Evaluación de las alteraciones de la coagulación de los donantes a corazón parado, su relación con la viabilidad de los injertos hepáticos y posibles acciones terapéuticas Marina Vendrell Jordà Aquesta tesi doctoral està subjecta a la llicència Reconeixement 3.0. Espanya de Creative Commons. Esta tesis doctoral está sujeta a la licencia Reconocimiento 3.0. España de Creative Commons. This doctoral thesis is licensed under the Creative Commons Attribution 3.0. Spain License. 1 UNIVERSIDAD DE BARCELONA FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE CIRUGÍA GENERAL Y DIGESTIVA LINEA DE INVESTIGACIÓN: TRASPLANTE DE HÍGADO Y VIABILIDAD DEL INJERTO TESIS DOCTORAL: P Presentada por Marina Vendrell Jordà MD, aspirante al título de Doctor en Medicina y Cirugía DIRECTORES: Constantino Fondevila Campo, MD, PhD, y Juan Carlos García-Valdecasas Salgado, MD, PhD Barcelona, 2018 5 CONSTANTINO FONDEVILA CAMPO, Profesor Asociado del Departamento de Cirugía General y Digestiva de la Universidad de Barcelona, JUAN CARLOS GARCÍA-VALDECASAS SALGADO, Catedrático del Departamento de Cirugía General y Digestiva de la Universidad de Barcelona, y CERTIFICAN: Que la tesis doctoral “ ”, presentada por Dª Marina Vendrell Jordà, ha sido realizada bajo su dirección, Y tras valorar el trabajo realizado por la aspirante al Título de Doctor, AUTORIZAN: Su presentación y defensa ante el tribunal correspondiente. Barcelona, mayo del 2018 7 Ad astra per alia porci. John Steinbeck 9 AGRADECIMIENTOS A mis directores de tesis, el Dr. Fondevila y el Dr. García Valdecasas. Sin su ayuda, paciencia y ánimo este trabajo no habría sido posible. Su dedicación, desde el principio, ha sido un ejemplo a seguir. A la Dra. Pilar Taurà, mi mentora, tanto durante mi residencia como ya de adjunta. Si no me hubiera incluido en su vorágine de inacabable energía y optimismo, tengo claro que no estaría donde estoy. A la Dra. Amelia Hessheimer, su increíble capacidad de trabajo es casi equiparable a su olfato para detectar las fugas de sevofluorano en el estabulario. Quisiera agradecer la dedicación de muchos colegas del Hospital Clínic: Javier Muñoz, Ángel Ruiz, Lilia Martínez, Jordi Núñez y todo el equipo de coordinación de trasplantes. También agradecer de un modo muy especial la ayuda y consejos del Dr. Ricard Valero, sin el cual seguramente no sería anestesióloga, a la Dra. Carmen Gomar, a la Dra. Graciela Martínez Palli y a la Dra. Anabel Blasi. A mi familia: mis padres, Francesc Vendrell y Àngels Jordà; Marta; Carla; Mireia; Nono; Júlia; Toni; Toni-monkey; Guillem y Roger. A mis abuelos. A Marta. Si empiezo con las bromas, los motivos, y todo lo que conlleva, serían más largos los agradecimientos que la tesis. Lo dejaremos en… ready, habibi? Y en la próxima Alhambra en el Far de la Mola. 10 A Núria, mi clon, que por algún extraño motivo lleva aguantando mis errores y dándome los mejores consejos (que acto seguido ignoro) desde hace 10 años... y me sigue cogiendo el teléfono. Y con ellas, al resto de mis amigos: Cris, María, Juanca, Germán (los CoAs), Guzmán (mi otro padre), Mavi y Melania (el Trirreno), Iván, Patri (marmotassa), Ana, los de la uni, los de Sitges. Y los de Barcelona, esos seres infectos. Si no fuera por todos ellos, habría terminado esta tesis mucho antes. Gracias por perfeccionar conmigo el noble arte del procrastinar. 11 ÍNDICE 12 13 1. RESUMEN ....................................................................................... 17 1.1. Introducción .................................................................................. 19 1.2. Hipótesis ....................................................................................... 22 1.3. Objetivos ....................................................................................... 23 1.4. Material y métodos ....................................................................... 23 1.5. Resultados ..................................................................................... 24 1.6. Discusión ....................................................................................... 26 1.7. Conclusiones ................................................................................. 28 2. INTRODUCCIÓN .............................................................................. 31 2.1. Situación Actual del Trasplante Hepático en España…………………….33 2.2. La Donación en Asistolia ………………………………………………………………34 2.3. La Lesión por Isquemia-Reperfusión…………………………………….………35 2.4. La viabilidad del Injerto del Donante en Asistolia..………………………37 2.5. El uso de Fibrinolíticos en los Injertos Provenientes de Donante en Asistolia………………………………………………………………………………….…………..39 2.6. Patrón de Hiperfibrinolisis en la Parada Cardíaca Extrahospitalaria…………………………………….……………………………………….…40 3. HIPÓTESIS ....................................................................................... 43 14 4. OBJETIVOS ...................................................................................... 47 4.1. Estudio Clínico ............................................................................... 49 1.2. Estudio Experimental .................................................................... 49 5. MATERIAL, MÉTODOS Y RESULTADOS ............................................. 51 5.1. Estudio 1: caracterización tromboelastométrica de las alteraciones de coagulación de los donantes en asistolia tipo 2 ............................... 53 5.2. Estudio 2: análisis del tratamiento con fibrinolíticos o heparina para mejorar la viabilidad de los injertos hepáticos provenientes de donantes en asistolia tipo 2………………………………………………………………………………..63 6. RESULTADOS ................................................................................... 77 7. DISCUSIÓN ...................................................................................... 81 7.1. Estudio 1 ....................................................................................... 83 7.2. Estudio 2 ....................................................................................... 89 8. CONCLUSIONES ............................................................................... 93 9. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................. 97 10. ANEXOS ........................................................................................ 109 10.1. Abreviaturas ............................................................................... 111 10.2. Índice de Figuras ........................................................................ 112 17 RESUMEN 18 19 1. INTRODUCCIÓN 1.1. INTRODUCCIÓN El trasplante hepático es, en la actualidad, el único tratamiento viable para los pacientes con enfermedades hepáticas terminales. Sin embargo, el incremento de las indicaciones de trasplante no se ve equiparado por un incremento en la oferta de órganos. Según datos de la Organización Nacional de Trasplantes, en el año 2016 se trasplantaron la mitad (54.5%) de los pacientes en lista de espera. A pesar de ello, hubo un 3,6% de muertes en lista y un 6.9% de pacientes que fueron retirados de la misma por contraindicación médica o empeoramiento clínico (1). Una de las estrategias globales más efectivas para disminuir la mortalidad en lista incluye el uso de injertos provenientes de donantes llamados ‘no convencionales’, siendo los ‘convencionales’ los injertos completos procedentes de donantes en muerte encefálica (DME). Por donantes no convencionales, nos referimos a los donantes vivos, la bipartición hepática (split liver technique), el trasplante secuencial (dominó) y los donantes en asistolia (DA) (2). Se definen como DA aquellos que sufren una parada cardiorrespiratoria irreversible; y son los que potencialmente más pueden incrementar el número de trasplantes. De acuerdo con la clasificación de Maastricht (3), se pueden definir cuatro tipos de DA. Los DA tipo 1 son aquellos que sufren una parada cardio-respiratoria (PCR) extra hospitalaria, y el potencial donante es trasladado al hospital sin habérsele realizado maniobras de reanimación cardiopulmonar (RCP). En los donantes tipo 2, a diferencia de en los tipo 1, se realizan maniobras de RCP, que son inefectivas. Los DA tipo 3 son aquellos en los que se induce la parada cardíaca (PC) mediante la retirada de soporte ventilatorio, en pacientes que presentan lesión cerebral pero en los que dicha 20 lesión es insuficiente para declarar la muerte encefálica. Finalmente, los DA tipo 4 son aquellos donantes en muerte encefálica que sufren una PCR no prevista. Los tipos 1, 2 y 4 son considerados DA no controlados, mientras que los tipo 3 son los llamados DA controlados. En cualquiera de estos cuatro supuestos, y a diferencia de lo que ocurre en los DME, hay un periodo de parada cardiorrespiratoria previo a la extracción de los órganos. Esto implica que los DA sufren, inevitablemente, un periodo conocido como ‘isquemia caliente’, con una baja perfusión tisular a temperatura corporal (37º). Durante la isquemia, la falta de llegada de oxígeno y metabolitos energéticos a las células conlleva una depleción en los depósitos de adenosín-trifosfato (ATP) intracelular, con fallo de las bombas de iones y, en última instancia, acumulo de sodio y edema celular (4). Por ello, los injertos de DA presentan una peor evolución que los de DME, observándose fundamentalmente un incremento de lesiones biliares no anastomóticas a nivel intra-hepático. El mecanismo fisiopatológico detrás de este cuadro se explica en parte por la mayor susceptibilidad del epitelio biliar a los periodos de isquemia caliente. Una activación del endotelio del plexo peribiliar y la consecuente formación de microtrombos exacerbaría la hipoxia colangiocelular (5,6). La aparición de la colangiopatía isquémica puede acompañarse de complicaciones graves (sepsis, desnutrición) en el contexto de un paciente inmunodeprimido. El tratamiento de la misma mediante radiología intervencionista suele fracasar y conllevar un incremento de los reingresos hospitalarios, siendo en la mayoría de los casos el retrasplante la única opción terapéutica (7). A lo largo de los años se han ido desarrollando diversas técnicas con el fin de mejorar la viabilidad de los órganos que provienen de los DA (8). Una de éstas es la perfusión regional abdominal normotérmica (PRAN). Mediante la oxigenación celular a 37º, no sólo cesa el insulto isquémico, sino que se potencia la recarga energética y la 21 reparación tisular. Es una técnica efectiva para disminuir, en los injertos que han sufrido una isquemia breve, la lesión provocada por una posterior isquemia prolongada (9,10). El Hospital Clínic de Barcelona presenta uno de los programas más activos de obtención de órganos a partir de DA tipo 2 con PRAN, con la serie más amplia publicada de trasplante de hígado. No obstante, la aplicabilidad de este procedimiento es del 10% (11). Una de las causas de esta baja aplicabilidad es la evolución subóptima durante el proceso de extracción del injerto (fases demasiado largas, límites de transaminasas durante la PRAN, o el aspecto macroscópico del hígado en el momento de la extracción). Todas ellas constituyen contraindicaciones relativas para la donación hepática. Durante la PC, se cree que la estasis sanguínea facilita la aparición de microtrombos que no son eliminados incluso cuando el flujo sanguíneo se ve restablecido mediante la PRAN, con lo cual la isquemia continúa a nivel microvascular. Ante dicha hipótesis, el uso de fibrinolíticos se ha postulado como una prometedora estrategia para mejorar la viabilidad de los órganos, al lisarse los trombos y permitir el paso de sangre. Existen estudios en modelos animales en DA controlados en los que la administración de trombolíticos mejoraba la viabilidad del injerto, al conseguir una mejor perfusión del mismo (12,13). En estudios similares realizados en humanos, se redujo la aparición de lesiones biliares intra-hepáticas (14,15) y, a nivel renal, se observaba una mejora de los órganos durante la perfusión, así como de los marcadores enzimáticos (16). Para valorar la efectividad de este tipo de tratamiento en DA no controlados, primero es necesario conocer las alteraciones de la coagulación que se dan en este tipo de donantes. Estudios recientemente realizados en pacientes que han sufrido una PCR recuperada muestran un estado de hiperfibrinolisis mediante tromboelastometría (17,18). Se cree que esto es debido a que, de un modo similar a lo que ocurre en los 22 politraumáticos, la coagulopatía es independiente del grado de lesiones y del consumo de factores de la coagulación, siendo causada en primera instancia por la hipoperfusión tisular (19). La tromboelastometría es una técnica de análisis viscoelástico en sangre total que proporciona información sobre la dinámica de formación, maduración y lisis del coágulo. Se trata de un método de análisis rápido, barato y sencillo que ha adquirido un mayor protagonismo en los últimos años, con la aparición de analizadores de uso más sencillo. Al realizarse en sangre total y a la temperatura del paciente, permite una evaluación más próxima a la realidad de la situación de coagulación del mismo (20). El análisis tromboelastométrico de los DA no controlados nos permite no sólo evaluar de una manera global el estado de coagulación, justificando el uso de fibrinolíticos en este tipo de donantes, sino que también puede ser un parámetro que nos ayude a tomar una decisión más objetiva acerca de la idoneidad de usar un determinado injerto sin comprometer los resultados del trasplante (11,21). 1.2. HIPÓTESIS Las alteraciones de la coagulación que presentan los donantes a corazón parado se correlacionan con el grado de hipoperfusión tisular sufrido durante la parada cardíaca. El uso de fibrinolíticos para tratar los microtrombos formados durante la parada cardíaca puede mejorar el flujo microvascular en injertos procedentes de donantes a corazón parado no controlados. 23 1.3. OBJETIVOS Identificar y caracterizar mediante tromboelastometría las alteraciones de coagulación de los donantes a corazón parado tipo 2 de la clasificación de Maastricht. Determinar si las alteraciones de la coagulación objetivadas en la tromboelastometría se correlacionan con los marcadores de hipoperfusión y viabilidad del injerto. Mediante un estudio experimental en animales, determinar si la administración de fibrinolíticos mejora la viabilidad del injerto. 1.4. MATERIAL Y MÉTODOS En el primer estudio se describen las alteraciones en la coagulación de los DA tipo 2 de la clasificación de Maastricht. Se trata de un estudio prospectivo observacional en el que, durante 18 meses, se han recogido los datos de los potenciales DA llegados al Hospital Clinic de Barcelona. Se recogen las características demográficas del donante, los datos relacionados con las maniobras de resucitación y los tiempos de isquemia. Inmediatamente tras la declaración de muerte, pero antes de la heparinización del potencial donante, se extrae una muestra de sangre con la que se realiza un análisis tromboelastométrico, así como analíticas para medir parámetros relacionados con la función hepática y renal. El segundo estudio es un estudio experimental en un modelo porcino previamente validado de trasplante hepático (22), en el que se ha reproducido la situación clínica del DA. Brevemente, se provoca una parada cardíaca mediante administración de cloruro potásico a cerdos donantes de entre 30 y 35 kg de peso, 24 estratificándose en tres grupos dependiendo de la administración o no de heparina antes de la parada cardíaca, de 60 minutos de duración, y/o fibrinolítico (activador tisular del plasminógeno –tPA-) durante la perfusión regional abdominal normotérmica (PRAN) que se mantiene 60 minutos. Después de realizar la extracción del injerto hepático, éste se almacena en la nevera a 4 C durante 4 horas y entonces se realiza el implante en el receptor, cuya situación clínica es controlada durante 5 días, momento de su eutanasia. En distintos momentos a lo largo del estudio, se realizan extracciones de sangre para monitorizar parámetros analíticos y de tromboelastometría. 1.5. RESULTADOS En el primer estudio, se recogen datos de 62 potenciales donantes, realizándose un análisis tromboelastométrico en 33 de ellos (en los 29 casos restantes no se pudo realizar la tromboelastometría por motivos logísticos). La mayoría proceden de hombres con un IMC (índice de masa corporal) >25. Uno de ellos presentaba trombocitopenia congénita con 66.000 plaquetas al ingreso. Ninguno recibía tratamiento antiagregante; uno recibía tratamiento con acenocumarol por fibrilación auricular. Las maniobras de RCP avanzada se mantuvieron durante una mediana de 1 hora, y la muestra para tromboelastometría, fue extraída aproximadamente a los 90 minutos post-parada (rango 48-127 minutos). En la analítica al ingreso, se observan niveles de hemoglobina y hematocrito dentro de la normalidad, con plaquetas en el límite inferior. Los tiempos de protrombina y tiempo de cefalina se encuentran alargados, indicando coagulopatía, con niveles de fibrinógeno dentro del rango de normalidad. De los 33 potenciales donantes, se trasplantaron 22 riñones y 5 hígados. 