Study of DNA-Ion interactions using nanopore translocation and optical tweezers

Abstract

[eng] This thesis uses two complementary single-molecule techniques, nanopipette microscopy and optical tweezers, to investigate the impact of various monovalent salts at high concentrations in DNA. The thesis begins by characterizing the conductance and noise properties of nanopipettes in a wide range of concentrations. Once the nanopipettes have been characterized, they are used to conduct DNA translocation experiments to examine how different cations influence their translocation parameters. These experiments also allow us to explore the effects of applied voltage and salt concentration on DNA folding configurations during translocation. In addition, we explore why compact DNA folding configurations have lower dwell times compared to longer folding configurations. Finally, optical tweezers are used to carry out stretching experiments on a DNA fork, providing information on DNA stability under conditions of high ionic strength related to DNA translocation experiments. The thesis is divided into six parts. Part I provides an introduction to the experimental techniques used throughout this work, along with the theoretical frameworks and concepts that will be needed for Parts II, III and IV. This part is divided into three chapters. Chapter 1 is an introduction to the nanofear field. The chapter describes the setup and basic concepts required to perform electrical measurements with nanopipettes and discusses the limits of resolution of the technique. The main sources of noise when experiments with nanopores are carried out are also described. Also, some relevant nanofluidic phenomena are introduced when working at the nanoscale, along with some theoretical foundations on the regulation of surface load. Finally, some previous results of DNA translocation through nanopores are shown. Chapter 2 introduces the optical trap and mini-tweezers configuration that was used to perform the experiments in this thesis. Chapter 3 introduces the basic components and structure of nucleic acids, focusing on DNA, which will be the biomolecule studied throughout the thesis. The chapter concludes by presenting the theoretical foundations of two elastic models used to describe the elastic properties of polynucleotides. Part II contains results of experiments with nanopipettes. It begins with chapter 4, where the conductance of nanopipettes for different salt concentrations is studied, comparing the contributions of conductance in volume and surface area and the effect of pH on surface loading. In addition, two conductivity models are compared to model the conductance of nanopipettes with concentration. In addition, the blinking noise of the nanopipettes is analyzed, exploring how the parameters that describe the noise change with concentration and tension. Chapter 5 presents λ-DNA translocation experiments in different monovalent salts. This chapter investigates the effect of concentration and cation type on translocation parameters such as residence time, electric current blocking, and charge blocking of λ-DNA translocations. The chapter focuses on how the cation-DNA interaction changes with the size of the cation. Chapter 6 studies the different folding configurations that occur during DNA translocation and how they depend on salt tension and concentration. To do this, an analysis of the different levels that occur during λ-DNA translocation and the residence time of the different levels is carried out. The analysis also allows us to extract general data on DNA translocation through nanopipettes. Finally, the causes of the lower dispersion of the dwell time of the more compact folding configurations compared to the longer folding configurations are explored. Part III includes experiments with optical tweezers. In Chapter 7, optical tweezers are used to conduct stretching experiments of long DNA forks at high ionic concentrations of various monovalent salts. The average opening force and the effect of concentration on fork stability are investigated. The chapter concludes with a joint discussion of the results of translocation experiments and optical tweezers at high salt concentrations. Part IV contains the results of a one-month international stay. Chapter 8 includes a brief introduction to the SPRNT (Single-molecule picometer resolution nanopore tweezers) technique, which was used to perform experiments with the Hel308 helicase. In addition, some preliminary experiments of the with the gp41 helicase using SPRNT are presented. Part V contains the final conclusions of the thesis and the future perspectives of the work. Part VI consists of all the Appendices. Appendices E and C complement the results of some of the chapters, while Appendices A, B, F, and D describe in detail the most important experimental protocols and MATLAB codes used in the development of the thesis.

