Origin, morphological, genetic, and chemical variability, and traditional uses of Cannabis: basis for new applications

Abstract

[eng] Cannabis sativa L. (hereafter referred to as Cannabis) is one of the earliest domesticated plants, with human use spanning over millennia for a variety of purposes. Given its widespread use and significance, Cannabis has been the focus of research in diverse scientific areas, from medicine, pharmacy, and agronomy to environmental and social sciences. However, most of the research has concentrated on modern hemp cultivars and drug strains, with limited attention given to wild-growing populations or traditional landraces across the plant's natural distribution area, leaving significant gaps in understanding their diversity. Similarly, while numerous publications have documented the traditional uses of Cannabis, this body of knowledge remains fragmented across various types of literature. This fragmentation, much like the limited research on wild-growing populations, complicates efforts to conduct comprehensive statistical analyses and gain a holistic understanding of the plant's diversity and cultural significance. This doctoral thesis aims to fill this gap by exploring the genetic, morphological, and phytochemical diversity of Cannabis and its traditional uses worldwide through seven interconnected studies. The research integrated various interdisciplinary methods, such as flow cytometry, Hyb-Seq genomic analysis, high-resolution geometric morphometrics, phytochemical analysis using UPLC-MS, and systematic ethnobotanical data collection, offering a comprehensive view of this versatile plant. In the first chapter we explored the genetic and cytogenetic diversity of Cannabis. Using flow cytometry, we examined genome size diversity across a wide range of wild-growing, landrace, and cultivated Cannabis accessions. The analysis revealed minimal variation in ploidy levels, with only one triploid individual identified, while the rest were diploid. A 1.189-fold variation in genome size was observed, but no strong correlation was found between genome size and geographical distribution or between wild-growing and cultivated plants. This suggests that the geographical expansion and domestication of Cannabis had a limited effect on its genome size. Notably, significant differences in genome size were observed between male and female plants. In another work of this chapter, we examined the phylogeographic and population genetics structure of wild-growing and landrace Cannabis populations, by employing a Hyb-Seq approach, combining shotgun sequencing and target capture with the Angiosperms353 enrichment panel. The results supported the classification of Cannabis as a monotypic genus, structured into three primary genetic groups: E Asia, which is sister to both Paleotropis group and Boreal group. Further subdivisions within these groups revealed phylogeographic patterns driven more by geographical distribution than by use-type. In the second chapter we focused on the morphological diversity of Cannabis. Due to significant changes in leaflet number during the plants’ development, a novel method was developed that allows, for the first-time, the application of a high-resolution geometric morphometrics approach on the entire leaf. By using polynomial models across more than 3,000 pseudo-landmarks, we modelled theoretical leaves with comparable leaflet numbers. This innovative approach enables the accurate prediction of genetic and developmental traits, providing new insights into Cannabis leaf morphology and uncovering heterochronic mechanisms responsible for changes in leaf shape during the development. Phytochemical diversity was the focus of the third chapter, which analysed cannabinoid composition in different Cannabis tissues, sexes, and across different phylogeographic groups identified in the first chapter. Significant differences in cannabinoid profiles were found between male and female inflorescences, but not between the leaves of either sex. While the cannabinoid profiles did not precisely correlate with phylogeographic groups, there was a clear differentiation between cultivated drug-type landraces and wild-growing populations, indicating the influence of selective breeding during domestication. The last, forth chapter explored traditional knowledge of Cannabis use. The first study in this chapter involved the development of the CANNUSE database, which consolidated 2,330 entries from 649 publications across 41 countries, providing a valuable resource for understanding traditional Cannabis uses. The second study analysed the standardized dataset from CANNUSE database and found that medicinal applications dominated, treating over 200 human ailments. Strong associations were observed between specific Cannabis plant parts and their corresponding uses and in treating different body systems. The third ethnobotanical study investigated the traditional knowledge of Cannabis use in Armenia through ethnobotanical surveys and bibliographic review. The results revealed a significant decline in medicinal and fibre uses but highlighted the continued importance of Cannabis seeds in alimentary uses, particularly in symbolic dishes, demonstrating the persistence of Cannabis as an important cultural and historical resource. In conclusion, the results of this thesis highlight the extraordinary genetic, morphological, and phytochemical diversity of Cannabis, particularly evident when focusing on wild-growing populations and traditional landraces. The findings support the classification of Cannabis as a monotypic genus, with marked intraspecific variability. The newly gathered comprehensive dataset of traditional uses provided novel insights into its rich traditional heritage, and revealed new potential applications rooted in traditional knowledge. These results underscore the importance of further research and the preservation of diversity within wild-growing populations of this versatile species.

