The tumor microenvironment in liver metastases from colorectal cancer in the context of histologic growth patterns

Abstract

[eng] Colorectal cancer (CRC) is the third most frequent cancer type in the world and the second cause of death because of cancer. Nowadays, 25% of cases are diagnosed at the metastatic stage (mCRC), and 20-25% of the remaining patients develop metastases during the disease course. Patients with mCRC have a poor prognosis, as the 5-year survival rate for mCRC is less than 20%. Most CRC metastases appear in the liver (CRLM), for which the only curative treatment is surgery. However, only 30% of patients are suitable for resection. The remaining 70% can only be treated with chemotherapy in combination or not with immunotherapy. This last one has shown discouraging results in the last clinical trials. In view of all this, there is a need for further research in the biology and in new therapeutic strategies focused on CRC liver. CRLMs are characterized by their way of growing in the host organ, as they show three histologic growth patterns (HGPs): desmoplastic, replacement and pushing. The desmoplastic pattern shows a fibrotic rim that separates tumor glands from liver parenchyma. On contrary, in replacement HGP, tumoral cells are in direct contact with hepatocytes. As the pushing pattern is the less common, the classification is usually simplified in desmoplastic (dHGP) and non-desmoplastic (non-dHGP) HGPs. These patterns have different biological aspects. However, their value is due to their utility as a prognostic and predictive marker, as dHGP has been associated with better patient outcomes, as well as a better response to anti-angiogenic treatments. In our study, we aimed to further characterize the biology of CRLM HGPs. As no features of primary tumoral cells have been associated with the appearance of each HGP, we postulated that tumor microenvironment factors may be underlying the observed differences in prognoses. Because of that, in our project, we focused on immune infiltrates and cancer associated fibroblasts present in each HGP. Concerning immune infiltrates, multiplex immunofluorescence (mIHC) let us investigate both lymphoid and myeloid cell subsets in a tissue microarray of 100 CRLM patients. Our results revealed an immunologically active anti-tumoral environment in dHGP, constituted by higher densities of cytotoxic T cells interacting with tumoral cells. On the other hand, higher levels of macrophages, both M1 and M2 polarized, as well as other pro-tumoral cell

subsets like Th2 lymphoid cells, non-macrophage CD163+ cells and Calprotectin+ cells, were at higher densities in non-dHGP, suggesting a pro-tumoral immune environment in this HGP. Through mIHC we also investigated several cancer associated fibroblasts (CAFs) subpopulations. Our results showed an enrichment of several COL1A1 expressing CAF subsets in dHGP. This protein from the extracellular matrix is associated with tumor growth restraining and an immune-active environment. Through in vitro experiments, we investigated the two main precursor cells that can give rise to activated fibroblasts in the liver: hepatic stellate cells (HSCs) and portal fibroblasts (PFs). We studied the changes at RNA level of both HSCs and PFs when activated by their co-culture with tumoral cells. The RNAseq results obtained showed differences between i) mesenchymal cells when co-cultured with tumoral cells ii) and the co-cultured conditions when compared when the corresponding monocultures. Moreover, we identified two useful markers to distinguish PF-derived CAFs, MFAP5, and HSC-derived CAFs, F2R. At functional level, PFs showed a higher capacity for recruiting Th2 cells and induce higher proliferation rates in tumor cells. We also assessed in vitro the function of CD90 marker through two subpopulations of CAFs isolated from the same patient, CD90hi and CD90lo, that had shown differences in their secretome. CD90hi cells showed higher expression of Podoplanin, which is associated to macrophage recruiting and M2 polarization. Our assays showed higher capacity of CD90hi cells to recruit monocytes, as well as to polarize them to an M2 phenotype. Altogether, the results of this thesis describe an immune active environment in dHGP and a pro-tumoral immune environment in non-dHGP, which could explain the failure of immunotherapy. This conclusion suggests a need for patient segregation according to HGP and proposes new targets for CRLM treatment. Moreover, both the results obtained about immune infiltrates and cancer associated fibroblasts open doors for interesting new research lines that could lead to understanding the biology underlying the prognostic value of HGPs as well as proposing new therapeutic targets for these patients.

