Efecto de las vesículas de membrana de cepas probióticas y comensales de Escherichia coli en la infección por rotavirus en células de epitelio intestinal

Abstract

[spa] La infección por rotavirus es la principal causa de gastroenteritis aguda, especialmente en niños menores de cinco años. Actualmente, no existe un tratamiento antiviral específico para esta infección; el tratamiento se centra en prevenir la deshidratación mediante la administración de líquidos y soluciones de rehidratación oral. En los últimos años, se ha explorado el uso de probióticos como posible terapia para tratar las infecciones por rotavirus. Los probióticos, definidos como microorganismos vivos que confieren beneficios a la salud del huésped, han mostrado efectos beneficiosos en la modulación de la respuesta inmunitaria y en la competencia con patógenos en el tracto gastrointestinal. Algunos estudios sugieren que ciertas cepas probióticas pueden reducir la duración y la severidad de la diarrea causada por rotavirus en niños. En el contexto de las terapias basadas en el microbioma, las vesículas de membrana derivadas de bacterias han emergido como herramientas prometedoras en biomedicina. Estas vesículas transportan biomoléculas presentes en la cepa productora, incluyendo proteínas y ácidos nucleicos, y actúan como vehículos de entrega de moléculas efectoras a las células del hospedador, donde activan vías de señalización y modulan respuestas celulares. En los últimos años, las vesículas extracelulares (EVs) bacterianas, en especial las producidas por probióticos, están siendo estudiadas por su capacidad de inducir respuestas inmunitarias y su potencial aplicación como adyuvantes o plataformas para el desarrollo de nuevas vacunas. Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) es una cepa probiótica conocida por sus propiedades beneficiosas en diversas enfermedades gastrointestinales. EcoR12 es una cepa comensal aislada de heces de un adulto humano sano, de la cual también se han reportado efectos beneficiosos en la modulación de la inflamación intestinal. Un estudio en modelos porcinos gnotobióticos mostró que la administración del probiótico EcN mejoró la sintomatología y potenció las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas durante el curso de la infección por rotavirus. La administración conjunta de EcN y triptófano mejoró la respuesta inmunitaria y modificó el metaboloma, sugiriendo el potencial terapéutico de este probiótico en las infecciones por rotavirus. Nuestro grupo estudia el rol de las vesículas de probióticos y microbiota en la comunicación intercelular con el hospedador. En esta interacción, cada vez hay más evidencias sólidas que indican que los efectos de la microbiota sobre la fisiopatología del hospedador están mediados por las vesículas liberadas por el conjunto del microbioma intestinal. En este contexto, nuestro grupo ha evaluado la efectividad de intervenciones basadas en vesículas extracelulares (EVs) del probiótico EcN o del comensal EcoR12 en la mitigación de la diarrea y mejora de la inmunidad en un modelo preclínico de infección por rotavirus (RV) en ratas lactantes, constatando la mejora de la inmunidad humoral y celular, siendo ciertos efectos específicos de la cepa. Así, las EVs de EcoR12 activaron la expresión intestinal de CD68, TLR2 e IL-12, mientras que las EVs de EcN estimularon la maduración intestinal, la integridad de barrera y mejoraron la función de absorción. Este trabajo permitió concluir que las intervenciones que involucran EVs de

