Beta cell dedifferentiation in the treatment of type 2 diabetes

Abstract

[eng] Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM) is the most common type of diabetes (90-95 %) traditionally associated with peripheral insulin resistance that entails compensatory β- cell mass expansion and hyperinsulinemia during the initial stages of the disease. Despite this early adaptation, later on, blood glucose levels cannot be maintained, and it leads to progressive β-cell failure that results from reduced β-cell function and β-cell mass. Therefore, pancreatic β-cell failure, due to the interplay of genetic and acquired factors, is key to the onset and progression of T2DM. Originally reduced functional β- cell mass was attributed to β-cell apoptosis but novel mechanisms such as β-cell dedifferentiation have shed more light on the matter. β-cell dedifferentiation or the loss of β-cell identity and maturity has been evidenced as a mechanism of β-cell failure during stress-induced glucotoxicity and its downstream pathways: oxidative stress, ER stress, the hexosamine pathway, inflammation and hypoxia. Interestingly, β-cell dedifferentiation could be a reversible process, these dedifferentiated cells could potentially be rescued and induced to redifferentiate into mature β-cells, opening new possibilities for the prevention and treatment of T2DM. Sulfonylureas (SUs) are oral hypoglycemic agents widely used for its lower cost. These drugs induce glucose independent insulin secretion by inhibiting potassium flux through the ATP-dependent potassium channels (KATP) in β-cells. It has been observed that after a long-term treatment, patients start to show a failure to respond to the drug (2ry failure). However, the cellular mechanism underlying such failure is still not fully understood. Indeed, there are some studies conducted in mice suggesting β-cell exhaustion after chronic hyperexcitability and hypersecretion that could be induced by SUs. However, no conclusive data in human islets has been reported to understand these sulfonylurea-induced effects. A novel T2DM therapy is the use of GLP-1R agonists. Glucagon-like peptide-1 (GLP- 1) is an incretin hormone mainly secreted by intestinal enteroendocrine L-cells, as the active form GLP-1 (7-36)NH2, that contributes to glucose homeostasis, primarily by potentiating glucose-induced insulin secretion in β-cells. GLP-1 binds to a specific receptor, GLP-1R, activating several pathways within the β-cell resulting in increased

insulin biosynthesis, improved β-cell function, and increased β-cell mass. As well as, preventing β-cell apoptosis.

The hypothesis of this work was that chronic exposure to glibenclamide, a second- generation SU, could induce β-cell dedifferentiation resulting in a reduction of the functional β-cell mass, which could contribute to the progression of secondary failure to sulfonylureas. Considering the protective effects of GLP-1R agonists on β-cell viability and function, it was hypothesized that this process could be attenuated by GLP-1R agonists, resulting in the preservation of mature β-cell function. The main aim of the present work has been to investigate the effect of T2DM treatments and the diabetogenic environment on human β-cell phenotype, which included specific aims such as analysis of chronic glibenclamide exposure on β-cell function, β-cell apoptosis, and β-cell identity; elucidate the underlying mechanisms contributing to the glibenclamide-induced effects on β-cell function and identity; analyze the impact of the GLP-1R agonist exendin-4 (Ex-4) on glibenclamide-induced effects. Lastly, to analyze the impact of high glucose on β-cell function, viability and identity. Pancreata from deceased organ donors were processed for islet isolation. Islet preparations above or equal to 80% purity were used for all experiments. Human islets were cultured for 4 to 7 days with glibenclamide, chemical chaperone PBA, Ex-4 or at high glucose. At the end of the culture in the different conditions, islets were collected to determine β-cell function (glucose-stimulated insulin secretion), β-cell apoptosis (TUNEL), ER stress and oxidative stress (gene expression analysis by RT-qPCR and Western Blot), and β-cell dedifferentiation (gene expression and immunohistochemistry). Human islets cultured with glibenclamide showed a lower stimulation index than control islets due to a higher basal insulin secretion. Islet insulin content was significantly reduced in the glibenclamide group after one week. B-cell apoptosis was increased in the glibenclamide group. Gene expression analyses provided for the first time results showing glibenclamide-induced reduction of insulin and key β-cell transcription factors. Protein expression analyses confirmed the reduction on insulin and some TFs, however