[cat] El càncer colorectal (CRC) és el tercer mes freqüent al món, així com el segon causant de morts per càncer. Actualment, el 25% dels pacients tenen metàstasi en el moment del diagnòstic (mCRC) i el 20-25% de la resta en desenvolupen durant el curs de la malaltia. Els pacients de mCRC tenen mal pronòstic, la supervivència als 5 anys és menor de 20%. La majoria de les metàstasis apareixen en el fetge (CRLM) i l’únic tractament disponible amb objectiu curatiu és la cirurgia, només viable per al 30% dels pacients. El 70% restant poden ser tractats amb quimioteràpia en combinació, o no, amb immunoteràpia. Aquesta última ha mostrat resultats desesperançadors en els darrers assajos clínics. Aquestes dades evidencien la necessitat d’investigar la biologia de les metàstasis hepàtiques de càncer colorectal per tal de trobar-ne noves estratègies terapèutiques. Les mCRC es caracteritzen per la manera en la que creixen en l’òrgan hoste, ja que ho fan seguin tres patrons de creixement histològics (HGPs): el patró desmoplastic, el replacement i el pushing. El patró desmoplastic mostra una càpsula fibrosa que separa físicament les glàndules tumorals del parènquima hepàtic. Per altra banda, en el patró replacement, les cèl·lules tumorals es troben en contacte directe amb el parènquima. Degut a que el patró pushing és el menys comú, la classificació dels HGP sol simplificar-se en desmoplastic (dHGP) i non-desmoplastic (non-dHGP). Aquests patrons mostren diferències a nivell biològic, però la seva rellevància recau en el seu valor com a factor pronòstic i predictiu de resposta a fàrmacs. El nostre projecte tenia com a objectiu caracteritzar la biologia d’aquests HGP que apareixen en les CRLM. Ja que no hi ha cap aspecte de les cèl·lules del tumor primari que s’hagin associat a l’aparició d’un patró histològic o d’un altre, vam hipotetitzar que les característiques del microambient tumoral podrien estar explicant les diferències en pronòstic observades entre els HGPs. Per aquesta raó, vam decidir centrar-nos en l’estudi dels infiltrats inflamatoris i dels fibroblasts associats a càncer (CAFs). Respecte els infiltrats inflamatoris, la tècnica d’immunofluorescència multiplex ens va permetre investigar diferents poblacions cel·lulars tant del llinatge limfoide com mieloide, en un microarray de teixit format per mostres provinents de 100 pacients. Els resultats obtinguts mostraren un ambient immunològicament actiu i anti-tumoral en el patró dHGP, constituït per alts nivells de limfòcits T citotòxics interactuant amb les cèl·lules tumorals. Per

altra banda, en el patró non-dHGP es va observar una densitat alta de macròfags, tant polaritzats a M1 com M2, així com d’altres poblacions pro-tumorals com limfòcits Th2, cèl·lules CD163+ CD68- i cèl·lules Calprotectin+, suggerint la presència d’un ambient immunològic pro-tumoral en aquest HGP. Aquesta tècnica també va permetre estudiar els fibroblasts associats a càncer (CAFs): el patró dHGP estava enriquit en subpoblacions de CAFs que expressen COL1A1. Està descrit que aquesta proteïna de la matriu extracel·lular té un efecte restrictiu sobre el creixement tumoral i promou l’activació de les cèl·lules del sistema immune vers el tumor. Mitjançant experiments in vitro, vam estudiar els dos precursors principals de CAFs en el fetge: les cèl·lules hepàtiques estrellades (HSCs) i els fibroblasts portals (PFs). Vam analitzar els canvis en RNA de HSCs i PFs quan eren co-cultivades amb cèl·lules tumorals. Els resultats obtinguts van mostrar diferències entre i) poblacions mesenquimals quan es cultivaven amb cèl·lules tumorals ii) cada població mesenquimal co-cultivada en comparació amb el seu corresponent monocultiu. També vam identificar dos marcadors que ens permeten distingir entre CAFs derivats de PFs, MFAP5, i CAFs derivats de HSCs, F2R. A nivell funcional, els PFs van mostrar una major capacitat per reclutar cèl·lules Th2 i induir un augment de la proliferació en les cèl·lules tumorals. També vam investigar a nivell in vitro la funció del marcador CD90 estudiant dues subpoblacions de CAFs aïllades del mateix pacient, CD90hi i CD90lo, que mostraven diferències en el seu secretoma. Els CD90hi expressaven alts nivells de Podoplanina, una proteïna associada al reclutament i polarització de macròfags. En els assajos funcionals in vitro vam observar que els CD90hi reclutaven mes monòcits i que eren capaços d’induir la seva polarització cap a M2. En conjunt, els resultats d’aquesta tesi descriuen un ambient immunològicament actiu en el dHGP i un de pro-tumoral en el non-dHGP, fet que podria explicar el fracàs de la immunoteràpia en aquests pacients. Aquesta conclusió suggereix una necessitat de segregar els pacients tenint en compte el HGP que mostren, al mateix temps que proposa noves dianes terapèutiques per al tractament de CRLM. A més, els resultats obtinguts tant respecte els infiltrats inflamatoris com respecte els CAFs obren portes per a noves línies de recerca. Aquestes podrien portar a entendre millor els mecanismes biològics que expliquen les diferències de pronòstic entre HGPs, així com proposar noves estratègies terapèutiques per a aquests pacients.