretion. Intestinal disaccharidase inhibitory activity in vitro The in vitro sucrase inhibitory activity of D-fagomine, DNJ, miglitol and acarbose was measured on preparations of hom- ogenised intestinal mucosa and on sections of everted small intestine (Table 1). The outcomes of the two in vitro assays 8 (a) (b) 6 4 2 0 30 *** * 60 90 120 Time (min) 8 6 4 2 0 30 60 90 120 Time (min) Pl as m a gl uc os e (m m ol /l) Pl as m a gl uc os e (m m ol /l) Fig. 2. Effect of D-fagomine (2mg/kg body weight) on the glycaemic response of normal Sprague?Dawley rats after ingestion (1 g/kg body weight) of: (a) sucrose and (b) starch. Normal rats were food-deprived for 12 h and then administered the carbohydrate and D-fagomine together. , Sucrose (1 g/kg); , sucrose ? D-fagomine (2mg/kg); , vehicle (water). Values are means with their standard errors of mean. Mean values were significantly different from the control: *P,0?05, ***P,0?001. L. Go?mez et al.1742 Br iti sh Jo ur na l of N ut ri tio n 292 were clearly different. Only the D-fagomine results were similar (P.0?05) in both assays. On homogenised mucosa, D-fagomine was a weaker inhibitor than the other compounds between two and three orders of magnitude. In contrast, when everted intestinal membranes were used, the inhibitory potencies of D-fagomine and acarbose were similar, and the differences between D-fagomine and the other two compoundswere lower. Agglutinating and antiadhesive activity of D-fagomine on fimbriated bacteria D-Fagomine modulated bacterial adhesion without affecting cell viability. At a concentration as high as 2000mg/l, D-fago- mine was virtually inactive as antimicrobial agent against an array of different strains. The results of the inhibition tests are included in Supplemental Table S2 (available online at http://www.journals.cambridge.org/bjn). D-Fagomine aggluti- nated cells of E. coli and S. enterica serovar Typhimurium at concentrations of 20 and 200mg/l with agglutinations of 60 and 70% of the control cultures, respectively (P,0?001). Fig. 5 illustrates this agglutination effect. Moreover, D-fagomine effectively prevented the adhesion of the same fimbriated bacterial strains on pig intestinal mucosa at concen- trations of 10 and 20mg/l (P,0?001) (Table 2). More than 95% of the Enterobacteriaceae were recovered in the supernatant. The effect was equivalent to that of a solution of mannose 0?05M (i.e. 9000mg/l). At 20mg/l, D-fagomine did not affect the adhesion of Bifidobacterium sp. to intestinal mucosa and promoted the adhesion of Lactobacillus acidophilus (P,0?001) (Table 2). Discussion Natural iminosugars mimic the structures of sugars and may have the capacity to bind to the same loci within biological systems. Particularly D-fagomine is structurally related to D-glucose and D-mannose (Fig. 1). We first tested D-fagomine for the modulation of postprandial blood glucose with regard to potential applications in the reduction of the risk of devel- oping IR and becoming overweight. D-Fagomine has been described before as a weak inhibitor of a-glycosidases in in vitro assays using purified enzymes(19) or homogenates of intestinal mucosa(25). When we tested D-fagomine in vivo, we found that it lowered postprandial blood glucose concen- tration in healthy rats given a single dose of sucrose. D-Fagomine was less efficient in doing so than acarbose, a non-absorbable inhibitor of both a-glycosidases and a-amylase, and similar in efficiency to DNJ, a more potent iminosugar in vitro (25), and its derivative miglitol (N-hydroxyethyl-DNJ). Then we corroborated that D-fagomine was a weaker sucrase inhibitor in vitro than DNJ, miglitol and acarbose (Table 1, first column). As the results were different in vitro and in vivo, 0?4 0?3 Pl as m a in su lin (n m ol /l) 0?2 **** 0?1 0?0 0 30 60 Time (min) 90 120 Fig. 4. Effect of D-fagomine on the insulinaemic response of normal Sprague?Dawley rats after ingestion of sucrose (1 g/kg body weight). Normal rats were food-deprived for 12 h and then administered the carbohydrate and D-fagomine together. , Sucrose (1 g/kg); , sucrose ? D-fagomine (2mg/kg); , vehicle (water). Values are means with their standard errors of mean. Mean values were significantly different from the control: *P,0?05, ***P,0?001. 6?5 (a) (b) 5?5 4?5 3?5Pl as m a gl uc os e (m m ol /l) AU C pl as m a gl uc os e (m m ol ? m in /l) 2?5 300 225 150 75 0 30 * *** *** ***** *** *** 60 120 0 30 *** *** *** ** 60 Time (min) Time (min) 90 120 Fig. 3. Dose-dependent effect of D-fagomine on the glycaemic response of normal Sprague?Dawley rats after ingestion of sucrose (1g/kg body weight). Normal rats were food-deprived for 12h and then administered the carbo- hydrate and D-fagomine together. AUC, area under the curve. (a) , sucrose (1g/kg); , sucrose ? D-fagomine (1mg/kg); , sucrose ? D-fagomine (2mg/kg); , sucrose ? D-fagomine (4mg/kg); , vehicle (water). (b) , vehicle (water); , sucrose (1g/kg); , sucrose ? D-fagomine (1mg/kg); , sucrose ? D-fagomine (2mg/kg); , sucrose ? D-fagomine (4mg/kg). Values are means with their standard errors of mean. Mean values were significantly different from the control: *P,0?05, **P,0?01, ***P,0?001. Fagomine along the intestinal tract 1743 Br iti sh Jo ur na l of N ut ri tio n 293 we tested the same compounds as sucrase inhibitors on everted intestine sleeves, an experimental set-up that is closer to the situation in vivo. This method is not commonly used because it is more experimentally complex than the method of homogenised mucosa and it has been shown that both preparations give similar sucrase activity(23). While D-fagomine was still a mild inhibitor in the everted sleeve test, the differences in the absolute values of sucrase inhibition by DNJ, miglitol and acarbose between the two in vitro assays were of more than one order of magnitude (Table 1). The sucrase inhibitory potencies of D-fagomine and acarbose in the everted sleeve test were similar, while those of DNJ and miglitol were approximately 10-fold and 70-fold higher. These results indicate that experimental departure from the in vivo situation may result in large differences in the outcome of brush-border sucrase inhibition assays and that potent inhibitors in vitro may not be as effective in vivo. The in vitro assays may provide information about comparative efficiencies and the everted sleeves, a set-up closer to the in vivo situation, may be a better option than working with purified enzymes or homogenates. Whatever the choice is, special attention must be paid when extrapolating the results to postprandial blood glucose modulation. To make sure that putatively useful compounds are not overlooked, direct testing in vivo appears to be the best option. As intraperitoneally administered D-fagomine induced insu- lin release and consequently lowered glycaemia in diabetic mice(18), stimulation of insulin secretion may be thought to account for the in vivo activity disclosed here. However, in our in vivo experiments, orally administered D-fagomine did not raise the blood insulin level (Fig. 3); on the contrary, as it lowered blood glucose, it also lowered the insulin response over the 2-h postprandial period. Moreover, D-fagomine did not show any effect on postprandial glycaemia after intake of glucose (Supplemental Fig. S2 available online at http:// www.journals.cambridge.org/bjn). These results imply that D-fagomine neither stimulated fast insulin secretion nor signifi- cantly affected glucose transport across the small intestine. Over the postprandial period, the action of D-fagomine appears to be that of slowing down the glucose release from oligomeric and polymeric carbohydrates by inhibition of brush-border glycosidases. So D-fagomine lowers the so- called glycaemic load (GL) of a meal. The GL corresponding to a given foodstuff is calculated as the amount of carbo- hydrates in it multiplied by its glycaemic index (GI), the area under the curve of blood glucose from 0 to 2 h after ingestion of 50 g of carbohydrate(26,27). The GL is thereby a measure of how much carbohydrates are incorporated systemically as glu- cose and how fast this occurs(26,27). Low GI and GL diets have been associated with a reduced risk of becoming overweight by delaying the onset of hunger and limiting the storage of nutrients as fat(28). While it is accepted that lowering the gly- caemic response by glycosidase inhibitors and low GI foods both delay the onset of IR(29,30), the question of whether diets with low GI and GL are effective at controlling excess weight is controversial(31). A recent meta-analysis of random- ised controlled trials and a more recent trial published later suggested that low-carbohydrate diets may only be associated with modest short-term weight loss(32,33). It should be noted though that these trials were conducted on large genotypically and phenotypically heterogeneous populations. Clearer effects may well be evident from studies with subpopulations that are sensitive to carbohydrate-related weight gain. Sup- porting this view is the observation that early (30min) post- prandial insulinaemia predicted weight gain in humans and that there exists a subpopulation characterised by early high- insulin secretion that gains weight while consuming a low-fat diet(34). Randomised controlled trials with D-fagomine and appropriate subpopulations may help to clarify the role of low-GL diets in weight gain and to confirm the reduction in the risk of developing type 2 diabetes associated with lowering postprandial glycaemia. Another controversial point involving lowering GL is that low-GI foods include ingredients that are poorly defined chemically (e.g. complex mixtures with uniden- tified minor components) and their mode of action is unclear. Moreover, most of these ingredients may alter the organoleptic and rheologic properties of the original foodstuff. As pure D-fagomine is effective at a concentration of 0?1% in the matrix, the ingredient may allow the design of foodstuffs with controlled GI resulting in only minimal modification of the composition and the other properties. Fig. 5. Aggregation of Salmonella enterica serovar Typhimurium in a solution of D-fagomine in PBS (200mg/l). Table 1. Inhibitory activity? of sugar mimetics on rat intestinal sucrase in vitro (IC50 values with their standard errors of mean) Assay Intestinal mucosa homogenate Everted intestine sleeves? Compound IC50 (mM) SEM IC50 (mM) SEM D-Fagomine 42?0 5?9 59?0 8?1 Acarbose 1?10* 0?13 53?0 8?9 Miglitol 0?150* 0?017 5?20* 0?80 DNJ 0?0270* 0?0030 0?77* 0?10 DNJ, 1-deoxynojirimycin. * Mean values were significantly different from those of D-fagomine within each assay (P,0?001). ? Activity is given as mmol of sucrose hydrolysed/h. ? Activity is normalised to mg of wet weight of the intestinal sleeve. L. Go?mez et al.1744 Br iti sh Jo ur na l of N ut ri tio n 294 We also disclose here an activity of D-fagomine that had never been suggested before: the modulation of bacterial adhesion. We observed that D-fagomine selectively agglutinated potentially deleterious Enterobacteriaceae and prevented their adhesion to pig intestinal mucosa. The adhesion of Lactobacillus spp. was promoted by D-fagomine while that of Bifidobacterium spp. was not affected (Table 2). Fimbriated strains such as E. coli and S. enterica serovar Typhimurium express mannose-specific lectins on the tip of their fimbriae that bind to membrane carbohydrates as a first step in the colo- nisation of other organisms(35). As D-fagomine is structurally similar to lectin-binding sugars such as mannose (Fig. 1), the observed agglutinating effect is most probably due to the affi- nity of the iminocyclitol for lectins. Non-fimbriated probiotic strains express other surface adhesins of glycoprotein nature (glycoprotein adhesins) that keep bacteria loosely attached to the intestinal wall(13). These interactions do not appear to be affected by D-fagomine. Notably, D-fagomine did not show any antibiotic effect on any of the strains tested. This is import- ant because other putatively beneficial strainswill keep their full viability in the presence of D-fagomine. Thus, the agglutination of Enterobacteriaceae will most probably favour intestinal colonisation by loosely bound non-pathogenic strains such as Bifidobacterium spp. and Lactobacillus spp. and might help to avoid the complications associated with intestinal conditions such as inflammatory bowel disease. As the intestinal micro- biota clearly influences the physiological status of the gut and even the health of the whole organism(36), further studies will determine whether this activity of D-fagomine results in long- term effects related to the reduction of health risk factors. In conclusion, here we report the short-term activity of D-fagomine along the intestinal tract, consisting of effectively lowering the postprandial blood glucose concentration and selectively agglutinating enterobacteria. D-Fagomine effec- tively modulates the blood glucose response in a dose- dependent manner after the ingestion of sucrose or starch, probably by delaying saccharide hydrolysis by brush-border glycosidases. We also show that the results of sucrase inhibition in vitro very much depend on the experimental set-up and cannot account for the activity of inhibitors in vivo. D-Fagomine also inhibits the adhesion of potentially deleterious bacteria to the intestinal mucosa. Based on all this evidence, D-fagomine may be used as a dietary ingredient or functional food component to reduce the health risks associated with an excessive intake of fast-digestible carbo- hydrates, or an excess of potentially pathogenic bacteria. Acknowledgements The present work was funded by Bioglane SLNE. Support is appreciated from: the Spanish Ministry of Science and Inno- vation (CDTI-NEOTEC 20080474, AGL2009-12374-C03-03/ALI; CTQ2009-07359); the Catalan regional government (Generalitat de Catalunya, 2009 SGR 00281 and pre-doctoral fellowship to L. G.); and the Panamanian government (SENACYT/IFARHU, pre-doctoral fellowship to E. M.-T.). Possible conflicts of inter- est: S. P., P. C. and J. L. T. are stockholders of Bioglane SLNE. J. M. P., X. C., M. A. C.-T., S. P., P. C. and J. L. T. designed the research; L. G., E. M.-T., M. E. J. and X. C. conducted the research into blood glucose and sucrase inhibition; M. A. C.-T and C. A. Table 2. Influence of D-fagomine on the adhesion of bacteria to intestinal pig mucosa* (Mean values of the logarithms of colony-forming units (CFU; total and supernatant) and percentage CFU in the supernatant) Total Supernatant Supernatant Log CFU/ml SEM Log CFU/ml SEM % CFU SEM Control (PBS) Salmonella enterica serovar Typhimurium FVB7654 8?59 0?01 6?07 0?00 0?30 0?01 S. enterica serovar Typhimurium FVB5643 8?60 0?00 6?14 0?00 0?35 0?01 Escherichia coli FVB2453 8?60 0?00 6?16 0?00 0?36 0?01 E. coli FVB3478 8?60 0?00 6?18 0?00 0?38 0?02 Lactobacillus acidophilus FVB1467 6?69 0?00 6?65 0?00 91?84 0?01 Bifidobacterium sp. FVB4278 7?08 0?00 7?08 0?00 99?15 0?01 D-Fagomine 10mg/l (0?07mM) S. enterica serovar Typhimurium FVB7654 8?56 0?01 8?53 0?00 91?80 0?06 S. enterica serovar Typhimurium FVB5643 8?32 0?00 8?22 0?00 78?40 0?12 E. coli FVB2453 8?09 0?00 8?07 0?00 94?50 0?01 E. coli FVB3478 8?27 0?00 8?24 0?00 95?10 0?01 L. acidophilus FVB1467 6?69 0?00 6?43 0?00 54?60 0?06 Bifidobacterium sp. FVB4278 7?08 0?00 7?08 0?00 99?17 0?00 D-Fagomine 20mg/l (0?14mM) S. enterica serovar Typhimurium FVB7654 8?07 0?01 8?04 0?00 98?20 0?00 S. enterica serovar Typhimurium FVB5643 8?47 0?00 8?45 0?00 95?50 0?00 E. coli FVB2453 8?04 0?00 8?02 0?01 96?30 0?06 E. coli FVB3478 8?00 0?00 8?00 0?00 99?00 0?00 L. acidophilus FVB1467 6?71 0?01 6?46 0?00 56?27 0?01 Bifidobacterium sp. FVB4278 8?08 0?00 8?08 0?00 99?17 0?01 FVB, Facultat Veterina`ria Barcelona. * Wells coated with pig mucosa overnight at 48C, loaded with the bacterial suspensions in the presence of D-fagomine and incubated at 378C for 90min. Both the attached material and the supernatant were counted for CFU. Fagomine along the intestinal tract 1745 Br iti sh Jo ur na l of N ut ri tio n 295 conducted the microbiology research; C. L. and S. P. provided essential materials; L. G., E. M.-T., J. M. P. and M. E. J. analysed the data; J. L. T. wrote the paper and had primary responsibility for the final content. All the authors reviewed the paper, and read and approved the final manuscript. Language assistance by Christopher Evans is appreciated. References 1. Koyama M & Sakamura S (1974) Structure of a new piperdine derivative from buckwheat seeds (Fagopyrum esculentum). Agric Biol Chem 38, 1111?1112. 2. AsanoN, Yamashita T, Yasuda K, et al. (2001) Polyhydroxylated alkaloids isolated from mulberry trees (Morus alba L.) and silk- worms (Bombyx mori L.). J Agric Food Chem 49, 4208?4213. 3. Asano N, Kato A, Miyauchi M, et al. (1997) Specific a-galac- tosidase inhibitors, N-methylcalystegines. Structure/activity relationships of calystegines from Lycium chinense. Eur J Biochem 248, 296?303. 4. Asano N, Tomioka E, Kizu H, et al. (1994) Sugars with nitro- gen in the ring isolated from the leaves of Morus bombycis. Carbohydr Res 253, 235?245. 5. Winchester B & Fleet GWJ (1992) Amino-sugar glycosidase inhibitors: versatile tools for glycobiologists. Glycobiology 2, 199?210. 6. 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The natural iminusugar D-fagomine reduces weight gain and faecal enterobacterial population of rats fed an energy-dense diet: Ramos-Romero S, Molinar-Toribio E, P?rez-Jim?nez J, Casado M, Pi?a B & Torres JL. 2013. IUNS 20th International Congress of Nutrition, Granada, Spain. ? Effects of D-fagomine on metabolic alterations in rats fed an energy-dense diet: Molinar-Toribio E, G?mez L, P?rez-Jim?nez J, Taltavull N, Mu?oz M, Llu?s L, Fortu?o A, Clap?s P & Torres JL. 2012. 22nd IUBMB & 37th FEBS fom Single Molecules to Systems Biology. ? D-Fagomina mantiene los niveles plasm?ticos de marcadores metab?licos en ratas alimentadas con una dieta alta en grasa y sacarosa: Molinar- Toribio E, G?mez L, P?rez-Jim?nez J, Clap?s P & Torres JL. 2012. XIV Congreso de la sociedad Espa?ola de Nutrici?n. Zaragoza, Espa?a. ? D-Fagomine, an iminosugar with physiological effects on postprandial blood glucose and bacterial adhesion: G?mez L, Molinar-Toribio E, Calvo-Torras MA, Adelantado C, Juan ME, Planas JM, Lozano C, Pumarola S, Clap?s P. & Torres JL. 2011. 11th European Nutrition Conference. Madrid, Spain. 298 7.1.3. Publicaciones complementarias ? Protective effect of the omega-3 polyunsaturated fatty acids eicosapentaenoic acid/docosahexaenoic acid 1:1 ratio on cardiovascular disease risk markers in rats: Llu?s L, Taltavull N, Mu?oz-Cort?s M, S?nchez-Martos V, Romeu M, Giralt M, Molinar-Toribio E, Torres JL, P?rez-Jim?nez J, Pazos M, M?ndez L, Gallardo J, Medina I & Nogu?s R. 2013. Lipids Health Dis, 12:140. ? Eicosapentaenoic acid/docosahexaenoic acid 1:1 ratio improves histological alterations in obese rats with metabolic syndrome: Taltavull N, Mu?oz-Cort?s M, Llu?s L, Jov? M, Fortu?o A, Molinar-Toribio E, Torres JL, Pazos M, Medina I & Nogu?s R. 2014. Lipids Health Dis, 13:31. ? Protein carbonylation associated to high-fat high-sucrose diet and its metabolic effects: M?ndez L, Pazos M, Molinar-Toribio E, S?nchez- Martos V, Gallardo JM, Nogu?s MR, Torres, JL & Medina I. 2014. J Nutr Biochem, 25:1243-1253. ? Effect of D-Fagomine on excreted enterobacteria and weight gain in rats fed a high-fat high-sucrose diet: Ramos-Romero S, Molinar-Toribio E, G?mez L, P?rez-Jim?nez J, Casada M, Clap?z P, Pi?a B & Torres JL. 2014. Obesity, 22:976?979. RESEARCH Open Access Protective effect of the omega-3 polyunsaturated fatty acids: Eicosapentaenoic acid/Docosahexaenoic acid 1:1 ratio on cardiovascular disease risk markers in rats Laura Llu?s1, N?ria Taltavull1, M?nica Mu?oz-Cort?s1, Vanesa S?nchez-Martos1, Marta Romeu1, Montse Giralt1, Eunice Molinar-Toribio2, Josep Llu?s Torres2, Jara P?rez-Jim?nez2, Manuel Pazos3, Luc?a M?ndez3, Jos? M Gallardo3, Isabel Medina3 and M Rosa Nogu?s1* Abstract Background: High consumption of fish carries a lower risk of cardiovascular disease as a consequence of dietary omega-3 long chain polyunsaturated fatty acid (n-3 PUFA; especially EPA and DHA) content. A controversy exists about the component/s responsible of these beneficial effects and, in consequence, which is the best proportion between both fatty acids. We sought to determine, in healthy Wistar rats, the proportions of EPA and DHA that would induce beneficial effects on biomarkers of oxidative stress, and cardiovascular disease risk. Methods: Female Wistar rats were fed for 13 weeks with 5 different dietary supplements of oils; 3 derived from fish (EPA/DHA ratios of 1:1, 2:1, 1:2) plus soybean and linseed as controls. The activities of major antioxidant enzymes (SOD, CAT, GPX, and GR) were determined in erythrocytes and liver, and the ORAC test was used to determine the antioxidant capacity in plasma. Also measured were: C reactive protein (CRP), endothelial dysfunction (sVCAM and sICAM), prothrombotic activity (PAI-1), lipid profile (triglycerides, cholesterol, HDLc, LDLc, Apo-A1, and Apo-B100), glycated haemoglobin and lipid peroxidation (LDL-ox and MDA values). Results: After three months of nutritional intervention, we observed statistically significant differences in the ApoB100/ApoA1 ratio, glycated haemoglobin, VCAM-1, SOD and GPx in erythrocytes, ORAC values and LDL-ox. Supplementation with fish oil derived omega-3 PUFA increased VCAM-1, LDL-ox and plasma antioxidant capacity (ORAC). Conversely, the ApoB100/ApoA1 ratio and percentage glycated haemoglobin decreased. Conclusions: Our results showed that a diet of a 1:1 ratio of EPA/DHA improved many of the oxidative stress parameters (SOD and GPx in erythrocytes), plasma antioxidant capacity (ORAC) and cardiovascular risk factors (glycated haemoglobin) relative to the other diets. Keywords: Omega-3 polyunsaturated fatty acids (PUFA), Eicosapentaenoic acid (EPA), Docosahexaenoic acid (DHA), Fish oils, Oxidative stress, Antioxidant status, Cardiovascular disease risk, Insulin resistance * Correspondence: mariarosa.nogues@urv.cat 1Unit of Pharmacology, Faculty of Medicine and Health Sciences, Rovira i Virgili University, Sant Lloren?, 21, 43201 Reus, Spain Full list of author information is available at the end of the article ? 2013 Llu?s et al.; licensee BioMed Central Ltd. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Llu?s et al. Lipids in Health and Disease 2013, 12:140 http://www.lipidworld.com/content/12/1/140 299 Background Diets with high fish content have been associated with a low cardiovascular disease (CVD) risk. Of particular note are the n-3 polyunsaturated fatty acids (n-3 PUFA): eicosapentaenoic acid (EPA, 20:5 n-3) and docosahexaenoic acid (DHA, 22:6 n-3). Fish are the major food sources of DHA and EPA and are carried in the circulation as triglycerides, especially phospholipids [1]. There are several experimental studies that show that the n-3 PUFA perform several functions in relation to the structure and function of the membrane, tissue metabolism, and gene regulation [2]. These fatty acids play important roles in reducing hypertriglyceridaemia [3,4], low density lipoprotein cholesterol (LDLc), very low density lipoprotein cholesterol (VLDLc), and increasing high density lipoprotein cholesterol (HDLc) concentrations [5] as well as various components of these molecules e.g. ApoA1 and ApoB100 of HDL and LDL/VLDL respectively. EPA and DHA improve hypertension [6], insulin sensitivity and glycaemia [7]. Oxidative stress and vascular endothelial dysfunction also play a critical role in the pathogenesis of CVD. Increased oxidative stress underlies the pathophysi- ology of hypertension and atherosclerosis by directly affecting the cells of the vascular wall [8]. Higher levels of soluble intercellular adhesion molecule-1 (sICAM-1) and soluble vascular cell adhesion molecule-1 (sVCAM-1) have been associated with an increased risk of ischaemic disease and peripheral artery disease mediated, in part, by C reactive protein (CRP) [9]. Type 1 plasminogen activator inhibitor (PAI-1) is also related to metabolic syndrome, obesity, and CVD [5]. The amount of n-3 PUFA necessary to provide health benefits is unknown [10] as are the proportions of EPA and DHA that provide the greatest benefit. The majority of the clinical studies carried-out to date use fish-oil derived dietary supplements, but with a higher EPA/DHA ratio than that commonly found in the fish themselves [11,12], and it would not trigger the effects in vivo compared to the ratio contained in fish. EPA and DHA derived from fish oils have demonstrable cardiovascular disease benefits in observational studies and experimental trials which, mainly, have investigated their effects in combination. As such, little is known of the potentially different effects of EPA and DHA, especially regarding which has the better protective effect on CVD [2]. Hence, our present study seeks to determine the proportion of EPA/DHA that is best able to achieve a protective effect of the n-3 PUFA on CVD risk factors. Three dietary interventions with the optimal relation n-3/ n-6 and different EPA/DHA ratios (1:1, 2:1, 1:2) were eval- uated in a healthy animal model. Soybean and linseed oils were used as control diets. Soybean is a rich source of linoleic acid (LA, 18:2 n-6), while linseed oil has an elevated content of alpha-linolenic acid (ALA, 18:3 n-3) [13]. Parameters of oxidative stress, inflammation, endothelial dysfunction, prothrombotic state, protein glycation, lipid peroxidation, and lipid profile were determined as risk factors or biomarkers indicative of CVD risk. Results Anthropomorphic measures None of the nutritional interventions, irrespective of the proportions of EPA/DHA (1:1, 2:1, 1:2) or soybean or linseed oil supplements, significantly increased the weight of the animals (260.3 ? 11; 259.3 ? 12; 255.5 ? 10; 259.1 ? 8; 266.3 ? 