Epigenetic determinants of differentiation in monocyte subsets: implications in autoimmune disease

Abstract

[eng] Monocytes are an extremely plastic and heterogeneous cell type with fundamental roles in the innate immune system. Single-cell omic studies have revealed a broad range of unique phenotypes and behaviors in the cells comprising this myeloid population which has been historically studied as a single category. In order to approach their study through bulk techniques, monocyte cells are grouped into smaller subpopulations to simplify their heterogeneity. The most common classification generates three non-overlapping subsets based on the expression of the surface molecules CD14 and CD16. The subsets receive the names of classical (cMO), intermediate (iMO) and non-classical monocytes (ncMO) and they originate via a sequential differentiation process in the reported order. The mechanisms leading their differentiation progress in humans are unknown. Individual and differentiated immune functions have been attributed to each subset. Also, differences in the proportions of monocyte subsets are reported in multiple physiological and pathological conditions. However, specific contributions of the monocyte subsets to disease development have rarely been explored. In this thesis, the molecular mechanisms regulating human monocyte subset differentiation were explored. Additionally, monocyte subset contribution to the pathophysiology of the autoimmune disease of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) was also inspected. Both studies applied a combination of bulk epigenomic and transcriptomic explorations of the monocyte subsets paired with the integration of exceptional single-cell RNA-seq datasets. Firstly, the differentiation process of monocyte subsets was studied in steady state. Through the study of the DNA methylome and transcriptome of the subsets we observed their linear path of origin. Gene ontology analyses of the differentially methylated positions and the differentially expressed genes associated with immunological functions previously ascribed to each subset in the literature. As anticipated, we described a significant correlation between methylation levels at certain positions and expression of the associated genes, particularly for positions located at promoters and intronic regions. Most surprisingly, we discovered a role for two transcription factors throughout this differentiation process: HIF-1α and T-bet. HIF-1α and its target genes were significantly less methylated and more expressed in cMOs. T-bet, which had never before been observed in unstimulated monocytes, presented an opposing behavior by being predominant in ncMOs. Integration with a dataset from a homozygous mutant for the gene encoding T-bet proved the role this transcription factor has in the development of the myeloid compartment in general and in ncMOs in particular. In this individual, functions previously attributed to ncMOs, such as TNF secretion, appeared affected by the mutation. Similarly, HIF-1α signature was aberrantly regulated in the mutant, confirming our previously proposed interaction between the two factors. Secondly, we investigated the role of the monocyte subsets in the autoimmune disease of SLE. We collected an extensive cohort of more than 20 SLE patients at the onset of a flare episode as well as samples from 10 healthy controls. DNA methylation profiles of the monocyte subsets from these samples revealed the predisposition of each subset to respond differentially to the inflammatory environment present in the disease. cMOs presented a high association of demethylation patterns with the family of transcription factors Fos/Jun. These results suggest propensity to macrophagic differentiation from these cells. ncMOs presented fewer specific differences but they were directed towards phenotypes best described in T lymphocytes, indicating a potential strengthened interaction between this subset and T cells. iMOs phenotypes were recurrently observed in between the other two extreme subsets. Transcriptomic profiling revealed cMOs as the subset with higher capability to respond to the inflammatory milieu of SLE, probably due to their less differentiated initial state. We also described an association of both datasets with disease activity, particularly regarding the methylation and expression of components of the STAT pathway. Additionally, we reported three CpGs that could be used as prognosis marker predicting the outcome of the flare episode. Finally, integration with a large single-cell RNA-seq dataset revealed the high heterogeneity of SLE samples and how the composition of our bulk samples was enriched by pathological cell subdivisions.