[cat] Cannabis sativa L. (en endavant, Cannabis) és una de les primeres plantes domesticades, usades pels humans des de fa mil·lennis amb diverses finalitats. Donat el seu ús estès i la seva rellevància, el Cannabis ha estat objecte de recerca en diverses àrees científiques, des de medicina, farmàcia i agronomia fins a ciències ambientals i socials. Tanmateix, la major part de la recerca s'ha centrat en varietats modernes de cànem i estirps psicoactives, deixant més o menys de banda les poblacions silvestres o les races tradicionals en la seva àrea natural de distribució i generant buits significatius en el coneixement de la seva diversitat. De manera similar, malgrat que els usos tradicionals de Cannabis han estat recollits en nombroses publicacions, aquest coneixement es troba dispers en diferents formats de publicació. Aquesta fragmentació, juntament amb una investigació limitada sobre poblacions silvestres, dificulta les anàlisis estadístiques i la comprensió holística de la diversitat i la significació cultural de la planta. Aquesta tesi doctoral pretén omplir aquest buit explorant la diversitat genètica, morfològica i fitoquímica de Cannabis i els seus usos tradicionals arreu del món a través de set estudis complementaris i estretament relacionats. Aquesta recerca integra diverses metodologies interdisciplinàries, com la citometria de flux, l'anàlisi genòmica Hyb-Seq, la morfometria geomètrica d'alta resolució, l'anàlisi fitoquímica mitjançant UPLC-MS i la recopilació sistemàtica de dades etnobotàniques, i permet oferir una visió integral d'aquesta planta versàtil. Al primer capítol es va explorar la diversitat genètica i citogenètica de Cannabis. Mitjançant citometria de flux, es va estimar la diversitat de la mida del genoma en una àmplia gamma de poblacions silvestres, races tradicionals i accessions cultivades. L'anàlisi va revelar una variació mínima en els nivells de ploïdia, amb només un individu triploide identificat, essent la resta diploides. Es va observar una variació d’1,189 vegades en la mida del genoma, però no es va trobar una correlació estreta entre la mida del genoma i la distribució geogràfica, ni entre plantes silvestres, ni en cultivades. Això suggereix que l'expansió geogràfica i la domesticació de Cannabis van tenir un efecte limitat en la mida del genoma. S’observaren, però, diferències significatives en la mida del genoma entre plantes masculines i femenines. En un altre treball d’aquest capítol, per a examinar l'estructura filogeogràfica i genètica de les poblacions de Cannabis silvestres i tradicionals, es va utilitzar l'enfocament Hyb-Seq, que combina la captura dirigida i la seqüenciació massiva amb el kit Angiosperms353. Els resultats obtinguts donen suport a la consideració de Cannabis com un gènere monotípic, estructurat en tres grups genètics principals: Àsia oriental, que és el grup germà dels grups paleotropical i boreal. Les subdivisions dins d'aquests grups van revelar patrons filogeogràfics condicionats per la distribució geogràfica més que pel tipus d'ús. El segon capítol es va centrar en la diversitat morfològica de Cannabis. A causa de canvis significatius en el nombre de folíols de les fulles que tenen lloc durant el creixement de la planta, es va desenvolupar un mètode nou, que permet, per primera vegada, l'aplicació d'un enfocament de morfometria geomètrica d'alta resolució. Utilitzant models polinòmics en més de 3.000 pseudopunts de referència, es van modelar fulles teòriques amb nombres de folíols comparables. Aquest enfocament innovador permet predir amb precisió trets genètics i de desenvolupament, de manera que proporciona noves perspectives sobre la morfologia de les fulles i permet descobrir mecanismes heterocrònics responsables dels canvis en la forma de les fulles durant el desenvolupament. La diversitat fitoquímica va ser l'objecte del tercer capítol, en el qual s’analitzà la composició de cannabinoides en diferents teixits, sexes i grups filogeogràfics identificats en l'estudi anteriorment esmentat de Cannabis. Es van trobar diferències significatives en els perfils de cannabinoides entre les inflorescències masculines i femenines, però no entre les fulles dels dos sexes. Tot i que els perfils de cannabinoides no es correlacionava exactament amb els grups filogeogràfics, hi havia una clara diferenciació entre les races tradicionals cultivades per a droga i les poblacions silvestres, la qual cosa indica la influència de la selecció durant la domesticació. Finalment, el quart capítol va explorar el coneixement tradicional dels usos de Cannabis. El primer estudi d'aquest capítol va significar la creació de la base de dades CANNUSE, que inclogué 2.330 registres corresponents a 649 publicacions de 41 països, la qual cosa proporciona un recurs valuós per a comprendre els usos tradicionals de Cannabis. El segon estudi analitzà el conjunt de dades estandarditzades de CANNUSE i posà de manifest que les aplicacions medicinals eren les predominants, i que la planta s’usava per al tractament de més de 200 malalties humanes. S’observaren correspondències entre parts de la planta i els seus usos per a tractar diferents sistemes corporals. El tercer estudi etnobotànic investigà el coneixement tradicional sobre els usos de Cannabis a Armènia mitjançant entrevistes etnobotàniques i revisions bibliogràfiques. Els resultats revelaren un descens significatiu al llarg del temps pel que fa als usos medicinals i de fibra, però posaren de manifest la importància actual de les llavors de Cannabis en usos alimentaris, especialment en plats simbòlics, demostrant-ne la persistència com un recurs cultural i històric important. En conclusió, els resultats d'aquesta tesi posen de manifest l'extraordinària diversitat genètica, morfològica i fitoquímica de Cannabis, especialment palesa en poblacions silvestres i races tradicionals. Els resultats donen suport a un gènere monotípic, amb una marcada variabilitat intraespecífica. Les dades exhaustives sobre usos tradicionals proporcionen noves perspectives sobre el seu ric patrimoni tradicional i revelen noves aplicacions potencials arrelades en aquest coneixement. Aquests resultats subratllen la importància de la recerca i la preservació de la diversitat en les poblacions silvestres d'aquesta espècie tan versàtil.