9, respectively). Abdominal fat tissue, as a percentage of overall body weight, was not significantly different in test diets compared to that of the animals on the control diets (3.89 ? 1.2; 3.62 ? 0.8; 4.12 ? 0.7; 4.3 ? 0.7; 4.2 ? 0.9, respectively). Antioxidant status and oxidative stress The biomarkers of antioxidant status and oxidative stress are summarised in Table 1. The concentrations of antioxidant enzymes in erythro- cytes indicated an activation of these enzymes in fish-oil diets. SOD values were higher in 1:1 EPA/DHA diet followed by 2:1 EPA/DHA, compared to the other 3 diets. GPx values were also higher in 1:1 and 2:1 EPA/DHA. There was a trend, albeit not statistically significant, towards higher CAT and lower GR values in fish-oil diets compared to the control diets. These results indicated that fish-oil diets, especially 1:1 and 2:1 EPA/DHA, had improved values of antioxidant enzymes than did soybean and linseed oils. The two control diets (soybean and linseed) had no significant differences between them with respect to the values of erythrocyte antioxidant enzymes. Finally, the plasma antioxidant capacity (ORAC) was significantly higher in the 1:1 diet than in the other diets. This result is in agreement with the high SOD and GPx values found in this supplemented group. Lipid peroxidation The mean LDL-ox values indicated higher oxidation in fish-oil diets than controls. LDL-ox of diets with 2:1 and 1:2 EPA/DHA ratios were significantly higher, compared to soybean and linseed diets. The EPA/DHA (1:1) group did not show significant differences with respect to control groups (Table 1). Mean values of MDA in the liver were not significantly different between groups. Lipid profile TG, CHOL, LDLc, HDLc, LDLc/HDLc, Apo A1 and Apo B100 were not statistically significantly different between supplemented groups (Table 2). Llu?s et al. Lipids in Health and Disease 2013, 12:140 Page 2 of 8 http://www.lipidworld.com/content/12/1/140 300 TG, LDLc and HDLc values were within the reference ranges observed in other studies [14,15], whereas CHOL concentrations were increased in all the groups compared to that observed by Levy et al. [14]. The linseed-oil diet group had significantly higher values of the ApoB100/ApoA1 ratio, compared to the 1:1, 2:1 and the soybean-oil diets. Glycaemia control and insulin resistance The post-intervention glucose concentrations were within the laboratory reference range in all the groups at <14 mM [16,17], but the glucose decreases obtained at the end of the experiment were greater in 1:1 and 2:1 EPA/DHA with respect to the other diets (Table 2). All EPA/DHA diets showed significantly lower values of glycated haemoglobin, relative to the linseed and soybean oil diets. Glycated haemoglobin concentrations were not significantly different among the 3 EPA/DHA diets (Table 2). The initial concentrations of insulin were within refer- ence range values (3.5 ? 4.4 ng/mL) described by other authors [17,18] in all groups (results not shown). The insulin increases observed at the end of the experiment were not significantly different relative to the baseline values, and without differences between groups (Table 2). Following nutritional intervention, the Wistar rats had HOMA values within laboratory reference ranges (<14) described by other authors [19]. The linseed group had significantly lower values compared to the EPA/DHA 1:1 and soybean supplemented groups (Table 2). Cardiovascular disease risk biomarkers Linseed diet decreased the sVCAM significantly with respect to the fish-oil diets while the 2:1 diet had significantly lower values than 1:2 diet (Table 3). The soybean group had lower values of PAI-1 than the 1:2 EPA/DHA group. No statistically significant differences were observed between the two control diets with respect to these biomarkers (Table 3). No significant differences were observed in CRP and in sICAM concentrations. Discussion Apart from the n-3 PUFA, fish oils contain aminoacids, vitamins, selenium and other minerals which con- tribute to the cardiovascular benefit. The majority of studies with purified EPA or DHA have demon- strated the bioactivity and effectiveness of these fatty acids; the implication being that the substantial CVD benefit of fish oil consumption is related to the n-3 PUFA content [2]. In our study, the supplemented dose of fish oils (extrapolated to animals) provides approximately double the amount of EPA and DHA of the European Union?s recommendation for the main- tenance of normal blood concentration of triglycerides in adults [20]. Soybean and linseed oils were used as control diets. Soybean is a rich source of linoleic acid (LA, 18:2 n-6), while linseed oil has an elevated content of alpha-linolenic acid (ALA, 18:3 n-3) [13]. However, all diets had a similar fat and energy content and, hence, the observed differences can be attributed to the different ratios of EPA and DHA. Moreover, the reasoning for using a weekly administra- tion of the oils was because in a previous test; the daily feed became very stressing for animals. According to that, it was decided a weekly doses as has been already described in the article of M?ndez et al. [13]. Table 1 Antioxidant and oxidative stress biomarkers in blood and liver of Wistar rats fed the oil supplements Biomarkers EPA/DHA 1:1 EPA/DHA 2:1 EPA/DHA 1:2 Soybean oil Linseed oil Mean ? SD Mean ? SD p Mean ? SD P Mean ? SD p Mean ? SD p Erythrocytes SOD (U/g Hb) 2129.2 ? 586.5 1880.9 ? 341.2 1226.1 ? 517.4 a0.023 1443.8 ? 426.2 1230.6 ? 283.9 a0.017 CAT (mmol/min/g Hb) 57.4 ? 11.1 76.7 ? 28.2 61.4 ? 13.2 41.5 ? 34.6 37.2 ? 20.9 GR (U/g Hb) 0.40 ? 0.08 0.734 ? 0.21 0.63 ? 0.35 0.93 ? 0.18 0.75 ? 0.20 GPx (U/g Hb) 107.1 ? 15.0 116.7 ? 30.7 a0.007 67.7 ? 34.5 a0.026 101.5 ? 38.2 71.1 ? 9.6 a0.002 b0.007 b0.001 Plasma ORAC (?mol TE/ml plasma) 48.15 ? 16.96 23.56 ? 5.97 a0.023 26.39 ? 9.01 a0.016 30.32 ? 9.64 a0.049 24.71 ? 9.70 a0.033 LDL-ox (ng/mL) 161.53 ? 30.9 212.25 ? 57.4 239.43 ? 70.02 109.03 ? 27.34 b0.007 94.52 ? 14.08 b0.001 c0.001 c0.001 Liver MDA (?g MDA/ g tissue) 10.29 ? 2.82 7.57 ? 2.55 8.81 ? 3.28 8.12 ? 2.53 6.53 ? 1.24 The data are expressed as mean ? SD (standard deviation). a: difference with respect to EPA/DHA 1:1 supplementation; b: differences with respect to EPA/DHA 2:1 supplementation; c: differences with respect to EPA/DHA 1:2 supplementation. Llu?s et al. Lipids in Health and Disease 2013, 12:140 Page 3 of 8 http://www.lipidworld.com/content/12/1/140 301 The influence of dietary interventions on the levels and composition of plasmatic FFA was also evaluated previously in a recently reported [13] in which we demonstrated that fish oil supplementation did not change the total amount of plasmatic FFA, but it altered the profile of the individual FFA. Animals fed fish oils exhibited significantly higher levels of EPA (20:5 n-3) and DHA (22:6 n-3) compared to those fed soybean oil. The supplementation with linseed oil provided similar levels of EPA compared to those observed in the FFA fraction from animals supplemented with fish oil; however, the amount of DHA in the FFA fraction was intermediate between those supplemented with fish and those with soybean oils. Animals fed linseed oil showed the highest amount of free Table 3 Cardiovascular disease (CVD) risk biomarkers in circulation in Wistar rats fed the different oil supplements EPA/DHA 1:1 EPA/DHA 2:1 EPA/DHA 1:2 Soybean oil Linseed oil Biomarkers Mean ? SD Mean ? SD Mean ? SD p Mean ? SD P Mean ? SD p CVD RISK MARKERS Inflammation CRP (?g/mL) 147.0 ? 20.5 147.1 ? 22.4 140.1 ? 52.7 172.9 ? 38.2 142.9 ? 52.0 Thrombotic activity PAI-1 (?g/mL) 7.48 ? 1.3 8.75 ? 1.8 9.18 ? 1.3 6.45 ? 0.8 c0.030 7.76 ? 1.1 Endothelial dysfunction sVCAM (?g/mL) 3.41 ? 0.7 3.01 ? 0.4 4.40 ? 1.3 b0.046 3.36 ? 1.7 2.10 ? 0.4 a0.001 b0.001 c0.003 sICAM (ng/mL) 0.59 ? 0.2 0.61 ? 0.2 0.53 ? 0.2 0.52 ? 0.1 0.59 ? 0.3 The data are expressed as mean ? SD (standard deviation). a: differences with respect to EPA/DHA 1:1 supplementation; b: differences with respect to EPA/DHA 2:1 supplementation; c: differences with respect to EPA/DHA 1:2 supplementation. Table 2 Cardiovascular disease (CVD) risk factors in circulation in Wistar rats fed the different oil supplements EPA/DHA 1:1 EPA/DHA 2:1 EPA/DHA 1:2 Soybean oil Linseed oil Biomarkers Mean ? SD Mean ? SD Mean ? SD p Mean ? SD P Mean ? SD p CV RISK FACTORS Lipid profile TG (mg/dL) 86.3 ? 65.1 124.5 ? 102.2 83.1 ? 10.4 108.5 ? 51.9 73.5 ? 25.2 CHOL (mg/dL) 93.3 ? 26.5 98.0 ? 14.8 112.3 ? 20.8 125.8 ? 16.5 118.5 ? 13.5 LDLc (mg/dL) 7.64 ? 3.3 7.4 ? 0.8 8.30 ? 1.3 10.39 ? 2.2 7.4 ? 1.6 HDLc (mg/dL) 37.4 ? 11.1 50.4 ? 25.9 47.3 ? 8.1 51.3 ? 7.8 46.8 ? 5.5 LDLc/HDLc 0.19 ? 0.5 0.20 ? 0.01 0.17 ? 0.01 0.20 ? 0.2 0.19 ? 0.1 ApoA1 (mg/mL) 43.0 ? 11.4 51.7 ? 11.9 47.9 ? 13.8 51.4 ? 13.3 30.6 ? 2.1 ApoB100 (mg/mL) 116.5 ? 16.8 137.0 ? 6.4 139.4 ? 23.8 126.8 ? 13.9 152.7 ? 35.7 ApoB100/ApoA1 2.79 ? 0.51 2.75 ? 0.54 3.10 ? 1.01 2.67 ? 1.11 5.02 ? 1.29 a0.029 b0.019 d0.029 Glycaemia Glucose increase (mmol/L) ?0.75 ? 0.42 ?0.15 ? 0.34 0.27 ? 0.49 a0.001 0.53 ? 0.25 a < 0.001 - 0.20 ? 0.31 d0.032 Glycated Haemoglobin (%) 4.14 ? 0.24 4.43 ? 0.72 4.17 ? 0.30 6.39 ? 0.99 a0.003 6.34 ? 1.84 a0.025 b0.007 b0.05 c0.004 c0.032 Insulin increase (ng/mL) 1.40 ? 0.8 0.15 ? 1.90 0.42 ? 0.4 0.9 ? 1.5 0.41 ? 0.5 Homa index 7.0 ? 3.0 4.1 ? 1.8 3.8 ? 1.5 6.9 ? 3.8 2.9 ? 1.1 a0.004 d0.032 The data are expressed as mean ? SD (standard deviation). a: differences with respect to EPA/DHA 1:1 supplementation; b: differences with respect to EPA/DHA 2:1 supplementation; c: differences with respect to EPA/DHA 1:2 supplementation; d: differences with respect to soybean oil supplementation. Llu?s et al. Lipids in Health and Disease 2013, 12:140 Page 4 of 8 http://www.lipidworld.com/content/12/1/140 302 LA (18:3 n-3), in agreement with the elevated content of LA in the linseed oil [13]. Oxidative stress Fatty acids with a greater degree of unsaturation in their molecular structure are more easily oxidised. As a consequence, diets rich in fish-oils are predisposed to causing increased oxidative damage in humans and animals. However, other studies have shown that diets supplemented with fish oils do not increase cellular oxidative damage, but may even exert an antioxidant effect [21,22]. Our results indicate that improvement in activity of SOD and GPX may explain the higher plasma antioxidant capacity (ORAC) in the EPA/DHA 1:1 supplemented group. In other study, n-3 PUFA diet corrected the decreased ORAC values in diabetic rats, and was probably due to the increased erythrocyte antioxidant enzymes SOD and GPX [11]. Our results corroborate this hypothesis. Further, these results concur with those recently reported [13] in which we demonstrated that fish-oils, especially EPA:DHA 1:1, averted protein carbonylation in plasma and liver. All these findings favour diets rich in EPA and DHA with respect to antioxidant enzymes; the proportion of 1:1 having a higher relevance than others. Lipid peroxidation To date, fish-oil supplements have not been unequivocally shown to prevent oxidation of LDL particles [23]. In our study, plasma oxidised LDL was higher in the groups supplemented with fish-oil n-3 PUFA. However, EPA/DHA 1:1 showed lower values than the other two diets with n-3 PUFA, and significant differences existed only among the groups supplemented with 2:1 and 1:2 diets, relative to soybean and linseed. LDL-ox was lower in the linseed oil group i.e. the ALA is more effective, in this case, than the administration of EPA and DHA. This is contrary to that which occurs in antioxidant protection and protein oxidation, and may be due to a synergistic effect of ALA i.e. on the one hand having less unsaturated bonds than EPA and DHA and hence less susceptible to oxidative attack while, on the other hand, although the rate of conversion from ALA to EPA and DHA is low in the organism, small quantities of these PUFA can contribute to an increase in the levels of antioxidants that protect LDL. There were no differences observed in liver MDA among the different groups, despite differences in the consumption of n-3 PUFA. As such, although the diets rich in fish oils do not exercise a clear protection to plasma LDL oxidation, liver lipoperoxidation were not affected in these groups, relative to the soybean and linseed oil groups. Few studies have evaluated MDA levels in liver following fish-oil administration, and the results have been contradictory. While some studies concluded that the administration of fish-oil for 2 months decrease MDA in rats with partial hepatectomy [24], other studies demonstrated, following 2 months of nutritional interven- tion in rats with experimental non-alcoholic fatty liver disease, that fish-oil derived n-3 PUFA increased liver MDA concentrations and promoted severe fatty liver [25]. These differences can be due to the different fatty acid proportions contained in the oils compared to other molecules with antioxidant capacity such vitamins C and E that, as well, affect the redox status of the organism. Lipid profile None of the supplementations increased body-weight and the amount of abdominal fatty tissue of the animals. We need to bear in mind that the intake of total fat was the same in all groups of animals. There were trends, albeit not statistically significant, towards a decrease in triglycerides, total cholesterol, LDLc and ApoB100 in the group supplemented with EPA/DHA 1:1 diet, relative to the other groups. Decreases in these factors would support a CVD protective role for EPA/DHA 1:1 diet. The Apo B100/Apo A1 ratio was significantly reduced by 1:1, 2:1 and soybean diets, compared to supplementation with linseed oil. Soybean and fish-oil PUFA reduce the risk of cardiovascular disease, essentially by improving the lipid profile, as has been shown by other studies [3,5]. Glycaemia control and insulin resistance Fish-oils are reported to be especially efficient in improving glycated haemoglobin concentrations in the circulation. Our study further highlighted that the 1:1 ratio of EPA/DHA induced the most beneficial improvement in this factor. There is a dearth of physiological data regarding the effect of n-3 PUFA on glucose homeostasis and insulin resistance in healthy rats. Glycated haemoglobin decreased on average by 33% in the groups receiving fish-oil supple- ments compared to those receiving soybean and linseed diets at the end of the nutritional intervention. This result concurs with those observed by our group on the protective effect of supplementation with EPA/DHA on the carbonylation of proteins [13]. Diets enriched with fish oil decreased protein carbonylation, especially the diet with 1:1 ratio of EPA/DHA. The significant decreases in HbA1c and non-increase in circulating glucose values observed in the study, indicate a beneficial effect of marine-fish-derived long chain n-3 PUFA in healthy animals. These changes would contribute towards the prevention of some diseases such as metabolic syndrome and obesity [5,7]. Llu?s et al. Lipids in Health and Disease 2013, 12:140 Page 5 of 8 http://www.lipidworld.com/content/12/1/140 303 In our study, all the groups had values of insulin and HOMA index within the reference range [18,19,26]; the linseed diet group showing the lowest values in these parameters. As such, the n-3 PUFA did not provoke increases in plasma insulin in healthy rats. Conclusions Our results demonstrate a positive protective effect of fish-oil supplementation in vivo. Specifically, these beneficial protective effects depend on the different proportions of EPA and DHA; the 1:1 proportion of EPA:DHA being the most beneficial since it improved antioxidant status, oxidised LDL, Apo-B100/Apo-A1 ratio, and glycated haemoglobin. Methods Animals This study was conducted in compliance with the norms of the Ethics Committee for Animal Research at the Centro Superior de Investigaciones Cient?ficas, Spain. Female Wistar rats (n = 35; 13 weeks of age) were purchased from Janvier (Le Genest St-Isle, France) and acclimatised for 8 days prior to the initiation of the study. The animal room was maintained at a temperature of 22 ? 2?C and 50-60% relative humidity with a 12 h light/dark photoperiod. The animals were fed a standard pellet diet (Panlab A04, Barcelona, Spain) and had free access to bottled water and food, except for a fasting period before sacrifice. Animals were randomly assigned to five groups (7 rats each). Supplementation Three groups had dietary supplements of fish oils containing different proportions of EPA/DHA (1:1, 2:1 and 1:2). The 4th group was fed soybean oil and the 5th with linseed oil. Oils differing in EPA:DHA ratio were obtained by mixing appropriate quantities of the commer- cial fish oils. Soybean oil, obtained from unrefined organic soy oil (first cold pressing), and linseed oil, obtained from unrefined organic flax oil (first cold pressing). All diets had a similar fat and energy content [13]. Feeding the selected oil involved weekly oral doses of 0.8 mL/Kg bodyweight for 13 weeks, and administered by gavage. Because of the high predisposition of fish oils to peroxidation, we established quality control to ensure that the oils did not oxidise during the nutritional intervention [13]. At the end of the study, the animals were anaesthetised with ketamine/xylacine (80/10 mg/kg, respectively) by intra-peritoneal injection. The animals were sacrificed by cardiac puncture, and exsanguinated. Plasma, serum and erythrocytes were stored at -80?C until required for batched analyses. Livers were removed, washed in phosphate buffered saline, weighed, and immediately frozen in liquid nitrogen and stored at -80?C until required for processing. Oxidative stress Antioxidant enzymes in erythrocytes Superoxide dismutase (SOD) [27], catalase (CAT) [28], glutathione peroxidase (GPx) [29] and glutathione reduc- tase (GR) [30] activities were determined in erythrocytes using standard spectrophotometric methods. The units of measurement for SOD, GPx and GR are expressed as U/g Hb, and as mmol/min/g Hb for CAT. Plasma antioxidant capacity Plasma antioxidant capacity was measured as the oxygen radical absorbance capacity (ORAC method) [31]. The assay measures the oxidative degradation of fluorescein after being mixed with free radical generators such as azo-initiator compounds. The units of measurement are ?mol trolox-equivalent/mL plasma (?mol TE/mL). Lipid peroxidation Liver malondialdehyde (MDA) levels Liver samples were homogenised in a sodium phosphate buffer (200 mM, pH 6.25) and then ultra-centrifuged (129000 g, 1 h, 4?C). Lipid peroxidation was calculated by measuring MDA concentrations using high performance liquid chromatography with fluorescence detection (HPLC-FL). The results are expressed as micrograms of malondialdehyde per gram of liver [32]. Oxidised LDL Plasma oxidised LDL (LDL-ox) was measured using ELISA kits (CUSABIO BIOTECH, China) according to the manufacturer?s instructions. The units of measurement are expressed as ng/mL. Cardiovascular disease risk factors Lipid profile The lipid profiles consisting of total plasma triglycerides (TG), cholesterol (CHOL), HDL cholesterol (HDLc) and LDL cholesterol (LDLc) were measured by spec- trophotometric methods (SPINREACT kits, Spain). ApoA1 and ApoB100 were measured using ELISA kits (CUSABIO BIOTECH, China). The units of measurement are expressed as mg/dL for TG, CHOL, HDLc, LDLc and as mg/mL for APO A1 and APO B100. Glycaemia control and insulin resistance Glucose Animals were fasted for 24 hours and a blood sample taken from the saphenous vein. The capillary blood was Llu?s et al. Lipids in Health and Disease 2013, 12:140 Page 6 of 8 http://www.lipidworld.com/content/12/1/140 304 spotted on glucose strips and read in the Ascensia Elite XL glucometer (Bayer Consumer Care AG, Basel, Switzerland). The results are expressed in mmol/L. Glycated haemoglobin Glycated haemoglobin was measured using a spectro- photometric kit method (SPINREACT, Spain). The units of measurement are expressed as percentage of total haemoglobin. Insulin Insulin was measured using an ELISA kit (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA). The results are expressed in ng/mL. HOMA index HOMA index (Homeostasis Assessment Model) is an estimate of insulin resistance and is calculated as: Fasting insulin (?U/mL) * fasting glucose (mmol/L) / 22.5. Biomarkers of cardiovascular disease risk Plasma CRP, sICAM, sVCAM and PAI-1 were measured by ELISA kits (CUSABIO BIOTECH, China). The results are expressed as ?g/mL for CRP, sVCAM and PAI-1 and in ng/mL for sICAM. Statistical analysis Results were expressed as means and standard devia- tions for each group of dietary supplementation. The data were analysed for differences between groups using one-way analysis of variance (ANOVA). The SPSS IBM 19 for Windows was used throughout. When significant differences were found, the means were compared using the Scheff? post-hoc test. Statistical significant was set at p < 0.05. Competing interests The authors declare that they have no competing interests. Authors? contributions All the authors have contributed substantially to the design and execution of the study as well as drafting and revising the manuscript. All have approved the final version submitted for publication. Acknowledgements This investigation was supported, in part, by the Spanish Ministry of Science and Innovation (Grants AGL2009-12374-C03-01, -02 and -03). We acknowledge the Spanish Ministry of Science and Innovation and Xunta de Galicia for the post-graduate fellowship to L. M. and the postdoctoral ?Isidro Parga Pondal? contract to M. P.; the Panamanian Government (SENACYT / IFARHU) for the postgraduate fellowship to EMT and the Instituto de Salud Carlos III for a Sara Borrell postdoctoral contract to JP-J. Editorial assistance was by Dr. Peter R. Turner of Tscimed.com. Author details 1Unit of Pharmacology, Faculty of Medicine and Health Sciences, Rovira i Virgili University, Sant Lloren?, 21, 43201 Reus, Spain. 2Institute of Advanced Chemistry of Catalonia ?CSIC (IQAC-CSIC), Barcelona, Spain. 3Institute of Marine Research-CSIC (IIM-CSIC), Vigo, Spain. Received: 23 July 2013 Accepted: 24 September 2013 Published: 1 October 2013 References 1. Ackman RG: Biogenic Lipids Fats and Oils. Boca Rat?n. Florida: CRC Press; 1989. 2. Mozaffarian D, Wu JH: (n-3) fatty acids and cardiovascular health: are effects of EPA and DHA shared or complementary? J Nutr. doi:10.3945/jn.111.149633. 3. Aguilera AA, Diaz GH, Barcelata ML, Guerrero OA, Ros RM: Effects of fish oil on hypertension, plasma lipids, and tumor necrosis factor-alpha in rats with sucrose induced metabolic syndrome. J Nutr Biochem 2004, 15:350?357. 4. Dyerberg J: Platelet - vessel wall interaction: Influence of diet. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 1981, 294:373?381. 5. 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J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2005, 827:76?82. doi:10.1186/1476-511X-12-140 Cite this article as: Llu?s et al.: Protective effect of the omega-3 polyunsaturated fatty acids: Eicosapentaenoic acid/Docosahexaenoic acid 1:1 ratio on cardiovascular disease risk markers in rats. Lipids in Health and Disease 2013 12:140. Submit your next manuscript to BioMed Central and take full advantage of: ? Convenient online submission ? Thorough peer review ? No space constraints or color figure charges ? Immediate publication on acceptance ? Inclusion in PubMed, CAS, Scopus and Google Scholar ? Research which is freely available for redistribution Submit your manuscript at www.biomedcentral.com/submit Llu?s et al. Lipids in Health and Disease 2013, 12:140 Page 8 of 8 http://www.lipidworld.com/content/12/1/140 306 RESEARCH Open Access Eicosapentaenoic acid/docosahexaenoic acid 1:1 ratio improves histological alterations in obese rats with metabolic syndrome N?ria Taltavull1*, M?nica Mu?oz-Cort?s1, Laura Llu?s1, Montserrat Jov?2, ?ngels Fortu?o3, Eunice Molinar-Toribio4, Josep Llu?s Torres4, Manuel Pazos5, Isabel Medina5 and M Rosa Nogu?s1 Abstract Background: Marine polyunsaturated fatty acids, eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA) have been associated with improvement in the Metabolic Syndrome (MS). The aim of this study is to evaluate how three fish-oil diets with different eicosapentaenoic acid/docosahexaenoic acid ratios (EPA/DHA ratio) affect the histology of liver, kidney, adipose tissue and aorta in a preliminary morphological study. This work uses an animal model of metabolic syndrome in comparison with healthy animals in order to provide information about the best EPA:DHA ratio to prevent or to improve metabolic syndrome symptoms. Methods: 35 Wistar rats, as a control, and 35 spontaneously hypertensive obese rats (SHROB) were fed for 13 weeks with 3 different suplemmentation of fish oil containing EPA and DHA ratios (1:1, 2:1 and 1:2, respectively). All samples were stained with haematoxylin/eosin stain, except aorta samples, which were stained also with Verhoeff and van Gieson?s stain. A histological study was carried out to evaluate changes. These changes were statistically analyzed using SPSS IBM 19 software. The quantitative data were expressed by mean ? SD and were compared among groups and treatments using ANOVA with post-hoc tests for parametric data and the U-Mann?Whitney for non-parametric data. Qualitative data were expressed in frequencies, and compared with contingency tables using ?2 statistics. Results: EPA:DHA 1:1 treatment tended to improve the density and the wrinkling of elastic layers in SHROB rats. Only Wistar rats fed with EPA:DHA 1:1 treatment did not show mast cells in adipose tissue and has less kidney atrophy. In both strains EPA:DHA 1:1 treatment improved inflammation related parameters in liver and kidney. Conclusions: EPA:DHA 1:1 treatment was the most beneficial treatment since improved many histological parameters in both groups of rats. Keywords: Metabolic syndrome, Omega-3-polyunsaturated fatty acids, EPA/DHA ratio, Histology, SHROB rats, Fish oils Background Fish oils are the most common source of Omega-3 fatty acids, mainly eicosapentaenoic acid, (EPA 20:5) and doco- sahexaenoic acid, (DHA 22:6). It has been pointed out protective effect and beneficial effects of these fatty acids on heart health, cardiovascular disease (CVD), blood lipid profile, Type 2 Diabetes mellitus (T2DM), inflammatory and renal diseases and other illnesses [1,2]. Other potential mechanisms of cardiovascular protection by EPA/DHA may include lowering blood pressure, reduced anti- inflammatory effects, improved insulin resistance and decrease oxidative stress [3,4]. Most of these signs and illnesses are related to meta- bolic syndrome (MS). MS is defined as the presence of at least three of the five cardiovascular disease risk fac- tors in the following list: elevated fasting triglycerides (TG), decreased high-density lipoprotein cholesterol, in- sulin resistance, abdominal obesity and high blood pres- sure [3,5]. Accordingly nutritional modifications such as fish oil supplementation may correct MS. * Correspondence: nuria.taltavull@urv.cat 1Unit of Pharmacology, Faculty of Medicine and Health Sciences, Rovira i Virgili University, Reus, Spain Full list of author information is available at the end of the article ? 