Integrative approach to address the heterogeneity and progression of Idiopathic Pulmonary Fibrosis: role of the immune response

Abstract

[eng] BACKGROUND: Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a progressive lung disease with unknown aetiology. It is believed that abnormally activated and/or damaged lung epithelial cells secrete a panel of profibrotic mediators that leads to extracellular matrix deposition, destruction of the lung architecture and recruitment of inflammatory cells. However, in this setting, the role of the immune response in the pathogenesis and progression of IPF remains controversial.

HYPOTHESIS AND OBJECTIVES: The investigation of peripheral blood and lung immune cell populations in relation to different phenotypes (and endotypes) may provide new insights into IPF pathobiology and progression. The two specific aims are: 1) to characterize the peripheral immune cell profile and its association with IPF progression, and 2) to explore the level of immune infiltrate in lung tissue and its association with IPF heterogeneity.

Methods: Whole blood immunological cell profile was determined by flow cytometry at diagnosis in 32 IPF patients, and 32 age- and smoking-matched healthy controls. Thirty-one IPF patients were followed up for one year and categorized as stable or progressors based on lung function deterioration and/or death. At 18–60 months, immunophenotypes were characterized again. Regarding aim two, immune signatures were assessed with Gene Set Variation Analysis (GSVA) and applied to the lung transcriptome of 109 IPF patients from the Lung Tissue Research Consortium (LTRC), followed by unbiased cluster analysis of GSVA immune-enrichment scores. Results were experimentally validated using flow cytometry analysis in the lung tissue of 26 IPF patients from the University of Pittsburgh. Finally, differential gene expression and hypergeometric test were used to explore non-immune differences between clusters.

RESULTS: IPF patients showed alterations in the peripheral immune cell profile at diagnosis, compared to healthy controls, that were associated with lung function abnormalities. Patients with progressive IPF, despite antifibrotic therapy, presented an over-activated and exhausted immunophenotype at diagnosis, which was maintained over time. For the second aim, two clusters (C#1 and C#2) of IPF patients were identified: C#1 (n=58) presented an enrichment in GSVA immune signatures (mainly cytotoxic and memory T cells signatures), compared to C#2 (n=51). Those results were validated by flow cytometry with similar unbiased clustering generation. Differential gene expression between clusters identified differences in cilium, epithelial and secretory cell genes, showing an inverse correlation with the immune response signatures. Interestingly, both clusters showed similar clinical features.

CONCLUSIONS: Patients with IPF showed significant alterations in the peripheral blood immunological profile at diagnosis, especially those with IPF progression who presented a dysregulated T CD8+ cells compartment, and an inverted CD4/CD8 ratio suggesting an over-activated, aged, and “exhausted” immune status potentially related to intracellular antigens. Moreover, two clusters of patients with very different levels of immune signatures and gene expression were identified in end-stage IPF lung tissue, despite showing similar clinical characteristics. However, whether these immune clusters can differentiate diverse disease trajectories remains unexplored.

[spa] INTRODUCCIÓN: La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es una enfermedad pulmonar progresiva de etiología desconocida. Se cree que las células epiteliales pulmonares dañadas secretan mediadores profibróticos que conducen al depósito de matriz extracelular, destrucción pulmonar y reclutamiento de células inflamatorias. Sin embargo, en este contexto, el papel de la respuesta inmunitaria en la patogénesis y la progresión de la FPI sigue siendo controvertido. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS: La investigación de las poblaciones de células inmunitarias pulmonares y de sangre periférica en relación con diferentes fenotipos/endotipos puede aportar nuevos conocimientos sobre la patobiología y la progresión de la FPI. Los objetivos específicos son: 1) caracterizar el perfil de células inmunitarias periféricas y su asociación con la progresión de la FPI, y 2) explorar el nivel de infiltrado inmunitario en el tejido pulmonar y su asociación con la heterogeneidad en FPI.

MÉTODOS: Se determinó mediante citometría de flujo en sangre total el perfil inmunológico en el momento del diagnóstico en 32 pacientes con FPI y en 32 controles sanos emparejados por edad y tabaquismo. 31 pacientes con FPI fueron sometidos a seguimiento durante un año y clasifica- dos como estables o progresivos en función del deterioro de la función pulmonar y/o la muerte. A los 18-60 meses, se volvieron a caracterizar los inmunofenotipos. En relación con el segundo objetivo, se evaluaron las firmas inmunitarias con el Gene Set Variation Analysis (GSVA) y se apli- caron al transcriptoma pulmonar de 109 pacientes con FPI del Lung Tissue Research Consortium (LTRC), seguido de un análisis de clustering no sesgado del enriquecimiento inmunitario del GSVA. Los resultados se validaron experimentalmente en tejido pulmonar de 26 pacientes con FPI de la Universidad de Pittsburgh. Por último, mediante análisis de expresión génica diferencial se exploraron las diferencias no inmunitarias entre los clusters.

RESULTADOS: Los pacientes con FPI mostraron alteraciones en el perfil inmunitario periférico en el momento del diagnóstico, en comparación con los controles, que se asociaron a anomalías en la función pulmonar. Los pacientes con FPI progresiva, pese al tratamiento antifibrótico, presentaban un inmunofenotipo “sobreactivado” y “agotado” en el diagnóstico, que se mantenía con el tiempo. En relación al segundo objetivo, se identificaron dos clusters de pacientes con FPI: C#1 (n=58) enriquecido en firmas inmunes (células T citotóxicas y de memoria), en comparación con C#2 (n=51). Estos resultados se validaron mediante citometría de flujo con una generación de clusters similar. A nivel de expresión génica, se identificaron diferencias en los genes de células ciliadas, epiteliales y secretoras, mostrando una correlación inversa con las firmas de respuesta inmunitaria. Curiosamente, ambos grupos mostraron características clínicas similares.

CONCLUSIONES: Los pacientes con FPI mostraron alteraciones significativas en el perfil inmunológico periférico, especialmente aquellos con progresión de la FPI que presentaban un compartimento de células T CD8+ desregulado, y una relación CD4/CD8 invertida. En el tejido pulmonar de pacientes con FPI terminal, se identificaron dos grupos con niveles muy diferentes de firmas inmunes y expresión génica, a pesar de mostrar características clínicas similares. Sin embargo, se desconoce si estos grupos inmunitarios pueden diferenciar diversas trayectorias de la enfermedad.