25 El análisis tromboelastométrico de los potenciales donantes muestra un patrón de hipocoagulabilidad en todos ellos, con un tiempo de formación alargado y una firmeza disminuida. Así mismo, todos los potenciales donantes muestran un patrón de hiperfibrinolisis, fulminante en 26 casos e intermedia en los 7 restantes. No se encuentra correlación entre el grado de lisis a los 30 minutos y la duración de las maniobras de RCP o el tiempo desde la parada cardíaca hasta la extracción de la muestra. Sí se ve una correlación inversa entre el grado de lisis a los 30 minutos y el pico de transaminasas (aspartato aminotransferasa –ASAT- y alanina aminotransferasa –ALAT-). En el segundo estudio, durante la PRAN se observa una mejoría en los flujos de bomba de perfusión, flujo arterial y flujo portal en aquellos animales que recibieron heparina pre-parada frente a aquellos animales que no la recibieron. No se observan diferencias en el grupo en el que se administró tPA en comparación con el grupo control. Durante el seguimiento, la supervivencia a los 5 días es del 83% en los grupos 1 y 2 (en los que no se administró heparina), y del 100% en el grupo 3 (al que se administró heparina antes de la PCR). Los grupos 1 y 2 presentan unos niveles más elevados de transaminasas (ASAT) y más bajos de tiempo de protrombina (TP) durante las primeras 72 horas del seguimiento, en comparación con el grupo 3. Durante el seguimiento, los niveles de gammaglutamil transferasa (GGT) y fosfatasa alcalina (FA) también se mantienen más bajos en el grupo 3, aunque esta diferencia no alcanza significación estadística. El análisis histológico permite observar la progresión de la lesión tisular a lo largo de las distintas fases del estudio. La lesión por isquemia-reperfusión es menor en aquellos animales pre-tratados con heparina, con una menor alteración de la arquitectura biliar, arteriolonecrosis y lesión de las glándulas peribiliares. En ninguno de los grupos se observan depósitos de fibrina significativos. 26 En cuanto a la expresión de los marcadores de activación endotelial e inflamación, hay una menor expresión de E-selectina, TNF e IL1-β en los animales que recibieron heparina, en el análisis realizado después de la reperfusión y durante el seguimiento; en comparación con los grupos que no recibieron heparina. El uso de tromboelastometría a lo largo del estudio sirvió para evaluar la correcta dosificación de tPa en el grupo 2, y de heparina en el grupo 3. 1.6. DISCUSIÓN El hallazgo más interesante del primer estudio es la observación de un patrón de hiperfibrinolisis en todos los potenciales donantes a corazón parado. A su llegada a nuestro hospital, el 100% de los potenciales DA presentaban un patrón de hiperfibrinolisis por tromboelastometría. Esto se asemeja a los resultados de los estudios de Viersen (17) y Schöchl (18), en los que se realizaron tests viscoelásticos en pacientes que sufrieron una parada cardíaca recuperada. Dicha hiperfibrinolisis podría atribuirse al hecho de que, en las situaciones de perfusión tisular inadecuada, se incrementa la secreción de trombomodulina endotelial que, en última instancia, causa un incremento del paso de plasminogeno a plasmina (23-27). Así mismo, la propia hipoxia y la secreción de catecolaminas incrementan la secreción de tPA endotelial (28-30). Todo ello conllevaría un estado de hiperfibrinolisis que no justifica el uso terapéutico de fibrinolíticos en los DCP. Los estudios que hasta este momento se han publicado, defendiendo el uso de fibrinolíticos en los hígados de DCP (14)(15) presentan importantes limitaciones metodológicas que ponen en duda la recomendación de este tratamiento. En el segundo estudio, destaca el hecho de que no hubo diferencias en cuanto a la calidad del injerto hepático, tanto durante la fase de PRAN como durante los 5 días de seguimiento, en los hígados provenientes de cerdos que habían recibido tPA en 27 comparación con los controles. Así mismo, el análisis histológico realizado sobre el tejido hepático tras 60 minutos de parada cardíaca no mostró depósitos significativos de fibrina en ninguno de los grupos. Esto se asemeja a los recientes resultados publicados por Verhoeven (31), en los que sólo se encontraron evidencias histológicas de microtrombos en 2 de 63 (3.2%) biopsias hepáticas de DCP. En otro estudio realizado por Op den Dries et al. (32) sólo se encontraron microtrombos en un 2.7% de los hígados que habían desarrollado colangiopatía isquémica. Las únicas características histológicas que se asociaron a la aparición de estenosis biliar son la lesión de las glándulas peribiliares profundas y del plexo peribiliar, y la necrosis del estroma mural. Todo ello, de nuevo, no justifica la estrategia de administrar fibrinolíticos cuando se utilicen este tipo de injertos. En el estudio de Viersen (17), la fibrinolisis se correlaciona con el tiempo de isquemia caliente y ésta, a su vez, podría correlacionarse con la viabilidad del injerto, aunque nuestro estudio no mostró resultados concluyentes en este aspecto. Por otro lado, la heparina administrada antes de la parada cardíaca favoreció la realización de la PRAN al mejorar el flujo de la bomba, permitiendo conseguir unos mejores flujos a nivel de la arteria hepática y la vena porta. Todo ello repercutió en una mejora en la viabilidad del injerto durante el seguimiento (menor pico de transaminasas, mayor TP), con menos signos de alteración de la arquitectura tisular (menor necrosis tisular, epitelio biliar conservado) y menor pico de marcadores de lesión endotelial (E-selectina) e inflamación tisular (TNF, IL1-β). El efecto protector de la heparina no sólo se debería a la reducción de la trombogénesis (33), sino a su importante actividad anti-inflamatoria, efecto éste independiente a su actividad anticoagulante (34). La ausencia de depósitos de fibrina en el tejido hepático después de la parada cardíaca, y el hecho de que el tratamiento con un agente fibrinolítico sea inefectivo 28 para mejorar la viabilidad del injerto hepático, ponen en entredicho la utilidad de este tratamiento. El uso de heparina antes de la parada cardíaca parece ser la mejor estrategia para mejorar la efectividad de la PRAN y, por tanto, la calidad del injerto hepático antes de su extracción y su funcionamiento post-trasplante. 1.7. CONCLUSIONES Los injertos hepáticos procedentes de donación en asistolia tienen una menor viabilidad que los procedentes de donantes en muerte encefálica, con una mayor incidencia de estenosis biliar debidas a isquemia. El hecho de que estas complicaciones biliares sean debidas a la formación de microtrombos en el plexo peribiliar puede ponerse en entredicho, dado que no se ha demostrado la existencia de los mismos tras parada cardíaca, ni una mayor incidencia de trombos en aquellos injertos que desarrollan estenosis biliares de origen isquémico frente aquellos injertos que no las desarrollan. Además, en los donantes en asistolia se desarrolla un estado en el que, debido a la hipoperfusión, se estimula la fibrinólisis endógena. Dicha fibrinólisis se estimula a través de la cascada de la proteína C y la secreción de tPA, y se relaciona directamente con el tiempo de isquemia caliente. Por lo tanto, la fibrinólisis medida por tromboelastometría podría correlacionarse con el grado de viabilidad del injerto, y constituir un marcador indirecto de su calidad. Por otro lado, la administración de heparina antes de la parada cardíaca ha demostrado su utilidad para mejorar tanto la calidad del injerto durante la PRAN como su viabilidad postoperatoria. 29 En cualquier caso, no se justifica en el momento actual el uso de fibrinolíticos para la prevención de la aparición de estenosis biliares isquémicas en los injertos provenientes de un donante a corazón parado. 31 INTRODUCCIÓN 32 33 2. INTRODUCCIÓN 2.1. Situación Actual del Trasplante Hepático en España El trasplante hepático es, en la actualidad, el único tratamiento viable para los pacientes con enfermedades hepáticas terminales. Según datos de la Organización Nacional de Trasplantes, en el año 2016 se trasplantaron la mitad (54.5%) de los pacientes en lista de espera, datos similares a los registrados en los años anteriores. No obstante, hubo un 3,6% de muertes en lista, y un 6.9% de los pacientes fueron retirados de la misma por contraindicación médica o empeoramiento clínico (1). Estos datos se asemejan a los datos europeos (35) y estadounidenses (36). Aunque a lo largo de los años y gracias a los avances médico-quirúrgicos se trasplantan más pacientes, también incrementa el número de pacientes con indicación de trasplante, y persiste la diferencia entre el número de pacientes pendiente de ser trasplantado y la oferta de órganos. Una de las estrategias globales más efectivas para incrementar la oferta de órganos y disminuir la mortalidad en lista de espera incluye el uso de injertos convencionales con criterios ampliados (denominados ‘subóptimos’), y de injertos no convencionales. Mientras que los injertos convencionales son aquellos injertos completos procedentes de donantes en muerte encefálica (DME), por no convencionales nos referimos a los procedentes de donantes vivos, a los generados tras bipartición hepática (split liver technique), al trasplante secuencial (dominó) y a los donantes en asistolia (DA) (2). Durante el año 2016, del total de 1159 trasplantes hepáticos realizados en España, un 14.6% (169) fueron trasplantes de donantes no convencionales, y de éstos un 80% provenía de donantes en asistolia (Figura 1) (1). La donación proveniente de 34 DA en España ha incrementado notablemente a lo largo de los últimos años, y de forma casi exponencial en los últimos tres años (37). Figura 1.- Número de trasplantes hepáticos procedentes de donante convencional (donante en muerte encefálica) y donante no convencional (aistolia, dominó, split, vivo) realizados en España en el 20161. 2.2. La Donación en Asistolia Los DA son aquellos donantes que sufren una parada cardiorrespiratoria irreversible. De acuerdo con la clasificación de Maastricht, se pueden definir cuatro tipos de DA (3,38, (39): Los DA tipo 1 son aquellos que sufren una parada cardíaca (PC) extra- hospitalaria, y el potencial donante es trasladado al hospital sin habérsele realizado maniobras de reanimación cardiopulmonar (RCP). En estos casos, se acepta la donación de tejidos. En los DA tipo 2, a diferencia de en los tipo 1, se realizan maniobras de RCP, que son inefectivas. Estos donantes, considerados como DA no controlados, son los que potencialmente más pueden incrementar el número de trasplantes. 1 Figura obtenida de la memoria anual de donación de la Organización Nacional de Trasplante de España. Electronic http://www.ont.es/infesp/Memorias/Memoria%20Hep%C3%A1tico%202016.pdf 35 Los DA tipo 3, o controlados, son aquellos en los que se induce la PC mediante la retirada de soporte ventilatorio tras obtener el consentimiento de la familia, en pacientes que presentan lesión cerebral pero en los que dicha lesión es insuficiente para declarar la muerte encefálica. Los DA tipo 4 ocurren en aquellos casos excepcionales en los que un donante en muerte encefálica sufre una PC no prevista tras la declaración de muerte encefálica, previa a la extracción de los órganos. Los donantes tipos 1, 2 y 4 son considerados DA no controlados, mientras que los tipo 3 son DA controlados. En los últimos años el número de DA en España se ha incrementado de forma significativa, sobre todo a expensas de los DA controlados (37). La diferencia fundamental entre los DA y los DME estriba en que en los primeros existe un periodo de parada cardiorrespiratoria (PCR) previo a la extracción de los órganos. Durante este periodo se produce una importante hipoperfusión tisular mientras se mantiene la temperatura corporal (37ºC), lo que se conoce como “tiempo de isquemia caliente”, que deteriora la calidad del injerto hepático y cuya duración determina la viabilidad o posibilidad de trasplante de estos injertos (40). 2.3. La Lesión por Isquemia-Reperfusión La lesión por isquemia-reperfusión (IR) es aquella que se da en un órgano cuando sufre un cese en el aporte sanguíneo con una posterior reinstauración del mismo. Dicha lesión conlleva una fisiopatología compleja, en la que participan factores moleculares y celulares, y que fundamentalmente se basa en una respuesta inflamatoria excesiva (41-46). 36 Durante la isquemia, la falta de llegada de oxígeno y metabolitos energéticos a las células conlleva una lesión celular directa, por incremento del metabolismo anaerobio, con oxidación de los componentes celulares y peroxidación lipídica. Por depleción en los depósitos de adenosín-trifosfato intracelular, hay fallo de las bombas de iones, acúmulo de calcio y sodio, y edema mitocondrial y celular. Además, se activa la transcripción de genes inflamatorios, y la activación del sistema inmune (4,47). Posteriormente y durante la fase de reperfusión, la lesión incrementa. Los radicales libres de oxigeno (RLO) generados ya desde la fase de isquemia causan lesión directa a nivel de la célula hepática y endotelial, con destrucción de la microvasculatura. Dichos RLO también estimulan las células de Kupffer, que generan citoquinas pro- inflamatorias como el TNF-α y la IL1- β, y quimiocinas como el CXC, que en última instancia promueven la activación, acúmulo y transmigración de los neutrófilos a través de un endotelio previamente lesionado (4,41,43,48), (Figura 2). Figura 2.- Mecanismo de isquemia-reperfusión hepática 2 . La lesión por isquemia caliente será mayor cuanto más largo sea el tiempo de la misma. Existen diversos estudios en los que se demuestran los cambios morfológicos 2 Extraído de Fondevila C, Busuttil RW, Kupiec-Weglinski JW. Hepatic ischemia/reperfusion injury—a fresh look. Experimental and Molecular Pathology, 2003; 74(2), 86–93. 37 que se dan a nivel tisular, con distintos niveles de degeneración y desestructuración cuanto mayor es el tiempo de isquemia caliente (21,49,50). 2.4. La viabilidad del Injerto del Donante en Asistolia En los injertos procedentes de DA, se observa un incremento de complicaciones a nivel de la vía biliar. Se trata fundamentalmente de lesiones de origen isquémico. La colangiopatía isquémica (CI) se define como una lesión o estenosis biliar intra o extra- hepática, no anastomótica, encontrándose la arteria hepática indemne (51). La incidencia descrita de CI oscila entre un 25-60% en los injertos de DA, en comparación con 10-30% en los injertos de DME (51). El mecanismo fisiopatológico detrás de la CI, y su mayor incidencia en los injertos procedentes de DA, se explica en parte por la mayor susceptibilidad del epitelio biliar a los periodos de isquemia caliente (5). En esta fase se dan también alteraciones de la microvasculatura. Existen estudios que consideran que dichas alteraciones microvasculares incluyen la aparición de microtrombos, que a su vez exacerbarían la hipoxia colangiocelular en el momento de la reperfusión (5,6). En cualquier caso, durante la fase de reperfusión la mayor sensibilidad del colangiocito a ésta provocará lesiones a nivel del citoesqueleto (41). En un estudio realizado por Op den Dries et al. (32), se analizó el papel de las glándulas peribiliares en el desarrollo de la CI, dado que en dichas glándulas se hallan las células progenitoras que contribuyen a la regeneración del epitelio biliar. Las alteraciones histológicas asociadas con la aparición de CI fueron la lesión de las glándulas peribiliares, el plexo vascular peribiliar, y la necrosis del estroma mural. Cuando de comparaban los injertos de DA versus los de DME, se vio que había una mayor lesión del plexo vascular peribiliar en los injertos de DA. La aparición de CI no afecta a nivel de la supervivencia de los receptores, pero sí hay una peor supervivencia de los injertos procedentes de DA en comparación con 38 los injertos procedentes de DME (52,53). En el estudio retrospectivo de Maheshwari et al (7), se analizaron los trasplantes realizados en el hospital John Hopkins entre marzo de 1997 y marzo del 2006; objetivándose un 15.5% de complicaciones biliares en los injertos procedentes de DME, vs un 60% en los injertos de DA; y un 40% de pérdida del injerto al año del trasplante, en el caso de los DA. Las complicaciones asociadas a CI pueden llegar a ser graves (sepsis, desnutrición) en el contexto de un paciente inmunodeprimido. El tratamiento de la misma mediante radiología intervencionista suele fracasar y conllevar un incremento de los reingresos hospitalarios, siendo en la mayoría de los casos, el retrasplante la única opción terapéutica (7,54). A lo largo de los años se han ido desarrollando diversas técnicas con el fin de mejorar la viabilidad de los órganos que provienen de los DA (8). Una de éstas es la perfusión regional abdominal normotérmica (PRAN). Mediante la oxigenación celular a 37º, no sólo cesa el insulto isquémico, sino que se potencia la recarga energética y la reparación tisular. Es una técnica efectiva para disminuir, en los injertos que han sufrido una isquemia breve, la lesión provocada por una posterior isquemia (fría) prolongada (9,10). El Hospital Clínic de Barcelona presenta uno de los programas más activos de obtención de órganos a partir de DA tipo 2 con PRAN, con la serie más amplia publicada de trasplante de hígado (55). No obstante, la aplicabilidad de este procedimiento es del 10% (11). Una de las causas de esta baja aplicabilidad es la evolución subóptima durante el proceso de extracción del injerto (fases demasiado largas, límites de transaminasas durante la PRAN, o el aspecto macroscópico del hígado en el momento de la extracción). Todas ellas constituyen contraindicaciones relativas para la donación hepática. Con el fin de poder estudiar mejor las alteraciones que se dan a este nivel, y los posibles tratamientos, desde mediados de los años 90 en nuestro hospital se realizan estudios pre-clínicos de trasplante hepático en animal grande (modelo porcino) (22). 