2014 Taltavull et al.; licensee BioMed Central Ltd. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly credited. The Creative Commons Public Domain Dedication waiver (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) applies to the data made available in this article, unless otherwise stated. Taltavull et al. Lipids in Health and Disease 2014, 13:31 http://www.lipidworld.com/content/13/1/31 307 Physiological changes should lead to morphological and histological changes too, but little research has been done on this issue [6]. Additionally, the amount of n-3 PUFA that needs to be in the diet to provide healthy effects is still unknown [7]. All fish contain EPA and DHA in amounts that vary depending on species. The EPA/DHA ratio in fish ranges between 0.22 and 1.25. The majority of the clinical stud- ies carried-out to date use fish-oil derived dietary sup- plements, but with a higher EPA/DHA ratio than that commonly found in the fish themselves. There is some controversy about the amounts of DHA or EPA that can have a positive effect on the prevention of metabolic al- terations and cardiovascular disease (CVD) [8]. Therefore, the aim of this study is to evaluate how three fish-oil treatments with different EPA/DHA ratios affect the histology of liver, kidney, adipose tissue and aorta in a preliminary morphological study. This paper uses an animal model of metabolic syndrome in com- parison to healthy animals in order to provide informa- tion about the best EPA: DHA ratio to prevent or to improve MS symptoms. Results Aorta Results in the aorta are shown in Table 1 and Figures 1 and 2. The aortic walls in SHROB rats are less healthy than those in Wistar rats: they are thicker and less dense, and have less wrinkling. However, there is some improve- ment in those rats consuming a EPA: DHA 1:1 treat- ment. Both the density and wrinkling are greater in the SHROB group supplemented with this proportion than with the other treatments. Likewise, the thickness of the wall is no different in this SHROB group than in the same Wistar group. No relationship was found between the anatomo- pathological findings and oxidative stress. However, aortic wall thickness was positively correlated with total plasma cholesterol levels, and negatively correlated with the HDL/LDL ratio (R2 = 0.613 and R2 = 0.658, respectively). Adipose tissue Results in adipose tissue are shown in Table 2 and Figure 3. To sum up, SHROB rats present greater hypertrophy and inflammation of the adipose tissue than Wistar rats. The results for each treatment group show that the 1:1 ratio presented no mast cells in Wistar rats unlike other groups. The 2:1 treatment decreased the number of mast cells in the adipose tissue of SHROB rats with respect to the other treatments. And, the 1:1 and 1:2 treatments showed no macrophages in SHROB rats unlike the other groups. Liver Results are shown in Figures 4 and 5. To sum up, in liver, the presence of steatosis in the centrilobular zone indicates initial harmful effects. The more widespread it is, the more the injury has progressed and the more se- vere it is. Therefore, periportal steatosis is worse than centrilobular steatosis, and non-zonal inflammation is the worst. In SHROB rats steatosis tended to be peripor- tal, but no statistically significant differences were found between treatment groups. As in the other tissues, in- flammation was evaluated according to the presence of white cells. SHROB rats also showed greater lobular in- flammation than Wistar. Kidney Table 3 and Figure 6 shows the results of the different variables studied in kidney. To sum up, kidney damage was greater in SHROB than in Wistar rats. The 2:1 treat- ment tends to worsen the kidney parameters in Wistar rats, while the 1:1 treatment improves renal atrophy in SHROB in comparison to the other tretments. The EPA: DHA 1:1 treatment had the lowest presence of atrophy followed by EPA:DHA 1:2. There were no differences in Table 1 Aorta results Thickness of wall (?m) Lumen area (mm2) Density of elastic tissue Wrinkling of elastic layers mean ? SD mean ? SD Yes (%) Yes (%) WISTAR EPA:DHA 1:1 101.60 ? 22.5 0.55 ? 0.31 42.86 85.71 EPA:DHA 2:1 91.91 ? 9.91a 0.43 ? 0.13 57.14 100c EPA:DHA 1:2 81.66 ? 5.47b 0.45 ? 0.10 100* 100d SHROB EPA:DHA 1:1 121.71 ? 18.04 0.56 ? 0.19 100 28.57 EPA:DHA 2:1 109.39 ? 13.82a 0.49 ? 0.13 33.33 0.00c EPA:DHA 1:2 122.82 ? 16.68b 0.64 ? 0.39 33.33 0.00d The quantitative data are expressed by mean ? SD. Qualitative data are expressed as frequencies. (*) Statistical differences with respect to EPA:DHA 1:1 treatment p < 0.05. The same letters in different strains mean significant statistical differences. p = 0.023a, p < 0.001b, p = 0.002c, p = 0.002d. Taltavull et al. Lipids in Health and Disease 2014, 13:31 Page 2 of 11 http://www.lipidworld.com/content/13/1/31 308 fibrosis, lipid depositions or inflammation of the kidney either between treatments or between strains. Discussion Although the relation between PUFA and cardiovascular disease has been widely demonstrated [1,9,10], limited information is available for histological changes. Aorta Data on various aortic layers are essential for under- standing various diseases (such hypertension or diabetes) that may remodel the tissue geometry and biomechan- ical properties of the vascular wall differentially [11]. Only two previous studies have investigated the effect of marine fatty acids on aorta histopathology. Park S. and Park Y. results suggested that the hypolipidemic ac- tion of fish oil had protective effects on aorta histopath- ology in male Wistar rats [12]. And Engler, et al., who show how DHA-fed spontaneously hypertensive rats significantly reduced blood pressure and vascular wall thicknesses in the coronary, thoracic, and abdominal aorta compared with controls [13]. In our study, despite the thickness of the aorta was not affected by any of the treatments, the ratio EPA: DHA 1:1 shown the highest value. And the highest value of wrinkling too. This indicates a healthier condition. A lower density of elastic layers and less wrinkling indi- cates increased stiffness of the aorta which has been as- sociated with greater vascular damage [11,14]. That?s the reason why the ratio EPA:DHA 1:1 is the best at maintaining or improving the aorta?s structure, and hence its function. We should emphasize that the portion of the aorta was taken from the same zone, therefore the results of the other variables can be attrib- uted to diet or strain and not to the location of the tis- sue sampling. All treatments had a similar fat and energy content and, hence, the observed differences can be attributed to the different EPA:DHA ratios. Adipose tissue According to the literature, omega 3 supplementation prevents the inflammation of the adipose tissue in obese and diabetic mice [9] and diminishes hypertrophy and hyperplasia in that tissue [15]. Our results seem to be Figure 1 Aortic wall thickness and wrinkling of elastic layers. Aortic wall thickness and wrinkling of elastic layers. Venhoeff & Van Gienson stain. (400x). Images on the left: Wistar rats. Images on the right: SHROB rats. (A and B) EPA:DHA 1:1 treatment. (C and D) EPA:DHA 2:1 treatment. (E and F) EPA:DHA 1:2 treatment. As we can see, images on the right, are thicker and less dense, and have less wrinkling, therefore are less functional. Taltavull et al. Lipids in Health and Disease 2014, 13:31 Page 3 of 11 http://www.lipidworld.com/content/13/1/31 309 contrary to the literature; in adipose tissue we observed hypertrophy of tissue when the abdominal fat weight/ body weight ratio in SHROB rats (6.7-7.8%) was higher than in Wistar rats (3.6-4.3%). There were significant differences in all treatment groups. Treatments did not affect this ratio in either Wistar or SHROB rats. This may be because SHROB rats were too severely affected by the diseases or because the weekly recommended dosage was too low. The greater presence of differently-sized adipocytes could be explained by the relation between PUFA, and peroxisome-proliferator-activated receptor ? (PPAR?), which plays a critical role in the regulation of adipocyte differentiation. PUFA are potential ligands for this nuclear Figure 2 Aorta results. At the top Histological cuts of abdominal aorta, Hematoxilin-eosin stain (400x) (A and B) EPA:DHA 1:1 in Wistar rat and SHROB rat respectively. We can observe the wall of aorta with the muscular cells nucleus and intuit elastic bands. As we can see SHROB rats presents a nuclei hypertrophy of aortic muscle cells than Wistar rats aortic muscle cells. When there was a nuclear hypertrophy of aortic muscle cells, the size of the cells increased and, consequently, the density decreased and the elastic layers were less wrinkled. This indicates a decreased health status. At the bottom four graphics (C) The different treatments did not affect the thickness of the aortic wall in either Wistar or SHROB rats. The same letters in different strains mean significant statistical differences. p = 0.023a, p < 0.001b. (D) In aortic lumen area there were no differences between Wistar and SHROB for any treatment or among treatments in each strain. This indicates that the portion of aorta was taken from the same zone, which enables results to be compared. (E) Wrinkling was significantly higher in Wistar than SHROB for the EPA:DHA 2:1, EPA: DHA 1:2 treatments (p = 0.002g and p = 0.002h respectively). The same letters mean significant statistical differences in different strains. (F) SHROB rats showed less density than Wistar without significant differences. In SHROB rats group the best value was given by EPA:DHA 1:1 treatment. Table 2 Adipose tissue results Variable size Macrophages Mast cells Inflammation Yes (%) Yes (%) Yes (%) No (%) Light (%) Moderate (%) Marked (%) WISTAR EPA:DHA 1:1 28.57a 14.29 0b 71.43 28.57 0.00 0.00 EPA:DHA 2:1 71.43 42.86 57.14 85.71c 14.29 0.00 0.00 EPA:DHA 1:2 33 16.67 100* 66.67 33.33 0.00 0.00 SHROB EPA:DHA 1:1 85.71a 0.00 85.71^b 28.57 71.43 0.00 0.00 EPA:DHA 2:1 57.14 14.30 42.86 0.00c 100.00 0.00 0.00 EPA:DHA 1:2 42.86 0.00 100^ 42.86 57.14 0.00 0.00 Data are expressed as frequencies. The same letters in different strains mean significant statistical differences, p = 0.031a, p = 0.01b, p = 0.001c. (*): Differences with EPA:DHA 1:1. In mast cells % p < 0.001. (^): differences with EPA:DHA 2:1. In mast cells % p = 0.022, p = 0.018 respectively. Taltavull et al. Lipids in Health and Disease 2014, 13:31 Page 4 of 11 http://www.lipidworld.com/content/13/1/31 310 receptor, which may be the reason why rats fed PUFA have more adipocytes of different sizes [16]. The PPAR family can also inhibit NF-?? factor transcription, which is also related to inflammation [5]. This may explain why PUFA prevents inflammation. However, the effect of different types of PUFA on body adiposity is still controversial. Omega-3 PUFA treat- ments, as our results show, improve inflammation in this tissue, especially in SHROB rats. Even being a very af- fected model, after the EPA:DHA treatment SHROB rats showed a slight inflammation or non- existent inflam- mation in all cases. Liver The effects of omega-3 PUFA on liver are the most contro- versial, showing contradictory results [17,18]. In our study Wistar rats showed better results in all the parameters de- termined in liver, specifically EPA:DHA 1:1 treatment, which showed the best results, leading to a total absence of any inflammatory process. Various studies have shown that both the excess and the total absence of omega 3 PUFA in experimental ani- mals have given rise to hepatic steatosis [19,20]. This could be explained by the nature of the PUFA n-3, which is fat. It is therefore of the utmost importance to establish the correct dosage range for these fatty acids. In our study, in healthy rats - Wistar rats- , the best treatment is EPA:DHA 1:1 implying a preventative role in the liver. However in the group of rats affected -SHROB rats- EPA:DHA 1:1 ratio also provides the less harmful lo- cation of steatosis. Kidney Finally, epidemiological studies suggest that omega-3 PUFA slow down the progression of renal dysfunc- tion in patients [21,22] and experimental models of diabetes [23,24]. Figure 3 Adipose tissue results. At the top Histological cuts of adipose tissue, Hematoxilin-eosin stain (A) EPA:DHA 1:1 in SHROB rat (100x), we can observe the variable size of adipocytes and intuit the presence of inflammatory cells. (B) EPA:DHA 1:2 in SHROB rat (300x) mast cells marked up by black arrows. At the bottom four graphics in which: (W) refers to Wistar strain, (S) refers to SHROB strain. (A) EPA:DHA 1:1, (B) EPA:DHA 2:1, (C) EPA:DHA 1:2. Equal letters, a, b, c, d, e means statistical differences among strains. (C) In both strain of rats there weren?t statistically significant differences in the proportion of different adipocyte sizes among the treatment groups. Comparing the two strains, it was higher in SHROB rats than in WISTAR rats for the EPA:DHA 1:1 diet (p = 0.031a). (D) As far as the presence of white cells, and therefore inflammation, is concerned; there was a higher effect of PUFA n-3 in Wistar rats than in SHROB rats. In these strain only EPA:DHA 1:2 treatment doesn?t show a significant improvement (p = 0.001c) (E) Mast cells % in Wistar rats showed differences with EPA:DHA 1:1 (p < 0.001*). And in SHROB rats (p = 0.022^, p = 0.018^ respectively) Comparing the two strains, in the EPA:DHA 1:1 diet, SHROB showed a greater presence of mast cells than WISTAR (p = 0.001b). (F) The proportion of macrophages in SHROB rats was lower than in Wistar rats but no significant differences were founded. Taltavull et al. Lipids in Health and Disease 2014, 13:31 Page 5 of 11 http://www.lipidworld.com/content/13/1/31 311 In our results, unlike SHROB rats, Wistar rats showed no renal dysfunction. A comparison of the treatments in SHROB rats shows that EPA:DHA 1:1 did not cause renal atrophy. Considering the greater effect in Wistar rats than in SHROB rats, treatments of marine fish-oil seem to be more preventative than restorative in kidney tissue. As in liver tissue. All this suggests that within the protective role of PUFA, the most appropriate ratio of its components is EPA:DHA 1:1 ratio as has been already described in the article of Lluis, et al. [4] carried on by our group. But also improves histological parameters in Obese rats with Metabolic Syndrome, as demonstrated in this work. Limitations The SHROB strain, also known as the Koletsky rat, is considered to be a good model for MS. It has mono- genetic obesity superimposed on a hypertensive genetic background. The obesity mutation is a recessive trait, designated fak, which is a nonsense mutation of the lep- tin receptor gene. This mutation renders the SHROB in- capable of central and peripheral responses to leptin. Animals can be identified as genetically obese at about five weeks of age and they also develop premature vas- cular disease, particularly of the abdominal arteries, al- though, microscopically, the lesions that occur in these vessels simulate those of human atherosclerosis [9]. The SHROB rats also develop severe glomerulosclerosis and A B DC E F Figure 4 Liver results. Graphics of liver results in which: (W) refers to WISTAR stain, (S) refers to SHROB stain. (A) EPA:DHA 1:1, (B) EPA:DHA 2:1, (C) EPA:DHA 1:2. Equal letters, a, b, c, d, e means statistical differences among strains. (A) Liver samples of WISTAR rats no showed steatosis. Consequently, between WISTAR and SHROB statistically significant differences were observed in all treatment groups (EPA:DHA 1:1 p = 0.001, EPA: DHA 2:1 p = 0.001, EPA:DHA 1:2 p = 0.031). The graphics showns the grade of stetosi in SHROB rats, its location is shown in graphic (B) we can see how in SHROB rats steatosis tended to be periportal, but no statistically significant differences were found between treatment groups. (C) SHROB rats also showed greater lobular inflammation than Wistar. There were significant differences between strains in the EPA:DHA 2:1 and EPA:DHA 1:2 treatments (p = 0.025* and p = 0.02^, respectively). (D) The presence of microgranulomas was higher in SHROB rats than in Wistar, and the differences were significant in three tretament groups: EPA:DHA 2:1 (p = 0.005a). In SHROB fewer microgranulomas were present in the EPA:DHA 1:1 and EPA:DHA 1:2 treatments, but there were no significant differences with other groups. (E) We found lipogranulomas in the Wistar EPA:DHA 2:1 group and in all the groups of SHROB rats, with significant differences between strains for EPA:DHA 1:1 (p < 0.001), EPA:DHA 2:1 (p = 0.001), EPA:DHA 1:2 (p = 0.002). (F) Portal inflammation was present in both Wistar and SHROB rats but differences were only significant between strains in the EPA: DHA 1:1 treatment (p < 0.001). No differences between treatments were found in the same strain. Taltavull et al. Lipids in Health and Disease 2014, 13:31 Page 6 of 11 http://www.lipidworld.com/content/13/1/31 312 renal failure [25]. SHROB strain has been used in many pharmacological studies with antihypertensive and antidia- betic drugs but our results indicate that it is probably not such a useful model for distinguishing subtle changes caused by diets. Conclusion PUFA n-3 treatments ? especially EPA:DHA 1:1 ratio? improved the density and wrinkling of the elastic layers in the abdominal aorta in SHROB rats and kidney atro- phy as well. EPA:DHA 1:1 also improved the inflam- mation parameters in the liver and the inflammation parameters in adipose tissue in both groups of rats. Therefore we can conclude that, Eicosapentaenoic acid/ Docosahexaenoic acid 1:1 ratio improves histological alterations in Obese Rats with Metabolic Syndrome which is a progress in the study of morphological changes and therefore functional changes of PUFA in the organism. It is important to note that is a preliminary morphological study, therefore most studies had to be done in this field. Methods and procedures Animals and supplementation All the procedures agreed with the European Union guidelines for the care and management of laboratory animals and the pertinent permission was obtained from the CSIC Subcommittee of Bioethical Issues. Thirty-five female Wistar rats, as a control group, and thirty-five spontaneously hypertensive obese rats (SHROB), as a model of SM, were purchased from Figure 5 Histological cuts of liver. Histological cuts of liver, Hematoxilin-eosin stain (A) EPA:DHA 2:1 treatment in SHROB rat (40x), shown steatosis with periportal location (B) EPA:DHA 2:1 treatment in SHROB rat (400x), lobular inflammation marked up with a black arrow. The picture also allows us to observe steatosi which is marked up, in part, with red arrows (C) EPA:DHA 2:1 in SHROB rat (600x), on the right some macrophages surrounding a lipidic drop, forming a lipogrnaulome and on the left a lipogranulome also formed by macrophages. The picture also allows us to observe steatosi at higher magnification (D) EPA:DHA 2:1 in Wistar rat (200x), portal inflammation, as we can see the inflammatory cells are surrounding portal space. Table 3 Kidney results Glomerulosclerosis Atrophy Thyroidization Presence Absence Light Middle Marked Absence Light Middle Marked WISTAR EPA:DHA 1:1 0a 100 0 0 0 100a 0 0 0 EPA:DHA 2:1 14.29 85.71 0 14.29 0 71.43b 14.29 14.29 14.29 EPA:DHA 1:2 0 100 0 0 0 100c 0 0 0 SHROB EPA:DHA 1:1 71.43a 100 0 0 0 0a 57.14 28.57 14.29 EPA:DHA 2:1 57.14 71.43 28.57 0 0 0b 57.14 14.29 28.57 EPA:DHA 1:2 42.86 85.71 0 14.29 0 0c 57.14 14.29 28.57 The data are expressed as frequency. The same letters in different strains mean significant statistical differences. Glomerulosclerosis: p = 0.005a. Thyroidization: p = 0.003a, p = 0.032b, p = 0.005c. Taltavull et al. Lipids in Health and Disease 2014, 13:31 Page 7 of 11 http://www.lipidworld.com/content/13/1/31 313 Janvier (Le Genest-St-Isle, France).The rats (13 weeks old) were kept in an isolated room with a constantly regulated temperature (22 ? 2?C), and controlled hu- midity (50 ? 10%) in a 12 h. artificial light cycle. Both groups of rats spent a prior period of adaptation that lasted two weeks. Rats of each strain were randomized into trhee groups (7 rats each): EPA:DHA 1:1 group, EPA:DHA 2:1 group and EPA:DHA 1:2 group. All groups were fed a standard pelleted diet from Harlan Ib?rica (Barcelona, Spain) and had ad libitum access to water and food. Oils with different EPA:DHA ratios were obtained by mixing appropriate quantities of the commercial fish oils AFAMPES 121 EPA (A.F.A.M.S.A., Vigo, Spain), Ener- Zona Omega 3 RX (Milan, Italy) and Oligen liquid DHA 80% (IFIGEN-EQUIP 98, S.L., Barcelona). The supplemented dose fish oils was in agreement with the European Union?s recommendation on omega-3 PUFA [26]. All supplements had a similar fat and energy content (55?66 mg of PUFA per 100 mg of total fatty acid) as is specified in a previous study recently pub- lished by our group [27]. However, they differed signifi- cantly in the proportion of individual fatty acids. In fish oil mixtures containing EPA:DHA ratios of 1:1, 2:1 and 1:2, EPA and DHA were the most abundant PUFA, mak- ing up approximately 50 mg per 100 mg of fatty acid between them. Because PUFA are extremely susceptible to oxidation and the potential toxic effects of lipid oxi- dation by-products, the lipid oxidation level was checked throughout the experiment (peroxide values < 5 meq. oxygen per kg of oil). Each group of rats (n = 7) had a weekly oral dose of 0.8 mL/Kg bodyweight of the oil supplements, for 13 weeks administered by gavage. Finally all rats were sacrificed at the age of 28 weeks. The rats were anesthetized intraperitoneally with ketamine and xylacine (80 mg/Kg and 10 mg/Kg body weight re- spectively), and then killed by exsanguination. Tissue sam- ples were collected from the abdominal aorta, abdominal adipose tissue, liver, and kidney. Tissue processing The dissected tissues were divided into two parts: the first one was quickly frozen in liquid nitrogen and stored at -80?C, for various biochemical determinations, and the second one was fixed in 10% formalin at pH 7.4, for histological analysis. All tissues, except adipose tissue, which was extracted from abdominal zone, were dis- sected entirely. The samples fixed in formalin were dehydrated in al- cohol and embedded in paraffin. Then all tissues were cut in typically 3 ?m thick slices, using a steel Knife BA C D FE Figure 6 Kidney results. At the top Histological cuts of kidney, Hematoxilin-eosin stain. (A) EPA:DHA 1:1 in SHROB rat (40x) thyroidization zones are marked by black arrows. Thyroidization it?s a kind of atrophy which gives them the appearance of the follicles in the thyroid gland as we can see in the picture (hence the name). (B) EPA:DHA 1:2 in SHROB rat (200x), inflammation in kidney can be observed by the presence of inflammatory cells, also we can observe a normal glomerulus on the top and a glomerulus with glomerulosclerosis marked by a black arrow. At the bottom three graphics in which: (W) refers to Wistar strain, (S) refers to SHROB strain. (A) EPA:DHA 1:1, (B) EPA:DHA 2:1, (C) EPA:DHA 1:2. Equal letters, a, b, c, d, e means statistical differences among strains. (C) We found greater presence of glomerulosclerosis in SHROB rats than in Wistar rats, but significant differences were found only in the EPA:DHA 1:1 treatment (p = 0.005a). (D) SHROB rats had greater thyroidization than Wistar rats in all treatment groups p = 0.003a, p = 0.032b, p = 0.005c. (E) Atrophy was also higher in SHROB rats. EPA:1:1 doesn?t shown atrophy in either both treatments, but no significant differences were founded. (F) Inflammation were better also in EPA:DHA 1:1 treatments in both strains, but without significant differences. Taltavull et al. Lipids in Health and Disease 2014, 13:31 Page 8 of 11 http://www.lipidworld.com/content/13/1/31 314 mounted in a microtome (Microm HN 355 s). Sections from the liver, kidney and adipose tissue were stained with haematoxylin/eosin (Harris Hematoxylin. QCA). Aorta sections were stained with hematoxylin/eosin, and Verhoeff and van Gieson?s stain (Van Gieson kit 100 test 6 ? 30 ml + 2 ? 