probióticos/microbiota pueden servir como una estrategia postbiótica segura (libre de bacterias) para mejorar los síntomas clínicos y las respuestas inmunitarias durante la infección por RV en el período neonatal. Además, podrían utilizarse como adyuvantes para mejorar la inmunogenicidad y la eficacia de las vacunas contra el RV. Aunque estos hallazgos son prometedores, es importante señalar que antes de trasladar las EVs de microbiota y probióticos a estrategias bióticas dirigidas a salud humana, es necesario conocer en mayor profundidad los mecanismos moleculares activados por las vesículas, responsables de sus efectos. Por ello, en este trabajo analizamos el impacto de las EVs de las cepas EcN y EcoR12 sobre la replicación viral, así como a nivel de estrés oxidativo, liberación de calcio, respuesta inflamatoria y antiviral, y refuerzo de la barrera intestinal incluyendo las proteínas de uniones estrechas y producción de mucina. Puesto que el rotavirus se replica principalmente en enterocitos diferenciados del epitelio intestinal, el estudio se ha llevado a cabo en monocapas polarizadas de células Caco-2, donde se ha analizado la expresión de genes involucrado en estos procesos fisiológicos alterados por el virus y la cuantificación/localización de proteínas por microscopía confocal. Respecto al análisis de mucina, el estudio se ha realizado en células LS174T, como modelo de células caliciformes productoras de mucina. Los resultados obtenidos muestran que el tratamiento previo con las EVs de estas cepas de la microbiota intestinal inhibe o interfiere con el ciclo replicativo e infectivo del RV en enterocitos maduros. A nivel molecular, las EVs reducen los niveles intracelulares de calcio y de especies reactivas de oxígeno (ROS) en las células infectadas. Además, previenen la deslocalización del regulador máster de estrés oxidativo NFR-2 inducida por el virus a medida que avanza el tiempo de infección. Respecto a la respuesta inflamatoria, los cambios más destacados inducidos por las EVs de ambas cepas afectan a la expresión de la enzima ciclooxigenasa-2 (COX-2). Es conocido que el RV induce la expresión de esta enzima, lo que se traduce en un aumento en la producción de prostaglandina E2 (PGE2), un mediador de la inflamación que a la vez estimula la replicación del RV. Es de destacar que las EVs de ambas cepas previenen la sobrexpresión de COX-2 en células infectadas, siendo este el mecanismo que podría explicar la menor replicación del RV en células tratadas con EVs. Sin embargo, algunos efectos son específicos de cepa. Así, las EVs de EcN (pero no las de EcoR12) activan en mayor medida la producción de IL-8, una quimiocina que promueve la atracción de macrófagos hacia el lugar de infección con la finalidad de erradicar al patógeno. La inducción de interferones (IFN) de tipo I es una parte importante de la respuesta antiviral, y ciertos virus, entre ellos el RV, han desarrollado estrategias para evadir la respuesta IFN. En estas vías de señalización los efectos paliativos están asociados específicamente a las EVs de EcoR12. En concreto, las EVs de esta cepa comensal preservan los niveles del factor de transcripción STAT-1, disminuidos por el RV, y en consecuencia incrementan la expresión de genes regulados por este factor como ISG15. Respecto a los cambios inducidos por el RV en la función de la barrera intestinal, las EVs de ambas cepas no inhiben el curso de la infección en células caliciformes, pero disminuyen la producción y secreción de mucina inducida por el virus, evitando así la

diseminación del virus y transmisión de la infección. A nivel de proteínas de uniones estrechas (tight junctions), los efectos preventivos de las EVs no afectan al nivel de expresión génica, pero si previenen la deslocalización de las proteínas ocludina y claudina-1 alteradas por el RV. De manera específica, las EVs del probiótico EcN también protegen la localización de ZO-1. A través del refuerzo de tight junctions, las EVs de estas cepas pueden interferir en el acceso del RV a las células y a su diseminación a los tejidos del hospedador. Por el contrario, las EVs previenen el incremento de permeabilidad de la barrera epitelial evitando la sobrexpresión de claudina-2, una proteína asociada al intestino permeable e inducida por el RV. Finalmente, se analizaron varios miRNAs relacionados con la infección por RV. Sin embargo, en nuestro modelo celular, no se observaron cambios significativos en su expresión en células infectadas. Aun así, las EVs de EcN y EcoR12 mostraron potencial antiviral a través de la regulación de mir-99b (implicado en autofagia) y miR-7 (inhibe la expresión de la proteína viral NSP5), respectivamente.