39 2.5. El uso de Fibrinolíticos en los Injertos Provenientes de Donantes en Asistolia Se considera que durante el periodo de isquemia caliente la estasis sanguínea facilita la aparición de microtrombos que no son eliminados incluso cuando el flujo sanguíneo se ve restablecido, con lo cual la isquemia continua a nivel microvascular. Ante dicha hipótesis, el uso de fibrinolíticos se postuló como una prometedora estrategia para mejorar la viabilidad de los órganos, al lisarse los trombos y permitir el paso de sangre (56-58). Para corroborar dicha hipótesis, se realizaron estudios pre- clínicos en animal grande, en los que se reproducían modelos de DA controlados y se administraban trombolíticos (12,13). En estos estudios se observó que la administración de trombolíticos mejoraba la viabilidad del injerto, con mejor perfusión del mismo. Un primer estudio en humanos realizado el año 2003 valoraba la mejor calidad de los injertos renales procedente de DA (controlados y no controlados), a los que se administraba estreptoquinasa post PCR. Se observó una menor tasa de desestimación del injerto en el grupo tratado con fibrinolítico (16). En el año 2010, Hashimoto et al. (14) realizaron un primer estudio en el que se administró activador tisular del plasminógeno (tPa) en injertos hepáticos procedentes de DA controlados, a nivel de la arteria hepática. Sólo 2 de los 22 casos a estudio presentaron lesiones biliares intra- hepáticas, con un 9% de incidencia de colangiopatía isquémica (en comparación con el hasta 60% descrito en las series históricas (7). Posteriormente, en el año 2015 el grupo de Seal et al. (15) realizó un estudio similar en injertos hepáticos provenientes de DA controlados, a los que se administraba tPa previo a la reperfusión portal. En el grupo al que se administró dicho tratamiento, se objetivó una menor incidencia de alteraciones biliares, y una mayor supervivencia al año y a los tres años. 40 2.6. Patrón de Hiperfibrinolisis en la Parada Cardíaca Extra-Hospitalaria Paralelamente a la publicación de los estudios de Hashimoto (14) y Seal (15), se publicaron una serie de estudios en los cuales se analizaba el patrón tromboelastométrico de los pacientes que sufrían una PC extra-hospitalaria (PCEH) (17,18). La tromboelastometría es una técnica de análisis viscoelástico en sangre total, que proporciona información sobre la dinámica de formación, maduración y lisis del coágulo. Se trata de un método de análisis rápido, barato y sencillo que ha adquirido un mayor protagonismo en los últimos años, con la aparición de nuevos analizadores de más fácil uso. Al realizarse en sangre total y a la temperatura del paciente, permite una evaluación más próxima a la realidad de la situación de coagulación del mismo (20). En los estudios realizados por de Viersen (17) y Schöchl (18), se observó un patrón de hiperfibrinolisis de aparición relativamente inmediata. La hiperfibrinolisis mediante tromboelastometría se define cuando la lisis del coágulo con respecto a su máxima amplitud -ML- es superior al 15%, y en todos los pacientes recogidos se observó dicha situación, en grado más o menos fulminante (Figura 3). Figura 3.- análisis tromboelastométrico de pacientes con PCEH en los cuales se extrajo la muestra ‘in situ’. En todos los casos se observó hiperfibrinolisis, siendo ésta fulminante (a, MCF <50mm); intermedia (b, MCF >50 mm pero con lisis precoz) o tardía 3. 3 Extraído de Schöchl H, Cadamuro J, Seidl S, Franz A, Solomon C, Schlimp CJ, and Ziegler B. Hyperfibrinolysis is common in out-of-hospital cardiac arrest: results from a prospective observational thromboelastometry study. Resuscitation, 2013; 84(4), 454–459. 41 Asimismo, la severidad de la fibrinólisis parece relacionarse con el grado de hipoperfusión tisular, puesto que en el estudio de Viersen (17) se observó una correlación inversa entre la velocidad de lisis del coágulo (lysis onset time –LOT-) y el exceso de base, el tiempo de RCP y el nivel de lactatos. Se cree que esto es debido a que, igual que en la coagulopatía del traumático, ésta es independiente del grado de lesiones y del consumo de factores de la coagulación, y viene causada en primera instancia por la hipoperfusión tisular (19), que favorece la lisis de cualquier trombo que se pueda haber generado. Pensamos que la utilización del análisis tromboelastométrico puede ser útil como herramienta para conocer el estado de viabilidad del injerto en los DA no controlados y, de este modo, ayudarnos en la toma de decisiones respecto a aceptar o rechazar dicho injerto para trasplante. Además, los resultados de dicho análisis nos permitirían valorar la utilidad del uso de agentes fibrinolíticos para el tratamiento de trombos en la microcirculación hepática que pueden determinar la aparición de complicaciones biliares. 43 HIPÓTESIS 44 45 3. HIPÓTESIS La hipótesis de este estudio es doble: - Las alteraciones de la coagulación que presentan los donantes a corazón parado se correlacionan con el grado de hipoperfusión sufrido durante la parada cardíaca. - El uso de fibrinolíticos para tratar los microtrombos formados durante la parada cardíaca puede mejorar el flujo microvascular en injertos procedentes de donantes a corazón parado no controlados. 47 OBJETIVOS 48 49 4. OBJETIVOS 4.1. ESTUDIO CLÍNICO 1) os donantes en asistolia tipo 2 de la clasific . 2) viabilidad del injerto. 4.2. ESTUDIO EXPERIMENTAL 3) Determinar si la administración de fib y los resultados post-trasplante 51 MATERIAL, MÉTODOS Y RESULTADOS 52 53 5. MATERIAL, MÉTODOS Y RESULTADOS 5.1. ESTUDIO 1 (CLÍNICO): CARACTERIZACIÓN TROMBOELASTOMÉTRICA DE LAS ALTERACIONES DE LA COAGULACIÓN EN LOS DONANTES EN ASISTOLIA TIPO 2 A lo largo de 18 meses se recogieron datos de todos los potenciales donantes en asistolia tipo 2 de la clasificación de Maastricht llegados a nuestro hospital. De los 62 potenciales donantes, finalmente se analizan datos de 33 DA. Se recogen datos demográficos, tiempos de resucitación cardiopulmonar, parámetros de laboratorio y análisis tromboelastométrico, así como de resultados en aquellos injertos trasplantados (de hígado y de riñón). Una descripción detallada de dichos datos, así como de su análisis y resultados, queda recogido en el primer artículo de esta tesis, Vendrell M, Hessheimer AJ, Ruiz A, de Sousa E, Paredes D, Rodríguez C, Saavedra S, Fuster J, Alcaraz A, Oppenheimer F, Taurá P, García-Valdecasas JC, and Fondevila C. Coagulation Profiles of Unexpected DCDD Donors Do Not Indicate a Role for Exogenous Fibrinolysis. American Journal of Transplantation, 2015; 15(3), 764–771. 54 Coagulation Profiles of Unexpected DCDD Donors Do Not Indicate a Role for Exogenous Fibrinolysis M. Vendrell1, A. J. Hessheimer2, A. Ruiz3, E. de Sousa4, D. Paredes3, C. Rodrı´guez3, S. Saavedra3, J. Fuster2, A. Alcaraz5, F. Oppenheimer4, P. Taura´1, J. C. Garcı´a-Valdecasas2 and C. Fondevila2,* 1Anesthesiology, Hospital Clı´nic, University of Barcelona, Barcelona, Spain 2General and Digestive Surgery, Institut de Malalties Digestives i Metabo`liques (IMDiM), Hospital Clı´nic, CIBERehd, IDIBAPS, University of Barcelona, Barcelona, Spain 3Transplant Coordination, Hospital Clı´nic, University of Barcelona, Barcelona, Spain 4Nephrology, Hospital Clı´nic, University of Barcelona, Barcelona, Spain 5Urology, Hospital Clı´nic, University of Barcelona, Barcelona, Spain Corresponding author: Constantino Fondevila, cfonde@clinic.ub.es It has been suggested that vascular stasis during cardio- circulatory arrest leads to the formationofmicrovascular thrombi and theviability of organsarising fromdonation after circulatory determination of death (DCDD) donors may be improved through the application of fibrinolytic therapy. Our aim was to comprehensively study the coagulation profiles of Maastricht category II DCDD donors in order to determine the presence of coagula- tion abnormalities that could benefit from fibrinolytic therapy. Whole blood from potential DCDD donors suffering out-of-hospital cardiac arrest was sampled after declaration of death in the emergency department, and rotational thromboelastomeric analysis was per- formed. Between July 2012 and December 2013, sam- ples from 33 potential DCDD donors were analyzed. All patients demonstrated hyperfibrinolysis (HF), as re- flected by maximum clot lysis of 98–100% in all cases, indicating that there is no role for additional fibrinolytic therapy in this setting. Aswell,weobserved correlations between thromboelastomeric lysis parameters and maximum hepatic transaminase levels measured in potential donors and renal artery flowsmeasuredduring ex situ hypothermic oxygenated machine perfusion, indicating that further studies on the utility of throm- boelastometry to evaluate organ injury and perhaps even viability in unexpected DCDD may be warranted. Abbreviations: aPTT, activated partial thromboplastin time; BMI, body mass index; CFT, clot formation time; CPR, cardiopulmonary resuscitation; CT, clotting time; DBD, donation after brain death; DCDD, donation after circulatory determination of death; DGF, delayed graft function; EMS, emergencymedical services; HF, hyper- fibrinolysis; HMP, hypothermic pulsatile machine perfusion; IC, ischemic cholangiopathy; IGF, immedi- ate graft function; INR, international normalized ratio; LOT, lysis onset time; LY30, lysis index at 30min; MCF, maximum clot firmness; ML, maximum lysis; NRP, normothermic regional perfusion; OHCA, out-of- hospital cardiac arrest; PAI-1, plasminogen activator inhibitor-1; PNF, primary non-function; RAF, renal artery flow; RARI, renal artery resistive index; TPA, tissue plasminogen activator Received 06 August 2014, revised 08 October 2014 and accepted for publication 11 October 2014 Introduction Given the current situation of solid organ donation in which the donor pool continually fails to meet demands, alterna- tive sources of organs are continuously sought. One such source that in theory offers considerable promise to increase the number of transplantable organs but in practice has yet to come close to meeting its supposed potential is that of donation after circulatory determination of death (DCDD). The traditional Maastricht classification describes four categories of DCDD donors; for practical purposes, however, there are really only two: those who suffer sudden an unexpected cardiac arrest, typically outside the hospital (corresponding to Maastricht category II), and thosewith significant neurological injury in whom an expected cardiac arrest occurs after the intentional removal of ventilatory support (Maastricht category III) (1,2). Rela- tively few organs are transplanted from DCDD donors— unexpected donors, in particular—relative to donation after brain death (DBD) donors out of justifiable concerns over their viability due to the prerecovery period of cardiac arrest they suffer (3–5). During cardiac arrest, red cell stasis and systemic ischemia provoke activation of the inflammatory cascade, tissue factor release, and thrombin generation (6). Furthermore, evidence suggests that endogenous fibrinolysis may be impaired in this setting (7,8), leading to the formation of thrombi in end-organ microvasculature. It has been suggested that this microvascular thrombosis is the reason American Journal of Transplantation 2015; 15: 764–771 Wiley Periodicals Inc. C Copyright 2015 The American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons doi: 10.1111/ajt.13058 55 DCDD kidneysmore frequently fail viability testing, thereby resulting in a higher discard rate relative to DBD donors (4,9), and why the incidences of vascular and biliary complications, namely ischemic cholangiopathy (IC), among DCDD livers are greater (10,11). Following this line of logic, several authors have suggested that the viability of organs arising from DCDD donors, especially those suffering unexpected arrest, may be improved through the application of fibrinolytic therapy (11–14). Traditional coagulation assays (prothrombin time/INR, acti- vated partial thromboplastin time, fibrinogen levels, platelet function studies, etc.) are not performed on whole blood and, therefore, do not take into account the critical interactions between plasma and platelets and cells in clotting. Viscoelastic coagulation assays such as thromboe- lastometry (ROTEM1, Tem Innovations GmbH, Munich, Germany), on the other hand, do use whole blood and measure the entire coagulation process from initial activation of the coagulation cascade to formation of the platelet plug to fibrin crosslinking and, finally, fibrinolysis (15). They provide a complete picture of the balance between thrombosis and lysis, something that standard tests do not. Using viscoelas- tic methods, recent reports have shown that patients with sudden and unexpected out-of-hospital cardiac arrest (OHCA) may actually suffer from hyperfibrinolysis, not hypercoagulability, as reports based on traditional coagula- tion tests suggest (16,17). Hence, the objective of the present work is to use thromboelastometry to comprehen- sively study the coagulation profiles of potential unexpected DCDD donors in order to determine whether exogenous fibrinolytic therapymight actually be of benefit in this setting. Patients and Methods Clinical protocol Out-of-hospital cardiac arrest iswitnessed, and basic life supportmaneuvers are initiated. Emergency medical services (EMS) are mobilized to the scene of the arrest, where advanced cardiopulmonary resuscitation (CPR), including endotracheal intubation, is performed. A person may be considered a potential DCDDdonorwhen, after performing the resuscitation maneuvers specified in the most current guidelines (18), these maneuvers are ineffective (19). If the person fulfills basic donor criteria (age 65 years, no history of criminality or violent death), transplant coordinators are notified about the pending arrival. The patient is then placed on a LUCASTM chest compression system (Jolife AB, Lund, Sweden) and routed to our center. In the emergency department, ventilation and chest compressions are withheld so that death may be diagnosed based on the absence of cardiac function and spontaneous respirations during a no-touch period of at least 5min (20). After the declaration of death, transplant coordinators have their first contact with the potential donor. The endotracheal tube is connected to a ventilator, LUCASTM is restarted, and the initial blood sample is taken (sample upon which thromboelastomeric analysis is performed). Subse- quently, heparin is administered (3mg/kg i.v.) and the surgical team called to perform bilateral femoral cannulation for the initiation of normothermic regional perfusion (NRP), as described previously (2,5). Blood is sampled at the start of NRP and then hourly to evaluate biochemical, hematological, and gasometric parameters. Temperature during NRP is maintained 35.5– 37.58C, pH 7.0–7.4 with the addition of bicarbonate, and hematocrit 21% with the addition of packed red blood cells. Additional heparin (1.5mg/kg) is empirically given every 90min. Simultaneous with restarting chest compressions after the declaration of death, the potential donor’s next-of-kin is contacted for information and consent. Contraindications to donation include a history of alcohol abuse or liver disease; biological risk factors, including intravenous drug abuse; cancer; andhepatitisB virus, hepatitisC virus orHIV infection. Trauma to the abdominal or femoral vasculature preventing the use of NRP also precludes donation. Other contraindications to donate are based on the donor’s evolution (5). If no contraindications are encountered, organ recovery is performed. At our center, only kidneys and livers are recovered from unexpected DCDD donors. The final decision to transplant a DCDD kidney depends on a step- wise evaluation of various criteria, including donor age and co-existing risk factors (diabetes, hypertension, tobacco); previous serum creatinine <2.5mg/dL; ultrasound description, when available; macroscopic aspect at organ recovery (normal vs. congested); and the aspect of the renal microvasculature (size and number of arteries and absence of significant atheromatous plaques or other abnormalities). In donors >60 years or with cardiovascular risk factors, a renal biopsy score based on modified Remuzzi criteria (21,22) is evaluated; kidneys with a score of 0–3 are considered for transplant, while those with a score of 4 are evaluated using ex situ hypothermic pulsatile machine perfusion (HMP; RM3, Waters Medical Systems1, IGLGroup, Rochester,MN) and thosewith a score of 5 or greater are discarded. In kidneys undergoing HMP, renal artery flow (RAF) must be >70mL/min and resistive index (RARI) <0.4 after 6 h with a progressive increase in systolic pressure