Oncogenes in aggressive B cell lymphomas: dissecting the mechanisms of their aberrant expression and tumorigenic role

Abstract

[eng] B cell lymphomas are a heterogeneous group of hematological neoplasms. The first tumorigenic events in B cell lymphomagenesis are usually translocations involving defined oncogenes that often lead a block on normal B cell differentiation. However, pre- tumoral cells need secondary hits involving other oncogenes to progress. The principal aims of this Thesis were to explore the functional role of specific oncogenes in aggressive B cell lymphomas, as well as to unravel the mechanisms that underlie their aberrant expression in lymphoid malignancies. Our final aim was to identify more effective targeted therapies against new specific oncogenic pathways to improve the outcome and life quality of patients with aggressive lymphomas. In the Study 1 of this thesis, I focused on mantle cell lymphoma (MCL), one of the most aggressive mature B cell neoplasms. Two subgroups of the disease with distinct clinical, biological and molecular features have been described. SOX11 transcription factor is aberrantly overexpressed in conventional MCL (cMCL) and negative or very weakly expressed in the nnMCL subtype. SOX11 has an oncogenic role in the pathogenesis of MCL. Patients with MCL expressing the SOX11 transcription factor have been shown to have worse prognoses compared to those that do not express SOX11, likely due to shorter responses to treatment and a higher incidence of relapse to current therapies. This might be attributed to the role of SOX11 regulating progenitors and stem cells proliferation and differentiation in various tissues. Additionally, SOX11 has been shown to enhance cancer stem cell (CSC) properties and to promote drug resistance in several cancer cell types. Thus, the aims for Study 1 were to identify SOX11-dependent stemness-related factors as possible prognostic biomarkers for relapsed MCL, and to find therapeutic interventions targeting CSC-related genes for treatment of aggressive MCL. In Study 1, I found that SOX11+ MCLs showed enrichment of hematopoietic and leukemic stem cell-related gene signatures, compared to SOX11- MCL primary cases and cell lines. Moreover, I identified Musashi-2 (MSI2) RNA-binding protein as one of the most significant stem cell-related genes upregulated in SOX11+ MCLs compared to SOX11- MCLs. MSI2 expression correlated with worse overall survival in MCL. In

addition, MSI2 expression was directly regulated by SOX11, and was associated with active intronic superenhancers. MSI2 upregulation might contribute to the maintenance of stem cell properties in MCL cells by promoting translation of stemness-related genes and downregulating apoptotic factors, since MSI2 knockdown and inhibition with Ro 08- 2750 (RO) small molecule impaired self-renewal capabilities, such as clonogenic growth and aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity, and decreased cell survival and chemoresistance. Finally, MSI2 knockdown inhibited tumoral cell dissemination and growth in MCL xenotransplanted mice models. Unfortunately, RO showed toxicity in our MCL mouse model, impairing us to test the efficacy of MSI2 inhibition in vivo. Therefore, our results open a new perspective for treatment, highlighting MSI2 oncogene as a potential therapeutic target to inhibit drug resistance and relapse in aggressive MCLs. In the Study 2 of this thesis, I focused on Burkitt lymphoma (BL), a highly proliferative B cell neoplasm that originates from germinal center B cells. Three clinical variants are distinguished: endemic (eBL), sporadic (sBL) and immunodeficiency-related BL. eBL is usually positive for Epstein-Barr virus (EBV) infection and presents with jaw or facial bone involvement. sBL shows lower frequency of EBV infection, and usually involves abdomen (Peyer’s patches). One of the genetic hallmarks of BL is the t(8;14), leading to MYC overexpression. However, MYC overexpression is not enough to develop a BL. Several studies have revealed genetic and molecular differences depending on the clinical variant and the EBV status of BL patients. For instance, EBV+ BLs show lower driver mutations than EBV- BLs. Approximately 25-50% of BL patients show SOX11 overexpression. Although SOX11 has an impact on MCL prognosis, no association between SOX11 expression and survival has been found in BL. Several studies have shown the oncogenic role of SOX11 in the pathogenesis of MCL, but the contribution of SOX11 to BL pathogenesis and clinical evolution remains unknown. Thus, the aims for the Study 2 were to understand the clinical relevance of SOX11 expression in BL, and to shed light on the functional role of SOX11 in the development of BL. In Study 2, I have observed that EBV infection and SOX11 expression were mutually exclusive, and that SOX11+ BLs mainly exhibited IG-MYC translocations