[cat] La infecció per rotavirus és la principal causa de gastroenteritis aguda, especialment en nens menors de cinc anys. Actualment, no existeix un tractament antiviral específic per a aquesta infecció; el tractament se centra a prevenir la deshidratació mitjançant l'administració de líquids i solucions de rehidratació oral. En els últims anys, s'ha explorat l'ús de probiòtics com a possible teràpia per tractar les infeccions per rotavirus. Els probiòtics, definits com a microorganismes vius que confereixen beneficis per a la salut de l'hoste, han demostrat efectes beneficiosos en la modulació de la resposta immunitària i en la competència amb patògens en el tracte gastrointestinal. Alguns estudis suggereixen que alguns probiòtiques poden reduir la durada i la severitat de la diarrea causada per rotavirus en nens. En el context de les teràpies basades en el microbioma, les vesícules de membrana derivades de bacteris han emergit com a eines prometedores en biomedicina. Aquestes vesícules transporten biomolècules presents en la soca productora, incloent-hi proteïnes i àcids nucleics, i actuen com a vehicles d'entrega de molècules efectores a les cèl·lules de l'hoste, on activen vies de senyalització i modulen respostes cel·lulars. En els últims anys, les vesícules extracel·lulars (EVs) bacterianes, especialment les produïdes per probiòtics, s'estan estudiant per la seva capacitat d'induir respostes immunitàries i el seu potencial com a adjuvants o plataformes per al desenvolupament de noves vacunes. Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) és una soca probiòtica coneguda per les seves propietats beneficioses en diverses malalties gastrointestinals. EcoR12 és una soca comensal aïllada de femta d'un adult humà sa, de la qual també s'han reportat efectes beneficiosos en la modulació de la inflamació intestinal. Un estudi en models porcins gnotobiòtics va mostrar que l'administració del probiòtic EcN va millorar la simptomatologia i va potenciar les respostes immunitàries innates i adaptatives durant el curs de la infecció per rotavirus. La administració conjunta d’EcN i triptòfan va millorar la resposta immunitària i va modificar el metaboloma, suggerint el potencial terapèutic d'aquest probiòtic en les infeccions per rotavirus. El nostre grup estudia el paper de les vesícules de probiòtics i microbiota en la comunicació intercel·lular amb l'hoste. En aquesta interacció, cada vegada hi ha més evidències sòlides que indiquen que els efectes de la microbiota sobre la fisiopatologia de l'hoste estan mediats per les vesícules alliberades pel conjunt del microbioma intestinal. En aquest context, el nostre grup ha avaluat l’efectivitat d'intervencions basades en vesícules extracel·lulars (EVs) del probiòtic EcN o de la soca comensal EcoR12 en la mitigació de la diarrea i la millora de la immunitat en un model preclínic d'infecció per rotavirus (RV) en cries de rata lactants. Els resultats han confirmat la millora de la immunitat humoral i cel·lular, amb efectes específics de cada soca. Així, les EVs d’EcoR12 van activar l'expressió intestinal de CD68, TLR2 i IL-12, mentre que les EVs d’EcN van estimular la maduració intestinal, la integritat de la barrera i van millorar la funció d'absorció.

Aquest treball permet concloure que les intervencions amb EVs de probiòtics/microbiota poden servir com a una estratègia postbiòtica segura (lliure de bacteris) per millorar els símptomes clínics i les respostes immunitàries durant la infecció per RV en el període neonatal. A més, podrien utilitzar-se com a adjuvants per millorar la immunogenicitat i l'eficàcia de les vacunes contra el RV. Encara que aquests descobriments són prometedors, és important assenyalar que abans de traslladar les EVs de microbiota i probiòtics a estratègies dirigides a la salut humana, cal conèixer en profunditat els mecanismes moleculars activats per les vesícules i responsables dels seus efectes. Per això, en aquest treball analitzem l'impacte de les EVs de les ceps EcN i EcoR12 sobre la replicació viral, així com a nivell de estrès oxidatiu, alliberament de calci, resposta inflamatòria i antiviral, i reforç de la barrera intestinal, incloent-hi les proteïnes d'unions estretes (tight junctions) i la producció de mucina. Atès que el rotavirus es replica principalment en enteròcits diferenciats de l'epiteli intestinal, l'estudi s'ha dut a terme en monocapes polaritzades de cèl·lules Caco-2, on s'ha analitzat l'expressió de gens implicats en aquests processos fisiològics alterats pel virus i la quantificació/localització de proteïnes mitjançant microscòpia confocal. Pel que fa a l'anàlisi de mucina, l'estudi s'ha realitzat en cèl·lules LS174T, com a model de cèl·lules caliciformes productores de mucina. Els resultats obtinguts mostren que el tractament previ amb les EVs d'aquestes soques de la microbiota intestinal inhibeix o interfereix en el cicle replicatiu i infectiu del RV en enteròcits madurs. A nivell molecular, les EVs redueixen els nivells intracel·lulars de calci i d’espècies reactives d’oxigen (ROS) en les cèl·lules infectades. A més, prevenen la deslocalització del regulador d’estrès oxidatiu NRF-2 induïda pel virus a mesura que avança el temps d'infecció.