from 20 up to 35mmHg. Livers are evaluated as described previously (5). ROTEMW analysis ROTEM1 analysis is performed on the initial blood sample taken right after the declaration of death and is analyzed within an hour of sampling. According to the literature, blood samples are stable for ROTEM analysis for up to 6 h after sample draw (23). Whole blood is activated extrinsically with recombinant tissue factor (EXTEM reagent) or intrinsically with ellagic acid (INTEM reagent) and the analysis run for at least 60min. Additional assays are performed to assess fibrinolysis through its inhibition with aprotinin (APTEM test) (24). For each analysis, a graph is created plotting time in minutes (x-axis) versus clot amplitude in millimeters (y-axis), and several different parameters of coagulation and lysis are measured. Clotting time (CT) is measured from the addition of the starting reagent to the formation of a clot with an amplitude of 2mm. Clot formation time (CFT) is the time from the end of CT until an amplitude of 20mm is reached, while alpha angle is the angle between the x-axis and the line tangential to the curve at the 2-mm amplitude; both are measures of the speed of clot strengthening. Maximum clot firmness (MCF) is the maximum amplitude of the clot, while maximum lysis is themaximumpercentage of amplitude lost relative toMCF (normal <15%, >15% indicating hyperfibrinolysis [HF]). The lysis index at 30min (LY30) is the ratio of the amplitude at 30min relative to MCF (normal 94–100%). Lysis onset time (LOT) is the time point after MCF when a 20% reduction in amplitude is produced (normally never reached) (15,17). Hyperfibrinolysis is characterized as fulminant when clot lysis occurs within 30min in the INTEM and EXTEM tests or when there is no clot formation, with recovery of clot formation in the APTEM test; intermediate when clot breakdown occurs between 30 and 60min; and late when clot breakdown occurs after 60min (24). Data and statistical analysis Donor demographic information; electrocardiographic findings at the scene and the timing of events from cardiac arrest to death; blood-based analytical Coagulation Profiles of Unexpected DCDD Donors American Journal of Transplantation 2015; 15: 764–771 56 and thromboelastomeric parameters; and donor outcomes (organs trans- planted, initial graft function, etc.) are recorded. Continuous variables are presented as the median and the 25–75% interquartile range, unless otherwise specified. Differences between groups are compared using the Mann–Whitney test for continuous variables. Bivariate correlations are evaluated using Kendall’s tau b correlation test. p-Value of <0.05 is considered statistically significant. Data is analyzed using IBM1 SPSS1 Statistics version 20 (IBM, Somers, New York). Institutional approval This protocol was approved by the Hospital Clı´nic Institutional Ethics Committee (1998/210). Results Demographic and clinical data Between July 2012 and December 2013, 62 potential DCDD donors were evaluated at our center; ROTEM1was performed on the initial blood sample in 33 cases. In the remaining 29 cases, the blood sample could not be analyzed within an hour of sampling due to logistical problems and was therefore discarded. Variables related to the potential donor and the events surrounding cardiac arrest are provided in Table 1. (Of note, these variables did not vary significantly from those of the 29 potential DCDD donors from the same time period who did not have ROTEM1 analysis performed.) An overwhelmingmajority of potential donors were men and, on average, overweight. Slightly over half of the patients had a personal history of tobacco use, and approximately one quarter had a history of arterial hypertension. None of the potential donors in the series were taking anti-platelet medication, though one did have congenital amegakaryocytic thrombocytopenia, with a platelet count upon arrival to the emergency room of 66109/L. Also, one potential donor was taking a vitamin K antagonist (acenocoumarol) for atrial fibrillation. Time from arrest to EMS arrival was less than 15min in all but eight cases. While waiting for EMS to arrive, CPR was initiated by a bystander in almost half of the cases, and the cardiac rhythm detected upon EMS arrival was asystole in approximately two thirds. Advanced CPR was performed for an hour (median), and the initial blood sample upon which ROTEM1 analysis was performed was drawn approximately an hour and a half after cardiac arrest (range: 48–127min). Blood counts and standard coagulation tests Data from blood counts and standard coagulation tests measured after the declaration of death is included in Table 2. Hemoglobin and hematocrit levels were in normal range, while platelet counts were at the low end of normal. Both INR and aPTT were prolonged, indicating coagulop- athy. Fibrinogen levels, however, were normal. Progression through the DCDD process and transplant outcomes Figure 1 provides a flow chart that depicts the outcomes of each of the 33 potential DCDD donors that were evaluated. Among them, 12were rejected prior to the initiation of NRP for the following reasons: family refusal (N¼4), biological risk factors (2), older age and concomitant medical pathology (2), cancer (2), judicial refusal (1), and prolonged ischemic time (1). During NRP, two potential donors were rejected due to inadequate venous return and inability to run the perfusion circuit. Also during NRP, the livers from 11 additional potential donors were rejected due to elevated hepatic transaminases. A total of 38 kidneys and eight livers were evaluated intraoperatively. Nine kidneys and three liverswere rejected Table 1: Demographic and cardiac arrest parameters of 33 potential unexpected DCDD donors that underwent ROTEM1 analysis after the declaration of death Demographic parameters Male sex 31 (94%) Age (y) 53 (47–57) BMI 26.0 (24.4–27.8) Risk factors Tobacco 17 (52%) Hypertension 8 (24%) Diabetes 5 (15%) Alcohol 2 (6%) Arrest parameters Time to EMS arrival (min) 8 (6–13) Initial rhythm Asystole 23 (70%) Ventricular fibrillation 7 (21%) Pulseless electrical activity 3 (9%) Bystander CPR 14 (42%) Time of CPR (min) 59 (50–69) Time to blood sample (min) 85 (75–102) Table 2: Baseline biochemical parameters, blood counts and standard coagulation tests from 33 potential unexpected DCDD donors that underwent ROTEM1 analysis after the declaration of death Median (25–75% IQR) Normal range1 Biochemical parameters Sodium (meq/L) 146 (140–150) 135–145 Potassium (meq/L) 6.1 (4.7–8.3) 3.5–5.5 Creatinine (mg/dL) 1.55 (1.36–1.80) 0.30–1.30 AST (IU/L) 116 (80–260) 5–40 ALT (IU/L) 95 (49–233) 5–40 GGT (IU/L) 33 (24–79) 5–40 LDH (IU/L) 798 (636–1180) 250–450 Blood counts and standard coagulation tests Hemoglobin (g/dL) 13.1 (12.0–14.1) 12.0–17.0 Hematocrit (%) 40 (38–43) 36–51 Platelets (109/L) 129 (113–148) 130–400 INR 1.53 (1.36–1.66) 0.80–1.20 aPTT (s) 50 (44–75) 25–33 Fibrinogen (mg/dL) 2.7 (2.2–2.8) 1.5–4.5 1Normal values are from our in-hospital laboratory. Vendrell et al American Journal of Transplantation 2015; 15: 764–771 57 due to poor macroscopic aspect at organ recovery. (With respect to the livers, a poor macroscopic aspect refers to ischemia of the bowel and gallbladder, poor bleeding from the cut common bile duct, and a congested ormoderately to severely steatotic aspect of the liver itself.) Additionally, three kidneys were turned down due complex vascular anatomy and two to pathological biopsies. Among the 24 kidneys that were generated, 16 underwent ex situ hypothermic pulsatile machine perfusion (HMP) and eight were transplanted without HMP. Two kidneys were discarded during HMP due to low RAF and high RARI. In all, 22 kidneys were transplanted (12 at our center and 10 at other institutions within our city). The median cold ischemic time was 840min (range: 495–1355). Rates of immediate graft function (IGF), delayed graft function (DGF), and primary non-function (PNF) were 14%, 77% and 9%, respectively. Among those DCDD kidney recipients who experienced DGF, postoperative hemodialysis was applied for amedian of 21 days (range: 2–46).With amedian follow- up of 16 months, the 3-, 6- and 12-month kidney graft survival rates are 91%. Furthermore, no kidney recipient has died in the series (patient survival rate 100%). After a median cold ischemic time of 435min (range: 320– 525), all five of the livers that were generated were transplanted. Immediate graft function was seen in four of the five recipients, and there was one case of PNF. With a median follow-up of 13 months, the 3-, 6- and 12-month liver graft and patient survival rates are 80%. ROTEMW data ROTEM1 analysis demonstrated a pattern of coagulopathy in all potential DCDD donors (Table 3). The initiation of clot formation was prolonged, as evidenced by increased CT values. The speed of clot strengthening was also reduced, as reflected by increased CFT and decreased alpha angle. As well, maximum clot firmness was below the normal range. Above all, the most striking finding was the fact that Figure 1: Outcomes of 33 potential DCDD donors that were evaluated with ROTEMW. Sixteen kidneys underwent hypothermic pulsatile machine perfusion (HMP). In all, 22 kidneys (some without previous HMP) and five livers were transplanted. Coagulation Profiles of Unexpected DCDD Donors American Journal of Transplantation 2015; 15: 764–771 58 all potential DCDD donors demonstrated HF at the time of blood sampling soon after the declaration of death, withML of 100% in all cases. The pattern of HFwas fulminant in the majority of cases—26 (79%)—and intermediate in the remaining seven (21%) (Figure 2). There was no correlation between LY30 and either the length of advanced CPR (Kendall’s tau b correlation coefficient 0.125, p¼ 0.374) or the length of time from cardiac arrest to blood sample (Kendall’s tau b correlation coefficient 0.009, p¼0.952). Among the 16 kidneys that underwent HMP, there was a significant relationship between LY30 and RAF 6h after the start of HMP (Kendall’s tau b correlation coefficient 0.456, p¼ 0.029. There was also an inverse relationship between LY30 and RARI at 6 h, though it did not reach the level of statistical significance based on small sample size (Kendall’s tau b correlation coefficient 0.282, p¼0.149). With respect to DCDD livers, therewas a significant inverse relationship between LY30 andmaximum hepatic transam- inase levels measured in potential donors (Kendall’s tau b correlation coefficient 0.338 for AST and 0.356 for ALT, p¼ 0.029 and 0.019, respectively). Discussion The major finding of this study is that endogenous hyperfibrinolysis is present in all unexpected DCDD donors, obviating the need for additional fibrinolytic drugs in this setting. While this is the first study to comprehensively study the coagulation profiles of DCDD donors, other groups have used thromboelastometry to study patients suffering OHCA. Schochl et al (17) analyzed blood samples drawn at the scene at a median of 6min (IQR: 3.5–9) after cardiac arrest and observed HF in 34%, while Viersen et al (16) drew samples for thromboelastometry upon arrival to the emergency department 42 13min after cardiac arrest and detected HF in 50% of cases. In the present study, in samples drawn at least 48min after arrest and after about 90min on average, HF was present in 100% of cases. Considering the results of these three studies together, it seems that the incidence of HF increases in direct relation to the length of cardiac arrest/warm ischemia a patient/potential donor suffers. Table 3: ROTEM1 parameters for 33 potential unexpected DCDD donors; INTEM and EXTEM tests measure clot formation and subsequent lysis following intrinsic and extrinsic activation, respectively Median (25–75% IQR) Normal range1 INTEM CT (s) 235 (187–1592) 100–240 INTEM CFT (s) 147 (129–179) 30–110 INTEM alpha angle (8) 63 (59–67) 70–83 INTEM MCF (mm) 38 (27–50) 50–72 EXTEM CT (s) 113 (94–158) 38–79 EXTEM CFT (s) 175 (147–218) 34–159 EXTEM alpha angle (8) 58 (51–62) 63–83 EXTEM MCF (mm) 36 (29–48) 50–72 EXTEM ML (%) 100 (100–100) <15 EXTEM LY30 (%) 5 (0–80) 94–100 EXTEM LOT (s) 818 (477–2167) –2 Of note, all 33 potential donors demonstrated hyperfibrinolysis, with maximum lysis of 100% in all cases. CFT, clot formation time; CT, clotting time; LOT, lysis onset time; LY30, lysis at 30min;MCF,maximumclot firmness;ML,maximum lysis. 1Normal values for ROTEM studies are provided by the manufac- turer. 2No normal value exists, as there is usually no lysis. Figure 2: Representative ROTEMW figures for potential unexpected DCDD donors. (A) reflects two patterns of fulminant hyperfibrinolysis, the one on the top much more advanced than the one below, while (B) reflects intermediate hyperfibrinolysis. Vendrell et al American Journal of Transplantation 2015; 15: 764–771 59 In the Viersen study, the authors observed significant correlations between the temporal onset of HF on throm- boelastometry (LOT) and markers of systemic hypoperfusion (base excess and lactate) as well as mortality, with a later onset of HF being associated with both improved perfusion and a lower rate of death (16). Hyperfibrinolysis has similarly been observed in trauma patients in association with signs of hypoperfusion, and it has been demonstrated that the pattern of HF can be predictive of outcome in this setting (24,25). While we did not obtain blood gas samples until later in the DCDDprocess (whenNRPwas initiated) andwere not able to correlate the onset or pattern of HFwith systemicmarkers of hypoperfusion, we did observe significant correlations between lysis parameters and some markers of organ injury (peak hepatic transaminases, renal artery flows measured during HMP). Though the present study was not designed to determine a definitive relationship between thromboelasto- meric parameters and markers of injury/viability (the number of patients being small and a great variability existing in cold ischemic times for the kidneys, at least, which is why we focused on parameters measured at a fixed time point during HMP instead of actual graft outcomes), this is nonetheless an intriguing preliminary finding and one that deserves further evaluation and validation in awell-designedprospective study. Hyperfibrinolysis in commonly found in situations of microcirculatory derangement as well as in shock (26,27); the initiating factor appears to be the adequacy—or, rather, the inadequacy—of perfusion. When organs and tissues suffer progressive ischemia, thrombomodulin, an integral membrane protein expressed on the surface of endothelial cells, is induced. Thrombomodulin serves as a cofactor for thrombin and converts it from a pro- to an anticoagulant enzyme, diverting it fromfibrin generation to the activation of protein C (6,28). Activated protein C consumes plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1), thereby reducing the inhibition of tissue plasminogen activator (TPA) and accelerating the conversion of plasminogen to plasmin (27,29,30). Simulta- neously, hypoxia and a secondary systemic rise in catechol- amines cause the release of TPA from endothelial cells, leading to excessive fibrinolysis (31–34). Studies investigating the use of systemic fibrinolysis in OHCA have shown an increase in bleeding complications without any improvements in measures of outcome (return of spontaneous circulation, neurological outcome, survival, etc.) (35,36); based on the fact that endogenous fibrinolysis is active, if not excessive, there does not appear to be any role for additional fibrinolytic therapy in unexpected DCDD donors, either. Nevertheless, there are some reports of the application of fibrinolytics in clinical DCDD. The Newcastle group performed a small trial in which 25 expected and unexpected DCDD donors were randomly assigned to streptokinase preflush or placebo prior to kidney recovery. According to their results, the use of streptokinase led to improvements in the gross aspects of the kidneys and injury biomarkers measured during ex situ machine perfusion, though no significant differences in terms of graft discard rates or outcomesweredetected. It should also benoted that therewas significantly greater intraoperative blood loss in the streptokinase group, though the authors attributed this to technical complications of the procedure (4). In the context of expected DCDD, the group at the Cleaveland Clinic recently described a series of 22 liver transplants performed with grafts fromexpectedDCDDdonors treatedwith recombinant TPA injected into the donor hepatic artery on the backtable, with or without heparin administered systemically prior to ventilator withdrawal. There was no control group in this study, and IC arose postoperatively in two cases (9%), including one in which heparin had been given prior to withdrawal. Of note, excessive postreperfusion bleeding was experienced in 64% of recipients (13). Also, the use of a fibrinolytic drug in previously anticoagulated patients in this study is rather surprising, given that proper anticoagulation should avoid the appearance of clot and the need for lysis. This last study also brings up two further important points that deserve consideration. First, the administration of a fibrinolytic drug to a