18 ml Casa Alvarez (WVG-1026). Haematoxylin stains cell nuclei blue, while eosin stains cytoplasm, connective tissue and other extracellular sub- stances pink or red. Verhoeff and van Gieson's stain is a mixture of picric and fuchsin acids which makes it pos- sible to observe the elastic layers of the aorta wall by staining them dark blue. The sections of all tissues were viewed under a light digital optical microscope (Leica DMD 108) for histopathological changes. Results of biochemical determinations such, as tissue oxidative stress and plasma lipid profile are not shown in this study, and were only used to establish correla- tions with the parameters of pathological anatomy. The tissue parameters were graded on the basis of the histological findings (Table 4) [12,13,28-30]. The thickness of the aortic wall was examined at two different points: maximum and minimum thickness. The Table 4 Categorization of the parameters in the different tissues Meaning Grade Meaning Grade Meaning Grade Aorta Liver Kidney Thickness of wall (?m) Steatosis Glomerulosclerosis Lumen perimeter (mm) < 5% 0 Absence 0 Lumen area (mm2) 5-33% 1 Presence 1 Density of elastic bands 33-66% 2 Atrophy Yes 1 > 66% 3 Absence 0 No 2 Localization of steatosis Light 1 Wrinkling of elastic layers Centrilobular 0 Middle 2 Yes 1 Periportal 1 Marked 3 Heterogeneous 2 No zonal 2 Thyroidization No 3 Absence 0 Nuclear hypertrophy Lobular inflammation Light 1 No 1 No 0 Middle 2 Heterogeneous 2 < 2 focus 1 Marked 3 Yes 3 2-4 focus 2 Fibrosis > 4 focus 3 Absence 0 Adipose tissue Portal inflammation Presence 1 Differently sized adipocytes No 0 Lipid depositions Yes 1 Yes 1 Absence 0 No 0 Fibrosis Light 1 Macrophages No 0 Moderate 2 Presence 1 Perisinusoidal or periportal 1 Inflammation Absence 0 Fibrosis bridges 2 Absence 0 Mast cells Cirrhosis 3 Light 1 Presence 1 Microgranuloma Moderate 2 Absence 0 Absence 0 Marked 3 Inflammation Presence 1 No 0 Lipogranuloma Light 1 Absence 0 Moderate 2 Presence 1 Marked 3 Macrophages Absence 0 Presence 1 Categorization of the parameters in the different tissues based on the literature: Park S and Park Y, 2009 [12]; Engler, et al., 2003 [13]; Mu?oz, et al., 2009 [28]; Xu ZJ, et al.,2010 [29]; Dobrian, et al., 2003 [30]. Taltavull et al. Lipids in Health and Disease 2014, 13:31 Page 9 of 11 http://www.lipidworld.com/content/13/1/31 315 mean of these two values was used. Semi quantitative parameters were assessed by the consensus of three observers. Inflammation of adipose tissue, liver and kidney was determined on the basis of the presence of inflammatory cells in tissue [28,30]. Varying adipocyte sizes indicate hypertrophy in adi- pose tissue. The more adipocytes there are of different sizes, the greater the degree of tissue hypertrophy [28]. As well as inflammation, glomerulosclerosis, atrophy, fi- brosis, lipid deposits and thyroidization were also evalu- ated in kidney. Thyroidization is the atrophy of some areas of the kid- ney. The presence of thyroidization, then, does not indi- cate a healthy status. The results of the categorical variables were expressed as the percentage of animals that presented the particu- lar category in every variable (relative frequency). Statistical analysis Statistical analysis was performed using SPSS IBM 19 software. The quantitative data are expressed by mean ? SD and were compared among groups and treatments using ANOVA with post-hoc tests for parametric data and the U-Mann? Whitney for non-parametric data. Qualitative data are expressed in frequencies, therefore, percent of animals which present or not present the variable. Relative frequencies were compared with con- tingency tables using ?2 statistics. A p-value of <0.05 was considered to be statistically significant. Results were statistically correlated with oxidative stress and lipid pro- file data. Abbreviations ANOVA: Analysis of variance; Apo: Apolipoprotein; CDV: Cardiovascular disease; DHA: Docosahexaenoic acid; EPA: Eicosapentaenoic acid; HDL: High-density lipoprotein; LDL: Low-density lipoprotein; MS: Metabolic syndrome; NF-?B: Nuclear factor kappa B; PUFA: Polyunsaturated fatty acids; PPAR: Peroxisome proliferator-activated receptor; SHROB: Spontaneously hypertensive obese rats; SHR: Spontaneous hypertensive rats; VLDL: Very-low- density lipoprotein. Competing interests The authors declare that they have competing interests. Authors? contributions All the authors have contributed substantially to the design and execution of the study as well as the drafting and revision of the manuscript. They have all approved the final version submitted for publication. Acknowledgements This investigation was supported, in part, by the Spanish Ministry of Science and Innovation (Grants AGL2009-12374-C03-01,-02 and ?03). EM acknowledges the Panamanian government (SENACYT / IFARHU) for her pre-doctoral fellowship. We thank URV?s Language Service for rewriting the English version of this paper. SUPPORTED BY: Proyectos de Investigaci?n Fundamental, Ministerio Espa?ol de Ciencia e Innovaci?n, Plan Nacional 2009.Referencia: AGL2009-12374-C03-01, -02 and ?03. Author details 1Unit of Pharmacology, Faculty of Medicine and Health Sciences, Rovira i Virgili University, Reus, Spain. 2Unit of Human Anatomy, Faculty of Medicine and Health Sciences, Rovira i Virgili University, Reus, Spain. 3Anatomical Pathology Service, Eldine Laboratory, Tarragona, Spain. 4Institute of Advanced Chemistry of Catalonia (IQAC-CSIC), Barcelona, Spain. 5Institute of Marine Research-CSIC, Vigo, Spain. Received: 11 October 2013 Accepted: 6 February 2014 Published: 11 February 2014 References 1. Tur JA, Bibiloni MM, Sureda A, Pons A: Dietary sources of omega 3 fatty acids: public health risks and benefits. Br J Nutr 2012, 107:23?52. 2. 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Mu?oz MC, Giani JF, Dominici FP, Turyn D, Toblli JE: Long-term treatment with angiotensin II receptor blocker decreases adipocyte size and improves insulin signalling in obese zucker rats. Ann N Y Acad Sci 2009, 27:2409?2420. 29. Xu ZJ, Fan JG, Ding XD, Qiao L, Wang GL: Characterization of high-fat, diet-induced, non-alcoholic steatohepatitis with fibrosi in rats. Dig Dis Sci 2010, 55:931?40. 30. Dobrian AD, Schirver SD, Lynch T, Prewitt RL: Effect of salt on hypertension and oxidative stress in rat model of diet-induced obesity. Am J Physiol Renal Physiol 2003, 285:F619?28. doi:10.1186/1476-511X-13-31 Cite this article as: Taltavull et al.: Eicosapentaenoic acid/ docosahexaenoic acid 1:1 ratio improves histological alterations in obese rats with metabolic syndrome. Lipids in Health and Disease 2014 13:31. Submit your next manuscript to BioMed Central and take full advantage of: ? Convenient online submission ? Thorough peer review ? No space constraints or color figure charges ? Immediate publication on acceptance ? Inclusion in PubMed, CAS, Scopus and Google Scholar ? Research which is freely available for redistribution Submit your manuscript at www.biomedcentral.com/submit Taltavull et al. Lipids in Health and Disease 2014, 13:31 Page 11 of 11 http://www.lipidworld.com/content/13/1/31 317 Protein carbonylation associated to high-fat, high-sucrose diet and its metabolic effects Luc?a M?ndeza,?, Manuel Pazosa, Eunice Molinar-Toribiob, Vanesa S?nchez-Martosc, Jos? M. Gallardoa, M. Rosa Nogu?sc, Josep L. Torresb, Isabel Medinaa aInstituto de Investigaciones Marinas, Consejo Superior de Investigaciones Cient?ficas (IIM-CSIC), E-36208 Vigo, Spain bInstituto de Qu?mica Avanzada de Catalunya, Consejo Superior de Investigaciones Cient?ficas (IQAC-CSIC), E-08034 Barcelona, Spain cUnidad de Farmacolog?a. Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad Rovira i Virgili, E-43201 Reus, Spain Received 20 December 2013; received in revised form 19 June 2014; accepted 26 June 2014 Abstract The present research draws a map of the characteristic carbonylation of proteins in rats fed high-caloric diets with the aim of providing a new insight of the pathogenesis of metabolic diseases derived from the high consumption of fat and refined carbohydrates. Protein carbonylation was analyzed in plasma, liver and skeletal muscle of Sprague?Dawley rats fed a high-fat, high-sucrose (HFHS) diet by a proteomics approach based on carbonyl-specific fluorescence-labeling, gel electrophoresis and mass spectrometry. Oxidized proteins along with specific sites of oxidative damage were identified and discussed to illustrate the consequences of protein oxidation. The results indicated that long-term HFHS consumption increased protein oxidation in plasma and liver; meanwhile, protein carbonyls from skeletal muscle did not change. The increment of carbonylation by HFHS diet was singularly selective on specific target proteins: albumin from plasma and liver, and hepatic proteins such as mitochondrial carbamoyl-phosphate synthase (ammonia), mitochondrial aldehyde dehydrogenase, argininosuccinate synthetase, regucalcin, mitochondrial adenosine triphosphate synthase subunit beta, actin cytoplasmic 1 and mitochondrial glutamate dehydrogenase 1. The possible consequences that these specific protein carbonylations have on the excessive weight gain, insulin resistance and nonalcoholic fatty liver disease resulting from HFHS diet consumption are discussed. ? 2014 Elsevier Inc. All rights reserved. Keywords: High-fat, high-sucrose diet; Obesity; Insulin resistance; NAFLD; Protein carbonylation; Sprague?Dawley rat 1. Introduction Protein carbonylation constitutes the most common biomarker of oxidative protein damage and can be induced by the attack of reactive oxygen species (ROS) [1]. The consumption of high-caloric diets associated to a westernized lifestyle has been linked to the generation of an excess of ROS, particularly superoxide anion through the mitochondrial electron-transport chain, and to the development of multiple metabolic disorders such as obesity, hypertension, hyper- glycemia, hyperinsulinemia or dyslipidemia [2?4]. As a consequence of this ROS overproduction, increased protein carbonylation levels have been described occurring together with these diet-induced disorders [5,6]. Protein carbonylation is an irreversible oxidative posttranslational modification, although cells exhibit native enzymatic systems that eliminate altered proteins and maintain cellular homeostasis and survival. These damage response systems are typically proteasome in the cytosol and adenosine triphosphate (ATP)-dependent proteases in mitochondria [7]. When these enzymatic systems come to fail, carbonylated proteins accumulate in the cell, and cellular functions are disrupted because carbonylated proteins either lose their catalytic and structural integrity, or interrupt regulatory pathways [8]. Protein oxidative damage has been traditionally accepted to be a random process since ROS generally attack protein nonenzymatically and radical species such as hydroxyl radicals are so reactive that are they able to oxidize most amino acids [9]. However, several studies have revealed that protein carbonylation is highly selective in diseases such as Alzheimer [10] or uremia [11], or even during the natural aging process. A dietary intervention study of Wistar rats supplemented with fish oils also showed such specificity by down-regulating carbonylation of several plasma and liver proteins [12]. However, to date, few studies have addressed protein oxidation linked to metabolic disorders induced by diet high in fat and/or sugars, and those that exist performed essentially total protein carbonylation measurements [13?17]. The aim of the present study is to evaluate comprehensively the impact of oxidative stress triggered by high-fat, high-sucrose (HFHS) diets on irreversible oxidative protein damage and, particularly, on protein carbonylation. Recent investigations indicated that obesity and insulin resistance are accompanied by an increased carbonylation of certain adipose-regulatory proteins [6,18]. The present work is Available online at www.sciencedirect.com ScienceDirect Journal of Nutritional Biochemistry xx (2014) xxx?xxx ? Corresponding author. Tel.: +34 986 231930; fax: +34 986 292762. E-mail address: luciamendez@iim.csic.es (L. M?ndez). http://dx.doi.org/10.1016/j.jnutbio.2014.06.014 0955-2863/? 2014 Elsevier Inc. All rights reserved. 318 focused on the explicit carbonylation of plasma, liver and skeletal muscle proteins since these tissues play a key role in the development of metabolic disorders [19], and they have not been addressed before. To this purpose, we analyzed total and individual protein carbonyl- ation in plasma, liver and skeletal muscle from rats fed a HFHS diet for 22 weeks compared with control rats fed a low-fat diet. Proteins susceptible to oxidation and carbonylation sites were identified by using a proteomics approach based on gel electrophoresis and protein identification by tandem mass spectrometry (MS/MS). Protein carbonylation was correlated with morphological measurements, and biochemical parameters of lipid and carbohydrate metabolism, lipid peroxidation products and endogenous antioxidant systems, and discussed in terms of its potential implication on the metabolic disorders observed. 2. Materials and methods 2.1. Materials and reagents Fluorescein-5-thiosemicarbazide (FTSC) was purchased from Invitrogen (Carlsbad, CA), and porcine sequencing-grade modified trypsin was from Promega (Madison, WI). Ketamine chlorhydrate (Imalgene 1000) was purchased from Merial Laboratorios S.A. (Barcelona, Spain), and xylacine (Rompun 2%) was from Quimica Farmaceutica S.A. (Barcelona, Spain). ProteoBlock protease inhibitor cocktail was purchased from Thermo Fisher Scientific Inc. (Rockford, IL). Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF); dithiothreitol (DTT); iodoacetamide; ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA); trichloro- acetic acid (TCA); Tris?HCl; 3,3-cholaminopropyl-dimethylammonio-1-propanesulfonate (CHAPS); sodium phosphate; magnesium chloride anhydrous; 2,2 -azobis(2- amidinopropane) dihydrochloride (AAPH); 3 ,6 -dihydroxyspiro[isobenzofuran-1[3H],9 [9H]-xanthen]-3-one (fluorescein); 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox); 2-thiobarbituric acid; 1,1,3,3,-tetraethoxypropane; propyl gallate and bicinchoninic acid (BCA) were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Urea, thiourea, sodiumdodecyl sulfate (SDS), glycine, glycerol and SerdolitMB-1were obtained from USB (Cleveland, OH). IPG buffer; Pharmalyte 3?10; ammonium persulfate; bromophenol blue; and 1,2-bis(dimethylamino)ethane were purchased from GE Healthcare Science (Uppsala, Sweden). Acrylamide; bis-N,N -methylene-bis-acrylamide; and Bio-Radprotein assaywere obtained fromBio-Rad (Hercules, CA). All other chemicals and reagents usedwereof analytical reagent grade, andwaterwas purified using aMilli-Q system (Millipore, Billerica, MA). 2.2. Animals and experimental design Male22-week-old Sprague?Dawley ratsweighing between500 and600 g (Janvier, Le Genest-St-Isle, France) were housed in animal cages (n=2?3/cage) with constantly regulated temperature (22?C?2?C), humidity (50%?10%) and light-controlled room (lights on 06:30?18:30). The animals were randomly assigned to one of two dietary groups: a control group (n=5) fed the reference diet Teklad Global 2014 (Harlan Teklad Inc., Indianapolis, IN) and a group (n=5) fed a HFHS based on TD. 08811 diet (Harlan Teklad Inc.). Rats had ad libitum access to water and food. Food intake and water consumption were registered daily throughout the study (means are shown in Table 1). After 22 weeks of experiment, rats were fasted overnight, anesthetized intraperitoneally with ketamine and xylacine (80mg/kg and 10mg/kg bodyweight, respectively) and then killed by exsanguination. The control diet composition was (% by weight) 4.3% fat (3.9% soybean oil), 46.7% available carbohydrate (41% corn and wheat starches), 16.3% protein, 21.5% total fiber, 4.6% minerals and 1.2% vitamins. Fats provided 13.3% of calories, carbohydrates provided 64.3%, and proteins provided 22.5%. Total energy density was 2.9 kcal/g. HFHSdiet compositionwas (%byweight) 24.3% fat (21% anhydrousmilk fat, 2% soybean oil), 43.5% available carbohydrate (32.4% sucrose), 20.9% protein, 4.7% total fiber (fromcellulose), 4.1%minerals, 1.8% vitamins (fromAmerican Institute ofNutrition 93-VX (94047)) and 0.004% antioxidants. Fats provided 45.9% of calories, carbohydrates provided 36.5% (27% from sucrose), and proteins provided 17.6%. Total energy density was 4.7 kcal/g. The approximate fatty acid profile of control diet (% of total fat) was 18% saturated fatty acids (SFA), 20% monounsaturated fatty acids (MFA) and 62% polyunsaturated fatty acids (PUFA). In the HFHS diet, the fatty acid profile was 61% SFA, 31%MUFA and 8% PUFA. The HFHS diet contained about 0.05% of cholesterol, mainly from the anhydrous milk fat. Control diet can contain small amounts of cholesterol, likely less than 0.001%. All the procedures followed the European Union guidelines for the care and management of laboratory animals, and all efforts were made to minimize suffering. The pertinent permission for this specific studywas obtained from the CSIC (Spanish Research Council) Subcommittee of Bioethical Issues (ref. AGL2009-12 374-C03-03). 2.3. Sample collection Total abdominal fat, corresponding to the sum of epididymal, perirenal and mesenteric depots, liver and skeletal muscle from hind leg were excised, washed with 0.9% NaCl solution, weighed and immediately frozen in liquid nitrogen upon sacrifice. The adiposity index [(total abdominal fat?100)/body weight] and hepatosomatic index [(liver weight?100)/body weight] were determined. One part of dissected livers was used for histological analysis. Blood samples were collected on a tube with EDTA by cardiac puncture, and plasma and erythrocyte samples were separated by centrifugation (850g, 4?C, 15min). Plasma samples for protein oxidation measurement were supple- mented with 5 mM PMSF. All samples were stored at?80?C until analysis. 2.4. Biochemical measurements Triglycerides, cholesterol, low-density lipoprotein (LDL) cholesterol and high-density lipoprotein (HDL) cholesterolweremeasuredby spectrophotometricmethods (SpinReact Kits, Girona, Spain) [20,21]. Thepercentage of glycatedhemoglobin, orHbA1c, in the blood was determined according to Sharp et al. [22]. Blood glucose levels were measured by an enzyme electrode method using the Ascensia ELITE XL blood glucose meter (Bayer Consumer Care AG, Basel, Switzerland). Plasma insulin concentrations were measured using a Rat/Mouse Insulin ELISA kit according to the manufacturer?s instructions (Millipore Corporation, Billerica, MA). 2.5. Determination of lipid peroxidation levels and antioxidant systems in blood and liver samples For estimating lipid peroxidation levels, we measured three different products of lipid peroxidation: lipid hydroperoxides (primary lipid oxidation product), conjugated dienes (intermediate oxidation product) and malondialdehyde (MDA) (end oxidation product). The first step for the estimation of lipid hydroperoxides and conjugated dienes was to extract liver lipids with dichloromethane [23] and to determine total lipid content [24]. Then, conjugated dienes were measured following the American Oil Chemists' Society method [25], and lipid hydroperoxides were measured following the method of Chapman and Mackay [26]. We also measured total MDA concentrations in plasma and liver. Total MDA was derivatized with thiobarbituric acid (TBA) after protein hydrolysis [27] and precipitation [28], and determined by high-performance liquid chromatography fluorescence according to Fukunaga et al. [29]. Total superoxide dismutase (SOD) activity was measured in plasma and liver following the method of Misra and Fridovich [30]. Catalase (CAT) activity was measured in plasma and liver according to the procedure of Cohen et al. [31]. Glutathione peroxidase (Gpx) and glutathione reductase (GR) activities were determined according to Wheeler et al. [32]. The oxidized and reduced glutathione balance (GSSG/GSH) was measured by the Hissin and Hilf fluorometric method [33]. The oxygen radical absorbance capacity (ORAC) from plasma and liver was determined according to Ou et al. [34]. ORAC measures antioxidant scavenging activity against peroxyl radicals induced by AAPH using fluorescein as fluorescent probe and Trolox as standard and quality control. 2.6. Liver histological studies Livers fixed in formalin were dehydrated in alcohol and embedded in paraffin. Serial liver sections (3 ?m)were stainedwithhaematoxylin/eosin (HarrisHematoxylin, Qu?mica Cl?nica Aplicada, S.A., Tarragona, Spain). Liver injury such as steatosis, lobular inflammation and fibrosis was evaluated by histological examination under a light microscope, as previously described [35]. Briefly, ten 200? light microscopic fields were viewed on each section and scored for the severity of hepatic steatosis, inflammation and fibrosis according to the following criteria: for hepatic steatosis (expressed as percent of Table 1 Body measurements and metabolic variables in rats Control (n=5) HFHS (n=5) Final body weight (g) 722.4 (95.6) 918.2 (93.3) ? Food intake (g/day) 26.7 (1.2) 21.9 (0.5) ? Energy intake (kcal/day) 77.4 (8.8) 101.0 (8.4) ? Total abdominal fat weight (g) 32.4 (13.8) 60.7 (9.3) ?? Adiposity index (%)a 4.4 (1.2) 6.7 (1.5) ? Liver weight (g) 15.6 (3.6) 24.8 (6.8) ? Total liver lipids (mg/g) 2.3 (0.2) 8.8 (1.9) ?? Hepatosomatic index (%)b 2.1 (0.3) 2.7 (0.8) Total cholesterol (mmol/L) 2.87 (0.40) 2.26 (0.20) LDL-C (mmol/L) 0.42 (0.11) 0.29 (0.04) HDL-C (mmol/L) 0.73 (0.06) 0.60 (0.06) Triglycerides (mmol/L) 2.13 (0.34) 1.71 (0.33) HbA1c (%) 5.7 (0.4) 5.0 (0.1) Plasma glucose (mmol/L) 4.1 (0.4) 4.5 (0.5) Plasma insulin (pmol/L) Week 5 0.25 (0.10) 1.16 (0.11) ?? Week 9 0.27 (0.12) 0.80 (0.03) ?? Week 13 0.29 (0.14) 0.88 (0.05) ?? Results are means (standard deviation); n, number of rats. a Adiposity index: (total abdominal fat?100)/body weight. b Hepatosomatic index: (liver weight?100)/body weight. ? Pb.05 vs. control group. ?? Pb.01 vs. control group. 2 L. M?ndez et al. / Journal of Nutritional Biochemistry xx (2014) xxx?xxx 319 hepatocytes containing fat droplets): grade 0, no fat; grade 1, steatosis occupying less than 33% of the hepatic parenchyma; grade 2, 34%?66% of the hepatic parenchyma; grade 3, more than 66% of the hepatic parenchyma; for inflammatory cell infiltration (graded on the basis of the presence of inflammatory cells): grade 0: none; grade 1, 1?2 foci/field; grade 2, 3?4 foci/field; grade 3, more than 4 foci/field. The staging of hepatic fibrosis was investigated as follows: 0, none; 1, mild, zone 3, perisinusoidal; 2, moderate, zone 3, perisinusoidal; 3, portal/periportal; 4, bridging fibrosis. 2.7. Protein extraction and fractionation To reduce sample complexity, proteins from liver and skeletal muscle were fractioned according to hydrophobicity into proteins soluble at low ionic strength (LIS fraction), mostly water-soluble proteins, and proteins soluble at high ionic strength (HIS fraction), mostly containing hydrophobic proteins associated with the various membranes in the cell. This sample fractionation improves sensitivity of water-soluble low abundance proteins. Between 200 and 400 mg of either liver or muscle was homogenized with an Ultra-Turrax high-performance disperser, in 25 vol of 20 mM sodium phosphate, pH 6.0, 0.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA and 10-?l/ml buffer of ProteoBlock protease inhibitor cocktail (100 mM AEBSF HCl, 80 ?M aprotinin, 5 mM bestatin, 1.5 mM E64, 2 mM leupeptin and 1 mM pepstatin A). Homogenized samples were centrifuged at 100,000g for 1 h at 4?C, and LIS fraction was recovered in the supernatants. HIS fraction was isolated by homogenization of the remaining pellets in 10 vol of 10 mM Tris?HCl, pH 7.2, 0.6 M NaCl, 1 mM EDTA and 10-?l/ml buffer of ProteoBlock protease inhibitor cocktail. After centrifugation at 16,000g for 15 min at 4?C, HIS fractions were contained in the supernatants. Protein concentration in each fraction was measured by the BCA assay [36]. 2.8. FTSC labeling of protein carbonyls Protein oxidation levels in plasma, liver and skeletal muscle were measured by a fluorescence-based assay as previously described [12,37,38]. Briefly, LIS or HIS protein fractions from liver, muscle and plasma samples were independently incubated with 1 mM FTSC in the dark (37?C, 2.5 h). FTSC specifically labels protein carbonyls. Afterward, proteins were precipitated with an equal volume of 20% chilled TCA (w/v) and centrifuged at 16,000g (20?C, 10 min). The pellets were washed five times with 100% ethanol/ethyl acetate (1:1) to remove the FTSC excess and finally redissolved in urea buffer (7 M urea, 2 M thiourea, 2% CHAPS, 0.5% Pharmalyte 3?10, 0.5% IPG 3?10 buffer and 0.4% DTT). FTSC-labeled proteins were stored at ?80?C until use. Protein concentration was determined by Bradford assay [39]. 2.9. Gel-electrophoresis-based evaluation of global and specific protein carbonylation levels 2.9.1. Gel electrophoresis and image analysis To evaluate the effect of HFHS diets on protein carbonylation level, we used a proteomics approach based on gel electrophoresis [40]. In order to analyze global protein carbonylation, 30 ?g of each FTSC-labeled sample were subjected to 1-D (monodimensional) SDS?polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and run in a Mini-PROTEAN 3 cell (Bio-Rad, Hercules, CA). The analysis of carbonyl levels in specific proteins was performed by resolving FTSC-labeled proteins in two-dimensional (2-D) electrophoresis gel [12,38]. Briefly, 400 ?g of protein was separated in 11-cm, pH 3?10, IPG strips (Immobiline DryStrip gels, GE Healthcare Science, Uppsala, Sweden) by using an Ettan IPGphor II isolectric focusing system (GE Healthcare Science) set at 20?C. After focusing, the strips were kept frozen at ?80?C until use. The second dimension was performed in laboratory-made 10% SDS?polyacrylamide gels by using an Ettan Daltsix electrophoresis system (GE Healthcare Science) at 15?C. Two 11-cm IPG strips corresponding to both diets were run in the same 2-D electrophoresis gel (24 cm wide), and five gels were running in each assay. FTSC-tagged proteins were visualized by exposing 1-D or 2-D gels to a UV transilluminator Molecular Imager Gel Doc XR System (Bio-Rad, Hercules, CA) equipped with a 520-nm band-pass filter (520DF30 62 mm). Then, gels were stained overnight with Coomassie dye PhastGel Blue R-350 (GE Healthcare Science) to visualize total protein level. Image analysis of 1-D gels was performed with the 1-D gel analysis software LabImage 1D (Kapelan Bio-Imaging Solutions, Halle, Germany) on the basis of the overall optical volume per lane. Meanwhile, protein spots were detected and matched among 2-D gels by using the PDQuest software version 7.1 (Bio-Rad, Hercules). The intensity of the spots was expressed as parts per million of the total integrated optical density of the gel, which was approximately constant among gels. 2.9.2. Calculation of carbonylation indexes To analyze the influence of diet on protein carbonylation level, we calculated a concentration-normalized ?protein carbonylation index? as previously described [12,38] and compared that value between diets. This normalized parameter of carbonylation divides the fluorescence intensity of lane/band/spot in the FTSC-stained gel by the protein concentration represented by the intensity of Coomassie. Therefore, carbonylation index allows normalizing the protein carbonylation level (measured by FTSC intensity in gel) with protein abundance (measured by Coomassie intensity in gel) and offsetting possible differences in protein loading and protein concentration. 