Pel que fa a la resposta inflamatòria, els canvis més destacats induïts per les EVs d'ambdues soques afecten l'expressió de l'enzim ciclooxigenasa-2 (COX-2). És conegut que el RV indueix l'expressió d'aquest enzim, la qual cosa es tradueix en un augment en la producció de prostaglandina E2 (PGE2), un mediador de la inflamació que alhora estimula la replicació del RV. Cal destacar que les EVs d'ambdues soques prevenen la sobreexpressió de COX-2 en cèl·lules infectades, sent aquest el mecanisme que podria explicar la menor replicació del RV en cèl·lules tractades amb EVs. No obstant això, alguns efectes són específics de soca. Així, les EVs d'EcN (però no les d'EcoR12) activen en major mesura la producció d'IL-8, una quimiocina que promou l'atracció de macròfags cap al lloc d'infecció amb la finalitat d'erradicar el patogen. La inducció d'interferons (IFN) de tipus I és una part important de la resposta antiviral, i certs virus, entre ells el RV, han desenvolupat estratègies per evadir la resposta IFN. En aquestes vies de senyalització, els efectes pal·liatius estan associats específicament a les EVs d'EcoR12. En concret, les EVs d'aquesta soca comensal preserven els nivells del factor de transcripció STAT-1, disminuïts pel RV, i en conseqüència incrementen l'expressió de gens regulats per aquest factor com ISG15.

Pel que fa als canvis induïts pel RV en la funció de la barrera intestinal, les EVs d'ambdues soques no inhibeixen el curs de la infecció en cèl·lules caliciformes, però disminueixen la producció i secreció de mucina induïda pel virus, evitant així la disseminació del virus i la transmissió de la infecció. A nivell de proteïnes de unions estretes (tight junctions), els efectes preventius de les EVs no afecten el nivell d'expressió gènica, però sí prevenen la deslocalització de les proteïnes ocludina i claudina-1 alterades pel RV. De manera específica, les EVs del probiòtic EcN també protegeixen la localització de ZO-1. A través del reforç de les unions estretes, les EVs d'aquestes soques poden interferir en l'accés del RV a les cèl·lules i en la seva disseminació als teixits de l'hoste. Per contra, les EVs prevenen l'increment de permeabilitat de la barrera epitelial evitant la sobreexpressió de claudina-2, una proteïna associada a l'intestí permeable i induïda pel RV.

Finalment, es van analitzar diversos miRNAs relacionats amb la infecció per RV. No obstant això, en el nostre model cel·lular, no es van observar canvis significatius en la seva expressió en cèl·lules infectades. Tot i així, les EVs d'EcN i EcoR12 van mostrar potencial antiviral a través de la regulació de miR-99b (implicat en autofàgia) i miR-7 (inhibeix l'expressió de la proteïna viral NSP5), respectivament.

[eng] Rotavirus infection is the leading cause of acute gastroenteritis, especially in children under five years old. Currently, there is no specific antiviral treatment for this infection; management focuses on preventing dehydration through the administration of fluids and oral rehydration solutions. In recent years, the use of probiotics as a potential therapy for rotavirus infections has been explored. Probiotics, defined as live microorganisms that confer health benefits to the host, have shown beneficial effects in modulating the immune response and competing with pathogens in the gastrointestinal tract. Some studies suggest that certain probiotic strains can reduce the duration and severity of rotavirus-induced diarrhoea in children. In the context of microbiome-based therapies, membrane vesicles derived from bacteria have emerged as promising tools in biomedicine. These vesicles carry biomolecules present in the producing strain, including proteins and nucleic acids, and act as delivery vehicles for effector molecules to host cells, where they activate signalling pathways and modulate cellular responses. In recent years, bacterial extracellular vesicles (EVs), especially those produced by probiotics, are being studied for their ability to induce immune responses and their potential application as adjuvants or platforms for the development of new vaccines. Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) is a probiotic strain known for its beneficial properties in various gastrointestinal diseases. EcoR12 is a commensal strain isolated from the stool of a healthy adult human, which has also been reported to have beneficial effects in modulating intestinal inflammation. A study in gnotobiotic porcine models showed that administration of the probiotic EcN improved symptoms and enhanced innate and adaptive immune responses during the course of rotavirus infection. Co-administration of EcN and tryptophan improved the immune response and modified the metabolome, suggesting the therapeutic potential of this probiotic in rotavirus infections. Our group studies the role of probiotic and microbiota vesicles in intercellular communication with the host. In this interaction, there is increasing solid evidence indicating that the effects of the microbiota on host pathophysiology are mediated by vesicles released by the entire intestinal microbiome. In this context, our group has evaluated the effectiveness of interventions based on extracellular vesicles (EVs) from the probiotic EcN or the commensal EcoR12 in mitigating diarrhoea and improving immunity in a preclinical model of rotavirus (RV) infection in suckling rats, noting improvements in humoral and cellular immunity, with certain effects being strain- specific. Thus, EcoR12 EVs activated intestinal expression of CD68, TLR2, and IL-12, while EcN EVs stimulated intestinal maturation, barrier integrity, and improved absorption function. This work concluded that interventions involving probiotic/microbiota EVs can serve as a safe postbiotic strategy (bacteria-free) to improve clinical symptoms and immune responses during RV infection in the neonatal period.