graft, evenwith subsequentwashout, is an intervention that could pose substantial risk for the development of uncontrollable hemorrhage in the recipient, in particular in the context of DCDD liver transplantation, where postreperfusion coagulopathy is common. Second, the fact that a case of IC arose even when the donor had been systemically anticoagulated is striking and raises doubt regarding the microvascular thrombosis theory in IC. Perhaps IC is not so much a consequence of clot in the peribiliary arterial plexus as it is of cholangiocellular ischemia and death. More than giving fibrinolytic drugs and other pharmacological agents, it may be that the best means we have of preventing IC and DCDD organ injury in general is to limit ischemia, both warm and cold, as much as possible, probably through a combination of in situ NRP followed by ex situ normothermic machine perfusion (37). A limitation of this study is that the results are only truly applicable in the context of unexpected DCDD, which, globally, is much less common than expected DCDD. In theory, HF could also develop in expected DCDD donors in direct relation to the degree of tissue hypoperfusion suffered duringwithdrawal and arrest, but specific evidence is lacking. Clinical trials using thromboelastometry to study donor coagulation profiles in the context of expected DCDD are therefore encouraged. In summary, the present study provides conclusive evidence that unexpectedDCDDdonors universally present hyperfibrinolysis due to the extended period of cardiac arrest they suffer; there is no role for additional treatment with exogenous fibrinolytic agents in this setting. Acknowledgments Research was supported by F.I.S. Grant 11/01979 from the Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Ciencia e Innovacio´n, Spain. M. Vendrell was Coagulation Profiles of Unexpected DCDD Donors American Journal of Transplantation 2015; 15: 764–771 60 supported by the ‘‘Premio Fin de Residencia ‘Emili Letang’’’ from the Hospital Clı´nic, Barcelona. The authors would like to thank Dr. Eva Oliver of Hospital Universitari de Bellvitge, Dr. Joana Sellare´s and Dr. Teresa Pont of Hospital Vall d’Hebro´n, Dr. Luis Guirado and Dr. Beatriz Bardajı´ of Fundacio´ Puigvert, and Dr. Ana Zapatero of Hospital del Mar for providing the data regarding kidneys transplanted at other centers. Disclosure The authors of this manuscript have no conflicts of interest to disclose as described by American Journal of Transplantation. References 1. Kootstra G, Daemen JH, Oomen AP. Categories of non-heart- beating donors. Transplant Proc 1995; 27: 2893–2894. 2. Fondevila C, Hessheimer AJ, Ruiz A, et al. Liver transplant using donors after unexpected cardiac death: Novel preservation protocol and acceptance criteria. Am J Transplant 2007; 7: 1849–1855. 3. Metcalfe MS, Nicholson ML. Non-heart-beating donors for renal transplantation. Lancet 2000; 356: 1853. 4. GokMA, ShentonBK, Buckley PE, et al. How to improve the quality of kidneys from non-heart-beating donors: A randomised con- trolled trial of thrombolysis in non-heart-beating donors. Trans- plantation 2003; 76: 1714–1719. 5. Fondevila C, Hessheimer AJ, Flores E, et al. Applicability and results of Maastricht type 2 donation after cardiac death liver transplantation. Am J Transplant 2012; 12: 162–170. 6. 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Se sometía al injerto a 4 horas de isquemia fría y posterior implante y seguimiento de los animales receptores a lo largo de 5 días o hasta su muerte. Se recogieron datos de efectividad de la PRAN como son los flujos vasculares hepáticos, parámetros de laboratorio del funcionalismo hepático y tromboelastométricos, parámetros de supervivencia y biopsias hepáticas tras la reperfusión en el receptor y en la autopsia / necropsia. Una descripción detallada de dichos datos, así como de su análisis y resultados, queda recogido en el segundo artículo de esta tesis, Hessheimer AJ, Vendrell M, Muñoz J, Ruiz A, Díaz A, Flores-Sigüenza L, Rodriguez Lanzilotta J, Delgado Oliver E, Fuster J, Navasa M, García Valdecasas JC, Taurá P, Fondevila C. Heparin but not tissue plasminogen activator improves outcomes in DCD liver transplantation in a porcine model. Liver Transplatation, 2018; Jan19. 64 Heparin But Not Tissue Plasminogen Activator Improves Outcomes in Donation After Circulatory Death Liver Transplantation in a Porcine Model Amelia J. Hessheimer,1* Marina Vendrell,3* Javier Mu~noz,1 Angel Ruız,5 Alba Dıaz,4 Luıs Flores Sig€uenza,1 Jorge Rodrıguez Lanzilotta,1 Eduardo Delgado Oliver,1 Jose Fuster,1 Miquel Navasa,2 Juan Carlos Garcıa-Valdecasas,1 Pilar Taura,3 and Constantino Fondevila1,5 1Department of Surgery and 2Liver Unit, Institut de Malalties Digestives i Metaboliques, Centro de Investigacion Biomedica en Red de Enfermedades Hepaticas y Digestivas, Institut d’Investigacions Biome`diques August Pi i Sunyer, Departments of 3Anesthesia, 4Pathology, and 5Hepatobiliary and Liver Transplant Surgery, Hospital Clınic, University of Barcelona, Barcelona, Spain Ischemic-type biliary lesions (ITBLs) arise most frequently after donation after circulatory death (DCD) liver transplantation and result in high morbidity and graft loss. Many DCD grafts are discarded out of fear for this complication. In theory, microvascular thrombi deposited during donor warm ischemia might be implicated in ITBL pathogenesis. Herein, we aim to evaluate the effects of the administration of either heparin or the fibrinolytic drug tissue plasminogen activator (TPA) as means to improve DCD liver graft quality and potentially avoid ITBL. Donor pigs were subjected to 1 hour of cardiac arrest (CA) and divided among 3 groups: no pre-arrest heparinization nor TPA during postmortem regional perfusion; no pre- arrest heparinization but TPA given during regional perfusion; and pre-arrest heparinization but no TPA during regional per- fusion. In liver tissue sampled 1 hour after CA, fibrin deposition was not detected, even when heparin was not given prior to arrest. Although it was not useful to prevent microvascular clot formation, pre-arrest heparin did offer cytoprotective effects during CA and beyond, reflected in improved flows during regional perfusion and better biochemical, functional, and histo- logical parameters during posttransplantation follow-up. In conclusion, this study demonstrates the lack of impact of TPA use in porcine DCD liver transplantation and adds to the controversy over whether the use of TPA in human DCD liver trans- plantation really offers any protective effect. On the other hand, when it is administered prior to CA, heparin does offer anti- inflammatory and other cytoprotective effects that help improve DCD liver graft quality. Liver Transplantation 00 000–000 2018 AASLD. Received September 5, 2017; accepted January 6, 2018. Because primary graft failure can generally be avoided by appropriate donor and graft selection, ischemic-type biliary lesions (ITBLs) are currently the most dreaded complication of donation after circulatory death (DCD) liver transplantation. ITBLs are defined as diffuse nona- nastomotic biliary strictures, with or without prestenotic dilatations, in the presence of a patent hepatic artery,(1) and they occur in approximately 16% of recipients of DCD livers.(2) The development of ITBLs is associated with significantly increased patient morbidity due to the need for multiple biliary procedures and repeat hospital- izations.(2,3) Up to 65% of patients with ITBLs require retransplantation or die.(3) Furthermore, the fear over the development of ITBLs significantly limits the utili- zation of livers arising through the DCD process,(4,5) wasting organ recovery resources and limiting access to this potentially lifesaving procedure. Ischemia/reperfusion injury has primarily been implicated in ITBL pathogenesis.(6) An additional Abbreviations: AP, alkaline phosphatase; AST, aspartate aminotrans- ferase; CA, cardiac arrest; cDCD, controlled/expected donation after circulatory death; CK19, cytokeratin 19; CS, cold storage; CT, clot- ting time; DBD, donation after brain death; DCD, donation after circulatory death; GGT, gamma glutamyltransferase; HAF, hepatic artery flow; IL, interleukin; ITBL, ischemic-type biliary lesion; LDH, lactate dehydrogenase; LY30, lysis index at 30 minutes; LY60, lysis index at 60 minutes; MCF, maximum clot firmness; mRNA, messenger RNA; NRP, normothermic regional perfusion; PAI-1, plasminogen activator inhibitor-1; PVF, portal vein flow; QPT, quick prothrombin time; ROTEM, rotational thromboelastom- etry; RT-PCR, reverse transcriptase polymerase chain reaction; TNF, tumor necrosis factor; TPA, tissue plasminogen activator; uDCD, uncontrolled/unexpected donation after circulatory death. ORIGINAL ARTICLE HESSHEIMER ET AL. 65 theory holds that microthrombi deposition in peri- biliary arterioles during the low-flow/no-flow period following ventilator withdrawal or cardiorespiratory arrest in controlled/expected donation after circula- tory death (cDCD) and uncontrolled/unexpected donation after circulatory death (uDCD) donors, respectively, may also play a role. On the basis of this theory, different authors have suggested that the via- bility of organs arising from DCD donors may be improved through the application of fibrinolytic therapy.(7-10) Normothermic regional perfusion (NRP) is used to limit warm ischemia during the period following decla- ration of death and prior to cold perfusion in uDCD and more recently cDCD donors.(11) Normothermic regional perfusion has been shown to replete cellular energy stores, reduce nucleotide degradation products, and induce endogenous antioxidants. It also allows for a comprehensive assessment of organ viability prior to recovery.(12) Furthermore, NRP offers an ideal oppor- tunity to treat and improve the quality of these mar- ginal grafts prior to recovery. The aim of the present study is to compare and con- trast the effects on liver graft quality of fibrinolytic therapy administered during a period of postarrest NRP with that of pre-arrest heparinization followed by postarrest NRP (our current standard for cDCD donor maintenance)(13) and postarrest NRP only (the standard in some countries where pre-arrest heparin- ization is prohibited by law) in a porcine model of DCD liver transplantation. Materials and Methods ANIMALS Male weanling pigs were used as donors and recipients. Animals were cared for according to the guidelines of the University of Barcelona Committee on Ethics in Animal Experimentation and the Catalan Department of the Environment Commission on Animal Experimentation. STUDY OVERVIEW Animals were divided among 3 groups: 1. Control group: 60 minutes cardiac arrest (CA) 1 1 hour NRP 1 4 hours cold storage (CS) 1 transplantation (n 5 6). 2. Tissue plasminogen activator (TPA) group: 60 minutes CA 1 1 hour NRP with TPA 1 4 hours CS 1 transplantation (n 5 6). 3. Heparin group: pre-arrest heparinization 1 60 minutes CA 1 1 hour NRP 1 4 hours CS 1 transplantation (n 5 6). DONOR PROCEDURE AND NRP Donor anesthesia was performed as described previ- ously.(14) The liver and hilar structures were dissected, and cholecystectomy was performed. Hepatic artery flow (HAF) and portal vein flow (PVF) were measured using ultrasonic flow probes connected to a flowmeter (HT107, Transonic Systems, Ithaca, NY). Control Group The descending aorta was cross-clamped at the aortic hiatus, and the heart was stopped with an intravenous injection of potassium chloride. The abdomen was closed, and a heating pad was placed to maintain a core temperature of 378C. Sixty minutes after the start of CA (the length of time chosen to maximize biliary injury), the abdomen was reopened, and the abdominal aorta and inferior vena cava were cannulated with a 16- Fr Jostra arterial cannula and a multiperforated 21-Fr HLS venous cannula, respectively (Maquet Cardiopul- monary, Hirrlingen, Germany). Cannulae were con- nected to a cardiopulmonary bypass circuit (Maquet Cardiopulmonary, Hirrlingen, Germany) primed with 500 mL of 1/6 M sodium bicarbonate, 500 mL of 20% mannitol, 500 mL of Ringer’s solution, and 500 mL of Voluven (Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany). Heparin (3 mg/kg) was also added to the Address reprint requests to Constantino Fondevila, M.D., Ph.D., Hepatobiliary and Liver Transplant Surgery, Hospital Clınic, Uni- versity of Barcelona, C/ Villarroel 170, 08036 Barcelona, Spain. Telephone: 34 93 227 57 18; FAX: 34 93 227 55 89; E-mail: cfonde@clinic.ub.es *These authors contributed equally to the work. Research was supported by FIS Grant 11/01979 from the Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Ciencia e Innovacion, Spain. Marina Vendrell was supported by the “Premio Fin de Residencia ‘Emil Letang’” from the Hospital Clınic, Barcelona. Copyright VC 2018 by the American Association for the Study of Liver Diseases. View this article online at wileyonlinelibrary.com. DOI 10.1002/lt.25013 Potential conflict of interest: Nothing to report. HESSHEIMER ET AL. LIVER TRANSPLANTATION, Month 2018 66 priming solution. Normothermic regional perfusion was run for 60 minutes, with a goal pump flow of 1.7- 1.8 L/minute and temperature 378C. HAF and PVF were recorded, and the perfusate was sampled via an in-line 3-way stopcock throughout NRP. At the end of NRP, the liver was perfused with 1 L of cold IGL-1 preservation solution (Institut Georges Lopez, Lissieu, France) both portally and arterially. The liver was then removed, prepared, and placed in CS at 48C. TPA Group TPA was added to the regional perfusion solution (1.5 mg/kg, administered as a 10-mg priming dose and the rest as a continuous infusion over the subsequent hour of NRP). The remainder of the procedure was the same as that described for the control group. Heparin Group Heparin (3 mg/kg intravenously) was administered approximately 5 minutes prior to aortic cross-clamp; the remainder of the procedure was the same as that described for the control group. RECIPIENT PROCEDURE AND POSTOPERATIVE MANAGEMENT Approximately 4 hours after the start of CS, the liver was transplanted into the recipient pig, as described previously.(14,15) Postoperatively, the recipient was cared for intensively for up to 5 days.(14) Animals that survived until the fifth day were reopened and eutha- nized under anesthesia, whereas nonsurvivors were subjected to autopsy. BLOOD AND SERUM ANALYSES In blood samples collected serially during follow-up, alkaline phosphatase (AP), aspartate aminotransferase (AST), gamma glutamyltransferase (GGT), total bili- rubin, and the quick prothrombin time (QPT) were determined using the Advia 1650 automatic analyzer (Bayer, Tarrytown, NY). ROTATIONAL THROMBOELASTOMETRY Rotational thromboelastometry (ROTEM) analyses were performed on blood samples taken from both the donor (prior to and at the end of CA and during NRP) and the recipient after graft reperfusion. Whole blood was activated extrinsically with recombinant tis- sue factor (EXTEM reagent) or intrinsically with ella- gic acid (INTEM reagent), and the analysis was run for at least 60 minutes. In the HEPTEM assay, coagu- lation is triggered via the intrisic pathway in the same manner as in INTEM. However, heparinase is added to rapidly degrade heparin and allow for the assessment of hemostasis in heparinized subjects. Alpha angle measured the speed of clot strengthening. Maximum clot firmness (MCF) was the maximum amplitude of the clot, whereas maximum lysis was the maximum percentage of amplitude lost relative to MCF (normal <15%, >15% indicating hyperfibrinolysis). The lysis index at 30 minutes (LY30) and the lysis index at 60 minutes (LY60) were the ratios of the amplitudes at 30 and 60 minutes, respectively, relative to MCF (normal 94%-100%). TISSUE ANALYSES Liver parenchymal biopsies were taken at baseline in the donor (immediately after opening the abdominal wall), and parenchymal and distal bile duct samples were taken both 1 hour after reperfusion in the recipi- ent and at the end of follow-up. Each biopsy was divided into 2 sections: 1 preserved in 10% formalin for paraffin inclusion and 1 diced finely and snap- frozen in liquid nitrogen for RNA extraction. Formalin-fixed samples were processed for routine his- tology. Sections were stained with hematoxylin-eosin and examined using standard light microscopy by 2 independent observers blinded to the identity of each sample. Parenchymal sections were evaluated for sinu- soidal congestion, hepatocellular vacuolization, and necrosis according to the semiquantitative method described by Suzuki et al.,(16) and peribiliary arteriolo- necrosis and gland injury were evaluated according to the methods described by Hansen et al. and op den Dries et al.