2.10. Identification of proteins by HPLC coupled with electrospray ionization ion trap MS/MS (LC-ESI-IT-MS/MS) Spots corresponding to proteins of interest were excised from gels and digested in situ with sequencing-grade bovine trypsin according to a protocol previously described [41]. Protein identity was ascertained by an LC system model SpectraSystem P4000 (Thermo Scientific, San Jose, CA) coupled to an IT MS model LCQ Deca XP Plus or LTQ Velos Pro with ESI interface (Thermo Scientific). Tryptic peptides were separated on a BioBasic-18 RP column, 0.18 mm?150 mm, 5 ?m (Thermo Scientific) using 0.5% aqueous acetic acid and in 80% acetonitrile as mobile phases A and B, respectively. A 90-min linear gradient from 5% to 60% B, at a flow rate of 1.5?1.7 ?l/min, was used. Peptides were detected using survey scans from 350 to 1600 Da (2 ?scans), followed by MS/MS scans (2 ?scans) of the six most intense peaks using an isolation width of 1 Da and a normalized collision energy of 35%. Fragmented masses were set in dynamic exclusion for 30 s after the second fragmentation event, and singly charged ions were excluded from MS/MS analysis. Protein identification was performed by homology of experimental MS/MS peak lists with theoretical MS/MS spectra contained in the Rattus norvegicus UniProtKB/Swiss-Prot database (28,855 sequences) released in October 2013 by using the Sequest HT search engine (Proteome Discoverer 1.4; Thermo Scientific, San Jose, CA). The following search criteria were applied: tryptic cleavage, up to twomissed cleavage sites, and tolerances ?1.5 Da for precursor ions and ?0.8 Da for MS/MS fragment ions. Methionine oxidation and carbamidomethylation of cysteine were set as variable modifications. Also, up to 18 different carbonyl modifications of amino acids were searched as variable modifications. These carbonyl modifications resulted from the direct oxidation of side chains of amino acid residues (oxidation of histidine to 2-oxohistidine, oxidation of cysteine or serine to 3-oxoalanine, oxidation of threonine to 2-amino-3-ketobutiric, oxidation of proline to glutamic semialdehyde or 5-oxoproline, oxidation of arginine to glutamic semialdehyde and oxidation of tryptophan to 3-hydroxykynurenine, kynurenine, N-fomylkynurenine, hydroxy-N-fomylkynurenine) or the adduction with carbonyls derived from lipid peroxidation and glycoxidation by Michael and/or Schiff base addition (MDA, acrolein, crotonaldehyde, 4-oxo-2-nonenal, 2-hexenal, glyoxal, 4-hydroxy-2-nonenal, 4-hydroxy-2-hexenal, acetaldehyde). Since Sequest HT has the limitation of allowing just six modifications per search, several consecutive searches for each samplewere required to explore oxidative sites of carbonyl modifications (Table 3 and Supplementary Tables S1 and S2). MS/MS spectra were manually inspected to identify an oxidation site and confirm the amino acid. The false discovery rate (FDR) was kept below 1%. 2.11. Statistical analysis Single biological replicates for each dietary treatment, control (n=5) and HFHS (n=5), were subjected to three independent experiments of FTSC carbonyl labeling and gel electrophoresis. Therefore, 1-D and 2-D gels were performed at least three times for each type of protein fraction (LIS and HIS proteins) and biological sample (plasma, liver and skeletal muscle). Individual and global oxidation protein levels were reported as mean and standard deviation (S.D.). Statistical analysis was performed using the Student t test with Statistica 6.0 program (Statsoft, Inc., Tulsa, OK). The level of significant difference was set at Pb.05. 3. Results 3.1. Metabolic changes induced by HFHS diet No rat died in any group during the whole experimental period. The energy intake of HFHS rats was higher than controls throughout the experiment, rising to be approximately 24% higher since the ninth week, despite their lower food intake compared to controls (Table 1). This fact is explained by the much higher energy density of HFHS diet (4.7 kcal/g) in comparison to the control diet (2.9 kcal/g). The HFHS group significantly increased body, abdominal and liver fat weights. Thus, at the end of experimental period, HFHS rats weighed almost 28% more than control rats and showed about 52% more abdominal fat. Accordingly, rats fed HFHS exhibited an adiposity index significantly higher (34%) than control rats. Livers of HFHS rats accumulated also 3.8-fold more lipids than rats fed a control diet. Although not statistically significant, the hepatosomatic index of HFHS rats also tended to increase (Table 1). Additionally, HFHS diet elicited a significant effect on plasma insulin levels. Insulin concen- trations were higher in rats fed HFHS diet than in control rats, and differences were significant from the fifth week on. Other parameters such as plasma glucose, HbA1c percentage, total cholesterol, LDL and 3L. M?ndez et al. / Journal of Nutritional Biochemistry xx (2014) xxx?xxx 320 HDL cholesterol, and triglycerides did not change significantly between diets. Histological features of the liver revealed hepatic steatosis and lobular inflammation in the group of HFHS animals (Fig. 1B, C and D). In contrast, rats fed control diet did not showa significant fat accumulation and inflammation in liver (Fig. 1A). No liver showed fibrosis. In regards to the parameters associated to oxidative stress, Table 2 shows the level of lipid peroxidation, antioxidant enzyme activity and antioxidant capacity in plasma and liver. HFHS livers showed higher lipid peroxidation in terms of lipid hydroperoxides and conjugated dienes. However, plasma and liver MDA values did not change between diets. The activity of the antioxidant enzymes SOD, CAT, GR and GPx, and the redox balance in terms of GSSG/GSH ratio were not different between dietary groups in both plasma and liver tissue. ORAC values also indicated no differences in the plasma and liver antioxidant capacity of rats fed control or HFHS diet. 3.2. Evaluation of protein oxidation in plasma As evidenced in Fig. 2, long-term HFHS consumption triggered a significant increase of global protein carbonylation level in plasma. Fig. 2A shows total plasma proteins resolved on 1-D SDS-PAGE and stained with Coomassie blue. Fig. 2B shows plasma FTSC-labeled proteins resolved on 1-D gels. Graphical representation of global carbonylation indexes in plasma is included in Fig. 2C. Statistical analysis on individual protein bands revealed that the most abundant plasma protein was also the major protein target of oxidative damage according to its highest carbonylation level (Fig. 2D). This protein was successfully identified as serum albumin by MS/MS (P02770, Sequest HT score: 696.5) and constitutes approximately 55% of total plasma proteins [42]. In the HFHS group, albumin underwent an increase higher than 50% in carbonylation as compared to the control group, and that increment represented about 50% of the increase of total protein carbonylation in plasma from HFHS rats. 3.3. Evaluation of protein oxidation in skeletal muscle Global protein carbonylation indexes were calculated for LIS and HIS fractions of skeletal muscle and respectively compared between diets (data not shown). These indexes were not significantly different between dietary groups, and therefore, there was not a significant effect of the high-caloric diet. However, some aspects of the carbonylated protein profiles should be highlighted (Supplementary Figs. S1 and S2). In the LIS muscular fraction, Coomassie-stained gels showed that proteins weremainly concentrated between ~45 and ~35 kDa (Supplementary Fig. S1A). However, the most carbonylated proteins were located at lower mass ranges (~40 and ~20 kDa) (Supplementary Fig. S1B). Thereby, we found high-concentrated, low-oxidized protein bands (as band 5) and low-concentrated, high-oxidized protein bands as band 9, and particularly band 10, for which carbonylation index was one order of magnitude higher to the rest of proteins (Supplementary Fig. S1C). Protein oxidation occurring in the HIS fraction appeared to be homogeneously distributed throughout mass and abundance protein ranges (Supplementary Fig. S2A and B), and their carbonylation indexes were in the same order of magnitude (Supplementary Fig. S2C). 3.4. Evaluation of protein oxidation in liver The analysis of 1-D gels of liver LIS and HIS proteins showed significant differences in the global protein carbonylation levels of control and HFHS groups (Figs. 3 and 4). Interestingly, LIS and HIS proteins were significantly more carbonylated in the HFHS rats than control animals (Pb.05 and Pb.001, respectively). Similarly to plasma, liver proteins exhibited different susceptibility to the oxidative damage induced by HFHS diet, and such specific vulnerability was found in LIS and HIS fractions (Fig. 3, bands 1?6 and Fig. 4, bands 1?2). Thus, someparticular proteins seemed tobe targets of the carbonylation triggered by HFHS diet consumption. To deepen the characterization of carbonylated proteins targeted by HFHS diets, 2-D gels were performed to isolate and identify individual proteins. Fig. 5A and B shows, respectively, LIS and HIS fractions resolved on 2-D gels. Only proteins displaying a significant change in their protein carbonylation level were marked in gels. Sevenprotein spots fromthe LIS fractiondisplayed a significant change in carbonylation (Fig. 5A andTable 3). Six of themshowedan increment of carbonylation in samples corresponding to HFHS diet (spots numbered as 1,2, 3, 4, 5 and6).Onlyoneproteinspotpresenteda reducedcarbonylation level in the HFHS group (spot 7). MS/MS analysis revealed the following identifications: spot 1 was assigned to mitochondrial enzyme carbamoyl- phosphate synthase (ammonia) (CPSase1); spot 2 was identified as albumin; spot 3 was, in fact, a mixture of two different proteins; one was bifunctional adenosine triphosphate (ATP)-dependent dihydroxyacetone kinase/flavin adenine dinucleotide (FAD)-adenosine monophosphate (AMP) lyase (cyclizing), and other was CAT. Spot 4 was another mitochondrial enzyme, aldehyde dehydrogenase (ALDH2). Argininosuc- cinate synthetase (ASS) was comprised in spot 5. Spot 6 contained regucalcin, and finally, spot 7 was the mitochondrial aspartate transam- inase (AST2).The analysis of 2-D HIS protein gels (Fig. 5B and Table 3) revealed four protein spots (numbered as 8, 9, 10 and 11) with increased carbonylation in rats fed a HFHS diet. Protein spot 8 was identified as the subunit beta of mitochondrial ATP synthase. Spot 9 was actin cytoplasmic 1. Twodifferentproteinsweremingled in spot 10:mitochondrial aldehyde dehydrogenase and 4-trimethylaminobutyraldehyde dehydrogenase. Fi- nally, spot 11was also amitochondrial protein, glutamate dehydrogenase 1 (GDH1). Protein identifications and their cellular compartments are summarized in Table 3 and detailed in supplementary Tables S1 and S2. Two proteins were found in spot 3 and in spot 10. The efforts made using high-resolution isoelectric focusing strips (18cm) in order to resolve the two proteins were unsuccessful. Hence, it was impossible to know if the change in protein carbonylation was due to a single protein or both. Further investigation was performed to identify oxidative sites and specific carbonylmodifications. Among the 13 proteins listed in Table 3, corresponding to the 11 spots of interest, all proteins except four of them (bifunctional ATP-dependent dihydroxyacetone kinase/FAD-AMP lyase, CAT, 4-trimethylaminobutyraldehyde dehydrogenase and ASS) demonstrated to have at least one oxidation site. Carbonylation sites found on each protein are shown in Table 3. It should be noted that all proteins exhibited proline residues oxidized (to glutamic semialdehyde and/or 5-oxoproline), with the exception of proteins found in spot 10. Moreover, ALDH2 (spots 4 and 10) and GDH1 (spot 11) showed carbonylation sites on tryptophan residues resulting from the oxidation of their side chain. Serine residues held carbonyl moieties arising from oxidation of the side chain as shown for serum albumin and ALDH2. Oxidation of arginine to glutamic semialdehyde was detected on two proteins: CPS1 and albumin. Finally, some oxidativemodificationswere detected on single carbonylated proteins: CPS1 showed carbonylation sites on threonine (from oxidation of its side chain), asparagine and cysteine residues (which were respectively bound to acetaldehyde and 2-hexenal); lysine residues bound to acrolein were found in AST2; and histidine residueswere oxidized to 2-oxohistidine, forminga Schiff base adduct with acetaldehyde on cytoplasmic actin 1. 4. Discussion The results presented here show that long-term consumption of a HFHS diet causes a characteristic carbonylation pattern in plasma and liver. Meanwhile, proteins from skeletal muscle are similarly carbonylated in animals fed HFHS and control diets. This character- istic map is in agreement with a previous study describing an 4 L. M?ndez et al. / Journal of Nutritional Biochemistry xx (2014) xxx?xxx 321 increment of liver protein oxidation in HFHS diet-fed rats, while protein oxidation in skeletal muscle was not modified [17]. The distinctive protein oxidation found in the HFHS group occurred in parallel with a significant increase in abdominal and liver fat, body weight and insulin levels in plasma. Abdominal fat and insulin resistance are strongly related in humans [43], and insulin resistance plays also an important role in liver fat accumulation and inflammation [44]. Our results also indicate a higher lipid peroxidation in terms of hydroperoxides and conjugated dienes in livers from HFHS rats. This is in agreement to their elevated hepatic steatosis and inflammation, and previous correlations of an increased lipid peroxidation in animal models of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) [45]. Thus, the increment of liver conjugated dienes and hydroperoxides found in the study can be related to hepatic steatosis and inflammation. The higher protein carbonylation and the increased production of primary and intermediary oxidation products did not correlate with theMDA values found in liver. Previous investigations had indicated that TBA reaction is not specific for the MDA generated by lipid peroxidation and that MDA analysis may have interferences in complex biological samples such as liver tissue [46,47]. In regard to antioxidant activities in liver, they did not show any significant differences between rats. This could be a consequence of Fig. 1. Liver histology after hematoxylin/eosin staining of liver sections from a representative rat fed a (A) control diet (200?) and (B) HFHS diet (200?). Lobular inflammation cell infiltrations aremarkedwith a black arrow, and steatosis is marked, in part, withwhite arrows. (C and D) The grade of steatosis and lobular inflammation, respectively, found in control and HFHS rats, both expressed as percentages. Table 2 Blood and liver oxidative stress parameters Plasma Liver Control (n=5) HFHS (n=5) Control (n=5) HFHS (n=5) Conjugated dienes (nmol/mg protein) 10.2 (0.9) 87.8 (30.3) ?? Lipid hydroperoxides (mEq O2/kg protein) 2.3 (0.3) 4.2 (0.6) ?? MDA (nmol/mg protein) 0.2 (0.05) 0.2 (0.05) 0.5 (0.1) 0.6 (0.1) SOD (U/g Hb or g tissue) 2112.2 (644.9) 2576.0 (1417.9) 13.6 (6.8) 14.5 (5.0) CAT (mmol/(min?g Hb or g T)) 116.2 (9.2) 119.3 (7.7) 10.3 (3.6) 11.1 (3.4) GR (U/g Hb or g T) 0.4 (0.2) 0.2 (0.1) 8.8 (1.1) 7.4 (3.2) GPx (U/g Hb or g T) 107.4 (9.9) 112.2 (10.6) 35.8 (4.1) 43.9 (17.5) ORAC (mmol TE/L P or kg T) 10.3 (0.6) 8.6 (2.0) 18.6 (1.0) 15.4 (3.1) GSSG/GSH 2.6 (0.3) 2.5 (0.7) Results are means (standard deviation); n, number of rats. Abbreviations: P, plasma; T, tissue; TE, Trolox equivalents. ?? Pb.01 vs. control group. 5L. M?ndez et al. / Journal of Nutritional Biochemistry xx (2014) xxx?xxx 322 Fig. 2. Effect of HFHS diet on carbonylation level of plasma proteins from male Sprague?Dawley rats. (A) 1-D Coomassie-stained gel of fresh plasma proteins from control and HFHS dietary groups. Lanes 1, 2, 3, 4 and 5: control diet. Lanes 6, 7, 8, 9 and 10: HFHS diet. (B) 1-D FTSC-stained gel of fresh plasma proteins from control and HFHS dietary groups. Lanes 1, 2, 3, 4 and 5: control diet. Lanes 6, 7, 8, 9 and 10: HFHS diet. (C) Global plasma protein carbonylation index for control and HFHS dietary groups. Data are presented as mean?S.D. (D) Plasma albumin carbonylation index for control and HFHS dietary groups. Data are presented as mean?S.D. *Pb.05, **Pb.01. Fig. 3. Effect of HFHS diet on carbonylation level of LIS liver proteins from male Sprague?Dawley rats. (A) 1-D Coomassie-stained gel of LIS proteins from control and HFHS dietary groups. Lanes 1, 2, 3, 4 and 5: control diet. Lanes 6, 7, 8, 9 and 10: HFHS diet. (B) 1-D FTSC-stained gel of LIS proteins from control and HFHS dietary groups. Lanes 1, 2, 3, 4 and 5: control diet. Lanes 6, 7, 8, 9 and 10: HFHS diet. (C) Global LIS protein carbonylation index for control and HFHS dietary groups. Marked bands (b1 to b6) showed differential protein carbonylation index. Data are presented as mean?S.D. *Pb.05. 6 L. M?ndez et al. / Journal of Nutritional Biochemistry xx (2014) xxx?xxx 323 metabolic adaptations of the liver to a prolonged high-caloric consump- tion as previously suggested [48]. Insulin resistance and protein carbonylation seem to be closely related through activation of c-jun NH(2)-terminal kinases by an increased protein carbonylation level [5,19]. On the contrary, plasma glucose values did not change between diets. This normoglycemia was coherent with the absence of change in the glycated hemoglobin percentage observed [49]. These results highlight the higher insulin level required in the HFHS group to maintain normal glucose levels compared to rats fed control diet; this is in turn the earliest sign of the onset of type 2 diabetes in HFHS rats [50]. Our results also showed that HFHS diet did not elevate plasma triglycerides and cholesterol levels. Similar plasma lipid profiles with different combinations of high caloric diets have been previously found [17,51,52], and several studies have even reported decreased plasma triglycerides and cholesterol levels [53?56]. Since it is well recognized that high refined sugar dietary content (up 60% of calories) can elevate plasma triglycerides levels [2,57], the level of sucrose in our diet was possibly too low (27.2% of calories) to produce a hypertriglyceridemic state. Moreover, an increase in triglyceride clearance by the adipose tissue and liver, evidenced in this work through the increase of weight and the liver steatosis and inflamma- tion, may also contribute to maintain, or even to decrease, plasma triglycerides levels [51]. The high level of fat in our diet could tend to inhibit fatty acid synthesis [55]. This fact together with the low level of cholesterol in the HFHS diet (0.05%, from milk fat), which was possibly not enough to elevate cholesterol levels in plasma, may explain that HFHS feeding did not change cholesterol levels that even seemed to tend to lower concentrations. Previous studies have reported inconsistent data for the induction of hypercholesterolemia in rats by a pure high-fat diet without cholesterol added [58]. Successful dietary interventions aimed to achieve hypercholesterol- emia currently incorporate high-caloric diets with more than 0.2% cholesterol [17,51,56]. Themap of the characteristic carbonylation pattern of proteins can provide a new insight into the pathogenesis of metabolic diseases derived from the high consumption of fat and refined carbohydrate. We found that plasma albumin is a target of oxidative stress triggered by the intake of an HFHS diet rich in milk fat. Milk fat is composed mainly of triglycerides in which the main fatty acids are palmitate, stearate, oleate, linoleate and linolenate [59]. In a previous work, we demonstrated that omega-3 fatty acids of marine origin (eicosapen- taenoic acid and docosahexaenoic acid), especially when given at 1:1 ratio, reduced plasma albumin oxidation ? in comparison with other fatty acids, mainly ?-linolenic acid from linseed oil and linoleic acid from soybean oil ? in healthy rats [12]. It appears that the quantity and/or quality of dietary fat influences plasma albumin oxidation. Perhaps, the role of albumin as fatty acid transporter in plasma might explain this interdependence. The increased carbonylation of albu- min, an important antioxidant in plasma [60], suggests that HFHS diet triggers oxidative stress and particularly oxidative damage on proteins. In accordance with this, Pandey et al. [61] noted that type-2 diabetic patients showed higher plasma carbonyl levels and more advanced oxidation protein products than healthy people, and these protein modifications were postulated to be among the molecular mechanisms leading to diabetic complications. Liver profiles revealed that mitochondrial proteins are the main targets of the differential diet-induced carbonylation, highlighting the importance of subcellular localizations of the proteins. Four central proteins associated to nitrogen metabolism suffered significant Fig. 4. Effect of HFHS diet on carbonylation level of HIS liver proteins from male Sprague?Dawley rats. (A) 1-D Coomassie-stained gel of HIS proteins from control and HFHS dietary groups. Lanes 1, 2, 3, 4 and 5: control diet. Lanes 6, 7, 8, 9 and 10: HFHS diet. (B) 1-D FTSC-stained gel of HIS proteins from control and HFHS dietary groups. Lanes 1, 2, 3, 4 and 5: control diet. Lanes 6, 7, 8, 9 and 10: HFHS diet. (C) Global HIS protein carbonylation index for control and HFHS dietary groups. Marked bands (b1 and b2) showed differencial protein carbonylation index. Data are presented as mean?S.D. *Pb.05. 7L. M?ndez et al. / Journal of Nutritional Biochemistry xx (2014) xxx?xxx 324 oxidative transformations. CPSase1 and ASS (key enzymes from urea cycle) together with GDH1 were more carbonylated in the HFHS group. Only mitochondrial AST2 appeared less oxidized by HFHS diet. Such alterations can influence amino acid and protein metabolism. Consistent with this, Barber et al. [62] reported that the consumption of high-caloric diets, specifically, ?cafeteria? diet, causes a decline in the activity of the enzymes of urea cycle. Interestingly, enzymatic activities of CPSase1 and ASS showed the most dramatic reduction. The level of CPSase1 also significantly decreased in a genetic ratmodel of obesity and type 2 diabetes [63]. A metabolomic study revealed that HFHS diet reduces plasma levels of nitrogen compounds, including urea [64]. Moreover, cafeteria-fed rats also showed high circulating amino acids levels [65]. Accordingly, mitochondrial GDH1 plays a central role in the catabolism of amino acids, particularly in the branched-chain amino acid (valine, leucine and isoleucine) catabolism [66]. The carbonylation observed for GDH1 in HFHS rats could contribute to explain the higher levels of amino acids in plasma as well as the reduced urea production caused by this kind of diets. Unlike the rest of the identified proteins, the HFHS diet reduced the carbonylation level of the mitochondrial AST2, a multifunctional enzyme that plays a role in amino acid metabolism, and in urea and tricarboxylic acid cycles. Interestingly, AST2 was less oxidized in soybean-oil-fed rats compared to fish-oil-fed rats, just the opposite behavior to the other liver proteins which were more oxidized by soybean supplementation [12]. More investigation is needed to explain the impact of diet on AST2 carbonylation and the biological relevance of its differential behavior in terms of carbonylation. Feillet-Coudray et al. [17] found lowered activities of the complex II and complexes II+III of the liver mitochondrial respiratory chain in HFHS-fed rats. Besides, our results suggest that ATP synthase (complex V) may lose activity due to its higher carbonylation in HFHS-fed rats. This fact could reduce oxidative phosphorylation and lower ATP cellular concentrations to finally result in mitochondrial disruption [67]. Supporting this hypothesis, Guo et al. [68] reported that the in vitro carbonylation of beta subunit of ATP synthase drastically decreases the enzyme activity. Moreover, lower ATP production due to reduction of oxidative phosphorylation could Fig. 5. Representative 2-D gels for control and HFHS groups showing total and carbonylated protein profiles of LIS and HIS liver fractions. Coomassie-stained 2-D gels that represent the abundance of LIS liver proteins in control and HFHS diets are shown respectively in panels (A) and (C). The level of carbonylation of LIS liver proteins in control and HFHS diets by visualizing images of the FTSC-stained 2-D gels is shown respectively in panels (B) and (D). The corresponding Coomassie-stained 2-D gels of HIS liver proteins from control and HFHS rats are shown respectively in panels (E) and (G). FTSC-stained 2-D gels of HIS liver proteins from control and HFHS rats are shown respectively in panels (F) and (H). *Proteins with higher carbonylation index (FTSC intensity normalized by the Coomassie intensity) in HFHS rats at Pb.05. ?Proteins with lower carbonylation index in HFHS rats at Pb.05. Numbered protein spots represent carbonylated proteins confidently identified, and they are listed in Table 3. 