Additionally, they could be used as adjuvants to enhance the immunogenicity and efficacy of RV vaccines. Although these findings are promising, it is important to note that before translating microbiota and probiotic EVs into biotic strategies aimed at human health, it is necessary to gain a deeper understanding of the molecular mechanisms activated by the vesicles responsible for their effects. Therefore, in this work, we analyse the impact of EVs from the EcN and EcoR12 strains on viral replication, as well as on oxidative stress, calcium release, inflammatory and antiviral responses, and reinforcement of the intestinal barrier, including tight junction proteins and mucin production. Since rotavirus primarily replicates in differentiated enterocytes of the intestinal epithelium, the study was conducted in polarized monolayers of Caco-2 cells, where the expression of genes involved in these physiological processes altered by the virus was analysed, along with the quantification/localization of proteins by confocal microscopy. Regarding mucin analysis, the study was conducted in LS174T cells, as a model of mucin-producing goblet cells. The results obtained show that pretreatment with EVs from these intestinal microbiota strains inhibits or interferes with the RV replicative and infective cycle in mature enterocytes. At the molecular level, EVs reduce intracellular levels of calcium and reactive oxygen species (ROS) in infected cells. Additionally, they prevent the virus- induced delocalization of the oxidative stress master regulator NFR-2 as infection progresses. Regarding the inflammatory response, the most notable changes induced by EVs from both strains affect the expression of the enzyme cyclooxygenase-2 (COX-2). It is known that RV induces the expression of this enzyme, leading to an increase in the production of prostaglandin E2 (PGE2), an inflammatory mediator that also stimulates RV replication. Notably, EVs from both strains prevent the overexpression of COX-2 in infected cells, which could explain the reduced RV replication in EV-treated cells. However, some effects are strain-specific. For instance, EcN EVs (but not EcoR12 EVs) significantly activate the production of IL-8, a chemokine that promotes the attraction of macrophages to the infection site to eradicate the pathogen. The induction of type I interferons (IFN) is an important part of the antiviral response, and certain viruses, including RV, have developed strategies to evade the IFN response. In these signalling pathways, the palliative effects are specifically associated with EcoR12 EVs. Specifically, EVs from this commensal strain preserve the levels of the transcription factor STAT-1, decreased by RV, and consequently increase the expression of genes regulated by this factor, such as ISG15. Regarding RV-induced changes in the intestinal barrier function, EVs from both strains do not inhibit the course of infection in goblet cells but decrease the virus-induced production and secretion of mucin, thereby preventing virus dissemination and transmission of the infection. At the level of tight junction proteins, the preventive effects of EVs do not affect gene expression levels but prevent the delocalization of occludin and claudin-1 proteins altered by RV. Specifically, EVs from the probiotic EcN also protect

the localization of ZO-1. Through the reinforcement of tight junctions, EVs from these strains can interfere with RV's access to cells and its dissemination to host tissues. Conversely, the EVs prevent the increase in epithelial barrier permeability by avoiding the overexpression of claudin-2, a protein associated with leaky gut and induced by RV. Finally, several miRNAs related to RV infection were analysed. However, in our cell model, no significant changes in their expression were observed in infected cells. Nonetheless, the EVs from EcN and EcoR12 showed antiviral potential through the regulation of miR-99b (involved in autophagy) and miR-7 (inhibits the expression of the viral protein NSP5), respectively.