(17,18) To study fibrin deposition, paraffinated sections were dewaxed with xylene and stained for fibrin using the Martius Scarlet Blue Stain Kit (Molekula, Newcas- tle Upon Tyne, UK), according to the manufacturer’s instructions. Also in paraffin-embedded tissue sam- ples, endogenous peroxidase activity was inhibited with peroxidase-blocking solution (S2023, DakoCytoma- tion, Glostrup, Denmark) for 10 minutes. Sections were washed with phosphate-buffered saline and in- cubated with anti-cytokeratin 19 (CK19) antibody (1/300, NCL-CK19 Mouse Monoclonal Antibody, Leica Biosystems GmbH, Nussloch, Germany) for 60 LIVER TRANSPLANTATION, Vol. 00, No. 00, 2018 HESSHEIMER ET AL. 67 minutes. Slides were washed with phosphate-buffered saline and incubated with secondary antibody (K4011, Dako Agilent Pathology Solutions, Glostrup, Den- mark) for 30 minutes. The peroxidase reaction was developed with a 3,3-diaminobenzidine tetrahydro- chloride substrate kit (K4007, Dako Agilent Pathology Solutions). Finally, slides were washed with distilled water and counterstained with hematoxylin-eosin and examined by 2 independent observers blinded to the identity of each sample. Real-time quantitative TaqMan reverse transcrip- tase polymerase chain reaction (RT-PCR) analyses of E-selectin, interleukin (IL) 1b, IL6, and tumor necrosis factor (TNF) gene expression were performed to detect endothelial cell activation and inflammation, as described previously.(15) All samples were assayed in duplicate, recording the mean for each sample. Results in each individual animal were normalized with the value of the respective gene in that animal at baseline, which was set to 0. DATA AND STATISTICAL ANALYSES All quantitative values are expressed as the median and 25%-75% interquartile range. Differences between groups were compared using the Mann-Whitney U test for 2 samples and the Kruskal-Wallis 1-way analy- sis of variance for multiple samples. P < 0.05 was con- sidered significant. Calculations were performed using SPSS statistics, version 20 (IBM, Armonk, NY). Results DONOR OUTCOMES Graft Perfusion During NRP From the start of NRP, PVF, HAF, and pump flows were significantly higher among donors in the heparin group compared with the other 2. These flows remained higher in the heparin group throughout NRP (Fig. 1). Rotational Thromboelastometry Rotational thromboelastometry demonstrated differ- ences between the groups in coagulation and lysis parameters prior to and during NRP (Table 1). Donors in the heparin group were adequately anticoagulated, as reflected by significantly prolonged CT and the absence of measurable clot formation on INTEM test; the effects of heparin persisted, though to a lesser extent, at the end of CA. During NRP, fibrinolytic therapy was adequate in the TPA group, as reflected by 100% lysis on HEPTEM assay. Finally, there were no differences in postreperfusion coagulation and lysis parameters in recipient pigs.                                                                   FIG. 1. (A) PVF, (B) HAF, and (C) pump flow during 1 hour of NRP (performed subsequent to 1 hour of CA). Flows were generally higher for grafts/animals treated with heparin prior to arrest. P < 0.05 for control (,*) and TPA (w,**) groups versus heparin group (~).                                                                   HESSHEIMER ET AL. LIVER TRANSPLANTATION, Month 2018 68 TRANSPLANTATION AND POSTOPERATIVE EVOLUTION There were no significant differences among the groups in lengths of CA (median [range]; control, 67 [65-70] minutes; TPA, 69 [66-71] minutes; and hepa- rin, 69 [66-70] minutes), NRP (control, 61 [60-67] minutes; TPA, 65 [61-68] minutes; and heparin, 64 [63-68] minutes), cold ischemia (control, 244 [222- 250] minutes; TPA, 242 [235-255] minutes; and hep- arin, 236 [232-243] minutes), or the anhepatic period during liver reperfusion (control, 18 [15-19] minutes; TPA, 17 [15-18] minutes; and heparin, 17 [16-18] minutes). Upon reperfusion, serum AST and total bilirubin increased and QPT decreased in all of the recipients. During the follow-up period, the AST level was lower and the QPT level was higher (reflecting improved hepatic synthetic function) in the recipients of grafts from donors with pre-arrest heparinization compared with those from donors without (both the control and TPA groups; Fig. 2 A-C). Both serum AP and GGT decreased immediately following reperfusion but then subsequently rose, with AP peaking approximately 24 hours in all 3 groups and GGT continuing to rise steadily until the end of follow-up. Although there were no differences among the groups in GGT, AP tended to be lower, at some points significantly so, in the recipients of livers treated with heparin prior to CA (Fig. 2D,E). Five-day survival was 83% in both the control and TPA groups and 100% in the recipients of grafts treated with heparin prior to CA. One recipient in each of the control and TPA groups died between the third and fourth posttransplant days due to apparent hepatic insufficiency, with progressive deterioration of serum bilirubin and QPT preceding death. MICROSCOPY STUDIES After an hour of cardiac standstill, no significant depo- sition of fibrin was detected in the samples, indepen- dent of treatment (pre-arrest heparinization or lack thereof). Notably, panlobular hepatocellular vacuoliza- tion was present in tissue samples taken after 1 hour of CA from livers from donors not previously treated with heparin, though this finding was relatively absent among heparin-treated grafts (Fig. 3). Ischemia/reperfusion injury was evaluated in postreperfusion tissue biopsies. Congestion and TABLE 1. Rotational Thromboelastomeric Parameters Measured in Donor Pigs Immediately Prior to CA, After 60 Minutes of CA, and During NRP and in Recipient Pigs 20 Minutes After Graft Reperfusion Reference Control TPA Heparin P Values Pre-arrest (INTEM) CT, seconds 63-212 151 (103-162) 171 (160-175) 3232 (1325-5136) <0.05 Alpha, deg 80-85 81 (80-82) 80 (80-81) — 0.34 MCF, mm 61-79 73 (71-74) 72 (70-73) — 0.16 LY30, % 94-100 97 (95-100) 97 (94-99) — 0.56 LY60, % 94-100 87 (86-90) 89 (86-93) — 0.66 ML, % <15 10 (6-14) 14 (7-19) — 0.52 End of arrest (INTEM) CT, seconds 63-212 131 (115-141) 128 (119-157) 523 (474-572) 0.005 Alpha, deg 80-85 73 (67-76) 79 (78-81) 45 (41-49) 0.004 MCF, mm 61-79 55 (50-60) 76 (69-79) 47 (38-56) 0.02 LY30, % 94-100 100 (98-100) 100 (99-100) 100 0.31 LY60, % 94-100 96 (94-97) 94 (93-96) 97 (95-98) 0.39 ML, % <15 8 (6-10) 11 (7-13) 7 (5-9) 0.17 NRP (HEPTEM) LY30, % 94-100 100 (98-100) 0 (0-2) 93 (91-94) 0.003 LY60, % 94-100 95 (90-97) 0 87 (84-90) 0.002 ML, % <15 13 (8-16) 100 14 (10-18) 0.007 Postreperfusion (EXTEM) CT, seconds 37-80 70 (69-81) 76 (67-80) 81 (67-89) 0.72 Alpha, deg 80-86 75 (75-78) 75 (74-76) 75 (73-77) 0.58 MCF, mm 66-81 67 (65-69) 63 (63-66) 63 (61-66) 0.07 LY30, % 94-100 100 100 (99-100) 100 (99-100) 0.48 LY60, % 94-100 100 (98-100) 99 (96-100) 98 (94-100) 0.86 ML, % <15 2 (1-4) 5 (1-8) 3 (1-9) 0.80 NOTE: Data are given as range or median (interquartile range). LIVER TRANSPLANTATION, Vol. 00, No. 00, 2018 HESSHEIMER ET AL. 69 vacuolization were observed to the same degree in all 3 groups, but less necrosis was observed among grafts treated with heparin prior to CA (Table 2; Fig. 4). Biliary epithelial histology was evaluated with anti- CK19 immunohistochemistry. At baseline, interlobu- lar bile ducts and ductules were lined by a uniform layer of cuboidal cells with large nuclei and scant                                                                                                                                        FIG. 2. Evolutions of (A) AST, (B) total bilirubin, (C) QPT, (D) AP, and (E) GGT over the course of the postoperative period, according to treatment group. At various points over the postoperative periods, these values tended to be improved among recipients of livers treated with heparin prior to CA. P < 0.05 for control (,*) and TPA (w,**) groups versus heparin group (~).                                                                                                                                                                                                                                                                               FIG. 3. Tissue samples taken at (A) baseline and (B-D) after an hour of CA were stained to detect the presence of fibrin. Even after an hour of CA, red cells were detected (staining yellow), but fibrin deposi- tion (which stains bright pink when present) was not, independent of whether heparin had been adminis- tered (D) or not (B, control group; C, TPA group) prior to arrest. Liver tissue samples taken after 1 hour of warm ischemia were also notable for significant hepatocellular vacuolization (B,C), which was vir- tually absent among livers from donors treated with heparin prior to CA (D).                                                                                                                                        HESSHEIMER ET AL. LIVER TRANSPLANTATION, Month 2018 70 cytoplasm. Five days after transplantation, atypical cholangiocellular proliferation/hyperplasia and partial collapse of the ductular lumen was prominent in grafts in the control and TPA groups, whereas biliary duc- tules were lined by a single layer of cuboidal cells with a relatively well-defined lumen among grafts in the heparin group (Fig. 5). When the peribiliary arterioles and periluminal and deep peribiliary glands were ana- lyzed, arteriolonecrosis and peribiliary gland injury were both minimal (50%) in samples from the con- trol and TPA groups, whereas no injury was observed in samples from the heparin group. ENDOTHELIAL ACTIVATION AND INFLAMMATORY RESPONSE After an hour of CA, expression of E-selectin messen- ger RNA (mRNA), a marker of endothelial activation, was lower in grafts in the heparin group versus those without treatment (P 5 0.03 and 0.05 versus control and TPA groups, respectively). Both after graft reper- fusion and after 5 days of follow-up in the recipients, levels of E-selectin mRNA also tended to be lower among heparin-treated grafts followed by grafts treated with TPA during NRP and grafts in the control group. After an hour of CA, tissue levels of TNF mRNA were lower in heparin-treated grafts (P5 0.04 for con- trol versus heparin groups). Both TNF and IL1b mRNA levels were significantly lower among heparin- treated grafts versus controls after reperfusion (P 5 0.03), and IL1b mRNA remained lower in heparin- treated grafts at the end of follow-up (P 5 0.02 when compared with the control group; Fig. 6). Discussion The major finding of the present study is that heparin provides anti-inflammatory and other cytoprotective effects when administered prior to CA in the context of DCD, independent of its role as an anticoagulant. This finding has potential to impact clinical practice, given that heparin is not universally given prior to the withdrawal of life support in cDCD, depending on local legislation and clinical practice guidelines. As well, this study demonstrates that fibrinolytic therapy, administered in order to dissolve theoretical micro- thrombi formed during warm ischemia, may not be as useful as some authors have suggested. Compared with human blood, porcine blood con- tains higher concentrations of fibrinogen, platelets, and plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) and a lower concentration of plasminogen.(19,20) Even despite this relative hypercoagulability at baseline, there was still no fibrin clot deposition (the target of fibrinolytic therapy) in this model after an hour of cardiac standstill, regard- less of whether heparin had been administered prior to                                                                                                                                        FIG. 4. Postreperfusion tissue samples were evaluated for changes associated with ischemia/reperfusion injury. Although congestion and vacuolization were all observed to the same extent in the postreperfusion samples, there was consistently less necrosis observed in grafts treated with heparin prior to CA. Representative samples from (A) control, (B) TPA, and (C) heparin groups, 2003 magnification.                                                                                                                                        TABLE 2. Changes Associated With Ischemia/Reperfusion Injury Were Assessed in Postreperfusion Biopsies According to the Semiquantitative Suzuki Scoring System Control TPA Heparin P Value Congestion 3.0 (2.0-3.0) 3.0 (2.8-3.0) 2.5 (1.0-3.0) 0.49 Vacuolization 3.0 (2.8-3.3) 3.0 (1.8-3.3) 3.0 (3.0-3.3) 0.86 Necrosis 3.0 (2.0-3.5) 3.0 (2.3-3.5) 1.3 (1.0-2.0) 0.005 LIVER TRANSPLANTATION, Vol. 00, No. 00, 2018 HESSHEIMER ET AL. 71                                                                                                                                        FIG. 5. Biliary epithelial histology was evaluated using anti-CK19 immunohistochemistry in liver tis- sue samples taken (A) at baseline and (B-D) after 5 days of follow- up. Ductular reaction, with prolifer- ation of cholangiocytes and partial collapse of the biliary lumen, was observed among grafts in the (B) control and (C) TPA groups, while normal ductular morphology remained relatively well preserved among grafts in the (D) heparin group.                                                                                                                                                                                                                                                                               FIG. 6. Tissue samples from various time points were evaluated for E-selectin, TNF, IL1b, and IL6 gene expression. Results in each ani- mal were normalized with the value of the respective gene in the same animal at baseline, set to 0. After an hour of CA, E-selectin mRNA was significantly lower in grafts treated with heparin prior to arrest, indicating less endothelial activation during the period of warm ische- mia. (A) The same tendency remained after both graft reperfusion in the recipient and after 5 days of follow-up. (B) Gene expression of TNF; (C) IL1b; (D) and IL6, all proinflammatory cytokines, was also lower among heparin-treated grafts after CA, graft reperfusion, and 5 days of follow-up. P < 0.05 for control (black columns, *) and TPA (gray columns) groups versus the heparin group (white columns).                                                                                                                                        HESSHEIMER ET AL. LIVER TRANSPLANTATION, Month 2018 72 arrest or not. It might be argued that a group receiving both pre-arrest heparinization and fibrinolytic therapy during NRP should have been included in this study. However, such an argument is rather counterintuitive. Adequate pre-arrest heparinization should prevent any theoretical clot from forming during the subsequent period of cardiocirculatory arrest. In this study, no microvascular clot was found, even when no therapy (neither heparin nor TPA) was given. Given that it was performed in a porcine model, the findings of this study need to be confirmed in the clini- cal setting. However, there is already clinical evidence of lack of fibrin clot deposition following CA in the context of DCD. A recent clinical study from Rotter- dam evaluated 282 sections from 94 biopsies from dis- carded human cDCD liver grafts (n 5 16) triple- stained to detect the presence of microthrombi. Micro- vascular clot with fibrin was only found in 1%-3% of the sections evaluated. Furthermore, when the authors evaluated cDCD and donation after brain death (DBD) grafts from an earlier era, microthrombi were found at rates of 3% and 11%, respectively, and there was no association between the presence of micro- thrombi and the subsequent development of ITBL.(21) Other authors have similarly studied histopathological changes associated with the appearance of ITBL after both DBD and cDCD liver transplantation in the clinical setting and have also described low rates of microvascular thrombi and no significant association between the presence of microthrombi and the devel- opment of ITBL.(17,18) Several years ago, Porte and Clavien highlighted the fact that platelet activation is reduced and coagulation altered early after death, with less stable clot formation and marked activation of the fibrinolytic system.(22) More recently, our group used ROTEM to show that potential uDCD donors universally suffer hyperfibri- nolysis at the moment death is declared.(23) Other groups have used thromboelastometry to study patients suffering CA, and it appears that the incidence of hyperfibrinolysis increases in relation to the length of arrest and warm ischemia.(24) When organs and tissues suffer progressive ischemia, thrombomodulin, an inte- gral membrane protein expressed on the surface of endothelial cells, is induced. Thrombomodulin serves as a cofactor for thrombin and converts it from a pro- coagulant to an anticoagulant enzyme, diverting it from fibrin generation to the activation of protein C.(25,26) Activated protein C consumes PAI-1, thereby reducing the inhibition of TPA and accelerating the conversion of plasminogen to plasmin.(27-29) Simultaneously, hypoxia and a secondary systemic rise in catecholamines cause the release of TPA from endo- thelial cells, leading to excessive fibrinolysis.(30,31) In the present model, CA is sudden, as is the case in human uDCD. In uDCD, given the abrupt and unexpected nature of arrest, the donor and liver undergo a very prolonged period of warm ischemia, and the risk for the development of ischemic biliary complications in the posttransplant period is very high if aggressive donor recovery and maintenance and strict organ selection criteria are not employed.