8 L. M?ndez et al. / Journal of Nutritional Biochemistry xx (2014) xxx?xxx 325 increase the accumulation of oxidized proteins by inhibiting the mitochondrial ATP-dependent proteases, specifically of the ATP-de- pendent Lon protease that is implicated in the removal of these oxidized proteins. [7,69]. Taking into consideration that the reduced mitochondrial enzyme activity precedes the development of NAFLD and insulin resistance [70], the higher level of mitochondrial enzyme carbonylation observed was consistent with the hyperinsulinemia and fatty liver developed by HFHS-fed rats. Presumably, the higher carbonylation level of mitochondrial ALDH2 and regucalcin in HFHS-fed rats may accelerate the oxidative deterioration of hepatic cells because both enzymes are linked to the cellular antioxidant defense. ALDH2 is involved in the antioxidant defense against toxic lipid peroxidation carbonyls such as 4-hydroxy-2- nonenal [71], and enzymes belonging to the ALDH family are carbonylation targets in adipose tissue of obese and insulin-resistant mice [6]. Regucalcinhas anactivating effect onSOD[72] anda suppressive effect on nitric oxide synthase activity in liver cytosol [73]. Moreover, regucalcin appears to be a key molecule in lipid metabolic disorders and diabetes [74]. Finally, actin cytoplasmic 1 was significantly carbonylated in the HFHS group. Since actin is essential in the maintenance of cellular structure and functionality, its damage is associated with several diseases [75]. Thereby, HFHS-fed rats could potentially suffer filament disruption and functional losses. The identification of the carbonylated sites on specific proteins strengthened the occurrence of oxidation in these proteins. At present, few carbonylation sites on proteins have been detected in vivo, and the potential impact of a certainoxidizedaminoacid foundonaprotein isnot sufficiently known [76]. In this study, we found oxidized residues of proline, histidine, serine, arginine, asparagine, threonine, lysine and tryptophan in specific proteins. More research is needed to understand the individual significance of these carbonylated residues. Oxidative modifications can alter biological protein activity by increasing their propensity to cross-link and precipitation, causing difficulties in their degradation and enhancing their cellular toxicity. The identification of the carbonylated sites on proteins can be a good starting point to explain how specific carbonylated proteins affect biological systems and tomake the use of oxidized proteins as diseasemarkers in the futuremore likely. Table 3 Identification of LIS and HIS liver proteins with different carbonylation levels between dietary groups Spot no. LIS/HIS fraction Identification Accession Cellular component Significant peptides (FDRb1%) Sequence coverage (%) Protein carbonylation index a Oxidative modificationsb Control (n=5) HFHS (n=5) 1 LIS Carbamoyl-phosphate synthase (ammonia), mitochondrial P07756 Mitochondrion 44 46.53 0.55 (0.21) 1.14 (0.44) ? 1N649, 1N652 4C648 5T295, 5T300 6P99, 6P464, 6P501, 6P601 7R1039 2 LIS Serum albumin P02770 Cytoplasm 13 30.92 0.89 (0.42) 1.85 (0.82) ? 6P510 7R509 8S513 3 LIS Bifunctional ATP-dependent dihydroxyacetone kinase/FAD-AMP lyase (cyclizing) Catalase Q4KLZ6 Cytoplasm 5 9.86 1.38 (0.86) 3.33 (1.27) ? P04762 Peroxisome 2 5.69 4 LIS Aldehyde dehydrogenase, mitochondrial P11884 Mitochondrion 16 41.04 2.55 (1.11) 9.43 (6.51) ? 6P94 8S93 10W95 11P94 5 LIS Argininosuccinate synthetase P09034 Cytoplasm Outer mitochondrial membrane 5 13.59 0.41 (0.13) 0.74 (0.27) ? 6 LIS Regucalcin Q03336 Cytoplasm 5 24.75 0.31 (0.26) 1.15 (0.74) ? 6P124 7 LIS Aspartate transaminase, mitochondrial P00507 Mitochondrion 10 32.33 1.57 (0.52) 0.64 (0.22) ? 2K107 6P98 11P98 8 HIS ATP synthase beta subunit G3V6D3 Mitochondrion 23 69.19 0.83 (0.16) 1.48 (0.42) ? 11P131, 11P333, 11P396, 11P400, 11P503, 11P512 9 HIS Actin, cytoplasmic 1 P60711 Cytoplasm 8 42.93 0.84 (0.17) 1.37 (0.26) ? 1H275 3H73 11P70 10 HIS Aldehyde dehydrogenase, mitochondrial P11884 Mitochondrion 15 49.71 0.50 (0.22) 1.14 (0.31) ? 9W471 4-trimethylaminobutyraldehyde dehydrogenase Q9JLJ3 Cytoplasm 3 7.89 11 HIS Glutamate dehydrogenase 1, mitochondrial P10860 Mitochondrion 16 42.11 0.45 (0.08) 0.62 (0.08) ? 6P224, 6P340 9W338 10W338 Spots of interest were identified by LC-ESI-IT-MS/MS as described in the Section 2.10. Protein spot no. refers to the numbered spots in 2-D gels shown in Fig. 5. For each protein spot, different parameters are indicated: tissue liver fraction, cellular component, significant peptides (FDRb1%), % sequence coverage, protein carbonylation indexes and oxidative modifications found in each protein. Results are means (standard deviation); n, number of rats a Protein carbonylation index: (FTSC/Coomassie intensities). b 1: Schiff base adduct with acetaldehyde, 2: Michael-type adduct with acrolein, 3: 2-oxohistidine, 4: Michael-type adduct with 2-hexenal, 5: 2-amino-3-ketobutiric, 6: glutamic semialdehyde (P), 7: glutamic semialdehyde (R), 8: 3-oxoalanine (S), 9: kynurenine, 10: N-formylkynurenine, 11: 5-oxoproline. ? Pb.05 vs. control group. 9L. M?ndez et al. / Journal of Nutritional Biochemistry xx (2014) xxx?xxx 326 To sum up, HFHS diet causes selective oxidative damage in proteins from different tissues. Results of this study indicate a different predisposition of plasma and liver proteins to suffer oxidative damage, being mitochondrial proteins the main targets of ROS attack. Some proteins (notably, albumin, CPSase1, ASS, GDH1, AST2, ALDH2, regucalcin, ATP synthase subunit beta, actin cytoplasmic 1) are the main targets of the ROS overproduced due to HFHS long-term consumption in the rat model. Given the huge importance and complexity ofmetabolicprocessesperformed in the liver, this differential oxidative damage could contribute to explain how HFHS diets induce metabolic alterations leading to obesity, insulin resistance and NAFLD. Additionally, this protein carbonylation profile may be used in nutritional intervention studies as an early marker of diet induced metabolic disorders. Supplementary data to this article can be found online at http://dx. doi.org/10.1016/j.jnutbio.2014.06.014. Acknowledgments This investigation has been supported by the Spanish Ministry of Science and Innovation (grants AGL2009-12374-C03-01, -02 and -03, IPT-2011-0828-90000, AGL2013-49079-C2-1,2-R). The Spanish Min- istry of Science and Innovation is gratefully acknowledged for the doctoral fellowship to L.M. Xunta de Galicia and the European Social Fund are also thankfully recognized for the financial support of the postdoctoral ?Isidro Parga Pondal? contract to M.P. EMT gratefully thanks the Panamanian government for a SENACYT / IFARHU predoctoral fellowship. L.M. also thanks the USC (Spain) for its doctoral program. The authors thank Lorena Barros and Mar?a Jes?s Gonz?lez for their excellent technical assistance and AFAMSA (Vigo, Spain) for the provision of raw material. References [1] Dalle-Donne I, Giustarini D, Colombo R, Rossi R, Milzani A. Protein carbonylation in human diseases. Trends Mol Med 2003;9:169?76. [2] Panchal SK, Brown L. Rodent models for metabolic syndrome research. 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Design and Methods: The rats were fed a high-fat high-sucrose diet (HFHS) supplemented with D-fago- mine (or not; for comparison) or a standard diet for 5 weeks. The levels of total bacteria, Enterobacter- iales and Escherichia coli were determined in fecal samples by performing quantitative real-time polymerase chain reactions on DNA. Results: Whereas the total levels of bacteria were independent of the diet, rats fed HFHS (without D-fag- omine) excreted significantly higher proportions of Enterobacteriales and E. coli than those fed a stand- ard diet. The levels of Enterobacteriales and E. coli of the rats given HFHS with D-fagomine were similar to those of the rats fed a standard diet. Compared to the standard group, rats fed HFHS with D-fagomine gained significantly less weight (15.3%) than those fed HFHS (20.9%). Conclusion: D-Fagomine reduces the amount of Enterobacteriales excreted by rats fed HFHS and this may help to avert becoming obese. Obesity (2014) 00, 00?00. doi:10.1002/oby.20640 Introduction Gut microbiota is increasingly recognized as contributing to the energy balance of its human host since it transforms undigested components of the host?s diet into absorbable nutrients via total or partial fermenta- tion in the bowel (1). Moreover, gut microbiota is in turn modulated by the host?s diet (2). This connection between microbiota and diet has an effect on the host?s phenotype; notably on lipid accumulation. It seems that a relationship exists between becoming overweight and a shift in the composition of gut microbiota, as demonstrated by the rel- ative abundance of the principal fecal bacterial taxa in mice (3) and humans (4). Proteobacteria comprise a quantitatively minor yet impor- tant phylum of microorganisms that includes the order Enterobacter- iales, composed of both non-pathogenic and opportunistic bacteria (5). Escherichia coli, a member of the Enterobacteriales, is a facultative anaerobic microorganism that is predominant in the gastrointestinal tract of homoeothermic animals. Most E. coli strains coexist with a healthy host; but it is an opportunistic microorganism that may cause enteric diseases and extra-intestinal infections (6). In rats, a high-fat high-sucrose diet (HFHS) induces obesity and an increase in the pro- portion of intestinal Enterobacteriales (7). Iminosugars, also referred to as iminocyclitols, are carbohydrate ana- logues in which the endocyclic oxygen has been replaced by nitrogen (8). D-Fagomine (1,2-dideoxynojirimycin) is a six-membered ring imi- nosugar; the spatial configuration of its hydroxyl groups coincides with those of D-glucose and D-mannose. D-Fagomine selectively agglutinates fimbriated enterobacteria (e.g., E. coli) and inhibits their adhesion to the intestinal mucosa (9); the reason for this is probably related to its structural similarity with lectin-binding saccharides (e.g., mannose). As D-fagomine inhibits the adhesion of E. coli in vitro, we hypothesized that it could counteract the overgrowth of Enterobacteriales induced by HFHS. This study therefore addresses the effect of D-fagomine on diet- induced disbiosis and its putative influence on weight gain. 1 Department of Biological Chemistry and Molecular Modelling, Institute for Advanced Chemistry of Catalonia (IQAC-CSIC), Barcelona, Spain. Correspondence: Sara Ramos-Romero (sara.ramos@iqac.csic.es) 2 Bioglane SLNE, Barcelona, Spain 3 Department of Environmental Chemistry, Institute of Environmental Assessment and Water Research (IDAEA-CSIC), Barcelona, Spain Disclosure: P.C. and J.L.T. are shareholders of Bioglane SLNE. Funding agencies: The work was funded by Bioglane SLNE; the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (via the awards: CDTI-NEOTEC 20080474, IPT- 2011-0828-900000, AGL2009-12374-C03-03/ALI, CTQ2009-07359 and CTM2011-30471-C02-01); the Catalan regional government (Generalitat de Catalunya, via the awards: 2009 SGR 281 and 2009 SGR 924, and also a pre-doctoral fellowship to LG); and the Panamanian government (via the SENACYT/IFARHU pre-doctoral fellowship to EMT). Additional Supporting Information may be found in the online version of this article. Received: 10 May 2013; Accepted: 4 October 2013; Published online 10 October 2013. doi:10.1002/oby.20640 www.obesityjournal.org Obesity | VOLUME 00 | NUMBER 00 | MONTH 2014 1 Brief Cutting Edge Reports OBESITY BIOLOGY AND INTEGRATED PHYSIOLOGY Obesity 329 Methods and Procedures Sprague?Dawley rats (male, 22-weeks old) supplied by Janvier (Le Genest-St-Isle, France) were housed under controlled conditions of humidity (60%), temperature (22C6 2C) and a 12 h light?12 h dark cycle with free access to water and feed during the study. The animals (n5 15) were randomly assigned to one of three dietary groups: a con- trol group fed a standard diet (STD); a group fed HFHS; and a group fed HFHS supplemented with 0.065% D-fagomine (HFHS1FG). The D-fagomine was provided by Bioglane (Barcelona, Spain). The experi- mental diets were pelletized in-house by lyophilization from frozen emulsions. The feed composition is detailed in Supporting Information Table T1. Feed consumption was monitored every day throughout the experiment and body weight was measured before and at the end of the nutritional intervention with D-fagomine. The animals were handled and killed in full accordance with European Union guidelines for the care and management of laboratory animals and the pertinent permission was obtained from the Spanish CSIC Subcommittee of Bioethical Issues (ref. AGL2009-12 374-C03-03). Samples of feces were collected before the nutritional intervention and at week 5, and were kept at 280C until analysis. Total DNA was extracted from the samples using QIAampVR DNA Stool Mini Kit from QIAGEN (Hilden, Germany) and quantified using a Nanodrop 8000 Spectrophotometer (ThermoScientific, Waltham, MA). Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) amplification experiments were performed using a LightCyclerVR 480 II (Roche, Basel, Switzerland), which moni- tors the fluorescence intensity of a DNA-binding dye in each tempera- ture cycle of the DNA amplification. The primer sequences used were: 50-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT-30 and 30-ATTACCGCGGCTG CTGGC-50 for total bacteria (10); 50-ATGGCTGTCGTCAGCTCGT- 30 and 30-CCTACTTCTTTTGCAACCCACT-50 for Enterobacteriales (10); and 50-GTTAATACCTTTGCTCATTGA-30 and 30-ACCAGGG TATCTAATCCTGTT-50 for the E. coli subgroup (11). Amplicon sizes were corroborated using a 2100 Bioanalyzer (Agilent Technolo- gies, Santa Clara, CA). Each qRT-PCR well contained 2 X SYBR Pre- mix Ex Taq (Takara Bio, Shiga, Japan) (10 mL), which include the DNA polymerase and SYBRR Green I as the DNA-binding dye, pri- mers (Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium) (1 mL of each 10 mM primer) and the sample or template DNA (2 mL). Standard quantification curves were plotted using DNA extracted from E. coli strain M15[pREP4] (QIAGEN, Hilden, Germany). Cycling conditions were: 10 s at 95C and 45 cycles of 5 s at 95C, 30 s at the primer- specific annealing temperature (65C for total bacteria and 61C for Enterobacteriales and E. coli), and 30 s at 72C (extension). To deter- mine the specificity of the qRT-PCR reactions, melting curve analysis was carried out by treatment for 2 s at 95C, for 15 s at 65C, and a continuous increase of temperature up to 95C (0.11C s21), with five fluorescence recordings per C. The relative RNA abundances for the different genes were calculated from the second derivative maximum of their respective amplification curves (Cp, calculated in triplicate) by considering Cp values to be proportional to the dual logarithm of the inverse of the specific RNA concentration, following the equation: [RNAa]/[RNAb]5 2Cpb-Cpa (12). Total bacteria were normalized as 16S rRNA gene copies per mg of wet feces (copies/mg). Energy content in the feces was determined by differential scanning calorimetry by means of a DSC-30 calorimeter (Mettler-Toledo, Columbus, OH). Blood glucose levels were measured by the enzyme electrode method using an Ascensia ELITE XL blood glucose meter (Bayer Consumer Care AG, Basel, Switzerland). Plasma insulin was meas- ured using a Rat/Mouse Insulin ELISA kit (Millipore Corporation, Billerica, MA). Data manipulation and statistical analysis was performed using GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, CA) and the DCp values (Cp total bacteria ? Cp Enterobacteriales or E. coli). Sta- tistical significance was determined by nonparametric tests (Krus- kal?Wallis and Mann?Whitney U). Differences were considered sig- nificant when P< 0.05. Results All the qRT-PCR experiments were specific for the corresponding target group of bacteria. All the standard curves showed a lineal regression index >0.999 and the primers showed amplification effi- ciencies of more than 95% (12). The total amounts of bacteria, expressed as Cp normalized to feces weight (g), were similar for all groups during the study: 0.1706 0.081 (STD), 0.0606 0.014 (HFHS), and 0.0756 0.034 (HFHS1FG) copies/mg at week 0 and 0.0476 0.021 (STD), 0.1596 0.021 and 0.1736 0.055 (HFHS1FG) copies/mg at week 5. The relative abundance of Enterobacteriales and E. coli, calculated as percentages with respect to the total bacte- ria counts, were similar for all the groups at the start of the study (Enterobacteriales: 0.0496 0.021 copies/mg; E. coli: 0.0346 0.018 copies/mg). The proportion of excreted Enterobacteriales and E. coli was significantly higher (P< 0.05) in the HFHS group after 5 weeks, whereas no significant differences were recorded between the STD and the HFHS1 FG groups (Figure 1). Body weight at time 0 was similar between groups (Table 1); after 5 weeks weight gain (Figure 2) was: 8.1%6 1.6% (STD), 20.9%6 1.7% (HFHS, P< 0.001 vs. STD), and 15.3%6 1.0% (HFHS1FG, P< 0.05 vs. STD and HFHS). Fasting blood glucose and insulin levels were higher in the HFHS group than in the STD and HFHS1FG groups (P< 0.05). The animals in both HFHS groups consumed less feed than those in the STD group (P< 0.05) yet energy intake was higher (P< 0.05) in the two HFHS groups. The remaining energy in the feces was also higher in the in the two HFHS groups than in the STD group (P< 0.05, Table 1). No significant differences in energy intake and energy excreted between the nonsupplemented and D-fago- mine supplemented HFHS groups were detected. Discussion This 5-week nutritional intervention study examined the influence of the iminosugar D-fagomine on excreted intestinal bacteria putatively connected with weight gain and increased levels of fasting blood glucose and insulin in rats fed HFHS. Rats fed HFHS were used as a model of a population consuming an excess of energy from food- stuffs such as pastry, chips and sweet beverages. As expected, the amount of fecal bacteria from healthy animals was not affected by diet (11,13): neither the diet nor the supplementation induced any variations in total bacteria which could have been asso- ciated with a pathological state (7). Hence, the model is adequate for nutritional interventions under physiological conditions and D- fagomine does not induce any deleterious changes. We did detect differences in the relative proportions of fecal Entero- bacteriales, particularly E. coli, between the standard and HFHS groups (Figure 1) in agreement with other work which reports an Obesity Fagomine and Excreted Enterobacteria Ramos-Romero et al. 2 Obesity | VOLUME 00 | NUMBER 00 | MONTH 2014 www.obesityjournal.org 330 increase in Enterobacteriales in caecal samples from rats fed HFHS (7,14). These studies also described a high variability in the propor- tion of Enterobacteriales in the gut of animals fed obesogenic diets (7,14). We show here that D-fagomine is capable of altering this effect of HFHS on the proportion of Enterobacteriales and E. coli (Figure 1). The effect of D-fagomine on gut microbiota may be explained by our previous observation that it selectively agglutinates fimbriated enterobacteria such as E. coli (9). Most members of the Enterobacteriales have mannose-specific lectins on their fimbriae, which are involved in adhesion. As D-fagomine may be regarded as a mannose analogue, it may compete with gut mucosa for the mannose-specific lectins on enterobacteria. TABLE 1 Body weight, feed and energy intake, energy in feces, and fasting blood insulin and glucose of rats fed experimental diets for 5 weeks Diets STD HFHS HFHS1FG Mean S.E.M. Mean S.E.M. Mean S.E.M. Body weight, initial (g) 603.8 28.6 633.6 13.7 662.1 11.1 Body weight, final (g) 652.8 35.8 766.4* 23.9 763.4* 14.6 Body weight, gain (%) 8.1 1.6 20.9** 1.7 15.3*$ 1.0 Initial blood glucose (mg dL21) 74.2 3.8 72.0 3.1 74.2 3.0 Final blood glucose (mg dL21) 67.6 2.2 79.8* 3.2 72.6 1.4 Plasma insulin (ng mL21)a 1.4 0.2 5.1* 1.0 1.7$ 0.4 Feed intake (g/day/100g body weight) 4.1 0.1 3.1* 0.0 2.9* 0.1 Energy intake (kJ/day/100g body weight)b 49.0 0.8 60.0* 0.3 57.1* 1.3 Energy in the feces (kJ g21)c 4.5 0.2 6.4* 0.5 5.8* 0.2 HFHS, high-fat high-sucrose diet; HFHS1FG, high-fat high-sucrose diet supplemented with D-fagomine (0.2% with respect to sucrose). an5 9. bEnergy intake is calculated as estimates of metabolizable energy based on the Atwater factors, assigning 16.7 kJ g21 to protein, 37.7 kJ g21 to fat, and 16.7 kJ g21 to available carbohydrate. cMeasured by differential scanning calorimetry. Values are means with the standard errors of the mean. Comparisons were performed using Kruskal?Wallis and Mann?Whitney U tests. * P< 0.05 vs. STD group, ** P< 0.001 vs. STD group, $ P< 0.05 vs. HFHS group. FIGURE 1 Excreted intestinal bacteria measured by qRT-PCR and expressed as percentages of total bacteria in fecal samples from rats fed a standard diet (STD), high-fat high-sucrose diet (HFHS), or high-fat high-sucrose diet with D- fagomine (HFHS1FG) after 5 weeks of nutritional intervention. (A) Enterobacteriales, (B) E. coli. Results are represented in box-plots. Comparisons were performed using Kruskal?Wallis and Mann?Whitney U tests. *P< 0.05 vs. STD group. Brief Cutting Edge Reports Obesity OBESITY BIOLOGY AND INTEGRATED PHYSIOLOGY www.obesityjournal.org Obesity | VOLUME 00 | NUMBER 00 | MONTH 2014 3 331 The effect of D-fagomine on intestinal bacteria might explain, at least in part, the observation that the supplemented HFHS1FG group significantly (P< 0.05) gained less weight and presented lower levels of fasting blood glucose and insulin than the HFHS group (Figure 2 and Table 1). As both groups did not differ in daily feed and energy intake or remaining energy in the faeces (Table 1) reasons other than changes in feeding behavior may be behind the effects of D-fagomine. It has been shown that intestinal microbiota significantly influences the absorption of nutrients from HFHS diets and can promote fat accumulation in the host adipocytes and liver via different mechanisms (15,16). An excess of Gram-negative bac- teria such as E. coli and other Enterobacteriales may induce obesity and insulin resistance through metabolic impairment associated with low-grade inflammation. This effect seems to be triggered by spe- cific components of bacteria, such as lipopolysaccharides (LPS) from their outer membrane (17,18). The fact that supplementation with E. coli has been shown to promote fat deposits in rats (19) sug- gests that the inhibition of E. coli adhesion to the intestinal mucosa by D-fagomine and the reduced weight gain in the supplemented group may be related. This reduction of fat accumulation may also explain the normal levels of fasting blood glucose and insulin in the rats given D-fagomine. Supplementation with D-fagomine appears to be a simple and harmless way to avoid the downstream effects asso- ciated with the potentially harmful changes in gut microbiota induced by diets that are rich in fat and refined carbohydrates. In conclusion, D-fagomine helps to eliminate the excess of Entero- bacteriales induced by a high-fat high-sucrose diet and lowers the consequent weight gain. It seems that these two effects might be related. Therefore, D-fagomine may help to avoid the complications associated with unhealthy eating by averting the potential diet- induced overpopulation of enterobacteria in the gut.O Acknowledgments SR-R designed and carried out the PCR experiments, drafted the manuscript and discussed the results. EM-T, LG and JP-J carried out the in vivo part of the experiment including collection of the in vivo data. MC and BP advised on the PCR technique. PC and JLT designed, supervised, and coordinated the study. All the authors read and approved the final manuscript. Language assistance from Christopher Evans is appreciated. VC 2013 The Obesity Society References 1. Hooper LV, Midtvedt T, Gordon JI. How host-microbial interactions shape the nutrient environment of the mammalian intestine. 