[cat] Aquesta tesi utilitza dues tècniques complementàries de molècula individual, la microscòpia de nanopipeta i les pinces òptiques, per investigar l’impacte de diverses sals monovalents a concentracions elevades en l’ADN. La tesi comença caracteritzant les propietats de la conductància i el soroll de les nanopipetes en un ampli rang de concentracions. Un cop caracteritzades les nanopipetes, s’utilitzen per dur a terme experiments de translocació de l’ADN per examinar com diferents cations influeixen en els seus paràmetres de translocació. Aquests experiments també ens permeten explorar els efectes de la del voltatge aplicat i la concentració de sal en les configuracions de plegament de l’ADN durant la translocació. A més, explorem per què les configuracions compactes de plegament de l’ADN presenten temps d’estada més baixos en comparació amb les configuracions de plegament més allargades. Finalment, s’utilitzen pinces òptiques per dur a terme experiments de d’estirament en una forquilla d’ADN, proporcionant informació sobre l’estabilitat de l’ADN en condicions d’alta força iònica relacionades amb els experiments de translocació de l’ADN. La tesi es divideix en sis parts. La Part I proporciona una introducció a les tècniques experimentals utilitzades al llarg d’aquest treball, juntament amb els marcs teòrics i conceptes que seran necessaris per a les parts II, III i IV. Aquesta part es divideix en tres capítols. El capítol 1 és una introducció al camp de nanopor. El capítol descriu la configuració i els conceptes bàsics necessaris per realitzar mesures elèctriques amb nanopipetes i discuteix els límits de resolució de la tècnica. També es descriuen les principals fonts de soroll quan es duen a terme experiments amb nanopors. També, s’introdueixen alguns fenòmens nanofluídics rellevants quan es treballa a nanoescala, juntament amb alguns fonaments teòrics sobre la regulació de la càrrega superficial. Finalment, es mostren alguns resultats previs de translocació d’ADN a través de nanopors. El capítol 2 introdueix la trampa òptica i la configuració del mini-tweezers que es va utilitzar per realitzar els experiments en aquesta tesi. El capítol 3 introdueix els components bàsics i l’estructura dels àcids nucleics, centrant-se en l’ADN, que serà la biomolècula estudiada al llarg de la tesi. El capítol conclou presentant els fonaments teòrics de dos models elàstics emprats per descriure les propietats elàstiques dels polinucleòtids. La Part II conté resultats d’experiments amb nanopipetes. Comença amb el capítol 4, on s’estudia la conductància de les nanopipetes per a diferents concentracions de sal, comparant les contribucions de la conductància en volum i superfície i l’efecte del pH sobre la càrrega superficial. A més, es comparen dos models de conductivitat per modelitzar la conductància de les nanopipetes amb la concentració. A més, s’analitza el soroll de parpelleig les nanopipetes, explorant com canvien els paràmetres que descriuen el soroll amb concentració i tensió. El capítol 5 presenta experiments de translocació λ-ADN en diferents sals monovalents. Aquest capítol investiga l’efecte de la concentració i el tipus de catió en els paràmetres de translocació com el temps d’estada, el bloqueig de la corrent elèctrica i el bloqueig de càrrega de les translocacions λ-DNA. El capítol se centra en com la interacció catió-ADN canvia amb la mida del catió. El capítol 6 estudia les diferents configuracions de plegament que es produeixen durant la translocació de l’ADN i com depenen de la tensió i la concentració de sal. Per a això, es fa una anàlisi dels diferents nivells que es produeixen durant la translocació λ-DNA i el temps de residència dels diferents nivells. L’anàlisi també ens permet extreure dades generals sobre la translocació de l’ADN a través de nanopipetes. Finalment, s’exploren les causes de la menor dispersió del temps d’estada de les configuracions de plegaments més compacte respecte a les configuracions de plegament més allargades. La part III inclou experiments amb pinces òptiques. En el capítol 7, les pinces òptiques s’utilitzen per dur a terme experiments d’estirament de llargues forquilles d’ADN a altes concentracions iòniques de diverses sals monovalents. S’investiga la força mitjana d’obertura i l’efecte de la concentració en l’estabilitat de la forquilla. El capítol conclou amb una discussió conjunta dels resultats dels experiments de translocació i pinces òptiques en altes concentracions de sal. La part IV conté resultats d’una estada internacional d’un mes. El capítol 8 inclou una breu introducció a la tècnica SPRNT (Single-molecule picometer resolution nanopore tweezers), que es va utilitzar per realitzar experiments amb l’helicasa Hel308. A més, es presenten alguns experiments preliminars de la amb l’helicasa gp41 helicasa fent servir SPRNT. La part V conté les conclusions finals de la tesi i les perspectives futures del treball. La Part VI consta de tots els Apèndixs. Els Appendices E i C complementen els resultats d’alguns dels capítols, mentre que els Appendices A, B, F i D descriuen en detall els protocols experimentals més importants i els codis MATLAB utilitzats en el desenvolupament de la tesi.