lineage tracing could not corroborate the increase of β-cell dedifferentiated cells in the glibenclamide group. Thus, glibenclamide seems to generally induce loss of β-cell identity without signs of disallowed or progenitor endocrine markers expression. Glibenclamide provoked ER stress observed through the induction of UPR markers. Interestingly, once ER stress was prevented by the chemical chaperone PBA, glibenclamide-induced loss of β-cell identity was avoided. Glibenclamide effects on β- cell function were not prevented by PBA due to the fact that PBA alone exhibited a reduction on the stimulation index. The addition of Ex-4 concomitantly to the culture medium could not prevent the glibenclamide-induced deleterious effects as hypothesized, although Ex-4 alone did not show any detrimental effects on β-cell function or viability. Moreover, induction of ER stress and loss of β-cell identity was also not prevented. The consideration of another β-cell dedifferentiation inducer such as hyperglycemia was tested, and results demonstrated that high glucose does not recapitulate the gene expression effects observed with glibenclamide. Despite both stressors glibenclamide and high glucose resulted in β-cell dysfunction, the mechanisms underlying such failure are very distinct. In conclusion, our results provide a demonstration that loss of human β-cell identity and maturity is driven by glibenclamide-induced ER stress. Thus, we present a mechanism of adaptation of primary human β-cells to ER stress through the loss of β- cell identity and maturity. This mechanism may contribute to the decline in functional β-cell mass that is linked to the secondary failure upon sulfonylurea treatment in T2DM, opening up novel therapeutic possibilities. Therefore, reducing ER stress may aid in the preservation of β-cell identity and β-cell function.

[cat] La diabetis mellitus tipus 2 (DM2) és el tipus de diabetis més freqüent (90-95 %) associada tradicionalment a la resistència perifèrica a la insulina que comporta una expansió massiva compensatòria de les cèl·lules β pancreàtiques i hiperinsulinemia durant les etapes inicials de la malaltia. Malgrat aquesta adaptació primerenca, més endavant, els nivells de glucosa en sang no es poden mantenir i condueixen a una fallada progressiva de les cèl·lules β que resulta de la reducció de la funció i de la massa cel·lular β. Per tant, la fallada de cèl·lules β, a causa de la interacció de factors genètics i adquirits, és clau en l'aparició i progressió del la DM2. Originalment, la reducció de la massa funcional de cèl·lules β es va atribuir a l'apoptosi d’aquestes, però nous mecanismes com la desdiferenciació d’aquestes cèl·lules han aportat més llum sobre la matèria. S'ha evidenciat la desdiferenciació de cèl·lules β o la pèrdua d'identitat i maduresa d’aquestes cèl·lules com un mecanisme de fracàs de cèl·lules β durant la glucotoxicitat induïda per l'estrès i les seves vies aigües avall: estrès oxidatiu o de reticle endoplasmàtic (RE), via hexosamina, inflamació i hipòxia. Curiosament, la desdiferenciació de cèl·lules β podria ser un procés reversible, aquestes cèl·lules desdiferenciades podrien potencialment ser rescatades i induïdes a redifferenciar-se en cèl·lules β madures, obrint noves possibilitats per a la prevenció i el tractament de la DM2. Les sulfonilurees (SUs) són agents hipoglucemiants orals molt utilitzats pel seu menor cost. Aquests fàrmacs indueixen la secreció d'insulina independent de glucosa inhibint el flux de potassi a través dels canals de potassi dependents de l'ATP (KATP). S'ha observat que després d'un tractament a llarg termini, els pacients comencen a mostrar una falta de resposta al fàrmac (fallada secundaria). No obstant això, el mecanisme cel·lular subjacent a aquest fracàs encara no s'entén del tot. De fet, hi ha alguns estudis en ratolins que suggereixen l'esgotament de les cèl·lules β després de la hiperexcitabilitat crònica i la hipersecreció d’insulina que podria ser induïda per les SUs. No obstant això, no s’ha descrit cap dada concloent en illots humans per entendre aquests efectes de les SUs. Una nova teràpia DM2 és l'ús d'agonistes del receptor de GLP-1 (GLP-1R). El GLP-1 és una hormona incretina secretada principalment per cèl·lules L enteroendocrines intestinals que contribueix a l'homeòstasi de la glucosa, principalment potenciant la