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FIGURE 2 Body weight gain of rats fed a standard diet (STD), high-fat high-sucrose diet (HFHS) or high-fat high-sucrose diet with D-fagomine (HFHS1FG) after 5 weeks of nutritional intervention. Results are given as means standard errors of the mean. Comparisons were performed using Kruskal?Wallis and Mann?Whitney U tests. *P<0.05 vs. STD group, **P< 0.001 vs. STD group, $ P< 0.05 vs. HFHS group. Obesity Fagomine and Excreted Enterobacteria Ramos-Romero et al. 4 Obesity | VOLUME 00 | NUMBER 00 | MONTH 2014 www.obesityjournal.org 332 333 7.2. EVALUACI?N DEL EFECTO MATRIZ (EM), RECUPERACI?N (RE) Y EFICIENCIA DEL PROCESO (EP) DE HPLC?ESI?MS/MS PARA LA DETERMINACI?N DE ISOPROSTANOS EN ORINA Se prepararon las siguientes rectas, como se indica en la Secci?n experimental 5.1.3.4.19 ? Recta 1 (R1): mezcla de patrones en agua sin pasar por extracci?n en fase s?lida (condiciones ideales). ? Recta 2 (R2): orina + extracci?n en fase s?lida y luego fortificaci?n con mezcla de patrones (efecto matriz). ? Recta 3 (R3): mezcla de patrones + orina + extracci?n en fase s?lida (cuantificaci?n). La informaci?n proporcionada por estas rectas permite evaluar el efecto matriz (EM), la recuperaci?n (RE) y la eficiencia del procedimiento (EP) de HPLC?ESI? MS/MS para cuantificar isoprostanos. Para el c?lculo del EM, RE y EP se utilizan las siguientes formulas, empleando las relaciones de ?rea de cada isoprostano (IsoP) y el est?ndar interno [2H4]-15-F2t-IsoP (IsoP-1): ? EM= B/(A+D) x 100 (1) ? RE= C/B x 100 (2) ? EP= C/(A+D) x 100 = (ME x RE)/100 (3) Efecto matriz (EM). Se calcul? a partir de la ecuaci?n 1 (ec 1) comparando la respuesta MS/MS de un analito (relaci?n del ?rea del analito/est?ndar interno IsoP- 1) a diferentes concentraciones en muestra de orina que se enriquecieron despu?s de la extracci?n (fluido biol?gico, contaminado) (R2, columna B, ec 1), y la respuesta del MS/MS (R1, columna A, ec 1) del mismo analito resuspendido en la fase m?vil (disolvente puro, limpio) + la concentraci?n basal (columna D). El efecto medio matriz, calculado de acuerdo con la ec 1, fue de 117%, 107%, 100%, 104%, 112% y 47%, para 15-F2t-IsoP (IsoP-2), 2,3-dinor-15-F2t-IsoP (IsoP-3), 5- F2t-IsoP (IsoP-4), 5-F2c-IsoP (IsoP-5), 8-F2t-IsoP (IsoP-6) y 15-F3t-IsoP (IsoP-7), respectivamente (Tablas 1, 2 y 3 columnas E y F), (Figuras 1, 2 y 3). Un valor de 100% indica que la respuesta en la fase m?vil y en los extractos de orina fueron iguales y por tanto no se observaron efecto de la matriz. Un valor > 100% indica 334 una mejora de ionizaci?n y un valor < 100% indica una supresi?n de la ionizaci?n. Es interesante remarcar que aunque el EM promedio para el IsoP-5 fue de 104, se observ? (Figura 2) que a altas concentraciones (800 pg/?L) el EM es mayor lo que podr?a atribuirse a condiciones de extracci?n. Por otra parte el IsoP-7 present? una supresi?n de se?al de m?s del 50% lo que indica la poca eficiencia de la formaci?n de iones de analito (IsoP-7) en presencia de compuestos que coeluyen en el fluido biol?gico (Figura 3). Estos datos claramente indican que el EM puede ser diferente para cada analito. Recuperaci?n (RE) vs eficiencia del proceso (EP). La recuperaci?n se calcul? a partir de la ec 2, empleando la rectas R3 (columna C) y R2 (columna B), debido a que los valores de recuperaci?n deben estar libres de las contribuciones del efecto matriz. Por otro lado, la ec 3 permite conocer la eficiencia general del proceso, ya que toma en cuenta el EM y la RE. La RE media fue de 98%, 133%, 109%, 86%, 108% y 92%, para IsoP-2, IsoP-3, IsoP-4, IsoP-5, IsoP-6 y IsoP-7, respectivamente (Tablas 1, 2 y 3 columnas G y H), (Figuras 1, 2 y 3). Se observ? que el IsoP-3 a bajas concentraciones (10 pg/?L) present? una mayor recuperaci?n 167%; a esta variabilidad de recuperaci?n podr?a estar contribuyendo el est?ndar interno (IsoP- 1). La EP calculada a partir de la ec 3 fue de 114%, 142%, 108%, 87%, 119% y 44%, para IsoP-2, IsoP-3, IsoP-4, IsoP-5, IsoP-6 y IsoP-7, respectivamente (Tablas 1, 2 y 3 columnas I y J). Se observ? una mayor EP medio para el IsoP-3 (142%) debido a una mayor recuperaci?n a bajas concentraciones, mientras que para el IsoP-7 la EP fue de 44% debido al efecto matriz. En conclusi?n la preparaci?n de estas rectas permite tener una mejor visi?n de los factores que est?n influyendo en el an?lisis. 335 Tabla 1. Efecto matriz (EM), recuperaci?n (RE), y eficiencia del proceso (EP) relaci?n de ?rea (IsoP-2/IsoP-1) y (IsoP-3/IsoP-1) en orina de rata. Figura 1. a) Representaci?n gr?fica de las rectas 1, 2, y 3 para el IsoP-2 y b) representaci?n gr?fica de las rectas 1, 2, y 3 para el IsoP-3. Conc: concentraci?n; IsoP: isoprostano; EM: efecto matriz, RE: recuperaci?n y EP: eficiencia del proceso. y = 9.2369x + 0.3611 R? = 0.9939 y = 9.2023x + 0.2319 R? = 0.9942 y = 9.2551x + 0.1003 R? = 0.99980.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0 0.1 0.2 0.3 ? r e a I s o P - 2 / ? r e a I s o P - 1 Conc IsoP-2/Conc IsoP-1 15-F2t-IsoP (IsoP-2) Relaci?n de ?rea RECTA_2 Relaci?n de ?rea RECTA_3 Relaci?n de ?rea RECTA_1 a) y = 18.652x + 0.3869 R? = 0.9769 y = 20.916x + 0.522 R? = 0.9913 y = 19.099x + 0.1327 R? = 0.995 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 0 0.1 0.2 0.3 ? r e a I s o P - 3 / ? r e a I s o P - 1 Conc IsoP-3/Conc IsoP-1 2,3-dinor-15-F2t-IsoP (IsoP-3) Relaci?n de ?rea RECTA_2 Relaci?n de ?rea RECTA_3 Relaci?n de ?rea RECTA_1 b) Medias de las relaciones de ?rea IsoP-2 IsoP-3 Conc (pg/?L) IsoP-2/IsoP-1 IsoP-3/IsoP-1 EM (%) RE (%) EP (%) R1 R2 R3 Basal Conc R1 R2 R3 Basal Conc IsoP-2 IsoP-3 IsoP-2 IsoP-3 IsoP-2 IsoP-3 10 0.28 0.35 0.38 0.025 0.44 0.49 0.83 0.023 117 108 107 167 124 181 50 1.04 1.31 1.23 0.025 2.18 2.45 2.82 0.023 123 111 94 115 115 128 100 1.95 2.18 2.04 0.025 3.89 3.99 4.62 0.023 111 102 94 116 104 118 promedio 117 107 98 133 114 142 Columna A B C D A B C D E F G H I J 336 Tabla 2. Efecto matriz (EM), recuperaci?n (RE), y eficiencia del proceso (EP) relaci?n de ?rea (IsoP-4/IsoP-1) y (IsoP-5/IsoP-1) en orina de rata. Figura 2. a) Representaci?n gr?fica de las rectas 1, 2, y 3 para el IsoP-4 y b) representaci?n gr?fica de las rectas 1, 2, y 3 para el IsoP-5. Conc: concentraci?n; IsoP: isoprostano; EM: efecto matriz, RE: recuperaci?n y EP: eficiencia del proceso. y = 9.4182x + 0.6792 R? = 1 y = 10.792x + 0.5401 R? = 0.9992 y = 10.606x + 0.3328 R? = 0.9932 0.0 4.0 8.0 12.0 16.0 20.0 0.0 1.0 2.0 ? r e a I s o P - 4 / ? r e a I s o P - 1 Conc IsoP-4/Conc IsoP-1 5-F2t-IsoP (IsoP-4) Relaci?n de ?rea RECTA_2 Relaci?n de ?rea RECTA_3 Relaci?n de ?rea RECTA_1 a) y = 32.525x - 3.3104 R? = 0.9993 y = 19.218x + 1.5945 R? = 0.9968 y = 24.752x - 0.0364 R? = 0.9934 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 0 1 2 ? r e a I s o P - 5 / ? r e a I s o P - 1 Conc IsoP-5/Conc IsoP-1 5-F2c-IsoP (IsoP-5) Relaci?n de ?rea RECTA_2 Relaci?n de ?rea RECTA_3 Relaci?n de ?rea RECTA_1 b) Medias de las relaciones de ?rea IsoP-4 IsoP-5 Conc* (pg/?L) IsoP-4/IsoP-1 IsoP-5/IsoP-1 ME (%) RE (%) PE (%) R1 R2 R3 Basal Conc R1 R2 R3 Basal Conc IsoP-4 IsoP-5 IsoP-4 IsoP-5 IsoP-4 IsoP-5 100 2.05 2.57 2.56 0.06 3.98 3.60 3.94 0.14 122 89 100 109 121 97 400 9.53 8.21 9.43 0.06 21.40 22.00 17.85 0.14 86 98 116 82 98 80 800 17.00 15.75 17.70 0.06 38.87 49.03 31.97 0.14 92 126 112 65 104 82 promedio 100 104 109 86 108 87 Columna A B C D A B C D E F G H I J 337 Tabla 3. Efecto matriz (EM), recuperaci?n (RE), y eficiencia del proceso (EP) relaci?n de ?rea (IsoP-6/IsoP-1) y (IsoP-7/IsoP-1) en orina de rata. Figura 3. a) Representaci?n gr?fica de las rectas 1, 2, y 3 para el IsoP-6 y b) representaci?n gr?fica de las rectas 1, 2, y 3 para el IsoP-7. Conc: concentraci?n; IsoP: isoprostano; EM: efecto matriz, RE: recuperaci?n y EP: eficiencia del proceso. y = 13.305x + 0.1497 R? = 0.9904 y = 13.096x + 0.0788 R? = 0.9986 y = 11.924x + 0.0318 R? = 0.9956 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 0 0.1 0.2 0.3 ? r e a I s o P - 6 / ? r e a I s o P - 1 Conc IsoP-6/Conc IsoP-1 8-F2t-IsoP (IsoP-6) Relaci?n de ?rea RECTA_2 Relaci?n de ?rea RECTA_3 Relaci?n de ?rea RECTA_1 y = 1.0253x + 0.0125 R? = 0.9908 y = 0.8641x + 0.0265 R? = 1 y = 1.9072x + 0.0089 R? = 0.9998 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0 0.1 0.2 0.3? r e a I s o P - 7 / ? r e a I s o P - 1 Conc IsoP-7/Conc IsoP-1 15-F3t-IsoP (IsoP-7) Relaci?n de ?rea RECTA_2 Relaci?n de ?rea RECTA_3 Relaci?n de ?rea RECTA_1 Medias de las relaciones de ?rea IsoP-6 IsoP-7 Conc (pg/?L) IsoP-6/IsoP-1 IsoP-7/IsoP-1 EM (%) RE (%) EP (%) R1 R2 R3 Basal Conc R1 R2 R3 Basal Conc IsoP-6 IsoP-7 IsoP-6 IsoP-7 IsoP-6 IsoP-7 10 0.22 0.24 0.31 0.01 0.05 0.03 0.04 0.03 104 35 130 63 135 22 50 1.31 1.62 1.44 0.01 0.20 0.13 0.11 0.03 123 53 90 105 110 56 100 2.38 2.60 2.68 0.01 0.39 0.21 0.20 0.03 109 52 103 107 112 56 promedio 112 47 108 92 119 44 Columna A B C D A B C D E F G H I J a) b) 338 7.3. CURVAS DE LOS PATRONES DEL ESTUDIO DE BIODISPONIBILIDAD DE POLIFENOLES EN ORINA Y HECES Se realizaron dos inyecciones en diferente tiempo (pase 1 y pase 2) para adecuar los patrones a los intervalos de concentraci?n de las muestras. Figura 1. a) Curva de la taxifolina y b) Curva del ?cido 3-hidroxifenilac?tico. y = 823893x + 57654 R? = 0.9985 0.00E+00 1.00E+06 2.00E+06 3.00E+06 4.00E+06 0 2 4 6 ?r ea , cu en ta s Concentraci?n, ppm Taxifolina (pase 1) y = 236510x + 3985 R? = 0.9994 0.00E+00 2.00E+05 4.00E+05 6.00E+05 8.00E+05 1.00E+06 0 2 4 6 ?r ea , cu en ta s Concentraci?n, ppm ?cido 3-hidroxifenilac?tico (pase 1) . Figura 2. a) Curva del ?cido 3,4-dihidroxifenilac?tico y b) Curva del ?cido homovan?lico. Figura 3. a) Curva del ?cido fer?lico y b) Curva del ?cido isofer?lico. y = 832067x + 12347 R? = 0.9997 0.00E+00 1.00E+06 2.00E+06 3.00E+06 4.00E+06 0 2 4 6 ?r ea , cu en ta s Concentraci?n, ppm ?cido 3,4-dihidroxifenilac?tico (pase 1) y = 22318x + 3012.4 R? = 0.9979 0.00E+00 2.00E+04 4.00E+04 6.00E+04 8.00E+04 1.00E+05 0 2 4 6 ?r ea , cu en ta s Concentraci?n, ppm ?cido homovan?lico (pase 1) y = 90002x + 7441.4 R? = 0.9972 0.00E+00 1.00E+05 2.00E+05 3.00E+05 4.00E+05 0 2 4 6 ?r ea , cu en ta s Concentraci?n, ppm ?cido fer?lico (pase 1) y = 90544x - 1390.4 R? = 0.9982 0.00E+00 1.00E+05 2.00E+05 3.00E+05 4.00E+05 0 2 4 6 ?r ea , cu en ta s Concentraci?n, ppm ?cido isofer?lico (pase 1) a) b) a) b) a) b) 339 Figura 4. a) Curva del ?cido 3,4-dihidroxifenilpropi?nico y b) Curva del ?cido 3- hidroxibenzoico. Figura 5. a) Curva del ?cido benzoico y b) Curva del ?cido g?lico. Figura 6. a) Curva de la taxifolina para ?reas <8.00E+5 y b). Curva de la taxifolina para ?reas >8.00E+5. y = 330584x + 2591.9 R? = 0.9941 0.00E+00 4.00E+05 8.00E+05 1.20E+06 1.60E+06 0 1 2 3 4 5 ?r ea , cu en ta s Concentraci?n, ppm ?cido 3,4-dihidroxifenilpropi?nico (pase 1) y = 233693x + 19224 R? = 0.9971 0.00E+00 2.00E+05 4.00E+05 6.00E+05 8.00E+05 1.00E+06 1.20E+06 0 1 2 3 4 5 ?r ea , cu en ta s Concentraci?n, ppm ?cido 3-hidroxibenzoico (pase 1) y = 1553.3x + 435.7 R? = 1 0.00E+00 2.00E+03 4.00E+03 6.00E+03 8.00E+03 0 1 2 3 4 5 ?r ea , cu en ta s Concentraci?n, ppm ?cido benzoico (pase 1) y = 1E+06x + 116325 R? = 0.9927 0.00E+00 1.00E+06 2.00E+06 3.00E+06 4.00E+06 5.00E+06 0 1 2 3 4 5 ?r ea , cu en ta s Concentraci?n, ppm ?cido g?lico (pase 1) y = 210899x + 2206 R? = 0.9991 0.00E+00 2.00E+05 4.00E+05 6.00E+05 8.00E+05 1.00E+06 0 1 2 3 4 5 ?r ea , cu en ta s Concentraci?n, ppm Taxifolina (pase 2) para ?reas < 8.00E+5 y = -1438.8x2 + 194967x + 16594 R? = 0.9998 0.00E+00 1.00E+06 2.00E+06 3.00E+06 4.00E+06 5.00E+06 6.00E+06 0 10 20 30 40 50 ?r ea , c ue nt as Concentraci?n, ppm Taxifolina (pase 2) para ?reas > 8.00E+5 a) b) a) b) a) b) 340 Figura 7. a) Curva del ?cido 4-hidroxifenilac?tico y b) Curva del ?cido p-cum?rico. Figura 8. a) Curva del ?cido cafeico para ?reas <2.00E+5 y b). Curva del ?cido cafeico para ?reas >2.00E+5. Figura 9. a) Curva del ?cido m-cum?rico y b) Curva del ?cido vainill?nico. y = 3362.3x + 148.13 R? = 0.9997 0.00E+00 2.00E+04 4.00E+04 6.00E+04 8.00E+04 1.00E+05 1.20E+05 1.40E+05 1.60E+05 0 20 40 60 ?r ea , cu en ta s Concentraci?n, ppm ?cido 4-hidroxifenilac?tico (pase 2) y = -8548.2x2 + 878962x + 85794 R? = 0.9996 0.00E+00 5.00E+06 1.00E+07 1.50E+07 2.00E+07 2.50E+07 0 20 40 60 ?r ea , cu en ta s Concentraci?n, ppm ?cido p-cum?rico (pase 2) y = 488787x - 2478.2 R? = 0.9996 -5.00E+04 0.00E+00 5.00E+04 1.00E+05 1.50E+05 2.00E+05 2.50E+05 3.00E+05 0 0.2 0.4 0.6 ?r ea , cu en ta s Concentraci?n, ppm ?cido cafeico (pase 2) para ?reas < 2.00E+5 a) y = -3238x2 + 379880x + 61975 R? = 0.99910.00E+00 2.00E+06 4.00E+06 6.00E+06 8.00E+06 1.00E+07 1.20E+07 0 10 20 30 40 50 ?r ea , cu en ta s Concentraci?n, ppm ?cido cafeico (pase 2) para ?reas > 2.00E+5 b) y = -2668.3x2 + 458296x + 27070 R? = 0.99990.00E+00 5.00E+06 1.00E+07 1.50E+07 0 20 40 60 ?r ea , cu en ta s Concentraci?n, ppm ?cido m-cum?rico (pase 2) y = 905.96x - 689.35 R? = 0.9993 0.00E+00 1.00E+04 2.00E+04 3.00E+04 4.00E+04 0 10 20 30 40 50 ?r ea , cu en ta s Concentraci?n, ppm ?cido vainill?nico (pase 2) a) b) a) b) 341 Figura 10. a) Curva del ?cido 4-hidroxifenilpropi?nico para ?reas <8.00E+4 y b) Curva del ?cido 4-hidroxifenilpropi?nico para ?reas >8.00E+4. Figura 11. a) Curva del ?cido 4-hidroxibenzoico para ?reas <1.00E+6 y b) curva del ?cido 4- hidroxibenzoico para ?reas >1.00E+6. Figura 12. a) Curva del ?cido 3,4-dihidroxibenzoico para ?reas <7.00E+5 y b) curva del ?cido 3,4-dihidroxibenzoico para ?reas >7.00E+5. y = 3884.6x + 7135.3 R? = 0.9987 0.00E+00 5.00E+04 1.00E+05 1.50E+05 2.00E+05 0 20 40 60 ?r ea , cu en ta s Concentraci?n, ppm ?cido 4-hidroxifenilpropi?nico (pase 2) para ?reas < 8.00E+4 a) y = -24.143x2 + 4764.8x + 6764.6 R? = 0.9995 0.00E+00 5.00E+04 1.00E+05 1.50E+05 2.00E+05 2.50E+05 0 20 40 60 80 ?r ea , c ue nt as Concentraci?n, ppm ?cido 4-hidroxifenilpropi?nico (pase 2) para ?reas > 8.00E+4 b) y = 358440x + 3652.6 R? = 1 0.00E+00 5.00E+05 1.00E+06 1.50E+06 2.00E+06 0 1 2 3 4 5 ?r ea , cu en ta s Concentraci?n, ppm ?cido 4-hidroxibenzoico (pase 2) para ?reas < 1.00E+6 a) y = -2559.3x2 + 348888x + 15515 R? = 0.9999 0.00E+00 2.00E+06 4.00E+06 6.00E+06 8.00E+06 1.00E+07 1.20E+07 0 20 40 60 ?r ea , cu en ta s Concentraci?n, ppm ?cido 4-hidroxibenzoico (pase 2) para ?reas > 1.00E+6 b) y = 347950x - 1322.1 R? = 0.9982 -2.00E+05 0.00E+00 2.00E+05 4.00E+05 6.00E+05 8.00E+05 0 1 2 3 ?r ea , cu en ta s Concentraci?n, ppm ?cido 3,4-dihidroxibenzoico (pase 2) para ?reas < 7.00E+5 a) y = -2083.4x2 + 291818x + 18938 R? = 0.9998 0.00E+00 2.00E+06 4.00E+06 6.00E+06 8.00E+06 1.00E+07 0 10 20 30 40 50 ?r ea , cu en ta s Concentraci?n, ppm ?cido 3,4-dihidroxibenzoico (pase 2) para ?reas > 7.00E+5 b) 342 Figura 13. a) Curva del ?cido hip?rico para ?reas <2.00E+6 y b) curva del ?cido hip?rico para ?reas >2.00E+6 (b). Figura 14. a) Curva del enterodiol para ?reas <2.00E+4 y b) curva del enterodiol para ?reas >2.00E+4. Figura 15. a) Curva del ?cido fenilac?tico para ?reas <1.500E+4 y b) curva del ?cido fenilac?tico para ?reas >1.500E+4. y = 122844x + 30366 R? = 0.9993 0.00E+00 1.00E+06 2.00E+06 3.00E+06 4.00E+06 5.00E+06 6.00E+06 0 20 40 60 ?r ea , cu en ta s Concentraci?n, ppm ?cido hip?rico (pase 2) para ?reas < 2.00E+6 a) y = -404.4x2 + 134837x - 17189 R? = 1 -2.00E+06 0.00E+00 2.00E+06 4.00E+06 6.00E+06 8.00E+06 0 20 40 60 80 ?r ea , cu en ta s Concentraci?n, ppm ?cido hip?rico (pase 2) para ?reas > 2.00E+6 b) y = 937.41x + 184.6 R? = 0.9996 0.00E+00 5.00E+03 1.00E+04 1.50E+04 2.00E+04 0 5 10 15 20 25 ?r ea , cu en ta s Concentraci?n, ppm Enterodiol (pase 2) para ?reas < 2.00E+4 a) y = -6.0907x2 + 999.19x + 202.61 R? = 0.9982 0.00E+00 1.00E+04 2.00E+04 3.00E+04 4.00E+04 5.00E+04 0 20 40 60 80 ?r ea , cu en ta s Concentraci?n, ppm Enterodiol (pase 2) para ?reas > 2.00E+4 b) y = 706.5x + 388.61 R? = 0.9997 0.00E+00 5.00E+03 1.00E+04 1.50E+04 2.00E+04 0 5 10 15 20 25 ?r ea , cu en ta s Concentraci?n, ppm ?cido fenilac?tico (pase 2) para ?reas < 1.500E+4 a) y = -6.4199x2 + 826.87x + 200.54 R? = 0.9996 0.00E+00 5.00E+03 1.00E+04 1.50E+04 2.00E+04 2.50E+04 3.00E+04 0 20 40 60 80 ?r ea , cu en ta s Concentraci?n, ppm ?cido fenilac?tico (pase 2) para ?reas > 1.500E+4 b) 343 Figura 16. a) Curva de la epicatequina para ?reas <7.00E+5 y b) curva de la epicatequina para ?reas >7.00E+5. Figura 17. Curva de la epigalocatequina. y = 36089x - 245.03 R? = 0.9999 0.00E+00 2.00E+05 4.00E+05 6.00E+05 8.00E+05 0 10 20 30 ?r ea , c ue nt as Concentraci?n, ppm Epicatequina (pase 2) para ?reas < 7.00E+5 a) y = -385.13x2 + 43802x - 7780 R? = 0.9995 -2.00E+05 0.00E+00 2.00E+05 4.00E+05 6.00E+05 8.00E+05 1.00E+06 1.20E+06 0 20 40 60 ?r ea , cu en ta s Concentraci?n, ppm Epicatequina (pase 2) para ?reas > 7.00E+5 b) y = 3639.3x + 341.56 R? = 0.9973 0.00E+00 5.00E+04 1.00E+05 1.50E+05 2.00E+05 0 10 20 30 40 50 ?r ea , cu en ta s Concentraci?n, ppm Epigalocatequina (pase 2) 344 7.4. ESPECTROS DE MASAS DE PATRONES DEL ESTUDIO DE BIODISPONIBILIDAD DE POLIFENOLES EN ORINA Y HECES En esta secci?n se presentan los espectros de masas de patrones comerciales que fueron decisivos para la identificaci?n de sus metabolitos derivados. Espectro de masas de (?)-epicatequina (EC) y (?)-epigalocatequina (EGC) (Figura 1). Se observ? adem?s de otros fragmentos, dos tipos de rupturas del anillo heteroc?clico de la EC y EGC caracter?sticos: la simple apertura del anillo heteroc?clico y la fisi?n retro-Diels-Alder (Figura 2). El fragmento m/z 125 de EC corresponde a la p?rdida del anillo A 164 Da por la simple apertura del anillo C (Figura 2), mientras que el fragmento a m/z 137 indica p?rdida del anillo A 152 Da por fisi?n retro-Diels-Alder. O OH OH OH OH HO A C B CH2 O OH OH OH OH -O 152 Dam/z 137 Fisi?n RDA H2C OH OH OH O OH -O m/z 125 164 Da Simple apertura del anillo heteroc?clico m/z 289 EC -1 Figura 2. Apertura del anillo heteroc?clico de EC. Simple apretura del anillo heteroc?clico (a la izquierda), fisi?n retro-Diels-Alder (a la derecha). Figura 1. a) Espectro de masas de la EC y b) espectro de masas de la EGC. 345 En la Figura 3 se muestran los espectros de masas del ?cido 4- hidroxifenilpropi?nico y el ?cido 3,4-dihidroxifenilpropi?nico. El ?cido 4- hidroxifenilpropi?nico con m/z 165 produce un ion m/z 121 por la p?rdida de 44 Da, debido a la p?rdida de CO2 (Figura 3a). El ?cido 3,4-dihidroxifenilpropi?nico con m/z 181 produce un ion m/z 137 por la p?rdida de 44 Da, debido a la p?rdida de CO2 (Figura 3b). Se detectan otros fragmentos caracter?sticos. En la Figura 4 se muestran los espectros de masas del ?cido 3- hidroxifenilac?tico, del ?cido 4-hidroxifenilac?tico y del ?cido 3,4- dihidroxifenilac?tico. El ?cido 3-hidroxifenilac?tico y el ?cido 4- hidroxifenilac?tico con m/z 151 producen un ion m/z 107 por la p?rdida de 44 Da, debido a la p?rdida de CO2 (Figura 4a, b). Mientras que el ?cido 3,4- dihidroxifenilac?tico con m/z 167 produce un ion m/z 123 por la p?rdida de 44 Da, debido a la p?rdida de CO2 (Figura 4c). Figura 3. a) Espectro de masas del ?cido 4-hidroxifenilpropi?nico y b) espectro de masas del ?cido 3,4-dihidroxifenilpropi?nico. 346 En la Figura 5 se muestran los espectros de masas del 4-hidroxibenzoico, del ?cido 3,4-dihidroxibenzoico y del ?cido vainill?nico. El ?cido 4-hidroxibenzoico con m/z 137 produce un ion m/z 93 por la p?rdida de 44 Da, debido a la p?rdida de CO2 (Figura 5a). El ?cido 3,4-dihidroxibenzoico con m/z 153 produce un ion m/z 109 por la p?rdida de 44 Da, debido a la p?rdida de CO2 (Figura 5b). Mientras que el ?cido vainill?nico con m/z 167 produce un ion m/z 152 por la p?rdida de 15 Da, debido a la p?rdida de un CH3, el ion m/z 123 por la p?rdida de 44 Da, debido a la p?rdida de un CO2, adem?s del ion m/z 108 por la p?rdida de 15+44 Da, debido a la p?rdida sucesiva del CH3 y CO2 (Figura 5c). Figura 4. a) Espectro de masas del ?cido 4-hidroxifenilac?tico, b) espectro de masas del 3- hidroxifenilac?tico y c) espectro de masas del ?cido 3,4-dihidroxifenilac?tico. 347 En la Figura 6 se muestran los espectros de masas del ?cido m-cum?rico y el ?cido p-cum?rico. Los ?cidos m-cum?rico y p-cum?rico con m/z 163 producen un ion m/z 119 por la p?rdida de 44 Da, debido a la p?rdida de CO2 (Figura 6a, b). Figura 5. a) Espectro de masas del ?cido 4-hidroxibenzoico, b) espectro de masas del ?cido 3,4-dihidroxibenzoico y c) espectro de masas del ?cido vainill?nico. 348 En la Figura 7 se muestra el espectro de masas del ?cido hip?rico con m/z 178 que producen un ion m/z 134 por la p?rdida de 44 Da, debido a la p?rdida de CO2. Figura 6. Espectro de masas del ?cido m-cum?rico y b) espectro de masas del ?cido p- cum?rico. Figura 7. Espectro de masas del ?cido hip?rico. 349 7.5. IDENTIFICACI?N DE LOS METABOLITOS DE POLIFENOLES DE SEMILLA DE UVA EXCRETADOS EN ORINA Y HECES En esta secci?n se describe la identificaci?n y confirmaci?n de los metabolitos presentes en muestras de orina y heces del estudio 2. Las muestras que fueron sometidas a una extracci?n en fase s?lida (SPE) fueron analizadas por cromatograf?a l?quida de alta eficiencia acoplada a espectrometr?a de masas en t?ndem con ionizaci?n por electroespray (HPLC?ESI?MS/MS) y el perfil cromatogr?fico se obtuvo a partir de experimentos de monitoreo de reacciones m?ltiples (MRM), es decir, la monitorizaci?n de pares de iones precursor (ion padre) y producto (ion hijo), para cada metabolito evaluado (Secci?n de resultados y discusi?n, Tabla 29). 7.5.1. Identificaci?n de metabolitos conjugados de EC y EGC Monoconjugados de (?)-epicatequina (EC) En la Figura 1a se muestra el MRM de la transici?n m/z 465?289 de una muestra no suplementada con extracto de semilla de uva (GSE) dieta (HFHS-soja), que correspondi? a tres monoconjugados de EC identificados como glucur?nidos de epicatequina (gluc-EC), gluc-EC-1 (tR=16.4 min), gluc-EC-2 (tR=15.9 min) y gluc-EC-3 (tR=14.8 min). En la Figura 1b se muestra el MRM de la transici?n m/z 465?289 de una muestra suplementada con GSE dieta (STD-GSE), que correspondi? a cinco monoconjugados en total que incluye los tres ya vistos en la dieta no suplementada (HFHS-soja), que fueron nombrados gluc-EC-4 (tR=3.2 min) y gluc-EC-5 (tR=2.1 min). 350 Los metabolitos gluc-EC-1, gluc-EC-2, gluc-EC-3, gluc-EC-4 y gluc-EC-5 fueron confirmados por escaneo del ion precursor (PIS). En la Figura 2 se muestran los PIS de los cinco gluc-EC. Tres metabolitos de gluc-EC-1, gluc-EC-2 y gluc-EC-3 ya han sido confirmados y reportados en muestras de ratas y humanos despu?s de la ingestas de cacao y fibra diet?tica de uva[1-3] mientras que un cuarto metabolito de gluc-EC (gluc-EC-4 ? gluc-EC-5) ha sido confirmado y reportado en orina de 24 h en humanos tras el consumo de cacao,[4] y tambi?n tras el consumo de t?, en orina de 12-24 h.[5] Nosotros, por exploraci?n del PIS detectamos 5 metabolitos gluc-EC. Se observ? en los PIS que el ion precursor m/z 465 produce un ion producto m/z 289 por la p?rdida de 176 Da del gluc, adem?s se compararon las se?ales obtenidas con el espectro del patr?n EC (Anexo 7.4, Figura 1a). Donde se observan adem?s de otros fragmentos, dos tipos de rupturas del anillo heteroc?clico de EC caracter?sticos, la simple apertura del anillo heteroc?clico y la fisi?n retro- Diels-Alder.[6] Tambi?n se observ? fragmentos caracter?sticos para gluc (175 Da y 113 Da).[7] Se observaron diferentes intensidades relativas en los picos de los gluc-EC. Esto se debe a la presencia del grupo gluc en diferentes posiciones. Por ejemplo, los iones m/z 245 (p?rdida de CO2 de EC) y una se?al poco intensa con m/z 137 (un fragmento del anillo A) sugiri? que el resto glucur?nido en los gluc-EC-1 y gluc- EC-3, estaba unido al anillo B, en la posici?n 7 ? 5 del anillo. Luego, en el espectro Figura 1. Cromatogramas MRM de la transici?n m/z 465?289 de los metabolitos gluc- EC-1, gluc-EC-2, gluc-EC-3, gluc-EC-4 y gluc-EC-5): a) dieta HFHS-soja y b) dieta STD- GSE. 351 PIS del gluc-EC-2 se observ? un fragmento con m/z 328 que corresponde a un fragmento de anillo B m?s el resto gluc (152 + 176), resultante de la fisi?n retro Diels-Alder del anillo-C de la EC.[8, 9] Esto indica que la glucuronidaci?n ha ocurrido en la posici?n 3? o 4? del anillo B. Figura 2. Espectro PIS de los metabolitos gluc-EC: a) PIS de la se?al a 16.4 min, b) PIS de la se?al a 15.8 min, c) PIS de la se?al a 14.8 min, d) PIS de la se?al a 3.2 min y e) PIS de la se?al a 2.1 min. 352 Diconjugados de (?)-epicatequina (EC) La transici?n m/z 545?369 (tR=14.6 min) correspondi? al glucur?nido-sulfato de EC (gluc-sulf-EC) (Figura 3a). La transici?n m/z 479?303 correspondi? a tres derivados de metil-glucur?nido de epicatequina (me-gluc-EC) identificados como me-gluc-EC-1 (tR=5.8 min), me-gluc-EC-2 (tR=4.8 min) y me-gluc-EC-3 (tR=0.4 min) (Figura 3b). La transici?n m/z 383?303 (tR=16.0 min) correspondi? al metil- sulfato de EC (me-sulf-EC) (tR=16.0 min) (Figura 3c). Figura 3. Cromatogramas MRM de los metabolitos diconjugados de EC: a) Transici?n m/z 545?369 del gluc-sulf-EC, b) Transici?n m/z 479?303 del me-gluc-EC. *Este cromatograma podr?a tener una anomal?a como se ve en los tiempos de retenci?n y c) Transici?n m/z 383?303 del me-sulf-EC. En la Figura 4 se confirma por segunda transici?n (289?245) del gluc-sulf- EC con tR= 14.6 min. 353 En la Figura 5 se muestran los PIS de los tres derivados de me-gluc-EC. Se observ? el ion precursor m/z 479 que produce un ion m/z 303 por la p?rdida de (176 Da) correspondiente a una unidad de gluc, adem?s se observ? el ion producto con m/z 289 por la p?rdida de 15 Da, debido a la p?rdida de una unidad de metilo despu?s de la p?rdida del gluc estos metabolitos ya han sido confirmados previamente en muestras de rata despu?s de la ingesta de cacao y fibra diet?tica de uva.[3, 4] Figura 4. a) Cromatograma MRM de la transici?n m/z 289?245 del gluc-sulf-EC para confirmar y b) cromatograma MRM de la transici?n m/z 545?369 del gluc-sulf-EC para cuantificar. 354 En la Figura 6 se muestra el espectro PIS para m/z 383 que produce un ion m/z 303 por la p?rdida de 80 Da, debido a la p?rdida de una unidad de sulf y fragmentos caracter?sticos de EC. Triconjugados de (?)-epicatequina (EC) Las transiciones m/z 331?303 (tR=16.7 min) y m/z 493?303 (tR=8.7 min) correspondieron a dos triconjugados de EC identificados como tri-metil-EC (Me3- EC) y di-metil-glucur?nido de EC (Me2-gluc-EC), respectivamente (Figura 7). Figura 5. Espectros PIS de los metabolitos me-gluc-EC: a) PIS de la se?al a 5.8 min, b) PIS de la se?al a 4.8 min y c) PIS de la se?al a 0.4 min. Figura 6. Espectro PIS de la se?al a 16.0 min que confirma la presencia del metabolito me- sulf-EC. 355 En la Figura 8a se muestra el espectro PIS para m/z 331 que produce un ion m/z 303 por la p?rdida de 28 Da, debido a la p?rdida de dos unidad de metilo; la p?rdida de la tercera unidad de metilo produce el ion m/z 286 por la p?rdida de 45 Da y fragmentos caracter?sticos de EC. En la Figura 8b se muestra el espectro PIS para m/z 493 que produce un ion m/z 303 por la p?rdida de 191 Da, debido a la p?rdida de una unidad de metilo y otra de gluc; adem?s se pudo observar el ion m/z 371 de menor intensidad debido a la p?rdida de 176 Da que corresponde ?nicamente a la p?rdida del gluc y fragmentos caracter?sticos de EC (Anexo 7.4, Figura 1a). Figura 7. Cromatogramas MRM de los metabolitos triconjugados de EC: a) Transici?n m/z 331?303 del me3-EC y b) Transici?n m/z 493?303 del me2-gluc-EC. Figura 8. a) Espectro PIS de la se?al a 16.7 min que confirma la presencia del metabolito me3-EC y b) espectro PIS de la se?al a 8.7 min que confirma la presencia del metabolito me2-gluc-EC. 356 Diconjugados de (?)