[cat] Els monòcits són un tipus cel·lular extremadament plàstic i heterogeni amb funcions fonamentals pel sistema immunitari innat. Els estudis òmics de cèl·lula única han revelat una àmplia gamma de fenotips i comportaments diferenciats de les cèl·lules que componen aquesta població mieloide, la qual històricament s'ha estudiat com una sola categoria. Per tal d'abordar el seu estudi mitjançant tècniques massives, els monòcits s'agrupen en subpoblacions simplificant la seva heterogeneïtat. La classificació més freqüent genera tres subconjunts basats en l'expressió de les molècules de superfície CD14 i CD16. Aquestes subpoblacions reben els noms de monòcits clàssics (cMO), intermedis (iMO) i no clàssics (ncMO) i s'originen mitjançant un procés de diferenciació seqüencial en l'ordre presentat. S'han atribuït funcions immunitàries úniques i diferenciades a cada subpoblació. A més, s’han reportat canvis en les proporcions de les subpoblacions de monòcits en múltiples condicions tant fisiològiques com patològiques. No obstant, poques vegades s'han explorat les contribucions específiques dels subconjunts de monòcits al desenvolupament d’una malaltia. Actualment, es desconeixen els mecanismes que condueixen la seva diferenciació en humans. En aquesta tesi, s’han estudiat els mecanismes moleculars que podrien regular aquesta diferenciació alhora que s’ha analitzat la contribució de les subpoblacions a la fisiopatologia de la malaltia autoimmune del lupus eritematós sistèmic (LES). Tots dos estudis apliquen una combinació d'exploracions epigenòmiques i transcriptòmiques de les subpoblacions de monòcits combinades amb la integració de de dades d'RNA-seq de cèl·lula única. En primer lloc, s’ha estudiat el procés de diferenciació de subpoblacions de monòcits en estat basal. Mitjançant l'estudi del metiloma del DNA i del transcriptoma de les subpoblacions hem observat el seu procés lineal de diferenciació. Mitjançant l’anàlisi d'ontologia gènica de les posicions diferencialment metilades i dels gens expressats de manera diferencial hem trobat associacions amb funcions immunològiques que anteriorment s’havien atribuït a cada subpoblació. De manera destacable, hem descrit el paper de dos factors de transcripció associats a aquest procés de diferenciació: HIF-1α i T-bet. HIF-1α i els seus gens diana es troben significativament menys metilats i més expressats en cMO. Per altra banda, T-bet, el qual mai s'havia observat en monòcits no estimulats, presenta un comportament oposat i és predominant en els ncMO. La integració amb dades d'un mutant homozigot per al gen que codifica T-bet demostra el paper que aquest factor té en el desenvolupament del compartiment mieloide en general i en els ncMO en particular. En aquest individu, les funcions anteriorment atribuïdes als ncMO, com ara la secreció de TNF, es troben afectades a causa de la mutació. De la mateixa manera, la signatura HIF-1α es regula aberrantment en aquest pacient, confirmant la nostra proposta d’interacció entre els dos factors. En segon lloc, s’ha investigat el paper de les subpoblacions de monòcits en la malaltia autoimmune del LES. Amb aquesta finalitat, s’ha recollit una cohort de més de 20 pacients amb LES a l'inici d'un episodi de brot, a més de 10 mostres de controls sans. Els perfils de metilació de DNA de les subpoblacions de monòcits d'aquestes mostres revela la predisposició de cada grup cel·lular per respondre de manera diferent a l'entorn inflamatori present en la malaltia. Els cMO presenten una alta associació a través de perfils de desmetilació amb la família de factors de transcripció Fos/Jun. Això suggereix una predisposició d’aquestes cèl·lules per la diferenciació macrofàgica. Els ncMO, per contra, mostren menys diferències específiques, però tot i així presenten fenotips inicialment descrits en els limfòcits T, cosa que podria indica una interacció reforçada entre aquesta subpoblació i les cèl·lules T. Els fenotips dels iMOs estan recurrentment entre els de les altres dues subpoblacions. L’anàlisis transcriptòmic revela els cMO com el subconjunt amb una capacitat més alta per respondre al medi inflamatori del LES, probablement a causa del seu estat inicial menys diferenciat. També observem una associació d'ambdós grups cel·lulars amb l'activitat de la malaltia, especialment pel que fa a la metilació i l'expressió de components de la via STAT. A més, identifiquem tres posicions CpG que es podrien utilitzar com a marcador de pronòstic per predir el resultat de l'episodi de brot de la malaltia. Finalment, la integració amb dades d'RNA-seq de cèl·lula única revela l'alta heterogeneïtat de les mostres de LES així com que la composició de les nostres mostres està enriquida per subpoblacions cel·lulars patogèniques.