Epigenetic and Epitranscriptomic Changes during Leukemic Cell Transdifferentiation

Abstract

[eng] Cellular transdifferentiation is defined as the process in which a differentiated cell from one specific lineage directly differentiates into another type of cell from another different lineage without going through a common intermediate multi-/pluripotent state. This event is believed to be driven mainly by epigenetic cues that reshape the epigenome for it to take a similar configuration normally found in the new lineage. Cellular transdifferentiation is a relatively rare event that occurs in humans under both physiological and pathological conditions. In cancer, this event acts as a therapy-resistance strategy for certain types of malignancies. Specifically in hematological cancers, such as follicular lymphoma (FL) and B cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL), B cells can transdifferentiate into malignant macrophages that resist to conventional therapy, leading to extremely poor prognosis. Very little is known about the epigenetic and epitranscriptomic changes that occur during B-cell-to-macrophage transdifferentiation, especially during the early stages of this event. Thus, we decided to investigate the global changes in 5-methylcytosine (5mC) DNA methylation and N6-methyl- adenosine (m6A) RNA methylation at different time-points of transdifferentiation using a human pre-B-ALL-to-macrophage C/EBP-driven transdifferentiation in vitro model (BLaER1). DNA 5mC methylation array analysis revealed no global methylation changes during BLaER1 B-cell-to-macrophage transdifferentiation, but rather discrete local changes in 251 CpGs, 99.6% (250) of which were demethylated upon transdifferentiation. 15.2% of those CpGs were located at gene promoter regions, controlling key macrophage genes, while 39.4% and 43.8% of the CpGs were located at gene bodies and distant genomic regions respectively, in which distant enhancers and silencers may be acting in a methylation-de- pendent manner. Correlation with Hi-C and expression array data, validation with 5-aza-2’- deoxycytidine passive DNA demethylation and UMI-4C analyses indicated that these distant regulatory regions control important macrophage genes in a methylation-dependent manner. On the other hand, m6A-seq RNA methylation analysis revealed numerous changes in the m6A epitranscriptome (6072 differential m6A peaks, corresponding to 3056 unique tran- scripts) upon BLaER1 B-cell-to-macrophage transdifferentiation. Gene ontology analyses revealed a strong enrichment in protein translation-related transcripts. We observed that mRNA transcripts with an increase in m6A content at the 3’UTR region were enriched in translation-related functions. shRNA-mediated knockdown of METTL3 and treatment with STM2457 (a small molecular competitive inhibitor of METTL3) both revealed that m6A in- creases the decay rate of crucial ribosomal protein transcripts, fine-tuning the levels of these protein during transdifferentiation by regulating global protein synthesis. In addition, METTL3 knockdown and treatment with STM2457 also revealed a significant decrease in BLaER1 B-cell-to-macrophage transdifferentiation, highlighting the importance of m6A in this transdifferentiation process. In conclusion, B-cell-to-macrophage transdifferentiation is an event in which both epigenetic and epitranscriptomic changes take place. While DNA 5mC methylation changes occur at discrete, local genomic regions (especially at distant regulatory regions), RNA m6A methylation changes are more drastic, both controlling key transdifferentiation processes. These findings shed some light on the vaguely studied field of cellular transdifferentiation, opening new opportunities in the diagnosis and treatment of malignant transdifferentiation events.

[spa] La transdiferenciación celular se define como un proceso en el cual una célula diferenciada perteneciente a un linaje específico directamente se diferencia en otro tipo celular perteneciente a otro linaje distinto sin pasar por un estado intermedio multi-/pluripotente común. Se piensa que este evento está impulsado principalmente por señales epigenéticas que remodelan el epigenoma para que éste adquiera una configuración similar a la del nuevo linaje. La transdiferenciación celular es un evento relativamente poco común que ocurre en humanos bajo condiciones fisiológicas y patológicas. En el cáncer, este evento actúa como una estrategia de resistencia a la terapia en ciertos tipos de malignidades. Específicamente en cánceres hematológicos, como linfoma folicular (FL) y leucemia linfoblástica aguda de células B (B-ALL), las células B pueden transdiferenciar en macrófagos malignos que resisten a la terapia convencional, conduciendo a pronósticos extremadamente malos. Se sabe muy poco sobre los cambios epigenéticos y epitranscriptómicos que ocurren durante la transdiferenciación de célula-B-a-macrófago, especialmente durante las etapas tempranas de este evento. Por ello, hemos decidido investigar los cambios globales en la metilación 5-metilcitosina (5mC) en ADN y en la metilación N6-metiladenosina (m6A) en ARN a lo largo de diferentes puntos temporales de la transdiferenciación usando un modelo humano de trans- diferenciación in vitro pre-B-ALL-a-macrófago estimulado por C/EBPa (BLaER1). El análisis mediante array de la metilación 5mC en ADN no revela cambios globales de metilación durante la transdiferenciación de célula-B-a-macrófago en BLaER1, sino que muestra cambios discretos locales en 251 CpGs, 99,6% (250) de las cuales se desmetilan a lo largo de la transdiferenciación. 15,2% de estas CpGs están localizadas en promotores génicos, controlando genes clave para el macrófago, mientras que un 39.4% y un 43.8% de las CpGs están respectivamente localizadas en cuerpos de genes y en regiones genómicas distantes, donde regiones potenciadoras y silenciadoras distantes pueden estar actuando de forma dependiente a la metilación. La correlación con Hi-C y arrays de expresión y la validación con la desmetilación pasiva del ADN mediada por 5-aza-2’-deoxycytidine y análisis mediante UMI-4C muestran que estas regiones distantes reguladoras controlan genes importantes para macrófago de forma dependiente a la metilación.

Por otra parte, el análisis de metilación del ARN mediante m6A-seq revela numerosos cambios en el epitranscriptoma de m6A (6072 picos de m6A diferenciales, correspondiéndose con 3056 transcritos únicos) tras la transdiferenciación de célula-B-a-macrófago en BLaER1. Análisis de ontología génica muestran un fuerte enriquecimiento en transcritos relacionados con la traducción proteica. Hemos observado que aquellos transcritos con un aumento en m6A en la región 3’UTR están enriquecidos en transcritos relacionados con la traducción. La depleción de METTL3 mediada por shRNA así como el tratamiento con STM2457 (un inhibidor molecular pequeño competitivo contra METTL3) han revelado que m6A aumenta la velocidad de decaimiento de transcritos de proteínas ribosomales cruciales, controlando de forma precisa los niveles de estas proteínas durante la transdiferenciación mediante la regulación de síntesis proteica global. Además, la depleción de METTL3 o el tratamiento con STM2457 también reveló una disminución significativa en la transdiferenciación de célula-B-a-macrófago en BLaER1, destacando la importancia de m6A en este proceso de transdiferenciación. En conclusión, la transdiferenciación de célula-B-a-macrófago es un evento en el que ocurren cambios epigenéticos y epitranscriptómicos. Mientras que la metilación 5mC en ADN ocurren en regiones discretas, locales del genoma (especialmente en regiones reguladoras distantes), los cambios de metilación m6A en ARN son más drásticos, ambos controlando procesos clave de la transdiferenciación. Estos hallazgos arrojan algo de luz sobre el vagamente estudiado campo de la transdiferenciación celular, abriendo nuevas oportunidades en el diagnóstico y tratamiento de eventos de transdiferenciación maligna.