-epigalocatequina (EGC) En la Figura 9 se muestran los cromatogramas, obtenidos a partir de experimentos de MRM, de dos metabolitos diconjugados de EGC. La transici?n m/z 465?385 correspondi? a un monoconjugado de EGC identificado como di- sulfato de epigalocatequina (sulf2-EGC) (tR=16.1 min). La transici?n m/z 561?385 (tR=11.8 min) correspondi? al otro diconjugado de EGC identificado como glucur?nido-sulfato de EGC (gluc-sulf-EGC). Figura 9. Cromatogramas MRM de los metabolitos diconjugados de EGC: a) Transici?n m/z 465?385 del sulf2-EGC y b) Transici?n m/z 561?385 del gluc-sulf-EGC. En la Figura 10 se muestra el espectro PIS para m/z 465 que produce un ion m/z 385 por la p?rdida de 80 Da, debido a la p?rdida de una unidad de sulf. Adem?s se puede observar fragmentos caracter?sticos de EGC (Anexo 7.4, Figura 1b). En la Figura 11 se muestra la confirmaci?n por segunda transici?n (305?261) del gluc-sulf-EGC con tR= 11.8 min. Figura 10. Espectro del PIS de la se?al a 16.1 min que confirma la presencia del metabolito sulf2-EGC. 357 Triconjugado de (?)-epigalocatequina (EGC) La transici?n m/z 575?319 (tR=13.5 min) correspondi? a un triconjugado de EGC identificado como metil-glucur?nido-sulfato de EGC (me-gluc-sulf-EGC) (Figura 12). En la Figura 13 se muestra el espectro PIS para m/z 575 que produce un ion m/z 319 por la p?rdida de 256 Da, debido a la p?rdida de una unidad de gluc (176 Da) y otra de sulf (80 Da), adem?s se puede observar el ion m/z 399 debido a la p?rdida de 176 Da que corresponde ?nicamente a la p?rdida del gluc y fragmentos caracter?sticos de EGC (Anexo 7.4, Figura 1b). Figura 11. a) Cromatograma MRM de la transici?n m/z 305?261 del gluc-sulf-EGC para confirmar y b) cromatograma MRM de la transici?n m/z 561?385 del gluc-sulf-EGC para cuantificar. Figura 12. Cromatograma MRM del metabolito triconjugado de EGC. 358 7.5.2. Identificaci?n de los metabolitos microbianos conjugados y no conjugados Hidroxifenilvalerolactona En la Figura 14 y 15 se muestran los cromatogramas MRM de los metabolitos microbianos derivados de la hidroxifenilvalerolactona. La transici?n m/z 191?147 correspondi? al 3- ? 4-hidroxifenilvalerolactona (tR=5.6 min). La transici?n m/z 207?163 (tR=3.5 min) correspondi? a 3,4-dihidroxifenilvalerolactona. La transici?n m/z 383?207 (tR=11.4 min) y (tR=10.3 min) correspondi? a dos gluc del 3,4-dihidroxifenilvalerolactona denominados gluc-3,4-dihidroxifenilvalerolactona- 1 y gluc-3,4-dihidroxifenilvalerolactona-2, respectivamente (Figura 14). Figura 13. Espectro PIS de la se?al a 13.6 min que confirma la presencia del metabolito me-gluc-sulf-EGC. 359 La transici?n m/z 287?207 correspondi? al sulf-3,4- dihidroxifenilvalerolactona a (tR=15.3 min). La transici?n m/z 221?177 correspondi? al 3-hidroxifenilmetilvalerolactona (tR=12.5 min) y al 4- hidroxifenilmetilvalerolactona (tR=12.1 min). La transici?n m/z 397?221 correspondi? al gluc-3- ? 4-hidroxifenilvalerolactona (tR=14.0 min) y la transici?n m/z 301?221 correspondi? al sulf-3- ? 4-hidroxifenilvalerolactona (tR=14.9 min) (Figura 15). Figura 14. Cromatogramas MRM de los metabolitos microbiano derivados de la hidroxifenilvalerolactona: a) MRM de la transici?n m/z 191?147 del 3-? 4- hidroxifenilvalerolactona, b) MRM de la transici?n m/z 207?163 del 3,4- dihidroxifenilvalerolactona y c) MRM de la transici?n m/z 383?207 del gluc-3,4- dihidroxifenilvalerolactona-1 y gluc-3,4-dihidroxifenilvalerolactona-2. 360 Figura 15. Continuaci?n de los cromatogramas MRM de los metabolitos microbianos derivados de la hidroxifenilvalerolactona: d) Transici?n m/z 287?207 del sulf-3,4- dihidroxifenilvalerolactona e) Transici?n m/z 221?177 del 3- hidroxifenilmetilvalerolactona y 4-hidroxifenilmetilvalerolactona, f) Transici?n m/z 397?221 del gluc-3- ? 4-hidroxifenilmetilvalerolactona y g) Transici?n m/z 301?221 del sulf-3- ? 4-hidroxifenilmetilvalerolactona. En la Figura 16 y 17 se muestran los PIS de derivados de la hidroxifenilvalerolactona. PIS para m/z 191 que produce un ion m/z 147 por la p?rdida de 44 Da, debido a la p?rdida de CO2 (Figura 16a). PIS para m/z 207 que produce un ion m/z 163 por la p?rdida de 44 Da, debido a la p?rdida de CO2 (Figura 16b). PIS para m/z 383 que produce un ion m/z 207 por la p?rdida de 176 Da, debido a la p?rdida de un gluc, ion m/z 163 por la p?rdida de 44 Da, debido a la p?rdida de CO2, adem?s de fragmentos caracter?sticos de gluc (175 Da y 113 Da) (Figura 16c, d). 361 PIS para m/z 287 que produce un ion m/z 207 por la p?rdida de 80 Da, debido a la p?rdida de un sulf (Figura 17e). PIS para m/z 221 que produce un ion m/z 177 por la p?rdida de 44 Da, debido a la p?rdida de CO2 (Figura 17f, g). PIS para m/z 397 que produce un ion m/z 221 por la p?rdida de 176 Da, debido a la p?rdida de un gluc, adem?s de fragmentos caracter?sticos de gluc (175 Da y 113 Da) (Figura 17h). PIS para m/z 301 que produce un ion m/z 221 por la p?rdida de 80 Da, debido a la p?rdida de un sulf (Figura 17i). La generaci?n de otros fragmentos caracter?sticos descritos en estudios previos,[5, 7, 10] tambi?n se tomaron en cuenta para la identificaci?n de los metabolitos. Figura 16. Espectro PIS de los metabolitos microbianos derivados de la hidroxifenilvalerolactona detectados en muestras de orina: a) PIS de la se?al a 5.6 min, b) PIS de la se?al a 3.5 min, c) PIS de la se?al a 11.4 min y d) PIS de la se?al a 10.3 min. 362 ?cido hidroxifenilval?rico En la Figura 18 se muestran los cromatogramas MRM de los metabolitos microbianos derivados del ?cido hidroxifenilval?rico. La transici?n m/z 193?175 correspondi? al ?cido 3-hidroxifenilval?rico a (tR=13.3 min) y al 4- hidroxifenilval?rico a (tR=11.3 min). La transici?n m/z 209?137 correspondi? al Figura 17. Continuaci?n de los espectros PIS de los metabolitos microbianos derivados de la hidroxifenilvalerolactona detectados en muestras de orina: e) PIS de la se?al a 15.3 min, f) PIS de la se?al a 12.5 min, g) PIS de la se?al a 12.1 min, h) PIS de la se?al a 14.0 min y i) PIS de la se?al a 14.9 min. 363 ?cido 3,4-dihidroxifenilval?rico a (tR=8.9 min) y la transici?n m/z 289?209 correspondi? al ?cido sulf-3,4-dihidroxifenilval?rico a (tR=7.8 min). En la Figura 19 se muestran los PIS de derivados del ?cido hidroxifenilval?rico. PIS para m/z 193 que produce un ion m/z 175 por la p?rdida de 18 Da, debido a la p?rdida de H2O (Figura 19a, b). PIS para m/z 209 que produce un ion m/z 137 por la p?rdida de 72 Da, debido a la p?rdida de CO2 y CO sucesivamente,[11] (Figura 19c). PIS para m/z 289 que produce un ion m/z 209 por la p?rdida de 80 Da, debido a la p?rdida de un sulf (Figura 19d). Figura 18. Cromatogramas MRM de los metabolitos microbianos derivados del ?cido hidroxifenilval?rico: a) Transici?n m/z 193?175 del ?cido 3-hidroxifenilval?rico y 4- hidroxifenilval?rico, b) Transici?n m/z 209?137 del ?cido 3,4-dihidroxifenilval?rico y c) Transici?n m/z 289?209 del ?cido sulf-3,4-dihidroxifenilval?rico. 364 ?cido hidroxifenilpropi?nico En la Figura 20 se muestran los cromatogramas MRM de los metabolitos microbianos derivados del ?cido hidroxifenilpropi?nico. La transici?n m/z 165?121 correspondi? al ?cido 3-hidroxifenilpropi?nico a (tR=8.5 min) y al 4- hidroxifenilpropi?nico a (tR=7.2 min). La transici?n m/z 341?165 correspondi? al ?cido gluc-3- ? 4-dihidroxifenilpropi?nico a (tR=10.4 min). La transici?n m/z 181?137 correspondi? al ?cido 3,4-dihidroxifenilpropi?nico a (tR=3.7 min) y la transici?n m/z 261?181 correspondi? al ?cido sulf-3,4-dihidroxifenilpropi?nico a (tR=13.0 min). Figura 19. Espectros PIS de los metabolitos microbianos derivados del ?cido hidroxifenilval?rico detectados en muestras de orina: a) PIS de la se?al a 13.3 min, b) PIS de la se?al a 11.3 min, c) PIS de la se?al a 8.9 min y d) PIS de la se?al a 7.8 min. 365 Figura 20. Cromatogramas MRM de los metabolitos microbianos derivados del ?cido hidroxifenilpropi?nico: a) Transici?n m/z 165?121 del ?cido 3-hidroxifenilpropi?nico y el ?cido 4-hidroxifenilpropi?nico, b) Transici?n m/z 341?165 del ?cido gluc-3- ? 4- hidroxifenilpropi?nico, c) Transici?n m/z 181?137 del ?cido 3,4-dihidroxifenilpropi?nico y d) Transici?n m/z 261?181 del ?cido sulf-3,4-dihidroxifenilpropi?nico. En la Figura 21 se muestran los PIS de derivados del ?cido hidroxifenilpropi?nico. PIS para m/z 165 que produce un ion m/z 121 por la p?rdida de 44 Da, debido a la p?rdida de CO2 (Figura 21a). PIS para m/z 341 que produce un ion m/z 165 por la p?rdida de 176 Da, debido a la p?rdida de un gluc, adem?s de fragmentos caracter?sticos del gluc (175 Da y 113 Da)[7] (Figura 21b). 366 En la Figura 22 se muestra la confirmaci?n por segunda transici?n (181?137) del ?cido sulf-3,4-dihidroxifenilpropi?nico con tR= 13.0 min. En la Figura 23 se muestran los cromatogramas MRM de los metabolitos microbianos derivados del ?cido hidroxifenilac?tico. La transici?n m/z 151?107 correspondi? al ?cido 3-hidroxifenilac?tico a (tR=4.5 min) y al 4- hidroxifenilac?tico a (tR=3.5 min). La transici?n m/z 167?123 correspondi? al Figura 21. Espectro PIS de los metabolitos microbianos derivados del ?cido hidroxifenilpropi?nico en muestras de orina, a) PIS de la se?al a 8.5 min y b) PIS de la se?al a 10.4 min. Figura 22. a) Cromatograma MRM de la transici?n m/z 181?137 del ?cido sulf-3,4- dihidroxifenilpropi?nico para confirmar y b) cromatograma MRM de la transici?n m/z 261?181 del ?cido sulf-3,4-dihidroxifenilpropi?nico para cuantificar. 367 ?cido 3,4-dihidroxifenilac?tico a (tR=1.9 min) y la transici?n m/z 247?167 correspondi? al ?cido sulf-3,4-dihidroxifenilac?tico a (tR=10.4 min). En la Figura 24 se muestra la confirmaci?n por segunda transici?n (167?123) del ?cido sulf-3,4-dihidroxifenilac?tico con tR= 10.4 min. Figura 23. Cromatogramas MRM de los metabolitos microbiano del ?cido hidroxifenilac?tico: a) Transici?n m/z 151?107 del ?cido 4-hidroxifenilac?tico y 3- hidroxifenilac?tco, b) Transici?n m/z 167?123 del ?cido 3,4-dihidroxifenilac?tico y c) Transici?n m/z 247?167 del ?cido sulf-3,4-dihidroxifenilac?tico. Figura 24. a) Cromatograma MRM de la transici?n m/z 167?123 del ?cido sulf-3,4- dihidroxifenilac?tico para confirmar y b) cromatograma MRM de la transici?n m/z 247?167 del ?cido sulf-3,4-dihidroxifenilac?tico para cuantificar. 368 ?cido hidroxibenzoico En la Figura 25 se muestran los cromatogramas MRM de los metabolitos microbianos derivados del ?cido hidroxibenzoico. La transici?n m/z 137?93 correspondi? al ?cido 4-hidroxibenzoico a (tR=2.9 min). La transici?n m/z 153?109 correspondi? al ?cido 3,4-dihidroxibenzoico a (tR=1.5 min). La transici?n m/z 313?137 correspondi? al ?cido gluc-3-hidroxibenzoico a (tR=9.3 min) y al ?cido gluc-4-hidroxibenzoico a (tR=7.5 min). La transici?n m/z 233?153 correspondi? al ?cido sulf-3,4-dihidroxibenzoico a (tR=9.1 min) y la transici?n m/z 247?167 correspondi? al ?cido sulf-vainill?nico a (tR=9.3 min). Figura 25. Cromatogramas MRM de los metabolitos microbianos derivados del ?cido hidroxibenzoico: a) Transici?n m/z 137?93 del ?cido 4-hidroxibenzoico, b) Transici?n m/z 153?109 del ?cido 3,4-dihidroxibenzoico, c) Transici?n m/z 313?137 de los ?cido gluc-3- hidroxibenzoico y ?cido gluc-4-hidroxibenzoico, d) Transici?n m/z 233?153 del ?cido sulf-3,4-dihidroxibenzoico y e) Transici?n m/z 247?167 del ?cido sulf-vainill?nico. 369 En la Figura 26 se muestran los PIS de derivados del ?cido hidroxibenzoico. PIS para m/z 313 que produce un ion m/z 137 por la p?rdida de 176 Da, debido a la p?rdida del gluc, adem?s de fragmentos caracter?sticos del gluc (175 Da y 113 Da)[7] (Figura 26a, b). PIS para m/z 233 que produce un ion m/z 153 por la p?rdida de 80 Da, debido a la p?rdida de un sulf, adem?s de fragmentos caracter?sticos del 3,4-dihidroxibenzoico (Figura 26c). PIS para m/z 247 que produce un ion m/z 167 por la p?rdida de 80 Da, debido a la p?rdida de un sulf, adem?s de fragmentos caracter?sticos del ?cido vainill?nico (Figura 26d). ?cido cin?mico En la Figura 27 se muestran los cromatogramas MRM de los metabolitos microbianos derivados del ?cido cin?mico. La transici?n m/z 179?135 correspondi? al ?cido cafeico a (tR=4.3 min). La transici?n m/z 163?119 Figura 26. Espectros PIS de los metabolitos microbianos de la familia del ?cido hidroxibenzoico detectados en muestras de orina: a) PIS de la se?al a 9.3 min, b) PIS de la se?al a 7.5 min, c) PIS de la se?al a 9.1 min y d) PIS de la se?al a 9.3 min. 370 correspondi? al ?cido m-cum?rico a (tR=8.3 min) y al p-cum?rico a (tR=6.7 min). La transici?n m/z 243?119 correspondi? al ?cido sulf-cum?rico a (tR=6.3 min) y al sulf-cum?rico a (tR=5.0 min) y la transici?n m/z 193?134 correspondi? al ?cido fer?lico a (tR=7.8 min). En la Figura 28 se muestra la confirmaci?n por segunda transici?n (163?119) del ?cido sulf-cum?rico con tR= 6.3 y 5.0 min. Figura 27. Cromatogramas MRM de los metabolitos microbiano derivados del ?cido cin?mico: a) Transici?n m/z 179?135 del ?cido cafeico, b) Transici?n m/z 163?119 del ?cido m-cum?rico y ?cido p-cum?rico y c) Transici?n m/z 193?134 del ?cido fer?lico. 371 ?cido hip?rico En la Figura 29 se muestran los cromatogramas MRM de los metabolitos microbianos derivados del ?cido hip?rico. La transici?n m/z 178?134 correspondi? al ?cido hip?rico a (tR=3.2 min). La transici?n m/z 194?100 correspondi? al ?cido hidroxihip?rico a (tR=6.3 min) y la transici?n m/z 193?178 correspondi? a los ?cidos me-hip?rico-1 a (tR=14.0 min), me-hip?rico-2 a (tR=7.8 min) y me-hip?rico-3 a (tR=5.6 min). Figura 28. a) Cromatograma MRM de la transici?n m/z 163?119 del ?cido sulf-cum?rico- 1 y ?cido sulf-cum?rico-2 para cuantificar para confirmar y b) cromatograma MRM de la transici?n m/z 243?163 del ?cido sulf-cum?rico-1 y ?cido sulf-cum?rico-2 para cuantificar. 372 En la Figura 30 se muestra la confirmaci?n por segunda transici?n (178?134) de los ?cido me-hip?rico con tR= 14.0 y 7.8 min en heces. Figura 29. Cromatogramas MRM de los metabolitos microbiano derivados del ?cido hip?rico: a) Transici?n m/z 178?134 del ?cido hip?rico, b) Transici?n m/z 194?100 del ?cido hidroxihip?rico, c) Transici?n m/z 194?178 del ?cido metil-hip?rico-1 y ?cido metil- hip?rico-2 (muestras de heces) y d) Transici?n m/z 194?178 del ?cido metil-hip?rico-2 y ?cido metil-hip?rico-3 (muestras de orina). 373 En la Figura 31 se muestra la confirmaci?n por segunda transici?n (178?134) de los ?cido me-hip?rico con tR= 7.8 y 5.6 min en orina. En la Figura 32 se muestran los cromatogramas MRM de los metabolitos microbianos derivados tipo lignanos. La transici?n m/z 297?253 correspondi? a la enterolactona (tR=15.5 min) y la transici?n m/z 377?297 correspondi? a la sulf- enterolactona (tR=15.2 min). Figura 30. a) Cromatograma MRM de la transici?n m/z 178?134 del ?cido me-hip?rico para confirmar y b) cromatograma MRM de la transici?n m/z 193?178 del ?cido me- hip?rico para cuantificar en heces. Figura 31. a) Cromatograma MRM de la transici?n m/z 178?134 del ?cido me-hip?rico para confirmar y b) cromatograma MRM de la transici?n m/z 193?178 del ?cido me- hip?rico para cuantificar en orina. 374 En la Figura 33 se muestra el PIS para m/z 297 que produce un ion m/z 253 por la p?rdida de 44 Da, debido a la p?rdida de CO2, adem?s de otros fragmentos caracter?sticos, reportados anteriormente.[11, 12] En la Figura 34 se muestra la confirmaci?n por segunda transici?n (297?253) del sulf-enterolactona con tR= 15.2 min. Figura 32. Cromatogramas MRM de los metabolitos microbiano tipo lignano: a) Transici?n m/z 297?253 de la enterolactona y b) Transici?n m/z 377?297 de la sulf- enterolactona. Figura 33. Espectro PIS del metabolito microbiano tipo lignano detectado en muestras de orina. a) PIS de la se?al a 15.5 min. 375 REFERENCIAS 1. Ramiro-Puig E, Urp?-Sard? M, P?rez-Cano FJ, Franch A, Castellote C, Andr?s-Lacueva C, Izquierdo-Pulido M,Castell M: Cocoa-Enriched Diet Enhances Antioxidant Enzyme Activity and Modulates Lymphocyte Composition in Thymus from Young Rats. J Agric Food Chem. 2007, 55:6431-6438. 2. Mateos-Mart? ML, P?rez-Jim?nez J, Elisabet Fuguet E, Torres JL: Profile of urinary and fecal proanthocyanidin metabolites from common cinnamon (Cinnamomum zeylanicum L.) in rats. Mol Nutr Food Res. 2012, 56:671-675. 3. Touri?o S, Fuguet E, Vinardell MP, Cascante M, Torres JL: Phenolic metabolites of grape antioxidant dietary fiber in rat urine. J Agric Food Chem. 2009, 57:11418?11426. 4. Urpi-Sarda M, Monagas M, Khan N, Llorach R, Lmuela-Rvent?s R, J?uregui O, Estruch R, Izquierdo-Pulido M, Andr?s-Lacueva C: Targeted metabolic profiling of phenolics in urine and plasma after regular consumption of cocoa by liqued chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr A. 2009, 1216:7258-7267. 5. Sang S, Lee M-J, Yang IL, Buckley B, Yang CS: Human urinary metabolite profile of tea polyphenols analyzed by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry with data-dependent acquisition. Rapid Commun Mass Spectrom. 2008, 22:1567-1578. 6. Touri?o S, Fuguet E, J?uregui O, Saura-Calixto F, Cascante M, Torres JL: High-resolution liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry combined with liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry to identify polyphenols from grape antioxidant dietary fiber. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2008, 22:3489?3500. 7. Levsen K, Schiebel H-M, Behnke B, Dotzer R, Dreher W, Elend M,Thiele H: Structure elucidation of phase II metabolites by tandem mass spectrometry: an overview. J Chromatogr A. 2005, 1067:55?72. 8. Gu L, Kelm MA, Hammerstone JF, Beecher G, Holden J, Haytowitz D, Prior RL: Screening of foods containing proanthocyanidins and their structural characterization using LC-MS/MS and thiolytic degradation. J Agric Food Chem. 2003, 51:7513-7521. 9. Monagas M, Urpi-Sarda M, S?nchez-Pat?n FS, Llorach R, Garrido I, G?mez-Cordov?s C, Andres-Lacueva C, Bartolom? B: Insights into the metabolism and microbial Figura 34. a) Cromatograma MRM de la transici?n m/z 297?253 de la sulf-enterolactona para confirmar y b) cromatograma MRM de la transici?n m/z 377?297 de la sulf- enterolactona para cuantificar. 376 biotransformation of dietary flavan-3-ols and the bioactivity of their metabolites. Food Funct. 2010, 1:233-253. 10. Urpi-Sarda M, Monagas M, Khan N, Lamuela-Raventos RM, Santos-Buelga C, Sacanella E, Castell M, Permanyer J, Andres-Lacueva C: Epicatechin, procyanidins and phenolic microbial metabolites after cocoa intake in humans and rats. Anal Bioanal Chem. 2009, 394:1545-1556. 11. Touri?o S, P?rez-Jimenez J, Mateos-Mart?n ML, Fuguet E, Vinardell MP, Cascante M, Torres JL: Metabolites in contact with the rat digestive tract after ingestion of a phenolic-rich dietary fiber matrix. J Agric Food Chem. 2011, 59:5955-5963. 12. Prasaina JK, Arabshahi A, Moore DR, Greendale GA, Wyss JM, Barnes S: Simultaneous determination of 11 phytoestrogens in human serum using a 2 min liquid chromatography/tandem mass spectrometry method. J Chromatogr B. 2010, 878:994-1002. 377 7.6. MATERIAL SUPLEMENTARIO DEL ART?CULO: Cardiovascular disease-related parameters and oxidative stress in SHROB rats, a model for metabolic syndrome Figure S1. Standard curve used to quantify GSH (glutathione) Figure S2. Standard curve used to quantify GSSG (glutathione disulphide) y = 314.72x + 12.47 R2 = 0.9993 0 100 200 300 400 500 600 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 GSH (ug/100 uL) Fu lo re sc en ce u n its y = 200.05x + 1.6618 R2 = 0.9919 0 50 100 150 200 250 300 350 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 GSSG (ug/100 uL) Fu lo re sc en ce u n its 378 Figure S3. Representative chromatogram of endogenous 15-F2t-IsoP in rat urine. A) The m/z 573 ion current chromatogram represents the [2H4]-15-F2t-IsoP internal standard; the signal used to quantify 15-F2t-IsoP. B) The m/z 569 ion current chromatogram represents endogenous 15-F2t-IsoP. The injection volume was 1 ?L. 379 Figure S4. Evolution of the body weight of SHROB and WKY rats from week 13 to week 27 of life. 380 Table S1. Fatty acid composition of the soybean oil provided weekly. Values are given as mean ? SD. Content (mol %) 14:0 0.96 ? 0.02 15:0 0.15? 0.01 16:0 17.78 ? 0.10 16:1?7 0.90 ? 0.03 17:0 0.21 ? 0.01 18:0 2.07 ?0.01 18:1?9 18.75 ? 0.03 18:1?7 1.52 ? 0.02 18:2?6 47.55 ? 0.01 18:3?3 4.00 ? 0.04 20:1?9 1.43 ? 0.09 18:4?3 0.15 ? 0.004 20:2?6 0.20 ? 0.05 20:4?6 0.40 ? 0.02 22:1?11 1.08 ? 0.005 22:1?9 0.25 ? 0.02 20:4?3 0.20 ? 0.03 20:5?3 0.70 ? 0.02 24:1?9 0.28 ? 0.05 22:5?3 0.26 ? 0.01 22:6?3 1.15 ? 0.03 ?3 6.47 ? 0.14 SFA 21.17 ? 0.10 MUFA 24.21 ? 0.11 PUFA 54.62 ? 0.03 EPA+DHA 1.85 ? 0.06 ?3, omega-3; SFA, saturated fatty acids; MUFA, monounsaturated fatty acids; PUFA, polyunsaturated acids. 381 7.7. MATERIAL SUPLEMENTARIO DEL ART?CULO: Effect of omega-3 PUFA supplementation at different EPA/DHA ratios on Spontaneously Hypertensive Obese Rat (SHROB) model of metabolic syndrome Table S1. Weekly intake of soya bean oil control diet and EPA/DHA (1:1, 2:1 and 1:2) diets. Control 1:1 2:1 1:2 Mean SEM Mean SEM Mean SEM Mean SEM Feed intake Amount (g/week) 164?9 7?0 154?0 5?7 160?2 3?6 140?3 7?1 Protein 22?9 1?0 21?4 0?8 22?3 0?5 19?5 1?0 L-cystine 0?7 0?02 0?4 0?02 0?5 0?01 0?4 0?02 Carbohydrate available 77?0 3?3 71?8 2?6 74?7 1?7 65?5 3?3 Crude fiber 35?4 1?5 33?1 1?2 34?4 0?8 30?1 1?5 Soybean oil 6?4 0?3 6?0 0?2 6?2 0?1 5?5 0?3 Mineral 7?5 0?3 7?0 0?3 7?3 0?2 6?4 0?3 Vitamin 2?0 0?08 1?8 0?07 1?9 0?04 1?7 0?08 Ash 7?5 0?3 7?0 0?3 7?3 0?2 6?4 0?3 Choline bitartrate 0?1 0?01 0?1 0?1 0?2 0?04 0?1 0?01 Oil intake2 Amount (mg/week) and type Soybean oil Marine oil with EPA/DHA (1:1) Marine oil with EPA/DHA (2:1) Marine oil with EPA/DHA (1:2) 333?0 - - - 5?5 - - - - 321?1 - - - 7?0 - - - - 337?0 - - - 9?0 - - - - 332?8 - - - 6?2 Macronutrients 382 Protein (% by weight) 14?3 0?6 14.3 0?5 14?3 0?3 14?3 0?7 Carbohydrate available (% by weight) 48?2 2?1 48.2 1?8 48?2 1?1 48?2 2?4 Fat (% by weight) 4?1 0?2 4.2 0?2 4?2 0?09 4?3 0?2 Energy from protein (%) 19?9 0?8 19?9 0?7 19?9 0?4 19?9 1?0 Energy from carbohydrate (%) 66?9 2?8 66?9 2?5 66?9 1?5 66?8 3?4 Energy from fat (%) 13?2 0?6 13?2 0?5 13?2 0?3 13?3 0?7 Total energy density (kJ/g )3 11?6 0?5 11.7 0?4 11?7 0?3 11?7 0?6 1 Data from the beginning of the experiment 2 0.8 mL/kg body weight. 3 Energy density is estimated as metabolizable energy based on based on the Atwater factors, assigning 16.7kJ/g to protein, 37.6kJ/g to fat, and 16.7kJ/g to available carbohydrate. 383 Table S2. Fatty acid composition (mol %) of the supplements: soya bean oil control and EPA/DHA (1:1, 2:1 and 1:2). 1 Control 1:1 2:1 1:2 Mean SD Mean SD Mean SD Mean SD 14:0 0?96 0?02 4?37 0?05 3?97 0?01 4?73 0?02 15:0 0?15 0?01 0?29 0?02 0?25 0?004 0?31 0?02 16:0 17?78 0?10 10?15 0?16 9?09 0?03 10?98 0?13 16:1?7 0?90 0?03 4?99 0?04 4?57 0?02 5?39 0?03 17:0 0?21 0?01 0?45 0?004 0?41 0?004 0?49 0?01 18:0 2?07 0?01 2?94 0?03 2?95 0?005 2?97 0?01 18:1?9 18?75 0?03 6?41 0?06 6?18 0?003 6?61 0?04 18:1?7 1?52 0?02 1?91 0?03 1?93 0?02 1?95 0?02 18:2?6 47?55 0?01 0?65 0?01 0?61 0?004 0?65 0?02 20:0 -- -- 0?32 0?01 0?39 0?01 0?20 0?002 18:3?3 4?00 0?04 0?36 0?01 0?32 0?004 0?33 0?02 20:1?9 1?43 0?09 0?98 0?03 1?39 0?01 0?63 0?02 18:4?3 0?15 0?004 1?51 0?02 1?56 0?02 1?64 0?002 20:2?6 0?20 0?05 0?21 0?003 0?28 0?01 0?17 0?01 20:3?6 -- -- 0?22 0?01 0?27 0?01 0?15 0?004 20:4?6 0?40 0?02 1?68 0?04 1?98 0?03 1?16 0?02 22:1?11 1?08 0?005 1?14 0?01 1?58 0?02 0?45 0?01 22:1?9 0?25 0?02 0?28 0?03 0?37 0?03 0?19 0?02 20:4?3 0?20 0?03 1?02 0?02 1?31 0?02 0?75 0?01 20:5?3 0?70 0?02 25?09 0?10 32?43 0?06 17?33 0?03 24:1?9 0?28 0?05 0?38 0?003 0?55 0?02 0?25 0?01 22:5?3 0?26 0?01 4?30 0?05 5?24 0?02 2?60 0?12 22:6?3 1?15 0?03 25?70 0?21 17?98 0?03 34?85 0?10 ?3 6?47 0?14 58?84 0?16 57?51 0?27 57?97 0?40 SFA 21?17 0?10 18?52 0?22 17?05 0?02 19?68 0?12 MUFA 24?21 0?11 17?22 0?12 17?14 0?07 17?43 0?11 PUFA 54?62 0?03 64?26 0?33 65?81 0?08 62?90 0?24 EPA+DHA 1?85 0?06 50?79 0?31 50?41 0?09 52?19 0?13 384 Figure S1. MRM chromatograms of F2-isoprostanes and F3-isoprostanes in the 2 standard solutions at a concentration of 20 pg/?L: a) MRM transition m/z 3 357?197 for 15-F2t-IsoP-d4; b) MRM transition m/z 353?193 for 15-F2t-IsoP; c) 4 MRM transition m/z 325?237 for 2,3-dinor-15-F2t-IsoP; d) MRM transition m/z 5 353?115 for 5-F2t-IsoP and 5-F2c-IsoP; e) MRM transition m/z 353?127 for 8-6 F2t-IsoP; f) MRM transition m/z 351?193 for 15-F3t-IsoP. 7 8 385 Figure S2. MRM chromatograms of F2-isoprostanes extracted from urine: a) MRM transition m/z 357?197 for 15-F2t-IsoP-d4; b) MRM transition m/z 353?193 for 15-F2t-IsoP; c) MRM transition m/z 325?237 for 2,3-dinor-15-F2t-IsoP; d) MRM transition m/z 353?115 for 5-F2t-IsoP and 5-F2c-IsoP; e) MRM transition m/z 353?127 for 8-F2t-IsoP; f) MRM transition m/z 351?193 for 15-F3t-IsoP. 386 7.8. MATERIAL SUPLEMENTARIO DEL ART?CULO: D-Fagomine lowers postprandial blood glucose and modulates bacterial adhesion. Supplemental Fig. S1. Effect of D-fagomine, DNJ, miglitol and acarbose (2 mg/kg body weight) on the glycaemic response of Sprague-Dawley rats after ingestion of sucrose (2 g/kg body weight). Normal rats were food-deprived for 12 h and then administered the carbohydrate and the tested agent together. Values are means with their standard errors of mean. Statistical differences were evaluated by 2-way ANOVA and Bonferroni?s post test. Mean values significantly different from the control (sucrose 2 g/kg): **P<0?01, ***P<0?001. 387 Supplemental Fig. S2. Absence of effect of D-fagomine (13?5 mg/kg body weight) on the glycemic response of Sprague-Dawley rats after ingestion of glucose (1 g/kg body weight). Normal rats were food-deprived for 12 h and then administered the D-glucose and D- fagomine together. Values are means with their standard errors of mean. 388 Supplemental Table S2. Inhibition of bacterial viability expressed as percentage of CFU related to the positive control. Microorganism CFU (%) in the presence of D-fagomine 20 mg/l (0?14 mM) 200 mg/l (1?4 mM) SEM 2000 mg/l (14 mM) SEM Streptococccus mutans 0 3?00 0?58 5?00 0?00 Streptococcus sanguis 0 1?00 0?00 2?00 0?00 Lactobacillus casei 0 10?00 1?16 15?00 0?58 Leuconostoc spp. 0 10?00 0?58 12?00 0?00 Lactococcus spp. 0 18?33 0?33 14?00 0?00 Campylobacter jejuni 0 9?00 0?58 15?00 1?16 S. enterica serovar Typhi 0 5?00 0?00 10?00 0?00 Escherichia coli 0 6?00 0?00 12?00 0?00 Clostridium perfringens 0 4?00 0?58 6?00 0?00 Mycobacterium spp. 0 3?00 0?58 5?00 0?00 Pseudomonas aeruginosa 0 1?00 0?00 2?00 0?00 Candida albicans 0 10?00 1?16 15?00 0?58 Saccharomyces cerevisiae 0 10?00 0?58 12?00 0?00