(5,32,33) Although this model lacks the “agonal phase” seen in the other clinical scenario of cDCD, it is unlikely that the addition of an agonal phase would have changed anything with regard to fibrin deposition (or, in this case, the lack thereof). It has been consistently seen that acutely critically ill patients suffering from a vari- ety of conditions (eg, trauma, sepsis, myocardial infarc- tion, or post-CA syndrome) present severe hemostatic alterations characterized by extreme hypocoagulability and hyperfibrinolysis. This condition, which has re- cently been denominated shock-induced endothe- liopathy (“SHINE”), appears to be a compensatory mechanism to improve perfusion when tissue and cel- lular oxygenation is significantly reduced (ie, when the patient is in a state of shock, regardless of the ori- gin).(34) The coagulation profiles of cDCD donors have not been specifically evaluated in the context of any clinical study. (We would encourage anyone with the means to do so; in our setting, however, all poten- tial cDCD donors are systematically heparinized prior to the withdrawal of life support.) However, given that the agonal phase is also characterized by critical cellular and tissue hypoxia, it is very likely that it, too, provokes the same systemic changes of hypocoagulability and hyperfibrinolysis seen in the aforementioned clinical scenarios. After 1 hour of warm ischemia, hepatocellular vacuolization, which was prominent among livers in the control and TPA groups (untreated up until that point), was significantly less among livers treated with heparin prior to arrest. Hepatocellular vacuolization has been observed in livers exposed to prolonged warm ischemia,(35) and the extent of vacuolization has been correlated with the degree of hepatocellular damage.(36) Theories as to the etiology of hepatocellular vacuoliza- tion include influx of plasma during cellular anoxia,(37) lysosomal degradation (ie, autophagic vacuoles),(38) or internalization of apical membranes due to adenosine triphosphate depletion.(39) Although the exact mecha- nism remains to be elucidated, it is possible binding LIVER TRANSPLANTATION, Vol. 00, No. 00, 2018 HESSHEIMER ET AL. 73 of heparin, which is known to have direct anti- inflammatory and cytoprotective effects and to reduce the expression of cellular adhesion molecules,(40-42) resulted in cell membrane stabilization during warm ischemia. These collateral effects of heparin could also be observed in liver tissue gene levels of E-selectin, TNF, IL1b, and IL6, which were lowest in this study among grafts arising from donors treated with heparin prior to CA. Furthermore, it is plausible that this pro- tective effect on the endothelium resulted in improved flows during NRP and, consequentially, improvements in postreperfusion liver biochemical, functional, and inflammatory parameters measured over the course of follow-up. Anti-CK19 immunostaining was used to evaluate biliary histological changes in this study. Bile ductules are very reactive anatomical elements of the liver.(43) Proliferative/hyperplasic ductular changes were ob- served in samples taken 5 days after transplantation from grafts in the control and TPA groups, whereas these changes were relatively absent in grafts in the heparin group. In accordance with the previous com- mentary, these findings are reflective of, if anything, the adequacy of perfusion during NRP. Mounting clinical evidence suggests that NRP has a significant positive impact on biliary preservation in the setting of DCD liver transplantation because it limits the length of warm ischemia, restores cellular energy stores, and reconditions the graft prior to cold perfusion and stor- age.(11,12) There are now several single-center series that describe excellent posttransplantation survival rates and virtually no ITBL using DCD livers recov- ered with postmortem NRP.(44-47) At our own center, postmortem NRP has been used to recover livers from cDCD donors.(13) Fifteen livers recovered in this fash- ion have been transplanted since 2014, with 92% 1- year graft survival and not a single case of ITBL. Apart from the fact that it is not beneficial, the administration of a fibrinolytic drug to a graft, which may have ongoing effects even after washout due to binding to the vascular endothelium,(48) is an interven- tion that could pose substantial risk for the develop- ment of uncontrollable hemorrhage in the recipient. This issue is particularly relevant in the setting of DCD liver transplantation, where postreperfusion coagulopathy is not uncommon.(49,50) Nonetheless, there are clinical reports that allege benefit for the use of fibrinolytic therapy in this setting. The Cleveland Clinic Group described a series of 22 transplants per- formed with cDCD grafts treated with TPA injected into the donor hepatic artery on the back table, with or without heparin administered systemically prior to ventilator withdrawal. There was no control group in this study, and ITBL arose postoperatively in 1 (9%) patient, including 1 in which heparin had been given prior to withdrawal. Notably, 64% of recipients had excessive postreperfusion bleeding.(7) Seal et al. subse- quently published a retrospective review of cDCD liver transplants performed at 2 North American centers wherein a small dose of TPA was administered directly into the hepatic artery prior to completing the portal anastomosis in 85 of 113 cDCD recipients trans- planted during a 7-year period. The authors described a lower rate of biliary strictures in the TPA-treated recipients (17% versus 33%; P 5 0.07).(8) It is impor- tant to note, however, that patients were not random- ized. The authors compared recipients of livers treated with TPA with controls from an earlier era. As well, donors were fully heparinized prior to withdrawal. One of the same 2 centers recently published a retrospective analysis of 138 cDCD liver transplants performed in which the last 100 recipients received low-dose TPA and verapamil injected directly into the hepatic artery immediately following graft reperfusion in the recipi- ent. Donors in both eras were heparinized prior to withdrawal, and the rates of ITBL in both eras were low (3%-5%) and not significantly different.(10) Also, the Indiana University Group compared cDCD livers treated with TPA added to the aortic flush and subse- quently directly injected into the hepatic artery (n 5 30) with a historic group of controls from an earlier era (n 5 61). They claimed the use of TPA significantly reduced the rates of both anastomotic and nonanasto- motic biliary strictures, though donor age was greater and the warm and cold ischemia times significantly longer in non-TPA grafts.(9) In contrast, a study from Leiden compared recipients of livers treated with uro- kinase during back-table surgery (n 5 63: 46 DBD and 17 cDCD) with a group of controls from an earlier era (n 5 122: 94 DBD and 28 cDCD). The control group had lower body mass index but longer cold ischemia times, but rates of ITBL were exactly the same in both groups (11% and 39% among DBD and cDCD recipients, respectively, in the control group versus 10% and 41% among DBD and cDCD recipi- ents, respectively, in the study group).(51) In summary, this experimental study suggests that fibrinolytic therapy does not play a role in improving liver grafts arising through the DCD process due to lack of fibrin clot deposition during CA. Although it may not be needed for its anticoagulant properties, heparin does offer anti-inflammatory and other HESSHEIMER ET AL. LIVER TRANSPLANTATION, Month 2018 74 cytoprotective effects that may be useful to help improve liver graft quality when administered prior to withdrawal of life support/CA in the context of cDCD. Acknowledgments: The authors would like to thank Dr. Marc Net and Institut Georges Lopez for pro- viding the Institut Georges Lopez 1 solution used in these studies. REFERENCES 1) Buis CI, Hoekstra H, Verdonk RC, Porte RJ. Causes and conse- quences of ischemic-type biliary lesions after liver transplantation. J Hepatobiliary Pancreat Surg 2006;13:517-524. 2) Jay CL, Lyuksemburg V, Ladner DP, Wang E, Caicedo JC, Holl JL, et al. Ischemic cholangiopathy after controlled donation after cardiac death liver transplantation: a meta-analysis. Ann Surg 2011;253:259-264. 3) Foley DP, Fernandez LA, Leverson G, Anderson M, Mezrich J, Sollinger HW, D’Alessandro A. 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En la analítica al ingreso, se observan niveles de hemoglobina y hematocrito dentro de la normalidad, con plaquetas en el límite inferior. Los tiempos de protrombina y tiempo de cefalina se encuentran alargados, indicando coagulopatía, con niveles de fibrinógeno dentro del rango de normalidad. De los 33 potenciales donantes, se trasplantaron 22 riñones y 5 hígados. El análisis tromboelastométrico de los potenciales donantes muestra un patrón de hipocoagulabilidad en todos ellos, con un tiempo de formación alargado y una firmeza disminuida. Así mismo, todos los potenciales donantes muestran un patrón de hiperfibrinolisis, fulminante en 26 casos e intermedia en los 7 restantes. No se encuentra correlación entre el grado de lisis a los 30 minutos y la duración de las maniobras de RCP o el tiempo desde la parada cardíaca hasta la extracción de la muestra. Sí se ve una correlación inversa entre el grado de lisis a los 30 minutos y el pico de transaminasas (aspartato aminotransferasa –ASAT- y alanina aminotransferasa –ALAT-). 80 En el segundo estudio, durante la PRAN se observa una mejoría en los flujos de bomba de perfusión, flujo arterial y flujo portal en aquellos animales que recibieron heparina pre-parada frente a aquellos animales que no la recibieron. No se observan diferencias en el grupo en el que se administró tPA en comparación con el grupo control. Durante el seguimiento, la supervivencia a los 5 días es del 83% en los grupos 1 y 2 (en los que no se administró heparina), y del 100% en el grupo 3 (al que se administró heparina antes de la PCR). Los grupos 1 y 2 presentan unos niveles más elevados de transaminasas (ASAT) y más bajos de tiempo de protrombina (TP) durante las primeras 72 horas del seguimiento, en comparación con el grupo 3. Durante el seguimiento, los niveles de gammaglutamil transferasa (GGT) y fosfatasa alcalina (FA) también se mantienen más bajos en el grupo 3, aunque esta diferencia no alcanza significación estadística. El análisis histológico permite observar la progresión de la lesión tisular a lo largo de las distintas fases del estudio. La lesión por isquemia-reperfusión es menor en aquellos animales pre-tratados con heparina, con una menor alteración de la arquitectura biliar, arteriolonecrosis y lesión de las glándulas peribiliares. En ninguno de los grupos se observan depósitos de fibrina significativos. En cuanto a la expresión de los marcadores de activación endotelial e inflamación, hay una menor expresión de E-selectina, TNF e IL1-β en los animales que recibieron heparina, en el análisis realizado después de la reperfusión y durante el seguimiento, en comparación con los grupos que no recibieron heparina. El uso de tromboelastometría a lo largo del estudio sirvió para evaluar la correcta dosificación de tPa en el grupo 2, y de heparina en el grupo 3. 81 DISCUSIÓN 82 83 7. DISCUSIÓN 7.1. ESTUDIO 1 En este primer estudio, la constatación de la existencia de un patrón de hiperfibrinolisis en todos los potenciales donantes en asistolia es un hallazgo muy interesante, puesto que deja de justificar la necesidad del uso de fibrinolíticos en los DA como método de prevención de complicaciones biliares. Nuestros resultados, observados en una situación de PC no recuperada, se asemejan a los resultados observados en los estudios realizados por Scöchl y Viersen (18,17). En ellos, se recogían muestras de pacientes que sufrían una PC, ya fuera en el escenario de la parada o a su llegada al hospital. En el primer estudio, con muestras recogidas a los 6 minutos (RIC 3.5-9) se vio un patrón de hiperfibrinolisis en un 35.8% de los casos; y en el segundo estudio (muestras recogidas a su llegada al hospital, 42 ± 13 minutos), se vio en el 53% de los pacientes. Nosotros encontramos un patrón de hiperfibrinolisis en el 100% de los casos (fulminante en el 79% de ellos e intermedia en el 21%) 4. El tiempo de recogida de las muestras en nuestro caso fue de 85 minutos (RIC 75-102). El hecho de que a tiempos de extracción más prolongados se dieran más casos de hiperfibrinolisis puede significar que a tiempos de isquemia caliente más prolongada, con mayor duración de la hipoperfusión tisular, mayor es el grado de fibrinólisis. Para comprender mejor la fisiopatología que subyace a esta observación, nos basamos en los estudios que se han realizado en la coagulopatía del paciente traumático. La hiperfibrinolisis en éste se da en aproximadamente el 25% de los casos 4 La hiperfibrinolisis objetivada por tromboelastomería se definió como tal cuando se daba una lisis máxima del coágulo (ML) superior al 20% dentro de los primeros 60 minutos tras el inicio de la formación del mismo. Nos referíamos a hiperfibrinolisis intermedia cuando el coágulo se rompía pasados los primeros 30 minutos (pero antes de los 60), y fulminante cuando se rompía antes de los primeros 30 minutos. 84 a su llegada al hospital (26,59,60). Clásicamente, se consideraba que ésta era de consumo, habiéndose desencadenado tras una situación de hipercoagulabilidad previa (26,61,62). Teniendo en cuenta el modelo celular de la coagulación (63), tras una primera fase de iniciación, se dar la amplificación y propagación del coágulo. Es en esta fase en la que se da el mayor paso de protrombina a trombina, y de fibrinógeno a fibrina. Para contrarrestar la excesiva trombogénesis, la fase final es la que se conoce como fase de resolución o fibrinólisis (64). Esta evita la excesiva sobreproducción del coágulo. El principal mediador de la fibrinólisis es la plasmina, que facilita el paso de fibrina a productos de degradación de la fibrina (PDF). El paso de plasminógeno a plasmina se ve estimulado, a su vez, por el activador tisular del plasminógeno (tPA) (Figura 4). Figura 4: Tras la formación de trombina, que estimula a su vez el coágulo maduro con depósitos de fibrina; la fibrinólisis viene dada por la activación de plasminógeno a plasmina por parte del activador tisular del plasminógeno. tPA: activador tisular del plasminógeno. PDF: productos de degradación de la fibrina. Tradicionalmente se consideraba que esta activación del tPA venía dada en respuesta a la formación excesiva de trombina y la oclusión venosa (65), y que la coagulopatía del traumático venía dada por el nivel de lesión tisular asociada, así como por la acidosis, hipotermia y un factor dilucional (59). tPA lisis del coágulo plasmina plasminógeno trombina protrombina estabilización del coágulo fibrinógeno fibrina PDF 85 No obstante, existen estudios que hablan una situación de hipocoagulabilidad independiente del traumatismo, debida fundamentalmente al grado de hipoperfusión tisular (23,66,67). En el estudio de Brohi, se realizó una analítica a aquellos pacientes politraumáticos que llegaban al hospital. En éstos se vio que los tiempos de protrombina (TP) y de cefalina (ttpa) eran independientes del nivel de consumo de factores de la coagulación, ya que la cantidad de trombina generada (inferida según sus fragmentos de protrombina, PF1 y PF2, encontrados) no alteraba dichos tiempos. La disminución de TP y el alargamiento del tiempo de cefalina sólo se vieron alterados cuando se daba hipoperfusión tisular, medida por el exceso de base. Varios estudios con resultados similares (26,68,69) han servido para definir la situación clínica conocida como coagulopatía aguda del traumático (ACoT en su acrónimo en inglés, Acute Coagulopathy of Trauma), en la que la hipocoagulabilidad e hiperfibrinolisis viene dada no tanto por una situación de consumo de factores, si no por una situación de perfusión inadecuada que estimula la salida de trombomodulina del endotelio. Ésta se une a la trombina y, de forma conjunta, el complejo trombina-trombomodulina activa la proteína C, inhibidora del Inhibidor del Activador del Plasminógeno (PAI). El PAI es a su vez inhibidor del tPA. Así pues, esta doble inhibición conlleva en última instancia una activación del tPA, cuya actividad se ve incrementada por partida doble, ya que la hipoperfusión también estimula la salida directa de tPA de la célula endotelial (70,71) (Figura 5). Otra hipótesis de porqué se produce esta situación, independientemente del grado de consumo, es la que se refiere a la lesión del glicocálix. Se basa en que, secundariamente al denudamiento del glicocálix, se secretan substancias heparinoides (heparan sulfato, condroitín sulfato) que incrementan la eficacia del tándem trombina- trombomodulina (70)(72)(73). 