secreció d'insulina induïda per glucosa en cèl·lules β. El GLP-1 s'uneix al seu receptor específic, GLP-1R, activant diverses vies dins de la cèl·lula β donant lloc a un augment de la biosíntesi de la insulina, una millora de la funció de les cèl·lules β i un augment de la massa cel·lular β. Així com, prevenir l'apoptosi de les cèl·lules β. La hipòtesi d'aquest treball era que la glibenclamida, una sulfonilurea de segona generació, podria induir la desdiferenciació de cèl·lules β donant lloc a una reducció de la massa funcional de cèl·lules β, la qual cosa podria contribuir a la progressió de la fallada secundària a les sulfonilurees. Tenint en compte els efectes protectors dels agonistes de GLP-1R sobre la viabilitat i la funció de les cèl·lules β, es va plantejar la hipòtesi que aquest procés podria ser atenuat pels agonistes de GLP-1R, donant lloc a la preservació de la funció de cèl·lules β madures. L'objectiu principal del present treball ha estat investigar l'efecte del tractaments de la DM2 i l’entorn diabetogènic sobre el fenotip de cèl·lules β humanes, incloent objectius específics com l'anàlisi de l'exposició crònica a glibenclamida sobre la funció cel·lular β, l'apoptosi de cèl·lules β, i la identitat cel·lular β; dilucidar els mecanismes subjacents que contribueixen als efectes induïts per glibenclamida sobre la funció, viabilitat i identitat de les cèl·lules β; estudiar l'impacte de l'agonista GLP-1R exendina-4 (Ex-4) sobre els efectes induïts per glibenclamida. Finalment, analitzar els efectes de l’exposició a alta glucosa sobre la funció, viabilitat i identitat de les cèl·lules β. Es van processar pàncrees de donants d'òrgans morts per a l'aïllament dels illots. Es van utilitzar preparats d'illots superiors o iguals al 80% de puresa per a tots els experiments. Els illots humans van ser cultivats de 4 a 7 dies amb glibenclamida, la xaperona química PBA, Ex-4 o amb alta glucosa. Al final del cultiu en les diferents condicions, es van recollir illots per determinar la funció de les cèl·lules β (secreció d'insulina estimulada per glucosa), l'apoptosi de cèl·lules β (TUNEL), l'estrès de RE i l'estrès oxidatiu (anàlisi de l'expressió gènica per RT-qPCR i Western Blot), i la desdiferenciació de cèl·lules β (expressió gènica i immunohistoquímica). Els illots humans cultivats amb glibenclamida van mostrar un índex d'estimulació més baix que els illots control a causa d'una major secreció basal d'insulina. El contingut

d'insulina dels illots va mostrar una reducció significativa en el grup de glibenclamida. L'apoptosi de cèl·lules β es va incrementar en el grup glibenclamida. Les anàlisis d'expressió gènica van proporcionar per primera vegada resultats que mostraven una reducció induïda per glibenclamida del gen de la insulina i factors clau de transcripció (TF) de cèl·lules β. Les anàlisis d'expressió de proteïnes van confirmar la reducció de la insulina i alguns TF, però el rastreig de llinatges no va poder corroborar l'augment de cèl·lules β desdiferenciades en el grup glibenclamida. Així, la glibenclamida sembla induir una pèrdua general d’identitat β sense signes d'expressió de marcadors endocrins no permesos o progenitors. La glibenclamida va provocar estrès de RE observat mitjançant la inducció de marcadors UPR. Curiosament, quan l'estrès de RE va ser evitat pel PBA, es va evitar la pèrdua d’identitat de les cèl·lules β induïda per la glibenclamida. Els efectes de la glibenclamida sobre la funció de cèl·lules β no van ser impedits pel PBA ja que el PBA sol ja va mostrar una reducció en l'índex d'estimulació. L'addició d'Ex-4 de manera concomitant al medi de cultiu no va poder evitar els efectes deleteris induïts per la glibenclamida com havíem hipotetitzat, tot i que l’Ex-4 per si sol no va mostrar cap efecte perjudicial sobre la funció o viabilitat de les cèl·lules β. A més, tampoc es va evitar la inducció de l'estrès de RE i la pèrdua d'identitat de les cèl·lules β. Es va considerar un altre inductor de la desdiferenciació de cèl·lules β com és la hiperglucèmia, i els resultats van demostrar que l'alta glucosa no recapitula els efectes d'expressió gènica observats amb glibenclamida. Tot i que tant la glibenclamida com l'alta glucosa van donar lloc a una disfunció de cèl·lules β, els mecanismes subjacents a aquest fracàs són molt diferents. En conclusió, els nostres resultats proporcionen una demostració de que la pèrdua d'identitat i maduresa de cèl·lules β humanes està impulsada per l'estrès de RE induït per la glibenclamida. Així, presentem un mecanisme d'adaptació de les cèl·lules β humanes a l'estrès de RE a través de la pèrdua d'identitat i maduresa de cèl·lules β. Aquest mecanisme pot contribuir a la disminució de la massa funcional de cèl·lules β que està vinculada a la fallada secundaria al tractament de sulfonilurees en la DM2, obrint noves possibilitats terapèutiques. Per tant, la reducció de l'estrès de RE pot ajudar a la preservació de la identitat cel·lular β i, en conseqüència, a la seva funció.