A single-cell RNA sequencing approach to understand the mechanisms underlying response and resistance to tofacitinib in ulcerative colitis

Abstract

[eng] Ulcerative colitis (UC) is a chronic inflammatory bowel disease that represents a major health problem worldwide due to its increasing prevalence and the lack of effective treatments. Tofacitinib is a JAK inhibitor that has been approved for the treatment of moderate-to-severe UC patients who presented an intolerance, insufficient response or loss of response to conventional or biological treatments. Despite its proven efficacy, approximately one-third of patients remain unresponsive, raising the risk of surgery and long-term disability. In this thesis, we explored for the first time the mechanisms underlying both response and resistance to tofacitinib in UC patients, aiming to provide insights into the factors contributing to treatment failure and to identify potential biomarkers of treatment response. To achieve this, we employed single-cell RNA sequencing analysis on colonic biopsies from UC patients before and after treatment with tofacitinib. Among the recruited patients, 40% responded to tofacitinib, showing improvement at a clinical, endoscopic and histological level. This response was also associated with significant changes in the abundance and inflammatory signatures of most intestinal cells, including neutrophils and inflammatory fibroblasts and macrophages. In contrast, non-responders experienced a worsening of the disease following treatment with tofacitinib, characterized by increased histological severity and increased abundance and enhanced activation of macrophages and fibroblasts. In vitro experiments confirmed that tofacitinib exerted opposing effects on macrophages depending on the type of activation. Lipopolysaccharide, but not TNF- or IFNγ-stimulated macrophages, produced abundant IL-10, which when blocked by tofacitinib, drove the enhanced activation of macrophages. Interestingly, tofacitinib did not directly induce an inflammatory effect on fibroblasts; rather, the pro-inflammatory state of fibroblasts appeared to be a secondary effect of macrophage hyperactivation. Remarkably, our research revealed that tofacitinib responders had higher baseline JAK-STAT activity compared to non-responders, suggesting that this pathway is a key driver of inflammation in these patients. In contrast, non-responders exhibited increased baseline NF-kB pathway activity and higher IL-10 signaling in macrophages compared to responders. This confirmed that IL-10 signaling was more prevalent in NR and may potentially assist in a regulatory control that tofacitinib interferes with, resulting in disease worsening in this subset of patients. Overall, we conclude that resistance to tofacitinib is mediated by macrophage hyperactivation, with IL-10-dependent macrophages identified as a key cellular subset contributing to this resistance. These findings highlight potential new targets for developing alternative treatments and offer valuable clinical insights into predicting responses to JAK inhibition, which could potentially aid in guiding more effective and personalized treatment strategies for UC patients.

[spa[ La colitis ulcerosa (CU) es una enfermedad inflamatoria intestinal crónica que representa un importante problema de salud a nivel mundial debido al aumento de su prevalencia y la falta de tratamientos efectivos. Tofacitinib es un inhibidor de JAK aprobado para el tratamiento de pacientes con CU que no responden a tratamientos biológicos. Sin embargo, un tercio de los pacientes no responden, lo que aumenta el riesgo de cirugía y discapacidad a largo plazo. En esta tesis, exploramos por primera vez los mecanismos subyacentes tanto a la respuesta como a la resistencia a tofacitinib en pacientes con CU, con el objetivo de proporcionar información sobre los factores que contribuyen a la falta de respuesta e identificar potenciales biomarcadores de respuesta al tratamiento. Para ello, empleamos análisis de secuenciación de ARN de célula única en biopsias colónicas de pacientes con CU antes y después del tratamiento con tofacitinib. Un 40% de los pacientes incluidos en este estudio respondieron a tofacitinib, mostrando mejora a nivel clínico, endoscópico e histológico. Esta respuesta también se asoció con cambios significativos en la abundancia y el perfil inflamatorio de la mayoría de las células de la mucosa intestinal, incluidos fibroblastos y macrófagos inflamatorios. Por el contrario, los pacientes que no respondieron a tofacitinib experimentaron un empeoramiento de la enfermedad tras el tratamiento con tofacitinib, caracterizado por un aumento de la severidad histológica y una mayor abundancia y activación de macrófagos y fibroblastos. Experimentos in vitro confirmaron que tofacitinib ejercía efectos opuestos en los macrófagos en función del tipo de activación de estos. Los macrófagos estimulados con lipopolisacárido, pero no aquellos estimulados con TNF o IFNγ, producían abundante IL-10, la cual al ser bloqueada por tofacitinib, conducía a una mayor activación de estos. Tofacitinib no indujo un efecto inflamatorio directo sobre los fibroblastos. El estado proinflamatorio de estos parece un efecto secundario de la hiperactivación de los macrófagos. Nuestra investigación revela que los pacientes que responden a tofacitinib tienen una mayor actividad basal de la vía JAK-STAT. Por el contrario, los pacientes que no responden presentan una mayor actividad basal de la vía NF-kB y una mayor señalización de IL-10 en macrófagos en comparación con los pacientes que responden. Esto confirma que la señalización de IL-10 es más predominante en los no respondedores y podría desempeñar un papel regulador en la inflamación, con el que tofacitinib interfiere, provocando así el empeoramiento de la enfermedad en este grupo de pacientes. En resumen, concluimos que la resistencia a tofacitinib está mediada por la hiperactivación de los macrófagos de la mucosa intestinal, identificando los macrófagos dependientes de IL- 10 como uno tipo celular clave que contribuye a dicha resistencia. Estos resultados destacan potenciales nuevas dianas terapéuticas para el desarrollo de tratamientos alternativos y ofrecen valiosas perspectivas clínicas para predecir la respuesta a la inhibición de JAK.