acquired during class switch recombination (CSR), rather than somatic hypermutation (SHM), the process predominantly observed in SOX11- and EBV+ BL cases. In addition, SOX11+ BLs showed lower levels of BCL6 and AICDA, alongside a distinct mutational landscape characterized by a higher frequency of SMARCA4, ID3 and RFX7 mutations, and a lower frequency of mutations in DDX3X gene, compared to EBV+ and SOX11- BLs. The previously described SOX11 distal enhancer regions associated to SOX11 expression in MCL were not observed in BL. There were similarities in the transcriptional program regulated by SOX11 in BL and MCL, including upregulation of chemokine receptors. However, SOX11+ BL cells did not show differences in tumor cell migration or adhesion towards stromal cells compared to SOX11- BL cell lines. Instead, BL SOX11+ cells showed more adhesion to VCAM-1, associated to homing through the Peyer’s patches. Therefore, I hypothesize that BL transformation could take place at different stages during germinal center differentiation and by distinct pathogenic mechanisms according to SOX11 expression or EBV infection in BLs. The molecular dichotomy observed between SOX11 and EBV suggests that both might play a role in early stages of BL tumorigenic transformation. However, due to limited functional effects observed upon ectopic overexpression of SOX11 in our BL cell line models compared to SOX11- BL cells, I hypothesize that SOX11 might not have a key role in the maintenance of this lymphoma in later stages. Overall, I have described the role of two oncogenes, MSI2 and SOX11, in two non-Hodgkin lymphomas, MCL and BL, respectively. I have unraveled the mechanisms by which MSI2 is overexpressed and how exerts its tumorigenic function in MCL, highlighting MSI2 as a new possible target for therapeutic interventions to overcome drug resistance in aggressive MCL. I have also given some insights into the functional role of SOX11 in BL, demonstrating a clear dichotomy between EBV and SOX11, and suggesting different B cell of origin and pathogenic mechanisms between them in the pathogenic early transformation of mature B cells in BL. These findings have improved our understanding of the molecular mechanisms underlying these lymphomas and might guide the development of future therapies.

[spa] Los linfomas de células B son un grupo heterogéneo de neoplasias hematológicas. Los primeros eventos en la linfomagénesis B son translocaciones que involucran ciertos oncogenes, resultando en un bloqueo de la diferenciación normal de las células B en las células tumorales. Sin embargo, las células pretumorales necesitan mecanismos secundarios que involucren a otros oncogenes para progresar. Los objetivos generales de esta tesis fueron explorar el papel funcional de ciertos oncogenes en los linfomas de células B agresivos, así como desentrañar los mecanismos que subyacen a su expresión aberrante en neoplasias linfoides. Nuestro objetivo final es poder desarrollar en el futuro terapias dirigidas más efectivas que aprovechen las vulnerabilidades de ciertas vías oncogénicas y mejorar la supervivencia y la calidad de vida de los pacientes con linfomas agresivos. El Estudio 1 de esta tesis versa sobre el linfoma de células del manto (LCM), una de las neoplasias de células B maduras más agresivas. Existen dos subgrupos de la enfermedad con distintas características clínicas, biológicas y moleculares. El factor de transcripción SOX11 se sobreexpresa de forma anómala en el subtipo de LCM convencional, pero se expresa negativa o muy débilmente en el subgrupo no nodal. SOX11 tiene un papel oncogénico en la patogénesis del LCM. Se ha demostrado que los pacientes con LCM que expresan el factor de transcripción SOX11 tienen peor pronóstico en comparación con aquellos que no expresan SOX11, probablemente debido a respuestas más cortas al tratamiento y una mayor incidencia de recaída con las terapias actuales. Esto puede atribuirse al papel de SOX11 en la regulación de la proliferación y diferenciación de progenitores y células madre en varios tejidos. Además, se ha demostrado que SOX11 promueve propiedades de células madre cancerosas (CSC) (stemness) y resistencia a las terapias en varios tumores. Por lo tanto, los objetivos del Estudio 1 fueron identificar factores relacionados con stemness regulados por SOX11 como posibles biomarcadores pronósticos para el LCM recidivante, y desarrollar terapias dirigidas hacia los genes relacionados con las CSC para el tratamiento del LCM agresivo.