86 Figura 5: La hipoperfusión y la lesión tisular estimularán la salida y activación de la trombina y la trombomodulina, que activarán la proteína C. Ésta inhibe el PAI, a su vez inhibidor del tPA. La doble inhibición, en última instancia, activa el tPA, que además presenta una mayor salida de la célula por la hipoperfusión. PAI: Inhibidor del Activador del Plasminógeno. tPA: activador tisular del plasminógeno. Estos mecanismos, ampliamente estudiados en el politraumático, son similares a la situación que se produce durante la isquemia caliente, y nos ayudar a explicar el patrón de hiperfibrinolisis que observamos tanto en los estudios de Viersen (17) y Schöchl (18) como en nuestro propio estudio con DA tipo 2. Por otro lado, los resultados de nuestro estudio no justifican la estrategia de la potencial utilidad del tPA para lisar los trombos de la microvasculatura (14,15,74) ya que ésta vendría determinada por una hipotética formación de trombos durante la isquemia caliente. En el primero de estos estudios, de Hashimoto y cols., se administró tPA a nivel arterial en el banco, antes de la colocación del injerto en el receptor. Los resultados en esta serie de casos mostraron una menor incidencia de complicaciones biliares no-anastomóticas (9%, en comparación con las series históricas que pueden llegar a hablar de hasta un 60% (6,54,75). Sin embargo, en los 22 injertos, antes de la administración de tPA se había administrado heparina, ya fuera en el donante antes de la parada cardíaca, o junto con la primera solución de preservación, según permitiera el protocolo aprobado en cada centro. En el segundo estudio, del grupo de Seal y cols., tPA trombina lesión tisular trombomodulina hipoperfusión activación proteína C PAI 87 se comparaba la administración de tPA en 85 DA con una cohorte histórica de 33 trasplantes en los que no se había administrado dicho tratamiento. De modo similar al estudio anterior, se observó una menor incidencia de lesiones biliares no anastomóticas en el grupo tratado (16.5%) versus el no tratado (33.3%) (p=0.07). No obstante, nuevamente se trata de un estudio en el que, por una parte, se administraba heparina pre-parada cardíaca en los donantes y, por otra, se comparaban los resultados del grupo tratado con una cohorte histórica, con lo cual, las mejoras técnicas podrían haber determinado la mejor viabilidad de los injertos en el grupo de estudio. Los resultados son similares al tercer estudio, de Kubal y cols. La crítica más importante de estos dos estudios es la de que el uso de heparina pre-parada cardíaca contravendría la necesidad de administrar fibrinolítico a posteriori, dado que la heparina previene la formación de trombos, con lo cual no debería haber depósitos de fibrina que lisar. En estudios experimentales realizados en un modelo murino (13) y canino (12) en los cuales se administró fibrinolítico (estreptoquinasa en el primer caso, uroquinasa en el segundo), se determinó que se producía una mejora en la integridad estructural y del funcionalismo del injerto, pero no aparecían depósitos de fibrina post-parada cardíaca. El mismo resultado se reprodujo en un estudio realizado en humanos (16) en el que se administró estreptoquinasa para evaluar la mejora del funcionalismo renal. Además, en los tres estudios se administró heparina pre parada cardíaca que, nuevamente, iría en contra de la necesidad de administrar fibrinolítico post parada. En un estudio más reciente (31), se analizó la incidencia real de depósitos de fibrina en la microvasculatura hepática. Se recogieron un total de 94 biopsias procedentes de 16 DA, y se analizaron 282 secciones en distintos tiempos. Sólo en 4 de las 282 secciones se observó, mediante tinción específica de Lendrum, la presencia de depósitos de fibrina. Dentro del mismo estudio, se compararon las biopsias procedentes de los receptores que desarrollaron estenosis biliares no anastomóticas durante el seguimiento, ya fueran de injertos procedentes de DA o de DME. Se 88 observó que no había una mayor incidencia de microtrombos en aquellos injertos procedentes de DA con respecto a los de DME , ni en aquellos injertos que desarrollaban estenosis biliares no anastomóticas frente a los que no. En otro estudio (32), en el que se incluyeron 128 pacientes trasplantados en los que se realizaron biopsias hepáticas del injerto en el momento del implante, sólo se encontraron microtrombos en un 2.7% de los hígados que posteriormente desarrollaron colangiopatía isquémica. Después de considerar toda la información previa, junto a la constatación del estado de hiperfibrinolisis observada en nuestros pacientes a su llegada al hospital, bien sea mediada directamente por una situación de hipoperfusión o siendo secundaria a una coagulopatía de consumo (62)(73)(76), podría inferirse que el uso de fibrinolíticos para lisar los posibles trombos generados durante el periodo de isquemia caliente no está justificado. Uno de los objetivos secundarios de nuestro estudio clínico era determinar si las alteraciones de la correlacionab . A nivel hepático, nuestros resultados mostraron una correlación inversa entre el tiempo de inicio de la lisis y el pico de transaminasas (AST) a la llegada al hospital (en la primera analítica), es decir, a menor estabilidad del coágulo según el análisis por ROTEM, mayor pico de transaminasas. En relación a la utilización de los riñones, de los 33 potenciales donantes renales fueron efectivos 19, y de ellos se trasplantaron 22 órganos. En este caso, lo que observamos es que a una mayor estabilidad del coágulo (menos porcentaje de lisis a los 30 minutos) había un mayor flujo de la arteria renal y unas resistencias menores durante el periodo de PRAN. Aunque nuestro estudio no estaba específicamente diseñado con este objetivo, podría considerarse el uso de tromboelastometría para evaluar la potencial viabilidad de los injertos provenientes de DA. 89 7.2. ESTUDIO 2 Lo más interesante de nuestro segundo estudio son los resultados referentes al efecto citoprotector de la heparina, al margen de su efecto anticoagulante. Además, los resultados de este estudio corroboran lo que ya observamos en el primero, es decir, la no-justificación, con la evidencia actual, del tratamiento con fibrinolíticos en donantes en asistolia después de la parada cardíaca. Realizamos este estudio experimental en un modelo de animal grande, ya previamente validado por nuestro grupo (22). Se reprodujo la situación clínica de los DA tipo 2 para valorar la verdadera necesidad del uso de fibrinolítico tras la parada cardíaca, y su efecto en el funcionalismo hepático. La situación de los DA tipo 2 es una situación no controlada, que suele implicar un tiempo de isquemia caliente más o menos largo, desde la inesperada parada cardio-respiratoria hasta el momento de la extracción del órgano y el inicio de su preservación fría. La realización de una perfusión abdominal normotérmica previa a este periodo de isquemia fría ha demostrado, tanto a nivel experimental (10,55,77), como en la clínica humana (78), que es un método efectivo para la mejora de la función del injerto, tanto hepático como renal. La técnica de PRAN determina un proceso de recuperación energética a nivel celular, por el cual la célula obtiene las condiciones fisiológicas y el substrato necesario para su mejora antes del almacenamiento en frío y el implante en el receptor (79,80,81). En nuestro centro y desde el año 1994, se ha instaurado un protocolo de obtención de órganos procedentes de DA tipo 2 con PRAN (11). Cuando se compara con la sangre humana, la sangre porcina contiene una mayor cantidad de fibrinógeno, plaquetas, y factor inhibidor del plasminógeno; y una menor concentración de plasminógeno. No obstante, el modelo porcino se ha validado como modelo para estudiar la coagulación y la fibrinólisis (82), incluso mediante la tromboelastometría (83). En nuestro caso, el uso del análisis tromboelastométrico en 90 todas las fases del proceso nos sirvió para garantizar la adecuada dosis de fármaco, ya fuera fibrinolítico post PCR, o heparina pre-PCR. La administración de heparina pre-PCR nos sirvió para analizar su efecto en los DA tipo 3 (controlados) en nuestro medio 5 (84). Aunque los DA controlados no presentan una situación de isquemia caliente tan evidente como la que se da en los DA tipo 2; en la fase agónica sí se da una progresiva hipotensión hasta la PCR. Es en esta fase de hipotensión extrema, con hipoperfusión tisular, cuando se desencadena la coagulopatía secundaria a la misma (23,66,67). Se cree que esto podría ser debido a un mecanismo de protección del organismo que, ante una situación de escaso aporte de oxígeno, pretende garantizar su llegada a nivel tisular mediante la lisis de cualquier trombo que se pudiera formar (70). Se ha descrito esta situación como ‘endoteliopatía inducida por shock’ (SHINE, del inglés ‘shock induced endoteliopathy’), en la que el objetivo es mejorar la perfusión cuando la oxigenación está severamente afectada (85). Esta teoría concuerda con nuestros resultados, y con lo visto previamente en el estudio en clínica humana: tras someter a los animales a 60 minutos de parada cardíaca, se realizó una primera biopsia hepática para analizar la posible aparición de depósitos de fibrina (86). En ninguna de las dos posibles situaciones que se daban en este momento (animales tratados con heparina pre-PCR o no) se vio la aparición de depósitos de fibrina. Recordemos que ya en los estudios realizados en animales (12,13) o en humanos (16,31,77) no se describía la aparición de depósitos de fibrina. Por su parte, en aquellos animales a los que se les había administrado heparina previo a la parada cardíaca, se vio un mantenimiento de la estructura hepática mejor que aquella de los animales en los que no se había administrado heparina pre-parada. La lesión del epitelio biliar es común durante el periodo de isquemia, siendo el 5 Según la legislación vigente en cada país, se permite la administración de heparina pre-parada cardíaca antes de la limitación del esfuerzo terapéutico para la donación de órganos en DA tipo III. 91 colangiocito especialmente sensible a la hipoxia celular (8,32,87-89). Las series son variables, pero la lesión biliar post-trasplante ocurre en hasta el 60% de los casos (51). Distintos estudios (32,90-92) han analizado con mayor detenimiento la fisiopatología a nivel celular, y el momento de aparición de la lesión. A partir de análisis tisular, en distintos momentos, se observa que dicha lesión ya se encuentra presente tras el tiempo de isquemia fría, sin necesidad de que se dé la reperfusión para ver una alteración de la arquitectura biliar del tejido conectivo. El análisis histológico de la lesión hepática por isquemia-reperfusión se basó en el índice de Suzuki (93,94), evaluándose el grado de congestión hepática, vacuolización hepatocelular y necrosis. Dicho índice de severidad de la lesión oscila entre el 0 y el 4, siendo el 0 la ausencia total de lesión, y el 4 un grado de lesión severa, con más del 60% de necrosis. En nuestro estudio, la congestión y la vacuolización eran similares en todos los grupos post parada, pero había una menor necrosis en el grupo que había sido previamente tratado con heparina. Para evaluar específicamente la lesión a nivel del colangiocito se realizó el análisis immunohistoquímico con CK-19, con resultados similares: en aquellos animales previamente tratados con heparina, las biopsias a los 5 días post trasplante mostraron una menor alteración de la estructura del colangiocito, con mantenimiento de la estructura biliar: una monocapa uniforme de células cuboideas (88). Los marcadores inflamatorios (IL1-beta, IL6, TNF y e-selectina) analizados a lo largo de los tiempos de estudio también mostraron una mayor elevación en aquellos animales que no habían sido tratados con heparina en comparación con aquellos que sí fueron tratados. Finalmente, si analizamos el funcionamiento del injerto a lo largo de los 5 días de seguimiento postoperatorio, vemos que hubo una más rápida recuperación en aquellos injertos que habían recibido heparina, puesto que el pico de transaminasas era menor, y el incremento de los valores del TP también se daban con mayor velocidad. 92 La heparina no sólo tiene un efecto de mejora de la función hepática por una disminución de formación del coágulo (33,95). Diversos estudios han demostrado que la administración de heparina (96-100) tiene efectos citoprotectores independientes a su efecto anticoagulante (34). En un estudio murino experimental realizado por Taha en el 2009 (97) se vio que el uso de heparina antes de la reperfusión disminuía las lesiones centrolobulilllares en el hígado de los animales pre-tratados. Existen otros estudios realizados con objetivos similares en distintos órganos, en los que se ve una menor lesión inflamatoria en aquellos órganos tratados con heparina versus aquellos en los que no se administró. Aunque se podría argüir que le efecto citoprotector de la heparina en estos casos viene dado por su efecto preventivo de la formación del trombo, que a su vez disminuiría la lesión por isquemia/reperfusión; se cree que la heparina tiene un efecto más directo al disminuir la expresión de moléculas de adhesión celular (98), disminuyendo la infiltración por neutrófilos y la lesión inflamatoria directa. Recordemos que la lesión por isquemia/reperfusión incluye una respuesta inflamatoria excesiva (41-50); por lo que este efecto de la heparina justificaría su uso en esta situación. Otros estudios sugieren que la heparina y sus derivados actúan eliminando a los radicales libres e inhibiendo la apoptosis (101-105). Para finalizar, recordemos que en ninguno de los casos en los que se administró fibrinolítico post parada cardíaca se vieron las mejoras que sí se vieron en los animales pre-tratados con heparina. Este hecho, junto con la ausencia de depósitos de fibrina post-parada cardíaca, asociado al potencial riesgo que representa la administración de fibrinolítico, al incrementar la posibilidad de hemorragia en el postoperatorio, determina que la recomendación de la administración de dichos agentes no pueda justificarse. 93 CONCLUSIONES 94 95 8. CONCLUSIONES Los injertos hepáticos procedentes de donación en asistolia tienen una menor viabilidad que los procedentes de donantes en muerte encefálica, con una mayor incidencia de estenosis biliar de origen isquémico. El hecho de que estas complicaciones biliares sean debidas a la formación de microtrombos en el plexo peribiliar puede ponerse en entredicho, dado que no se ha demostrado la existencia de los mismos en injertos hepáticos tras la parada cardíaca, ni una mayor incidencia de trombos en aquellos injertos que desarrollan estenosis biliares de origen isquémico frente a aquellos injertos que no las desarrollaron. En los donantes en asistolia se desarrolla un estado en el que, debido a la hipoperfusión, se estimula la fibrinólisis endógena. Dicha fibrinólisis se genera a través de la cascada de la proteína C y la secreción de tPA, y se relaciona directamente con el tiempo de isquemia caliente. Por lo tanto, la fibrinólisis medida por tromboelastometría podría correlacionarse con el grado de viabilidad del injerto, y servir como marcador indirecto de la calidad del mismo. La administración de heparina antes de la parada cardíaca ha demostrado su utilidad para mejorar tanto la efectividad de la aplicación de la PRAN como la viabilidad y evolución del injerto post-trasplante. El uso de los agentes fibrinolíticos para la prevención de la aparición de las estenosis biliares de origen isquémico no está justificada en el momento actual. 97 BIBLIOGRAFÍA 98 99 9. BIBLIOGRAFÍA 1. ONT. Memoria Trasplante Hepático 2016. 2017 Jun 9;:1–22. 2. Fondevila C, Jiménez-Galanes S, García-Valdecasas JC. ¿Cómo incrementar el número de trasplantes hepáticos? Gastroenterología y Hepatología. 2009 Aug;32(7):519–30. 3. Kootstra G, Daemen JH, Oomen AP. Categories of non-heart-beating donors. TPS. 1995 Oct;27(5):2893–4. 4. Fondevila C, Busuttil RW, Kupiec-Weglinski JW. 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ABREVIATURAS ACOT acute coagulopathy of trauma o coagulopatía aguda del traumático ALAT alanina aminotransferasa ASAT aspartato aminotransferasa ATP adenosín-trifosfato CXC quimiocina C CI colangiopatía isquémica DME donantes en muerte encefálica DA donantes en asistolia GGT gamma glutamil transferasa IL1-β interleuquina-1-beta IMC índice de masa corporal LOT lysis onset time ML maximal lysis PAI plasminogen activator inhibitor o inhibidor del activador del plasminógeno PC parada cardíaca PCEH parada cardíaca extra hospitalaria PCR parada cardio-respiratoria PDF productos de la degradación del fibrinógeno PF 1 prothrombin fragment 1 PF 2 prothrombin fragment 2 PRAN perfusión regional abdominal normotérmica RCP reanimación cardiopulmonar RIC rango intercuartílico RLO radicales libres de oxígeno ROTEM rotational thromboelastometry o tromboelastometría rotacional 112 SHINE shock-induced endotheliopathy o endoteliopatía inducida por shock TNF tumor necrosis factor o factor de necrosis tumoral TP tiempo de protrombina tPa tissue plasminogen activator o activador tisular del plasminógeno ttpa tiempo de tromboplastina parcial activado o tiempo de cefalina 10.1. ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1………………………………………………………………………………………………………………………34 Figura 2………………………………………………………………………………………………………………………36 Figura 3………………………………………………………………………………………………………………………40 Figura 4………………………………………………………………………………………………………………………84 Figura 5………………………………………………………………………………………………………………………86