En el Estudio 1, observé que los LCM SOX11+ mostraban un enriquecimiento de firmas genéticas relacionadas con células madre hematopoyéticas y leucémicas, en comparación con los casos y líneas celulares primarios de LCM SOX11-. Además, identifiqué la proteína de unión al ARN Musashi-2 (MSI2) como uno de los genes relacionados con la stemness más importantes regulados al alza en los LCM SOX11+ en comparación con los SOX11-. La expresión de MSI2 se correlacionaba con una peor supervivencia global en los pacientes con LCM. Además, la expresión de MSI2 estaba regulada directamente por SOX11 y se asociaba con superpotenciadores intrónicos activos. El incremento de la expresión de MSI2 podría contribuir al mantenimiento de las propiedades de las células madre en las células del LCM mediante el incremento de la traducción de genes relacionados con la stemness y el descenso de factores pro- apoptóticos, ya que el silenciamiento y la inhibición de MSI2 con el fármaco Ro 08-2750 (RO) perjudican las capacidades de autorrenovación, como el crecimiento clonogénico y la actividad de la aldehído deshidrogenasa (ALDH), y disminuyen la supervivencia celular y la quimiorresistencia de las células del LCM. Finalmente, la eliminación de MSI2 inhibió la diseminación y el crecimiento de células tumorales en modelos de ratones xenotrasplantados con células de LCM. Desafortunadamente, el fármaco RO mostró toxicidad en nuestro modelo de ratón de LCM, lo que nos impidió comprobar la eficacia de la inhibición de MSI2 in vivo. Por lo tanto, nuestros resultados abren una nueva perspectiva para el tratamiento, destacando el oncogén MSI2 como una diana terapéutica potencial para inhibir la resistencia a los medicamentos y la recaída en los pacientes con LCM agresivo. El Estudio 2 de esta tesis versa sobre el linfoma de Burkitt (BL), una neoplasia de células B altamente proliferativa que se origina a partir de las células B del centro germinal. Se distinguen tres variantes clínicas: BL endémico (eBL), BL esporádico (sBL) y BL relacionado con inmunodeficiencia. El eBL suele presentar infección del virus de Epstein-Barr (EBV) y afecta generalmente la mandíbula o el hueso facial. El sBL muestra una frecuencia más baja de infección por EBV y generalmente se desarrolla en el abdomen (placas de Peyer). Una de las características genéticas de BL es la t(8;14), que conduce a

la sobreexpresión de MYC. Sin embargo, la sobreexpresión del oncogén MYC no es suficiente para desarrollar un BL. Varios estudios han revelado diferencias genéticas y moleculares según la variante clínica y el estado del EBV de los pacientes con BL. Por ejemplo, los BL que son EBV+ muestran mutaciones “driver” en menor proporción que los BL que son EBV-. Aproximadamente el 25-50% de los pacientes con BL muestran sobreexpresión del factor de transcripción SOX11. Aunque SOX11 tiene un impacto en el pronóstico del LCM, no se ha encontrado asociación entre la expresión de SOX11 y la supervivencia en los pacientes de BL. Varios estudios han demostrado el papel oncogénico de SOX11 en la patogénesis del LCM, pero se desconoce la contribución de SOX11 a la evolución clínica del BL. Por lo tanto, los objetivos del Estudio 2 fueron comprender la relevancia clínica de la expresión de SOX11 en BL e investigar sobre el papel funcional de SOX11 en el desarrollo del BL. En el Estudio 2, observé que la infección por EBV y la expresión de SOX11 eran mutuamente excluyentes, y que los BL SOX11+ exhibían principalmente translocaciones IG-MYC adquiridas durante el mecanismo de conmutation del isotipo (CSR), en lugar de durante la hipermutación somática (SHM), como ocurre en los casos de BL SOX11- y EBV+. Además, los BL SOX11+ mostraron niveles más bajos de BCL6 y AICDA, junto con un paisaje mutacional distintivo caracterizado por una frecuencia más alta de mutaciones en SMARCA4, ID3 y RFX7, y una frecuencia más baja de mutaciones en el gen DDX3X, en comparación con los BL EBV+ y SOX11-. Las regiones potenciadoras distales de SOX11 descritas anteriormente asociadas a la expresión de SOX11 en el LCM no se observaron en el BL. Había similitudes en el programa transcripcional regulado por SOX11 en BL y MCL, incluida la regulación positiva de los receptores de quimiocinas. Sin embargo, las células SOX11+ BL no mostraron diferencias en la migración o adhesión de las células tumorales hacia las células del estroma en comparación con las líneas celulares SOX11-. En cambio, las células BL SOX11+ mostraron más adhesión a VCAM- 1, que promueve la migración de las células B hacia las placas de Peyer. Por lo tanto, la transformación del BL podría tener lugar en diferentes etapas durante la diferenciación del centro germinal y mediante distintos mecanismos patogénicos según la expresión de

SOX11 y la infección por EBV en los BL. La dicotomía molecular observada entre SOX11 y EBV sugiere que ambos podrían desempeñar un papel relevante en las primeras etapas de la transformación tumorigénica de BL. Sin embargo, los limitados efectos funcionales observados en nuestros modelos celulares de BL SOX11+ sugieren que SOX11 podría no tener un papel clave en el mantenimiento de este linfoma en etapas posteriores. En general, en esta tesis se ha descrito el papel de dos oncogenes, MSI2 y SOX11, en el LCM y el BL, respectivamente. He desentrañado los mecanismos por los cuales MSI2 se sobreexpresa y cómo ejerce su función tumorigénica en el LCM, destacando MSI2 como una nueva diana terapéutica para vencer la resistencia a los medicamentos en el LCM agresivo. También se han aportado algunas ideas sobre el papel funcional de SOX11 en el BL, demostrando una clara dicotomía entre EBV y SOX11, y sugiriendo diferentes mecanismos patogénicos y diferencias en las células B de origen entre ellos en la transformación temprana del BL. Estos hallazgos han mejorado nuestra comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes a estos linfomas y podrían guiar el desarrollo de futuras terapias.